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Mechanism of Benzaldehyde Lyase Studied via Thiamin Diphosphate-Bound Intermediates and Kinetic Isotope Effects †

Department of Chemistry, Rutgers University, Newark, New Jersey 07102, USA.
Biochemistry (Impact Factor: 3.02). 04/2008; 47(12):3800-9. DOI: 10.1021/bi702302u
Source: PubMed

ABSTRACT

Direct spectroscopic observation of thiamin diphosphate-bound intermediates was achieved on the enzyme benzaldehyde lyase, which carries out reversible and highly enantiospecific conversion of ( R)-benzoin to benzaldehyde. The key enamine intermediate could be observed at lambda max 393 nm in the benzoin breakdown direction and in the decarboxylase reaction starting with benzoylformate. With benzaldehyde as substrate, no intermediates could be detected, only formation of benzoin at 314 nm. To probe the rate-limiting step in the direction of ( R)-benzoin synthesis, the (1)H/ (2)H kinetic isotope effect was determined for benzaldehyde labeled at the aldehyde position and found to be small (1.14 +/- 0.03), indicating that ionization of the C2alphaH from C2alpha-hydroxybenzylthiamin diphosphate is not rate limiting. Use of the alternate substrates benzoylformic and phenylpyruvic acids (motivated by the observation that while a carboligase, benzaldehyde lyase could also catalyze the slow decarboxylation of 2-oxo acids) enabled the observation of the substrate-thiamin covalent intermediate via the 1',4'-iminopyrimidine tautomer, characteristic of all intermediates with a tetrahedral C2 substituent on ThDP. The reaction of benzaldehyde lyase with the chromophoric substrate analogue ( E)-2-oxo-4(pyridin-3-yl)-3-butenoic acid and its decarboxylated product ( E)-3-(pyridine-3-yl)acrylaldehyde enabled the detection of covalent adducts with both. Neither adduct underwent further reaction. An important finding of the studies is that all thiamin-related intermediates are in a chiral environment on benzaldehyde lyase as reflected by their circular dichroism signatures.

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    • "The next step (step3 in Scheme 1) is the dehydration process of DHETHDP which is different from other well studied THDP-dependent enzymes [13] [18] [20] [41]. The C1 00 hydroxyl group is protonated by a proton donor B2 to form a water molecule and generate eno- lacetyl-THDP. "
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    ABSTRACT: Phosphoketolase (PK) is a thiamine diphosphate (THDP) dependent enzyme which plays key roles in the metabolism of heterofermentative bacteria. By using density functional theory (DFT) method, the catalytic mechanism of PK has been studied on simplified models. The calculation results indicate that the formation of 2-α,β-dihydroxyethylidene-THDP (DHETHDP) and erythrose-4-phosphate (E4P) involves one C–C bond formation and one C–C bond cleavage process. Each C–C bond formation or cleavage is always accompanied by a proton transfer in a concerted but asynchronous way. The dehydration process in the reaction of PK is distinct from that of other THDP-dependent enzymes. The Keto–Enol tautomerism process is assisted with a mediator His553. His64, His553 and His97 are found to have the function to stabilize the transition states and intermediates. His64 is a better candidate of B1 catalyst. His553 acts as a proton donor to protonate the carbonyl oxygen, and plays intermediary role in the Keto–Enol tautomerism process. His97 is the probable B2 catalyst in the dehydration process.
    Full-text · Article · Dec 2013 · Computational and Theoretical Chemistry
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    ABSTRACT: Die Reaktionstechnik ist ein Schlüsselaspekt bei der Optimierung von chemischen Reaktionen. Die Biokatalyse steht allerdings einer Reihe von Problemen bei der Integration der interdisziplinären Methoden aus der Biologie, Thermodynamik und Ingenieurwissenschaften gegenüber. Vier bedenkliche Sachverhalte sind hervorzuheben: (1) willkürliche Modellvereinfachungen, (2) subjektive Wahl optimaler Reaktionsbedingungen, (3) ungenügende Analyse der Umgebungseinflüsse auf den Reaktionsverlauf und (4) unzureichende Beurteilung von Reaktion und Stofftransport in Zweiphasensystemen. Ein quantitatives Verständnis der kinetischen und thermodynamischen Phänomene geht dadurch verloren und erschwert die rationale Auslegung eines Prozesses. Deshalb wurde eine systematische Methodik entwickelt, um Enzymreaktionen mit dem Ziel einer Prozessoptimierung rational auszulegen. Zwei Reaktionen wurden wegen ihrer wirtschaftlichen Bedeutung gewählt: Die Cofaktorregenerierung durch Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii (FDH) und die Carboligation von Aldehyden durch Benzaldehydlyase aus Pseudomonas fluorescens Biovar I (BAL). Durch eine modellbasierte Analyse von Reaktionsanfangsraten und Verlaufskurven konnte erstmalig ein mechanistisches Modell für die FDH und BAL entwickelt werden. Das neue FDH-Modell lieferte im Vergleich zu dem formalkinetischen Literaturmodell deutlich bessere Vorhersagen. Das Modell für die BAL war ebenso in hervorragendem Einklang mit allen experimentellen Daten. Anschließend wurde der Einfluss der Reaktionsbedingungen auf jeden unabhängigen kinetischen Parameter mathematisch modelliert. Diese thermodynamischen Gleichungen wurden mit dem kinetischen Modell gekoppelt und das kombinierte Modell wurde anhand von Verlaufskurven beurteilt. Dies führte letztendlich zu hervorragenden Modellvorhersagen in einem weiten Bereich (20-55°C, I = 25-400 mM, pH 7,2-10,4, 5-45% (v/v) DMF), selbst wenn mehr als ein Einflussfaktor variiert wurde. Da wässrig-organische Zweiphasensysteme die enzymatische Umsetzung von hydrophoben Stoffen erleichtern können, wurde das Potential von Hexan und Methylisobutylketon (MIBK) untersucht. Die Ermittlung der intrinsischen Enzymkinetik kann im Zweiphasensystem durch den Stofftransport verfälscht werden. Um dieses Problem zu überwinden, wurden die Reaktionsbedingungen rational optimiert, wodurch der resultierende Fehler erfolgreich auf unter 2,2% gedrückt werden konnte. Reaktionsanfangsraten deuteten auf identische Modellparameter im Vergleich zum Einphasensystem hin, woraus geschlossen werden konnte, dass die Enzymkinetik im Zweiphasensystem unverändert bleibt. Diese Schlussfolgerung konnte durch die Analyse von vier Verlaufskurven und einer dimensionslosen Kennzahl (Hatta-Zahl) bestätigt werden. Eine modellgestützte Optimierung der Reaktionsbedingungen (z.B. T, pH, Grenzfläche) wurde nachfolgend durchgeführt, um die Raum-Zeit-Ausbeute (RZA) zu maximieren. Bemerkenswert war, dass die genauen Werte von Reaktionsdauer, Enzymkonzentration und Phasenverhältnis abhingen. Dies bedeutet, dass optimale Reaktionsbedingungen nur solange gültig sind, bis ein Prozess verändert wird. Basierend auf den in silico-Versuchen wurden zwei optimale Experimente in Puffer-MIBK durchgeführt. Im Vergleich zu Literaturdaten gelang es so, die Produktivität um das 4- bzw. 11-fache zu erhöhen. Zuletzt sind drei wichtige Ergebnisse aus biochemischer Sicht an dieser Stelle erwähnenswert: (1) Für effiziente Synthesen mit BAL sollte I auf den niedrigsten Wert eingestellt werden. (2) Die pH-Abhängigkeit der enzymatischen Aktivität ist durch DMSO beeinflusst. Als Konsequenz werden verschiedene pH-Maxima bei unterschiedlichem DMSO ermittelt. Dadurch können zum ersten Mal die anscheinend widersprüchlichen pH-Maxima (3 pH-Einheiten Unterschied) in der Literatur erklärt werden. (3) In diesem Zusammenhang konnte durch potentiometrische Tests die Behauptung gestützt werden, dass der Dissoziationszustand von Glu50 im aktiven Zentrum der BAL den Aktivitätsanstieg aus dem sauren Bereich heraus bestimmt und darüberhinaus durch DMSO beeinflusst wird. Zusammenfassend wurde im Gegensatz zu vergleichbaren Arbeiten ein Modell entwickelt, das neben T und pH auch I und DMF berücksichtigt und erwiesenermaßen auch in Puffer-Hexan und Puffer-MIBK gültig ist. Durch den modularen Aufbau der einzelnen Gleichungen kann diese Vorgehensweise auch auf andere Enzymsysteme übertragen werden und stellt eine systematische und leistungsfähige Methode dar, Enzymreaktionen für technische Anwendungen rational zu optimieren. Reaction engineering is a key aspect in the optimisation of chemical reactions. However biocatalysis faces a set of problems while implementing the interdisciplinary methods from biology, thermodynamics, and engineering science. Four issues are of mayor concern: (1) arbitrary simplifications in kinetic modelling, (2) subjective choice of optimal reaction conditions, (3) only a rudimentary knowledge of environmental conditions on the progress curve of enzymatic reactions and (4) lacking consideration of the complex interaction of reaction and mass transfer in two-phase systems. Owing to these problems, a quantitative physical understanding of the kinetic and thermodynamic phenomena dwindles away and impairs high productivities. Thus, a systematic methodology was developed within this thesis in order to rationalise enzymatic reactions with the aim of a process optimisation. Two enzyme reactions were investigated due to their commercial interest in the fine chemical industry: Formate dehydrogenase from Candida boidinii (FDH) and benzaldehyde lyase from Pseudomonas fluorescens Biovar I (BAL). For the first time a mechanistic kinetic model for both FDH and BAL was developed. The FDH model demonstrated a superior fit to experimental data in comparison to the literature model. The model for BAL was developed on the basis of elementary reaction steps as well. As a result a mechanistic kinetic model for BAL was published for the first time and exhibited a prediction ability which was in excellent agreement with all experiments. Subsequently, the influence of the process conditions was modelled as a function of temperature, pH, ionic strength and DMF content, which served as cosolvent for the hydrophobic reactands. These thermodynamic equations were coupled with the kinetic model and the resulting combined model was tested for progress curve prediction under different conditions. Demonstrating good prediction in all experiments the combined model was successfully validated in a wide range of conditions (20-55°C, 25-400 mM ionic strength, pH 7.2-10.4, 5-45% DMF (v/v)). Since two-phase systems facilitate the conversion of hydrophobic compounds, the potential of hexane and methyl isobutyl ketone (MIBK) was investigated. Due to the interaction of enzyme reaction and mass transfer the evaluation of the intrinsic kinetics in two-phase systems are difficult. In order to overcome the problem, reaction conditions were rationally optimised. Under the optimised conditions the error due to mass transfer was successfully lowered to 2.2% and smaller and could be neglected, consequently. Initial rate analysis in the optimised two-phase systems indicated identical intrinsic model parameters and it was concluded, that the enzyme kinetics are not changed as a result of the interphase or dissolved organic solvent molecules in the aqueous phase. This argumentation was supported by four progress curve measurments in buffer-hexan and by analysis of an absolute engineering measure: the Hatta number. A model-assisted optimisation of the reaction conditions (e.g. temperature, pH value, DMF content, interfacial area) was subsequently carried out to maximise space-time-yield (STY). Remarkably, the values depend systematically on reaction time, enzyme concentration and the volume ratio of a two-phase-system. As a result, the identified optimal reaction conditions holds only true as long as the process remains unchanged. Based on the in silico-tests two optimal experiments were performed in buffer-MIBK. In comparison to literare values the productivity could be increased by 4- and 11-fold, respectively. Finally, some of these findings and additional observations associated with this study were discussed from a biochemical view. Three important results are noted: (1) For an efficient synthesis with BAL the lowest possible ionic strength should be chosen. (2) The pH dependency of the enzymatic activity showed to depend on the DMSO concentration. As a result, different pH maxima are observed for varying DMSO concentrations. Now, the seemingly contrary pH maxima (3 units difference) could be elucidated by considering this correlation in respect to the activity of BAL. (3) In this respect the claim could be supported that glutamate in position 50 governs the acidic limb of the pH-activity profile by potentiometric tests.
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    ABSTRACT: Die Synthese pharmazeutisch relevanter (R)-Benzoine mit der Benzaldehydlyase ist nahezu ausschließlich für das wässrige Einphasensystem beschrieben, für welches die Auswahl hydrophober Substrate jedoch begrenzt und die Effizienz teils unzureichend ist. Zudem wirken sich häufig verwendete Löslichkeitsvermittler nachteilig sowohl auf die Enzymaktivität als auch auf die Produktqualität aus. In dieser Arbeit wurde ein gelstabilisiertes Zweiphasensystem entwickelt, welches den Einsatz der rekombinant hergestellten Benzaldehydlyase aus Pseudomonas fluorescens in organischen Lösungsmitteln und somit die enzymatische Herstellung neuartiger, stark hydrophober (R)-Benzoine ermöglichte. Die homogen gereinigte Benzaldehydlyase wurde hierzu in eine PVA-Matrix immobilisiert und für die Carboligation aromatischer bzw. heterozyklischer Aldehyde in n-Hexan eingesetzt. Der Umsatz der Aldehyde ohne Optimierung des Systems betrug bereits bis zu 77% und der Enantiomerenüberschuss der synthetisierten (R)-Benzoine lag überwiegend bei >99%. Mit dem gelstabilisierten Zweiphasensystem konnten für die (R)-2,2’-Furoin-Synthese wesentlich höhere Produktivitäten als mit einem in der Literatur beschriebenen, wässrigen Einphasensystem erzielt werden. Stellvertretend wurde die (R)-3,3’-Furoin-Synthese untersucht und optimiert, wodurch die Umsätze für 3-Furaldehyd auf 90% gesteigert werden konnten. Die Verwendung eines eigens für dieses Zweiphasensystem entwickelten, kontinuierlich betriebenen Wirbelschichtreaktors führte zu einer Verbesserung der Produktextraktion und somit zu einer höheren Raum-Zeit-Ausbeute sowie zu einer Verminderung unerwünschter Nebenreaktionen. Des Weiteren wurden die physikochemischen Eigenschaften des gelstabilisierten Zweiphasensystems untersucht. Die 9%ige PVA-Matrix erwies sich als äußerst druckfest und elastisch. Selbst ein langzeitiger Kontakt mit organischen Lösungsmitteln hatte nahezu keinen Einfluss auf die Stabilität der PVA-Immobilisate. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Enzymverteilung in den kugelförmigen Immobilisaten homogen war und Proteine ab einer Molekülmasse von 154 kDa vollständig in der PVA-Matrix zurückgehalten wurden. Die Bestimmung der substratspezifischen Verteilungskoeffizienten für das gelstabilisierte Zweiphasensystem erfolgte neben n-Hexan auch für weitere organische Lösungsmittel, wobei auch die Substratdiffusion gemessen wurde. The synthesis of pharmaceutically relevant (R)-benzoins catalyzed by the benzaldehyde lyase is almost exclusively described for aqueous monophasic systems. In such systems the number of convertible hydrophobic substrates is limited, the turn over number is partly unsatisfactory and additives which are commonly used for the improvement of the substrate solubility have a negative influence on the enzyme activity and the product quality. This thesis describes the development of a gel-stabilized two-phase system that enabled the application of the recombinantly produced benzaldehyde lyase derived from Pseudomonas fluorescens in organic solvents for the synthesis of novel, strongly hydrophobic (R)-benzoins. The benzaldehyde lyase was homogeneously purified and immobilized into a PVA matrix for the carboligation of hydrophobic, aromatic or heterocyclic aldehydes in n-hexane. The conversion of the different aldehydes was already up to 77% without prior optimization of the system. (R)-benzoins were synthesized with an enantiomeric excess of predominantly >99%. With respect to the (R)-2,2'-furoin synthesis the enzyme productivity was considerably higher with the gel-stabilized system than with an aqueous monophasic system described in the literature. Furthermore the gel-stabilized two-phase system was investigated and optimized for the synthesis of (R)-3,3-furoin whereas the conversion of 3-furaldehyde was increased to 90%. The product extraction could be improved in a specially engineered, continuously operating fluidized-bed reactor whereby the space-time yield was increased and unwanted side reactions were minimized. Furthermore the physico-chemical properties of the system were investigated. The 9% containing PVA matrix was highly compression-proof and elastic. Even the contact of organic solvents did nearly not influence the stability of the PVA immobilizates. Homogeneous partition of the enzyme in the round-shaped immobilizates was proven. Proteins with a molecule mass of more than 154 kDa were completely retained by the matrix. Besides for n-hexane the substrate specific partition coefficient and diffusion were determined for others solvents as well.
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