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SKY and genetic fingerprinting reveal a cross-contamination of the putative normal colon epithelial cell line NCOL-1

Institute of Human Genetics, University of Wuerzburg, Gastrolabor/Bau 4, Joseph-Schneider-Str. 2, 97074 Wuerzburg, Germany.
Cancer Genetics and Cytogenetics (Impact Factor: 1.93). 05/2005; 158(1):84-7. DOI: 10.1016/j.cancergencyto.2004.08.023
Source: PubMed

ABSTRACT

In vitro studies addressing the primary prevention of colon carcinoma are preferably conducted using normal colonic cells, because these cells are more likely to represent the potential target for prevention in vivo. Established cell lines of normal colonic origin are mostly lacking; however, this is probably due to the difficulties associated with establishment of such cell lines. Cross-contamination with malignant cells is a frequent event, and so any successfully established cell line of normal origin should be scrutinized prior to further investigation. We performed a cytogenetic (spectral karyotyping) and genetic fingerprint (Promega PowerPlex ES multiplex system and Applied Biosystems AmpFlSTR SGM Plus multiplex system) analysis of the putative normal colon epithelial cell line NCOL-1, derived from two different sources (NCOL-1a and 1b). We show that NCOL-1a and 1b are probably derived from the colon carcinoma cell line LoVo, with a matching probability of 99.9995, most probably through cross-contamination. Karyotypes of LoVo and NCOL-1a were identical; NCOL-1b displayed additional marker chromosomes. Our findings highlight the importance of molecular and cytogenetic characterization of established cell lines to avoid drawing misleading conclusions from the original findings.

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    • "n zu können . Um optimale zytogenetische Studien zur Adenom - Karzinom - Sequenz durchführen zu können , wäre es von großem Vorteil , zusätzlich den Karyotyp von normalen unveränderten Enterozyten und Adenomen ebenfalls darzustellen . Bislang war es allerdings nicht möglich , aus normaler Darmmukosa und Adenomen etablierte Zelllinien zu erwerben ( Melcher et al . , 2005 ) ."
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    ABSTRACT: Die in-vitro Kultivierung von epithelialen Tumorzellen ist schwierig und die Metaphasengewinnung an primärem Material nicht in ausreichender Menge und Qualität möglich. Bislang werden meist kommerzielle Kolonkarzinomzelllinien für Studien zur Kolonkarzinogenese verwendet. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden zwei Kolonkarzinomzelllinien und eine Adenomzelllinie etabliert. Der native Primärtumor und die korrespondierende Normalschleimhaut sind verfügbar. Damit steht nun ein Modell der Adenom-Karzinom-Sequenz zur Verfügung und Ergebnisse. Die neuetablierten Kolonkarzinomzelllinien Geki-3 und -4 und die Adenomzelllinie Geki-2 wurden mit den kommerziellen Zelllinien Colo206F und Colo678 verglichen. Dazu wurde eine Charakterisierung mittels der spektralen Karyotypisierung (SKY) sowie einer Mikrosatellitenanalyse durchgeführt. Im Gegensatz zu der Adenomzelllinie finden sich in allen untersuchten Kolonkarzinomzelllinien multiple chromosomale Aberrationen. Dabei zeigten sich keine wesentlichen Unterschiede zwischen den kommerziell erhältlichen Zelllinien, die schon Jahre in Kultur sind und den neuetablierten Linien. Obwohl die chromosomale Instabilität in-vivo wichtig für die Karzinomentstehung und -metastasierung ist, kommt es unter Kulturbedingungen offenbar nicht zu einer Progression der chromosomalen Instabilität. Neben Adenom- und Karzinomzelllinien wären normale Kolonepithelzelllinien für Studien zur Kolonkarzinogenese ebenfalls von großer Wichtigkeit. Die Etablierung von normalen Epithelzelllinien ist allerdings noch schwieriger als die Etablierung von Adenomzelllinien. Aus normalen Kolonepithelzellen wurde bisher nur die Etablierung einer Epithelzelllinie, der NCOL-1, beschrieben. Ebenfalls im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass diese Zelllinie der mikrosatelliteninstabilen Kolonkarzinomzelllinie Lovo entspricht, so dass zurzeit keine normale Kolonepithelzelllinie verfügbar ist. In-vitro cultivation of epithelial tumor cells is difficult. Isolation of sufficient amounts of high quality cells in metaphase in primary material has so far not been possible. So far commercial colon carcinoma cell lines have mostly been used for studies on the development of colon carcinomas. For this dissertation, two lines of colon carcinoma cells and one of colon adenoma cells were established. The native primary tumor and the corresponding normal mucosa are available. The newly established cell lines Geki-3 and Geki-4 and the cell line of the adenoma cells Geki-2 were compared to the commercial lines Colo 206F and Colo 678. In order to achieve the characterisation by spectral karyotyping (SKY) and analysis of microsatellites ware performed. In contrast to the adenoma cells there are multiple chromosome aberrations in all examined carcinoma cells. There were no major differences between the commercially available cells, having been cultured for years, and the newly established ones. Even though chromosomal instability is important for the development and metastatic growth in-vivo, there doesn’t seem to be any progression of chromosomal instability in-vitro. Beside adenoma and carcinoma cell lines, normal epithelial cells would be of major importance for studies in carcinoma genesis. Establishing normal cell lines is even more difficult than the establishment of adenoma cells. So far there has only been one report of the establishment of a line of epithelial cells from normal mucosa cells, NCOL-1. In the course of this study we could prove though, that the NCOL-1 cell line originates from the same source (Lovo). This means, that there is currently no normal line of colon mucosa cells available.
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    ABSTRACT: Dickdarmkrebs ist in Deutschland bei Männern und Frauen die zweithäufigste Krebserkrankung. Die Rolle von Ballaststoffen bei der Prävention von Dickdarmkrebs bleibt umstritten: Vielversprechenden in vitro- und Tierexperimenten stehen widersprüchliche epidemiologische Studien gegenüber. Funktionelle Kohlenhydrate als Bestandteile präbiotischer Lebensmittel sollen die Colon-Mikroflora zu Gunsten von Bakterienstämmen verändern, die kurzkettige Fettsäuren (SCFA) bilden und deren Konzentrationen im Colon, auch im distalen Teil, wo die meisten Coloncarcinome entstehen, erhöhen. SCFA, vor allem Butyrat, gelten als präventiv wirksame Substanzen gegen Dickdarmkrebs. Für die vorliegende Arbeit wurden drei verschiedene, von der Firma Südzucker neu entwickelte, funktionelle Oligosaccharide (OS, hergestellt aus Isomaltulose und resistenter Stärke) mit Humanfaeces gesunder Probanden in vitro fermentiert. Die daraus gewonnenen Fermentationsüberstände (FÜ) wurden im Zellkultursystem an Coloncarcinom-Zelllinien unterschiedlicher Differenzierungsgrade (HT29, HT29 Clon 19A, T84) getestet. Untersucht wurden cytotoxische Effekte, proliferationshemmende Wir-kung, Apoptoseinduktion, Einfluss auf den Zellzyklus und elektrophysiologische Para-meter. Zur Anwendung kamen spektralphotometrische und durchflusscytometrische Methoden sowie Messungen in vertikalen Diffusionskammern (Ussing-Kammern). Bei allen Versuchen wurden parallel SCFA-Gemische, deren SCFA-Konzentrationen analog den FÜ waren, untersucht, außerdem ein FÜ „Kontrolle“, der ohne OS-Fermentation hergestellt wurde. In mehreren voneinander unabhängigen Fermentationen konnten reproduzierbare Ergebnisse hinsichtlich der SCFA-Gehalte der FÜ erzielt werden. Das Verhältnis der drei Haupt-Fettsäuren Acetat, Propionat und Butyrat in den FÜ nach OS-Fermentation entsprach weitgehend den in vivo-Verhältnissen. Die untersuchten FÜ und SCFA-Gemische wirkten in der Konzentration von 50 % bei allen Zelllinien cytotoxisch. Ebenso war eine dosisabhängige Proliferationshemmung und in der Konzentration von 50 % die Induktion von Apoptose zu verzeichnen. Durch die parallele Untersuchung analoger SCFA-Gemische in PBS konnte gezeigt werden, dass cytotoxische und proliferationshemmende Effekte der FÜ im Wesentlichen auf ihren SCFA-Gehalt zurückzuführen sind. Für die Apptoseinduktion konnte dies nicht bestätigt werden: Die SCFA-Gemische induzierten überwiegend mehr Apoptose als die entsprechenden FÜ. Ebenso waren die Wirkungen von FÜ und SCFA-Gemischen auf den Zellzyklus unterschiedlich: Die SCFA-Gemische konnten die DNA-Synthese-Phase zum Teil deutlich stärker hemmen als die FÜ; die FÜ führten hauptsächlich zu einem G2-Arrest. Bei den elektrophysiologischen Untersuchungen in Ussing-Kammern zeigten weder FÜ noch SCFA-Gemische Effekte auf transepithelialen Widerstand oder Kurzschlusstrom. Die Fermentationsmuster der verwendeten FÜ und die SCFA-Konzentrationen der ent-sprechenden Gemische unterschieden sich nicht stark genug voneinander, um in den verwendeten Testsystemen signifikant unterschiedliche Ergebnisse zu erzielen. Auch die verwendeten Zelllinien zeigten ein inkonsistentes Verhalten nach Inkubation mit FÜ bzw. SCFA-Gemischen, so dass keine Beziehung zwischen Differenzierungsgrad und Wirkung der Testsubstanzen hergestellt werden konnte. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass aus der in vitro-Fermentation von OS mit Humanfae-ces reproduzierbare SCFA-Muster resultieren, die den in vivo-Verhältnissen gleichen. Gleichzeitig wurde ein Methodenspektrum für das Screening von FÜ bzw. SCFA-Gemischen bei unterschiedlich differenzierten Coloncarcinom-Zelllinien entwickelt, das die Zellen in allen Wachstumsphasen (exponentiell, subkonfluent, konfluent, ausdifferenziertes Monolayer) erfasst. Die Wirkungen der FÜ waren allerdings nur zum Teil auf die darin enthaltenen SCFA zurückzuführen. Welche anderen FÜ-Inhaltsstoffe, vor allem hinsichtlich ihrer apoptosehemmenden und Zellzyklus-beeinflussenden Wirkungen, eine Rolle spielen, konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht geklärt werden. Ebenso erlaubt die vorliegende Arbeit keine Rückschlüsse darauf, welche der für die Fermentati-on verwendeten OS eine besonders positive Wirkung auf Faktoren haben, die die Coloncarcinogenese hemmen können (z.B. Induktion von Apoptose). Für zukünftige Studien sollten FÜ mit größeren Unterschieden in ihrer SCFA-Zusammensetzung verwen-det werden. Außerdem sollten dieselben OS, die für die in vitro-Fermentationen verwendet werden, in Tierstudien oder in humanen Interventionsstudien hinsichtlich ihrer Fermentierbarkeit untersucht werden. Colon cancer is the second most common cancer in Germany. The role of dietary fibre in the prevention of colon cancer is still controversial: Promising results from in vitro and animal studies are contradictory to inconsistent results from epidemiological stu-dies. Functional carbohydrates as constituents of prebiotic food can modify the colonic microflora for the benefit of short chain fatty acid (SCFA)-producing microbial strains. The SCFA-concentrations should also be increased in the distal part of the colon where most colon carcinomas are developing. SCFA are considered to be preventive against colon cancer. For this study, three different new functional oligosaccharides (OS, made of Isomaltulose and resistant starch) were produced from the Südzucker company and fermented in vitro with human feces of healthy test subjects. The resulting fermentation supernatants (FS) were tested in a cell culture system, using colon carcinoma cell lines of various degrees of differentiation (HT29, HT29 Clone 19A, T84). Cytotoxicity, proliferation, the induction of apoptosis, influences on the cell cycle and electrophysiological parameters were measured. Spectral photometric and flow cytometric methods were performed, as well as measurements in vertical diffusion chambers (Ussing chambers). The parallel testing of SCFA-mixtures with the same SCFA-concentrations as in the FS was included, as well as the testing of a FS „Control“ which was produced without OS-fermentation. Several independent fermentations revealed reproducible results regarding the SCFA-concentrations of the FS. After OS-fermentation, the ratio of the three major SCFA in the FS, acetate, propionate, and butyrate, was similar to that observed in vivo. The FS and SCFA-mixtures tested had a cytotoxic effect on all cell lines at the con-centration of 50 %. A dose dependent decrease in cell proliferation could be found, as well as the induction of apoptosis at a concentration of 50 %. Parallel testing of the analogous SCFA-mixtures showed that cytotoxic and proliferation inhibiting effects of the FS could be primarily attributed to their SCFA-content. This could not be confirmed for apoptosis induction: the SCFA-mixtures were mostly able to induce a higher apoptosis rate than the FS. Similarly, the effects of FS and SCFA-mixtures on the cell cycle were different: The SCFA-mixtures showed more potent inhibition of DNA-synthesis than the analogous FS, which generally led to an arrest in the G2-phase of the cell cycle. Neither FS nor SCFA-mixtures had an impact on transepithelial resistance or short circuit current of differentiated cell monolayers in Ussing chambers. The difference in the fermentation patterns of the various FS and the SCFA-concentrations of the SCFA-mixtures was not great enough to achieve significantly different results in the test systems used. Also, the various differentiation grades of the cell lines showed inconsistent results after treatment with FS and their SCFA-mixtures, so that no correlation could be found between degree of differentiation and test compound action. This study shows that the in vitro fermentation of OS with human feces results in reproducible SCFA-patterns in the FS, similar to the in vivo situation. For the screening of FS and their SCFA-mixtures, respectively, a spectrum of methods was established for the incubation with colon carcinoma cell lines of various differentiation states and of all stages of growth (exponential, subconfluent, confluent, fully differentiated monolayer). Indeed, the effects measured after incubation with FS could only in part been ascribed to their SCFA content. Other FS components than SCFA that play a role, especially regarding to their apoptosis inhibiting and cell cycle influencing effects, remain to be identified. Also, this study allows no conclusions to be drawn, which of the fermented OS is more promising in it’s beneficial influence on colon cancer preventing factors, e.g. the induction of apoptosis, than the other. Future studies should investigate FS with greater differences in their SCFA-concentrations. The same OS which were used for the in vitro fermentation, should also be tested in animal studies and human intervention studies to elucidate their fermentation patterns in vivo.
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