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DIAS, L. L. C.; SANTA-CATARINA, C.; FLOH, E. I. S.; SILVEIRA, V. Proteômica comparativa
aplicada à cultura de tecidos de plantas. Revista Brasileira de Horticultura Ornamental,
2007. v. 13. p. 2002-2008.
2002
PROTEÔMICA COMPARATIVA APLICADA À CULTURA DE TECIDOS DE
PLANTAS.
Dias, Leonardo L. C.1; Floh, Eny I. S.1; Santa-Catarina, Claudete1; Silveira, Vanildo2
1Laboratório de Biologia Celular de Plantas (BIOCEL), Departamento de Botânica, Instituto
de Biociências/USP. São Paulo-SP; 2Laboratório de Biotecnologia (LBT), Centro de
Biociências e Biotecnologia (CBB), Universidade Estadual do Norte Fluminense (UENF),
Avenida Alberto Lamego, 2000. Parque California. CEP 28013-602. Campos dos
Goytacazes-RJ. E-mail: vanildo@uenf.br.
INTRODUÇÃO
Nas últimas décadas os códigos genéticos de diversos organismos foram
completamente seqüenciados, representando um importante avanço do
conhecimento na área genômica. No contexto das “ômicas” grande ênfase tem-se
dado para a genômica funcional, que visa a identificação da seqüência e função dos
genes e proteínas através de estudos do transcriptoma e proteoma dos organimos
vivos (Figura 1).
Figura 1. Organograma dos estudos das “ÔMICAS”
nos organimos vivos. A genomica funcional refere-se
aos estudos do transcriptoma e proteoma.
Embrora a proteômica tenha ganhado destaque nos últimos anos, o termo
Proteoma é relativamente novo e refere-se ao conjunto de proteínas expressas pelo
genoma de um organismo num dado momento ou condição (Wasinger et al., 1995).
Neste contexto, a proteômica é a ciência que estuda sistematicamente um proteoma
(Park, 2004), permitindo avaliações quantitativas e qualitativas de proteínas que
atuam no metabolismo celular (Chen & Harmon, 2006). Conseqüentemente, a
identificação de proteínas expressas diferencialmente permite a associação destes
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polipeptídeos com diferentes eventos fisiológicos que ocorrem nas células, tecidos e
órgãos (Korkumat et al., 2006).
A proteômica possui diversas aplicações como: 1) estudo da expressão
diferencial de proteínas, que pode fornecer importantes informações sobre a
sinalização celular e desenvolvimento dos organismos; 2) estudo de modificações
pós-traducionais; 3) estudos de interação proteínas-proteínas e suas possíveis
aplicações no desenvolvimento de mecanismos de defesa; 4) estudo da proteômica
estrutural que visa o estudo da composição protéica de organelas e membranas; 5)
estudo da função das proteínas através da proteômica funcional e; 6) proteômica
computacional, que visa estudos de modelagem e dinâmica das proteínas (Figura
2).
Figura 2. Tipos e aplicações de estudos em proteômica em diferentes sistemas biológicos.
A dinâmica de proteínas em um sistema vivo é influenciada por diversos
fatores internos e externos que determinam modificações estruturais e a
conformação das proteínas. Neste sentido, o estudo e caracterização de mapas
proteômicos apresentam-se como uma importante ferramenta complementar aos
estudos de genômica. A análise proteômica oferece a oportunidade de examinar
simultaneamente alterações e classificar padrões temporais de acúmulo de
proteínas que ocorrem durante o desenvolvimento da semente, possibilitando a
identificação de proteínas marcadoras estádio específicas (Dias et al., 2007; Silveira
et al., 2007). Nos últimos anos vários estudos têm enfocado a caracterização da
dinâmica de proteínas ao longo do desenvolvimento vegetal, associada à
caracterização do genoma e transcriptoma (Roberts, 2002; Heazlewood & Millar,
2003; Chen & Harmon, 2006; Rossignol et al., 2006).
Avaliações da expressão gênica em nível do transcriptoma fornecem
informações importantes sobre carga genética transcrita de um organismo em um
determinado estado, entretanto, ela não reflete diretamente a expressão das
proteínas deste organismo (Chen & Harmon, 2006). Vários mecanismos estão
envolvidos no controle da síntese protéica, mecanismos estes que atuam desde a
transcrição do gene até a obtenção da proteína na forma ativa (Figura 3). Durante a
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síntese protéica podem ocorrer modificações pós-transcricionais e pós-traducionais
alterando conformação espacial de proteínas e gerar diferentes classes protéicas,
as quais bioquimicamente e estruturalmente que podem desempenhar diferentes
funções nas vias metabólicas e na composição do proteoma do organismo.
Figura 3. Mecanismos de controle que atuam na síntese protéica. Estes mecanismos fazem
com que um único gene dê origem a múltiplas proteínas com conformações e funções
distintas.
PROTEÔMICA EM PLANTAS
Os estudos proteômicos em plantas foram iniciados com milho (Touzet et al.,
1996) e Arabidopsis thaliana (Shanoun et al., 2000). De acordo com os trabalhos
iniciais, as análises proteômicas em plantas foram divididas em duas categorias: 1)
estudo do proteoma específico de determinados órgãos ou tecidos e conseqüente
elaboração de mapas proteômicos de referência e; 2) análise proteômica
comparativa de diferentes proteomas (Rose et al., 2004). Este último ainda pode ser
dividido de acordo com o objetivo do estudo em: 1) avaliação entre diferentes
genótipos; 2) avaliação da influência da aplicação de sinais no metabolismo vegetal,
como por exemplo a adição ou supressão de reguladores de crescimento e; 3)
comparação entre diferentes tecidos e/ou estádios de desenvolvimento vegetal.
Atualmente, uma das maiores dificuldades da proteômica vegetal é a
capacidade de identificação de proteínas de espécies, cujos genomas ainda não
foram seqüenciados. A identificação e caracterização de proteínas são aceleradas
pela disponibilidade de seqüências genômicas e de seqüências expressas (EST,
Expressed Sequence Tags). Para contornar os problemas de falta de seqüências
genômicas, duas são as alternativas possíveis: 1) através de seqüências ESTs
disponíveis, as proteínas podem ser identificadas por seqüências de peptídeos
obtidas por MS/MS, mas é altamente dependente do tamanho e qualidade dos
bancos de dados de ESTs e; 2) outro caminho seria realizar buscas baseadas na
homologia com proteínas de outras espécies vegetais, preferencialmente usando-se
seqüências obtidas de MS/MS ou seqüencimento de Edman.
Em geral, a maioria absoluta dos trabalhos em proteômica comparativa em
plantas utilizam a interface que consiste principalmente na separação das proteínas
através de eletroforese bidimensional (2-DE) em gel de poliacrilamida (2D-PAGE)
com posterior identificação da proteína por espectrometria de massas
(MS/MS)(Figura 4).
A 2-DE é um poderoso e amplo método de análise de misturas complexas
de proteínas extraídas de células, tecidos e outros materiais biológicos. A 2-DE
separa as proteínas em dimensões distintas, em que na primeira dimensão as
proteínas são separadas de acordo com seus pontos isoelétricos (pI) e na segunda
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dimensão estas são separadas de acordo com suas massas moleculares. Mesmo
com as limitações inerentes da técnica, em estudos de proteômica comparativa em
que o objetivo é identificar diferenças quantitativas e qualitativas entre amostras de
proteínas, a 2-DE é normalmente o método de escolha, e gera dados em um
formato que possibilita uma fácil avaliação visual e fornece comparação
fisicoquímicos e quantitativos (Cánovas et al., 2004).
Figura 4. Etapas da análise proteômica em plantas, usando a interface eletroforese
bidimensional (2D-PAGE) e espectrometria de massas MS/MS.
Atualmente a 2-DE tem sido amplamente utilizada em resultado de inúmeros
avanços nas metodologias. O uso de gradientes imobilizados de pH (IPG) na
isofocalização e a otimização no processo de aplicação das amostras têm permitido
a utilização de quantidades cada vez menores de proteínas (Cánovas et al., 2004).
Em plantas o preparo da amostra também merece preocupação e trata-se de
uma etapa crítica e absolutamente essencial para a obtenção de bons resultados.
Neste sentido, especial atenção deve ser destinada ao preparo inicial da amostra,
em que diferentes métodos de extração podem ser testados e utilizados para isolar
e fracionar as proteínas dos materiais vegetais (Carpentier et al., 2005; Natarajan et
al., 2005)
Os tecidos vegetais possuem grande quantidade de água e baixa relação
proteína/matéria fresca, além de possuir substâncias que interferem na análise
protéica, como compostos fenólicos, enzimas proteolíticas e oxidativas, terpenóides,
pigmentos, ácidos orgânicos, íons inibitórios e carboidratos. Após a extração,
geralmente as proteínas são precipitadas em soluções salinas, tamponantes e/ou
solventes orgânicos, visando a eliminação da maioria dos interferentes (Carpentier
et al., 2005).
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A seleção da solução extratora ideal, aquela que solubiliza a maior
quantidade de proteínas, depende de cada espécie, tecido e das proteínas de
interesse. As diferentes soluções extratoras possuem afinidades com classes
específicas de proteínas, o que permite uma extração diferencial de acordo com o
método utilizado (Carpentier et al., 2005). Os métodos mais utilizados para extração
de proteínas totais em céluas e tecidos vegetais utilizam soluções caotrópicas,
geralmente a base de uréia e tiouréia ou diretamente com ácido tricloroacético
(TCA)/Acetona (Carpentier et al., 2005; Natarajan et al., 2005; Saravanan & Rose,
2004) seguido de pelo menos um método de precipitação para a concentração das
proteínas e a eliminação dos interferentes (Carpentier et al., 2005).
PROTEÔMICA COMPARATIVA E CULTURA DE TECIDOS DE PLANTAS
O uso da biotecnologia em muitas espécies vegetais depende de protocolos
de regeneração in vitro a partir da cultura de células e/ou de tecidos de plantas. No
sentido de viabilizar a cultura de tecidos de plantas, a proteômica comparativa
apresenta-se como uma importante ferramenta no estudo e controle dos processos
morfogenéticos in vitro.
O uso de proteínas como marcadores para o monitoramente e compreensão
de diferentes fases do desenvolvimento da planta in vitro, seja via organogênese ou
embriogênese somática, apresenta-se como uma das principais alternativas para a
otimização destes processos in vitro.
Na cultura de tecidos vegetais, os estudos proteômicos comparativos vem
sendo utilizados principalmente no sistema de embriogênese somática. Neste
contexto, padrões protéicos vêm sendo utilizados como marcadores da competência
das culturas embriogênicas, onde são observadas diferenças significativas nos
perfis protéicos de tecidos embriogênicos e não embriogênicos (Kormutak &
Vookova, 1997; Moraes et al., 2006).
Na embriogênese somática uma melhor compreensão dos fatores
associados a embriogênese em plantas também pode ser obtida na interface entre
os modelos de embriogênese somática e embriogênese zigótica (Silveira et al.,
2007). Durante o desenvolvimento embrionário, a deposição de substâncias de
reserva é um processo chave, fornecendo os compostos que serão usados desde
os estádios iniciais do desenvolvimento até a autotrofia, após a germinação (Merkle
et al., 1995).
As proteínas estão entre as principais substâncias de reserva acumuladas
durante o desenvolvimento embrionário (Bewley & Black, 1994). Na embriogênese
zigótica, o aumento no conteúdo de proteína ocorre como resultado da síntese de
proteínas de reserva e proteínas LEA (“late embryogenesis abundant”). As proteínas
LEA têm grande afinidade com as moléculas de água, atuando na proteção à
desidratação da semente (Bewley & Black, 1994). As proteínas de reserva são
utilizadas como fonte de nitrogênio no desenvolvimento e germinação do embrião,
sendo divididas em quatro classes de acordo com a sua solubilidade: (a) albuminas,
solúveis em água ou em tampão de pH neutro, (b) globulinas, solúveis em soluções
salinas e insolúveis em água, (c) glutelinas, solúveis em ácido diluído ou em
soluções alcalinas e (d) prolaminas, solúveis em álcoois (Shewry et al., 1995).
Em Helianthus annus, as deidrinas e outros dois grupos de LEA, além de
outras proteínas de baixo peso molecular, foram identificadas durante a dormência
dos embriões (Garello et al., 2000). Campalans et al. (2000) estudando os eventos
moleculares envolvidos na aquisição de tolerância à desidratação, observou a
indução de novos polipeptídeos durante a desidratação de embriões de Prunus
amygdalus. Como resposta à ação do ABA e do estresse osmótico que ocorre no
embrião maduro, foram identificadas as proteínas tipo deidrinas, LEA e outras
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(Campalans et al., 2000), que têm sido utilizadas como marcadores das diferentes
fases desses processos (Garello et al., 2000).
Finalmente, a proteômica comparativa aplicada a cultura de tecidos de
plantas apresenta um grande potencial de aplicação para controle, viabilização e
otimização dos processos morfogenéticos in vitro. A identificação de proteínas
diferencialmente expressas durante o desenvolvimento vegetal configura-se como
um potente marcador molecular do metabolismo em plantas, podendo fornecer
informações importantes sobre a competência e grau de evolução da morfogênese
in vitro. Estudos em proteômica comparativa são essenciais e complementares aos
estudos de Bioquímica e Biologia Celular, Morfologia e Fisiologia Vegetal que
tradicionalmente são realizados para monitoramento e otimização dos protocolos de
cultura de tecidos de plantas.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BEWLEY, J.D.; BLACK, M. Seeds: physiology of development and germination,
2ª ed., New York:Plenum Press, p. 445, 1994.
CAMPALANS, A.; PAGÈS, M.; MESSEGUER, R. Protein analysis during almond
embryo development. Identification and characterization of a late embryogenesis
abundant protein. Plant Physiology and Biochesmistry, v. 38, p. 449-457, 2000.
CÁNOVAS, F.M.; DUMAS-GAUDOT, E.; RECORBET, G.; JORRIN, J.; MOCK, H.P.;
ROSSIGNOL, M. Plant proteome analysis. Proteomics, v. 4, p. 285-298, 2004.
CARPENTIER, S.C.; WITTERS, E.; LAUKENS, K.; DECKERS, P.; SWENNEN, R.;
PANIS, B. Preparation of protein extracts from recalcitrant plant tissues: An evalution
of different methods for two-dimensional gel electrophoresis analysis. Proteomics,
v. 5, p. 2497-2507, 2005.
CHEN, S.; HARMON, A.C. Advances in plant proteomics. Proteomics, v. 6, p.
5504-5516, 2006.
DIAS, L.L.C.; SILVEIRA, V.; SANTA-CATARINA, C.; BALBUENA, T.S.; FLOH, E.I.S.
Comparative analysis of the two-dimensional gel electrophoresis patterns during
seed development in Ocotea catharinensis. Proteomics, (submetido). 2007.
GARELLO, G.; BARTHE, P.; BONELLI, M.; BIANCO-TRINCHANT, J.; BIANCO, J.;
PAGE-DEGIVRY, M.L. Abscisic acid-regulated responses of dormant and non-
dormant embryos of Helianthus annuus: role of ABA-inducible proteins. Plant
Physiology and Biochemistry, v. 38, p. 473-482, 2000.
HEAZLEWOOD, J.L.; MILLAR, A.H. Integrated plant proteomics – putting green
genomes to work. Functional Plant Biology, v 30, p. 471-482, 2003.
KORMUTÁK, A.; SALAJ, T.; VOOKOVÁ, B. Storage protein dynamics in zygotic and
somatic embryos of white fir. Biologia Bratislava, v. 61, p. 479-485, 2006.
KORMUTÁK, A.; VOOKOVÁ, B. Biochemical variation between non-embryogenic
and embryogenic calli of siver fir. Biologia Plantarum, v. 39, p.125-130, 1997.
2008
MERKLE, S.A.; PARROTT, W.A.; FLINN, B.S. Morphogenic aspects of somatic
embryogenesis. In: THORPE, T.A. (ed.) In vitro embryogenesis in plants, Kluwer
Academic Publishers, Dordrecht, p. 155-203, 1995.
MORAES, F. M. DE S.; SOUSA, M. V.; SANTA-CATARINA, C.; FLOH, E.I.S.;
RICART, C. A. O. Two-dimensional electrophoresis analysis of Ocotea catharinensis
during somatic embryogenesis and embryogenic competence acquisition. In: XXXV
Reunião Anual da SBBq. Águas de Lindóia. Anais da... v. 1, p. W-19, 2006.
NATARAJAN, S.; XU, C.; CARPENA, T.J.; GARRETT, W.M. Comparison of protein
solubilization methods suitable for proteomic analysis of soybean seed proteins.
Analytical Biochemistry, v. 342, p. 214-220, 2005.
PARK, O.K. Proteomic Studies in Plants. J. Bioch. Mol. Biol., v. 37, p. 133-138,
2004.
ROBERTS, J.K.M. Proteomics and a future generation of plant molecular biologists.
Plant Molecular Biology, v. 48, p. 143-154, 2002.
ROSE, J.K.C.; BASHIR. S.; GIOVANONI. J.J.; JAHN, M.M.; SARAVANAN, R.S.
Tackling the plant proteome: practical approaches, hurdles and experimental tools.
The Plant Journal, v. 39, p. 715-733, 2004.
ROSSIGNOL, M.; PELTIER, JB,; MOCK, H.P.; MATROS, A.; MALDONADO, A.M.;
JORRIN, J. Plant proteome analysis: a 2004 2006 update. Proteomics, v. 6, p.
5529-5548, 2006.
SAHNOUN, I.; DÉHAIS, P.; MONTAGU, M.V.; ROSSIGNOL, M.; ROUZÉ, P.
PPMdb: a plant plasma membrane database. J. Biotechnology, v. 78, p. 235-246,
2000.
SARAVANAN, R.; ROSE, J.K.C. A critical evalution of sample extraction techniques
for enhanced proteomic analysis of recalcitrant plant tissues. Proteomics, v. 4, p.
2522-2532, 2004.
SHEWRY, P.R.; NAPIER, J.A.; TATHAM, A.S. Seed storage proteins: structures and
biosynthesis. Plant Cell, v. 7, p. 945-956, 1995.
SILVEIRA, V.; SANTA-CATARINA, C.; BALBUENA, T.S.; MORAES, F.M.S.;
RICART, C.A.O; SOUSA, M.V.; GUERRA, M.P.; HANDRO, W.; FLOH, E.I.S.
Endogenous abscisic acid levels and comparative proteome during seed
development of Araucaria angustifolia (Bert.) O. Ktze. Biologia Plantarum, (no
prelo), 2007.
TOUZET, P.; RICCARDI, F.; MORIN, C.; DAMERVAL, C.; HUET, J.C.;
PERNOLLET, J.C.; ZIVY, D.; DEVIENNE, D. The maize two dimensional gel protein
database: towards an integrated genome analysis program. Theor. App. Genet., v.
93, p. 997-1005, 1996.
WASINGER, V.C.; CORDWELL, S.J.; CERPA-POLJAK, A.; YAN, J.X.; GOOLEY,
A.A.; WILKINS, M.R.; DUNCAN, M.W.; HARRIS, R.; WILLIAMS, K.W.; HUMPHERY-
SMITH, I. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma
genitalium. Electrophoresis, v. 16, p. 1090-1094, 1995.
... The field of plant proteomics has grown and accumulated information on molecular biological issues. In plant tissue culture studies, for example, this science is an important tool in the assessment and control of in vitro morphogenetic processes [7]. The application of proteomics regarding genetic plant improvements can also evaluate proteins responsive to biotic or abiotic effects [8]. ...
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Diabetes mellitus (DM) is a metabolic syndrome and is mainly characterized by chronic hyperglycemia. In DM, developing diabetic nephropathy is a major complication. Several studies have shown that Aloe vera (AV) exerts beneficial effects on DM. Proteomic analysis has long been used to systematically study the group of proteins that are being expressed in a given situation. Therefore, in this study, we aimed to evaluate the effect of butanolic fraction of AV (ABF) on the kidneys of type 1 DM rats through proteomic analysis, in order to elucidate the protective mechanism of AV. The streptozotocin-induced diabetic model in male Wistar rats was used. We verified that the hypoglycemic effect of ABF lasted up to 6h after administration. Through proteomic analysis, 36 proteins related to DM were identified with statistical differences between control and diabetics without treatment groups. Thereafter, to verify the results of ABF and insulin, a new statistical analysis was performed considered the treated groups. ABF treatment exerted a beneficial effect by altering the expression of nine of these proteins, among which six of them showed interaction with each other as presented in the string map (10-kDa heat shock, cytochrome P450 2C23, L-lactate dehydrogenase B chain, fructose-bisphosphate aldolase A, transaldolase and cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit beta). In conclusion, AV modulated proteins related to mitochondrial function, vascular system and glycolysis/pentose pathway in diabetes situation and these results provide further insights and understanding of the possible molecular mechanisms by which AV may lead to the establishment of treatment and prevention methods for DM-associated kidney damage.
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Ocotea odorifera é uma espécie nativa da Mata Atlântica, com características recalcitrantes, que se encontra em risco de extinção devido a sua exploração econômica. Técnicas baseadas na biotecnologia podem ser utilizadas para o processo de conservação e reintrodução no seu ambiente natural de espécies ameaçadas de extinção. Dentre as técnicas biotecnológicas, a embriogênese somática (ES) vem sendo utilizada com bastante sucesso em programas de melhoramento genético e conservação de germoplasma de espécies arbóreas. Contudo, para o estabelecimento de protocolos eficientes de ES são necessários estudos básicos de fisiologia e bioquímica do desenvolvimento da semente e da germinação, para que as condições in vivo possam ser recriadas de forma eficiente in vitro. O objetivo deste trabalho foi avaliar as variações no conteúdo endógeno de aminoácidos, PAs, AIA, ABA e estabelecer marcadores protéicos durante a germinação de sementes de O. odorifera. As sementes foram germinadas em substrato de vermiculita em fotoperíodo de 16h a 27°C. A seguir, coletadas após 0, 15, 30 e 45 dias de semeadura. Foi observado que: a) o conteúdo de aminoácidos aumentou durante o processo germinativo. A asparagina foi observada em maior quantidade e predominou durante todo o período analisado. A metionina e a ornitina, precursores das PAs, e o triptofano, precursor do AIA, aumentaram ao longo do processo germinativo; b) o conteúdo total de PAs decresceu nos últimos 15 dias de avaliação. Neste período, as poliaminas conjugadas apresentaram aumento indicando possível relação entre conjugação e disponibilidade de PAs nas células; c) a relação Put/(Spm+Spd) diminui ao final do período analisado enquanto no mesmo período a Spm foi a PA livre mais abundante indicando relação entre Spm e alongamento celular; d) O AIA apresentou aumento ao logo do processo germinativo, ao mesmo tempo em que a queda no conteúdo de ABA pode ser observada; e) o conteúdo de proteínas decresceu ao longo do processo germinativo. Os perfis protéicos diferiram pouco entre os estádios analisados. Entretanto, foi observada variação significativa na abundância (% de volume) em 39 spots, que foram definidos como marcadores do processo germinativo. Dentre esses spots incluem-se 26 que reduziram e 2 spots que aumentaram suas abundâncias ao longo do processo germinativo, 10 que apresentaram tanto aumento quanto diminuição durante o período observado e apenas 1 exclusivo da semente madura. Estes resultados abrem perspectivas para a avaliação de parâmetros fundamentais para a otimização de protocolos de ES e permitiram uma maior compreensão das variações endógenas dos diferentes compostos citados no processo germinativo das sementes de O. odorifera. Ocotea odorifera is a native tree from the Atlantic Forest with recalcitrant features that is in risk of extinction because its economical exploration. Techniques based on biotecnology can be used for the conservation and reintroduction process of species in risk of extinction in their natural environment. Between these biotecnologycal techniques, the somatic embryogenesis (SE) have been used sucessfully in programs of genetic breeding and tree germoplasm conservation. However, basic studies of physiology and biochymical of the seed development and germination are necessary for the establishment of efficient protocols of SE. Thus, these condictions in vivo can be recriated in vitro. The aim of this work was to evaluate the variations in the endogenous content of amino acids, polyamines, IAA, ABA and protein markers throughout the seed germination of O. odorifera seeds. The seeds were germinated on vermiculite substrate at 27°C and 16h of photoperiod and collected after 0, 15, 30 e 45 days of sowing. It was observed that: a) the amino acids content increased troughout the germination process. Asparagine was the highest content sighted and prevailed during the period studied. Methionine and ornithine, polyamines precursors, and tryptophan, IAA precursor, increased troughout germination process; b) the total PAs content decreased in the last 15 days of evaluation. At the same period, conjugated PAs showed an increase, indicating a relation between conjugation and avalability of polyamines inside the cells; c) the Put/(Spm+Spd) relation decreased while the Spm was the most abundant free PA observed at the end of the period analyzed indicating a relation between Spm and celular elongation; d) IAA increased during all the process while a decrease of ABA was sigthed; e) protein content decreased troughout the period observed. The proteic profile didnt change a lot between the stages. Os perfis protéicos diferiram pouco entre os estádios analisados. Entretanto, foi observada variação significativa na abundância (% de volume) em 39 spots, que foram definidos como marcadores do processo germinativo. Among them, could be include 26 that decreased and 2 that decreased its abundances troughout the germinative process, 10 that both increased and decreased throughout the period analyzed and just 1 exclusive from mature seed. These results open perspectives to avaliation of fundamentals parameters to optmization of ES protocols and allow a better comprehension about the edogenous variation of the differents compounds citeds in the process of O. odorifera seeds germination.
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Somatic embryogenesis is the formation of an embryo from a cell other than a gamete or the product of gametic fusion. This is not an artificial phenomenon, and is known in nature as a form of apomixis called adventitious embryony, first described by Strasburger in 1878 [1] (see Sharma and Thorpe, this volume). Although Steward [2] and Reinert [3] are generally given credit for the first descriptions of somatic embryogenesis in 1958, such credit might more properly belong to Levine [4], who in 1947 reported the recovery of carrot “seedlings” from tissues exposed to low levels of α-naphthaleneacetic acid, via a process whose description sounds very much like somatic embryogenesis.
Article
This paper describes the first maize database of proteins separated by two-dimensional electrophoresis. Fifty-six coleoptile proteins and 18 leaf proteins from two maize lines were partially microsequenced. Thirty-six proteins (49%) displayed high similarity with database proteins. Nine of these proteins, representing five different functions, had never been described in maize. No conclusive function could be found for 45 polypeptides (61% of the microsequenced proteins). In addition, an alternative identification method, based on amino acid analysis, allowed candidates to be proposed for 17 proteins out of 44 additional proteins analyzed in the coleoptiles. These results are stored in a database which also includes, when available, genetic information about the chromosomal location of structural genes and regulatory factors of proteins. This database is being used in the context of a project on the genetic mapping of the expressed genome in maize.
Article
Protein analysis has been at the heart of plant science for many years, but with new questions emerging from an abundance of genomic information and further improvements in technology, there are now new opportunities to undertake large-scale analyses and to move to more complex systems than has been possible previously. This explosion of interest and data is often referred to simply as proteomics, which is the study of the complete set of proteins expressed at a given time and place, the proteome. As its name suggests proteomics is intricately linked to allied technologies such as genomics, transcriptomics and metabolomics. In this review of plant proteomics we outline a series of issues that face the practical user, particularly the largest problem that currently faces researchers, the myriad of options to choose from. The choices, problems and pitfalls of entering into gel-based and non-gel-based arraying techniques are discussed together with advances in pre-fractionation of samples, liquid chromatography separations and subcellular analyses. Issues relating to mass spectrometry analysis and the eventual protein identification are outlined, and the dilemmas of data storage and analysis are highlighted. During this tour we provide a series of references to the literature — experimental, theoretical and technical — to illustrate the breadth of current investigations using these techniques.
Article
Comparative study on SDS-protein profiles and isoenzyme composition of non-embryogenic and embryogenic calli in two callus lines of silver fir (Abies alba Mill.) revealed the presence of abundant polypeptide fractions and an increased number of isoperoxidases in non-embryogenic calli. Non-specific esterase, on the other hand, exhibited an opposite tendency, while glutamate dehydrogenase was the only enzyme system consisting uniformly of one isoenzyme band in both types of calli investigated.
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Composition and accumulation patterns of storage proteins in female gametophyte and embryos of the white fir (Abies concolor) were investigated during embryogenesis and germination of mature seeds using SDS-PAGE and immunological approach. Altogether 9 major and minor protein components with molecular masses of 14, 16, 22, 24, 27, 30, 35, 38, and 43 kDa were detected in female gametophytes and 9 protein bands in the embryos with the molecular sizes of 14, 16, 22, 24, 25, 27, 34, 38, and 43 kDa. The species seems to deviate in this respect from other representatives of Pinaceae. A conspicuous increase of storage protein synthesis was observed at the stage of fully cellularized female gametophytes and at the cotyledonary stage of embryo development. There exists a high degree of similarity between storage protein profiles of white fir zygotic and somatic embryos. Successive stages of somatic embryogenesis exhibited a high degree of similarity of storage proteins except for cotyledonary stage when a noticeable increase in storage protein synthesis was registered. Conversely, during germination of somatic embryos, an overwhelming majority of storage proteins was depleted.
Article
PPMdb is a proteome database dedicated to proteins from plant plasma membranes. It provides comprehensive two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2-D PAGE) maps, partial amino acid sequences and expression data. All this information is gathered and structured in a relational database, after being analyzed and annotated. PPMdb includes active links to related biological databases (EMBL, GenBank, GenPep, and SWISS-PROT and TrEMBL) as well as to MEDLINE abstracts. Information on specific protein spots can be displayed by clicking on the 2-D maps. In addition, users can query the database by accession number, protein name, pI and MW, and cellular location. Access to PPMdb is available at the following URL: http://sphinx.rug.ac.be:8080.
Article
The expression pattern of proteins was analysed during late embryogenesis in almond (Prunus amygdalus) to obtain information on the molecular events leading to the acquisition of the embryo desiccation tolerance. Analysis of the ABA content in developing embryos revealed high levels at 50 DAF with a rapid decrease at the onset of desiccation. Two-dimensional electrophoresis of proteins showed that at least ten different polypeptides were induced by dehydration of the embryos. By immunoscreening of a mature embryo cDNA expression library, the ABA inducible Parab21 cDNA (for P. amygdalus responsive to ABA) encoding for a highly phosphorylated protein was isolated and characterized. Parab21 belongs to the LEA-D11 protein family, and contains all the protein motifs characteristic for the RAB/dehydrin group of proteins. The Parab21 mRNA is expressed during late embryogenesis and is also inducible by water deficit and ABA treatment in vegetative tissues. Southern blotting and mapping data are consistent with a single Parab21 gene in the almond genome although other immunologically-related proteins have been detected suggesting that a complex family of RAB/dehydrin-related genes will be involved in desiccation tolerance in almonds.
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Embryos of Helianthus annuus L. became dormant 3 weeks after anthesis and their dormancy was lifted during storage in dry conditions. The objectives of this study were to investigate changes in the pattern of soluble proteins associated with the release of embryo dormancy. Sunflower dehydrins and group 3 late embryogenesis-abundant (LEA) proteins were studied in developing embryos. Three dehydrins (17, 21 and 26 kDa) and two group 3 LEA polypeptides (17 and 23 kDa) appeared during dormancy induction. Their levels remained steady until maturity. After imbibition, these polypeptides disappeared within 24 h except for the 23-kDa protein whose levels remained stable for a further 4 d, whatever the culture condition. Analysis of radiolabelled proteins by two-dimensional gel electrophoresis revealed that among dormancy-associated proteins other than dehydrin and group 3 LEA, several low molecular mass (18, 19, 20 and 21 kDa) proteins were expressed in dormant embryos but not detected in non-dormant embryos. After a treatment with fluridone, which inhibits ABA synthesis, or with GA3, which allows germination to occur, the 19-kDa protein could not be detected. In contrast, application of ABA to non-dormant embryos arrested germination and enhanced the synthesis of the 18- and 21-kDa proteins, but not that of the 19- and 20-kDa polypeptides. These results demonstrate that steady-state levels of specific proteins change during early imbibition of dormant and non-dormant sunflower embryos and indicate that these changes may be associated with differential gene expression responsible for the maintenance of dormancy.
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A protein map of the smallest known self-replicating organism, Mycoplasma genitalium (Class: Mollicutes), revealed a high proportion of acidic proteins. Amino acid composition was used to putatively identify, or provide unique parameters, for 50 gene products separated by two-dimensional gel electrophoresis. A further 19 proteins were subjected to peptide-mass fingerprinting using matrix-assisted laser desorption ionisation-time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry and 4 were subjected to N-terminal Edman degradation. The majority of M. genitalium proteins remain uncharacterised. However, the combined approach of amino acid analysis and peptide-mass fingerprinting allowed gene products to be linked to homologous genes in a variety of organisms. This has allowed proteins to be identified prior to detection of their respective genes via the M. genitalium sequencing initiative. The principle of 'hierarchical' analysis for the mass screening of proteins and the analysis of microbial genomes via their protein complement or 'proteome' is detailed. Here, characterisation of gene products depends upon the quickest and most economical technologies being employed initially, so as to determine if a large number of proteins are already present in both homologous and heterologous species databases. Initial screening, which lends itself to automation and robotics, can then be followed by more time and cost intensive procedures, when necessary.