Chromatic alteration on marble surfaces analysed by molecular biology tools

Abstract

The patina represents a superficial natural alteration of the constituting matter of the work of art. It emerges from the natural and usual stabilization process that the materials of the surface undergo because of the interaction with outdoor agents characterizing the surrounding environment. Besides, it is not linked to an obvious phenomenon of degradation that can be noticed through the change in the original colour of the matter.
This is what we intend when we talk about biological patina usually generated by macro and/or micro-organic colonization (fungi, bacteria, alga) which contributes to surface bio-deterioration and thus lead to the formation of orange, red or even brown and dark pigmented areas. The presence of chromatic alterations (rose-coloured areas), as a consequence of bacterial colonization, was most particularly pointed out in different sites, such as in the marble slabs on the facades of both the Cathedral of Siena (Duomo di Siena) and the Certosa of Pavia. The present study shows an example of chromatic alteration of the surface of marble works due to bacterial colonization.

Full text

Conservation Science in Cultural Heritage! "/#$$"
1. Introduction
The surfaces of works of art exposed to a specific environment with which they inter-
act, are subject to a high number of exchanges and reactions leading to the creation of
the “natural patina” through the alteration of the surface. That definition already explains
its genesis and stands as the consequence of a natural phenomenon of surface alteration
of the matter. Cesare Brandi [1] defined patina as “that particular characterization of the
surface of a historical, cultural, artistic work deriving exclusively from the natural and
usual stabilization and modification process that the materials of the surface undergo
because of the interaction with outdoor agents characterizing the surrounding environ-
ment, in particular with the light energy, the air and its components, the temperature and
the humidity that characterize it”. The legislation called NorMal 1/88 defined it as “the
alteration strictly limited to natural modifications of the surface that is not linked to an
obvious phenomenon of degradation that can be noticed through a change in the origi-
nal colour of the matter” [2].
The patina is considered a very complex process due to an exchange of matter and
energy between two open systems, i.e the work of art and the environment; thus the pati-
na arouses an additional fascination onto the surface of the work, except if it alters the
interpretation of the work too much [3]. This is often the case when we talk about “bio-
logical patina” or bio-films, usually generated by macro and/or micro-organic colonization
(fungi, bacteria, alga) which contribute to the surface bio-deterioration and thus lead to
the formation of pigmented areas [4-5]. The presence of chromatic alterations (rose-
CHROMATIC ALTERATION ON MARBLE SURFACES ANALYSED
BY MOLECULAR BIOLOGY TOOLS
Franco Palla
Dipartimento di Scienze Botaniche, Laboratorio di Biologia Molecolare
Università degli Studi di Palermo
Elena Tartamella
Dottore in Restauro, Recupero e Riqualificazione delle Architetture, Facoltà di Architettura
Università degli Studi di Palermo

#
coloured areas), as a consequence of bacterial colonization, were particularly pointed out
in different sites, such as in the marble slabs on the facades of both the Cathedral of
Siena (Duomo di Siena) [6-7] and the Certosa of Pavia [8].
The present study shows an example of chromatic alteration of the surfaces of mar-
ble works due to some bacterial species, such as Micrococcus.
2. Study case
The monumental complex of Fontana Pretoria (Pretoria Fountain) is situated in one of
the richest sites in terms of history and meaning [9] of the Historical Centre of Palermo. It
offers the monumental water machine [10], extraordinary scenographic complex which, in
the collective psyche, represents, with the flow of water, one of the souls of the city. The
Pretoria Fountain is even more highlighted by the unusual architectural structure, adorned
with numerous marble elements, statues of various sizes, basins, steps and terrace eas-
ing a closer view onto the work (fig. 1). That was the intent of the Senate of Palermo when
they decided in 1573 to buy the fountain from the Toledo family. Twenty years earlier, the
fountain had been ordered by the Toledo family to Francesco Camilliani, a Tuscan man-
nerist sculptor, for their private Florentine villa. Later on, his son, Camillo Camilliani creat-
ed the miscellaneous marble elements giving life to the great water machine of Palermo.
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Figure 1. Camillo Camilliani, Pretoria Fountain: preliminary drawing for
the definitive stage, Berlin, Kunstbibliotek.

'
Pretoria Fountain, best known as “Fontana delle Vergogne” (Fountain of the Shames)
probably because of the suggestive sculptural elements, also represents an important
example of stony works in outdoor environment and degraded both for natural causes
and for inappropriate choices made in previous restoration interventions [11].
The latest restoration of the whole fountain including the water machine started in
1998 under the direction of the architect G. Favara (Sovrintendenza per i BB. CC. AA. of
Palermo) and the Dr M.P. Demma (Centro Regionale di Progettazione e Restauro della
Regione Siciliana). This restoration shall contribute to gathering a complex basis of
knowledge, studies and researches [12-13].
The sculptural-architectural work shows a widespread and complex state of alteration:
the marmoreal surfaces were almost completely covered by calcareous deposits and
encrustations mostly grey-brown, stratified and very homogeneous that hid the modelled
marbles of the central stem, the zoomorphic heads of the fish pond and also large parts of
the full relief statues. Besides, the water belt of the fountain and the presence of an inap-
propriate hydraulic system, go back as early as the restoration of the 1950s and have con-
tributed to creating optimal conditions for the growth of weeds and abundant microflora [14].
The encrustations and the deposits created a “uniform mantle” that covered the whole
structure and hid the real tone of the work. This point made it impossible to precisely
know the general conservation state of the marmoreal materials (fig. 2A-B). The cleaning
Conservation Science in Cultural Heritage
AB
Figure 2. Sediments on the surfaces of the marble samples: A) piece of the thick layer of
deposit/encrustation covering the works; B) algal patina on anthropomorphic element [9].

(
carried out in the first stage of the latest restoration (finished in 2003), have pointed out
for the statues a phenomenon of loss of cohesion. Parts of the stony shapes gathered
lots of cracks and fractures; numerous interventions and/or remaking were therefore real-
ized thanks to iron pins and flasks (fig. 3) which provoked the breaking of the parts of the
weaker material as well as a disjointedness of the moulded levels because they under-
went oxidation and an increase in volume.
Pigmented areas were discovered around the water pipe and classified as chromatic
alterations deriving from the diffusion of the product of iron oxidation (red-orange colour)
or were correlated to the presence of metallic elements in copper alloy (green sky-blue
colour) [15]. A particular attention was drawn on the pigmented areas that came out, after
the cleaning stage, on the marmoreal surfaces of the statues of Ebe and Naiade-
Caratide, on the pleats of the dress of Cerere (fig. 4A), on the Child with jug of the cen-
tral stem (fig. 4B) and on the balustrade facing the Pretorio Palace (fig. 4C). It was con-
cluded that these pigmented areas were gradually spreading and increasing and that the
chemical-petrographical analysis put some biological cause forward.
Scientific literature indicates that epi- and endolytic micro-organisms have an important
role in most parts of the processes, they indeed contribute both to chemical-physical alter-
ation of the constituent materials and to the formation of pigmented patina on the surfaces
[16-18]. These micro-organisms are able to produce fast colouring pigments such as chloro-
phyll, carotenoid, melanin that may generate chromatic variations towards yellow, orange,
red, or even brown colour [4]; as an example, the reaction of the carotenoid pigments with
the calcareous groundmass leads to the formation of very strong chemical bonds, the prod-
uct of which is almost insoluble under organic solvents or inorganic ones [7]. The marmo-
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Figure 3. Chromatic alteration of
the stem basin caused by the old
metallic reinforcement rings [9].

)
real works of the Pretoria fountain presented no thick encrustations and were then probably
in thermo-hygrometric, lighting and nutrition conditions that may trigger micro-biotic growth.
The samples from the pigmented areas, useful to the characterisation of the species
of the possible microbial gathering, were taken either by means of a sterile tampon
(dampened with solution of 0.9% NaCl-0.02% Tween-80-polyoxyethylene sorbitan
monooleate) or, when possible, micro samples of material were taken by means of dis-
posable sterile equipment.
When the sample was taken by a damp plug, the solution in which the stick was
dipped was diluted (1:10) and afterwards incubated at 30°C for 16-24 hours.
The morphological analysis of the bacterial typologies grown on agar plate that was
carried out through examination under direct microscopic observation, has allowed to dis-
tinguish bacterial colonies, either pigmented ones (yellow, red) and colourless ones (fig. 5).
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Figure 4. Pigmented areas: A) Cerere, pleats of the dress, B) Child, central stem, C)
Balustrade facing Pretorio Palace.
A
B
C

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Figure 5. Bacterial colony cultured on agar plate: A) pigmented; B) pigmented and colour-
less [19].
A
B

"
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At the scanning electron microscope, they respectively appear as bacilliform and coccus-
form bacteria [19].
When it happened possible to execute micro sample, 200 mg of stony material were
submitted to cycles of freezing (– 80°C) and unfreezing (+ 55°C) in presence of 250 µl of
10 mM Tris HCl pH 8.0 / 1mM EDTA (1XTE) to induce the lysis of the microbial cells and
to extract the bacterial DNA using the kit “QIAmp DNA stool” according to the protocol
given by QIAGEN and slightly modified by the authors. This methodology was also cho-
sen to extract the DNA of the bacterial colony isolated on agar plate.
Aliquots of bacterial DNA were successively used as template molecule in the reac-
tions of in vitro molecular amplification (PCR) [19], according to specific protocols.
The determination of the nucleotide sequence of the PCR fragments and the com-
parison with the corresponding parts of microbial genomes deposited in the database
EMBL-Germany and NIH USA [20], allowed us to identify Arthrobacter, Bacillus and
Micrococcus as the prevailing microbial species to be found on the pigmented areas.
They belong to bacterial species able to produce pigmentations, crystalline aggregates,
effluorescence and patina [4].
The characterisation and identification of the bacterial colonies is also of major impor-
tance in terms of treatment of the marble surfaces with biocides, so as to be able to eval-
uate their efficiency and to determine the appropriate concentration of each biocide to be
used. In the present case, the Benzalconium chloride in aqueous solution and the
Algophase in isopropylic alcohol were used. Then, by means of tests of “inhibition of bac-
terial growth”, the action of each biocide in concentrations from 0,1 to 3% was valuated
for each bacterial species. The analysis of the ring of inhibition of bacterial growth
emphasizes that Bacillus (fig. 6) and Arthrobacter have a high degree of sensitivity under
the action of either the Benzalconium chloride or the Algophase, while the test colonies
of Escherichia coli, strain 71/18, (fig. 6) are less sensitive to the product. Indeed the inhi-
bition of the growth is much smaller.
Figure 6. Test of inhibition of
bacterial growth: effect of bio-
cide (concentrations 0.3 and
3%) benzalconium chloride
(plate on the left side) /
Algophase (plate on the right
side) on the growth of the
bacteria Bacillus and E. coli.

+
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3. Conclusion
The stony works located outside display an acceleration of the natural ageing of the
materials owing to physical, chemical and biological factors. The physical causes can be
assimilated to purely mechanical and thermal actions. The chemical causes derive from
the interaction of the compounds with the constitutive elements of the works of art; they
are often induced by macro and micro biological systems (especially weeds, alga, fungi
and bacteria).
According to the metabolic and anchorage process to the substratum, these systems
cause the alteration of the work, well-known as bio-deterioration, that appears on the sur-
faces modifying its geometry and the eye-perception. The formation of biological patina
is usually a consequence of a colonization by various bacterial genera able to produce
pigmentations, crystalline aggregations and mineral precipitates of carbonate and phos-
phate, efflorescence and patina. It is therefore one of the superficial alterations that is
most frequently detected [4].
In the marble pieces of the Pretoria Fountain, some areas showing an expanding and
intensifying reddish chromatic alteration were pointed out. These alterations as showed
by the chemical-stratigraphical analysis have a biological origin.
The study shows that, in the pigmented areas, various bacterial species are present.
The prevalent ones, Bacillus, Arthrobacter and Micrococcus, were detected by a combi-
nation of techniques of in vitro culture and molecular investigations, according to proto-
cols carried out in our laboratory for different study cases [21-24].
Concerning the genus Bacillus, we know that it includes aerobes and facultative aer-
obes, bastoncellar bacteria, able to produce endospore allowing the survival of organ-
ism even if the environmental conditions in terms of nutritious, temperature and water
activity, suddenly change [25].
The bacteria of Arthrobacter genus, even though they don’t create spores or other
quiescent forms, are particularly resistant to the drying process and nutritious lack.
They constitute a heterogeneous group of bacteria characterised by a great nutri-
tional versatility able to degrade herbicides, caffeine, nicotine, phenols and other
organic compounds that are not so much common [25]. Some Arthrobacter species
present different morphologies during the cycle of life starting from a single element
with a form of coccus and transforming into a rod form that then constitutes the most
important form of microcolony and that is successively retransformed into coccus
form [25].

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Conservation Science in Cultural Heritage
As it was supposed from the beginning of the study, the presence of bacteria of
Micrococcus genus was definitely confirmed. Finally, the presence of corineform bacteria
belonging to the Cellulomonas family facultative aerobes with variable morphology is not
to be excluded.
The inhibition test of bacterial growth have provided information on the efficiency and
on the optimal concentration of biocide to use in the frame of this restoration project. They
also show how important is the concentration of the bacterial species present in a micro-
bial consortium is. As a matter of fact, different bacterial species show a different sensi-
tivity to the same biocide, as it was showed in this work through the different inhibition
mark of the Arthrobacter and Bacillus growth compared to that of Escherichia coli. The
use of molecular biotechnologies for a quick and accurate characterisation of the exist-
ing bacterial species, appears as one of the starting points of a project of conse-
rvation/restoration because it provides fundamental information regarding the choice of
the right biocide and the optimal concentration to use.
The restoration yard of Pretoria Fountain stands as a real laboratory of research
under progress, and above all, it allowed to develop interesting biotechnological applica-
tions for an efficient and specific diagnosis of microbial communities on marble works of
art. If we consider these applications in terms of scientific capitalization [26], they consti-
tute a surveying methodology in the field of microbial colonisation that proves to be use-
ful to the prevention and preservation of the cultural heritage.
Acknowledgements
Particular thanks are directed to Dr Demma and architect Favara, for the constant and
faithful collaboration and also to the Soprintendenza BB.CC. of Palermo that partially
financed the present research. Moreover, we wish to thank Professor Tomaselli and the
architect Smecca for their precious collaboration. The survey was carried out in the frame
of the research activity (ex 60%) MIUR.
Bibliography
[1] BRANDI C. 1994, Il restauro: teoria e pratica (a cura di Michele Cordaro), edizioni
Roma, Edizioni Riuniti.
[2] ISTITUTO CENTRALE PER IL RESTAURO 1988, Raccomandazioni Normal, altera-
zioni macroscopiche dei materiali lapidei, Roma, ICR-CNR.

#$
[3] GORBUSHINA A.A., KRUMBEIN W.E., HAMMAN C.H., PANINA L., SOUKHARJEV-
SKI S., WOLLENZIEN U. 1993, Role of black fungi in colour change and biodeterio-
ration of antique marbles, Geomicrobiology Journal,11, 205-220.
[4] KRUMBEIN W.E. 2003, Patina and cultural heritage – a geomicrobiologist’s pro-
spective – How microbes change surfaces, in R. Kozlowski (ed), Cultural Heritage
Research: a Pan European Challenge, Proceedings of the 5th European
Commission Conference (Cracow, 16-18 May 2002), 1-9.
[5] STERFLINGER K., KRUMBEIN W.E., RULLKOTTER J. 1999, Patination of mar-
ble and granite by microbial communities, Z. dtsch. Geol. Gesellsch., 150, 299-
311.
[6] TIANO P., TOMASELLI L. 1989, Un caso di biodeterioramento del marmo, Arkos, 6,
12-18.
[7] TIANO P., TOMASELLI L. 2004, Red staining and heterotrophic bacteria, Coalition,
8, 2-4.
[8] ABBRUSCATO P., SORLINI C. , ZANARDINI E. 2003, Molecular characterisation of
lead-resistant isolates from Certosa di Pavia red strains, in C. Saiz-Jimenez (ed),
Molecular Biology and Cultural Heritage, Lisse/Abingdon/Exton (PA)/Tokyo: A.A:
Balkema Publishers, 109-113.
[9] DEMMA M.P. 2006, Da Firenze a Palermo: rilettura delle vicende storiche e artistiche
della Fontana Pretoria, in G. Favara & M.P. Demma, La Fontana Pretoria in Palermo,
Palermo, Assessorato BB CC e AA. e P.I.
[10] CASSARÀ S. 2006, La macchina dell’acqua, in G. Favara & M.P. Demma, La
Fontana Pretoria in Palermo, Palermo, Ass.to BB CC e AA. e P.I., 225-245.
[11] DEMMA M., FAVARA G. 2006. Un problema di metodo: il restauro, in G. Favara &
M.P. Demma, La Fontana Pretoria in Palermo, Palermo, Assessorato BB CC e AA e
P.I., 281-307.
[12] DEMMA M., FAVARA G. 2006, La Fontana Pretoria in Palermo, Palermo,
Assessorato BB CC e AA. e P.I. (731.7209458231 CDD-20).
[13] TARTAMELLA E. 2006, Fontana Pretoria: Studio e ricerca delle alterazioni naturali
ed artificiali sulla superficie marmorea dello stelo centrale, Palermo, Thesis
University.
[14] FAVARA G. 2006, La conoscenza dello stato di conservazione prima del restauro, in
G. Favara & M.P. Demma, La Fontana Pretoria in Palermo, Palermo, Assessorato BB
CC e AA. e P.I., 11-18.
[15] RIZZO G., ERCOLI L. 2006, Indagini chimiche-petrografiche sui materiali lapidei e
sul loro degrado, in G. Favara & M.P. Demma, La Fontana Pretoria in Palermo,
Palermo, Assessorato BB CC e AA. e P.I., 249-257.
[16] BRIMBLECOMBE P., GROSSI C. 2003, Blackening of buildings, in H. CACHIER
F%Palla! E% Tartamella & Chromatic alteration on marble surfaces analysed by molecular biology tools

#
Conservation Science in Cultural Heritage
(ed.), Air pollution & cultural heritage, Workshop Abstracts (Seville, Spain, 1-3
december 2003), Seville, 21-22.
[17] MAY E., LEWIS F.J., PEREIRA S., TAYLER S., SEAWARD M.R.D., ALLSOPP D.
1993, Microbial deterioration of building stone - a review, Biodeterioration Abstracts,
7, 109-123.
[18] URZÍ C., KRUMBEIN W.E., WARSCHEID T. 1992, On the Question of Biogenic
Coulour Changes of Mediteranean Monuments in D. DECROUEZ, J. CHAMAY and
F. ZEZZA (eds.), Geneve, Proceedings 2nd International Symposium. Musée d’art et
d’historie, 397-420.
[19] PALLA F. 2006, Analisi per l’identificazione di microorganismi deteriogeni sulle
superfici marmoree delle statue di Fontana Pretoria, in G. Favara & M.P. Demma,
La Fontana Pretoria in Palermo, Palermo, Assessorato BB CC e AA. e P.I., 261-
266.
[20] ALTSCHUL S.F., MADDEN T.L., SCHÄFFER A.A., ZHANG J., ZHANG Z., MILLER
W., LIPMAN D.J. 1997, Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of pro-
tein database search programs, Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402.
[21] FEDERICO C., RUSSO R., ANELLO L., PALLA F. 1999, Biotechnologies tools to test
biodeteriogens in stone specimens, in O. CIFFERI, P. TIANO, G. MASTROMEI
(eds), Microbes and Art, the Role of Microbial Communities in the Degradation and
Protection of Cultural Heritage, ICMC Abstracts (Florence, 16-19 June 1999)
Firenze, Consiglio Nazionale delle Ricerche.
[22] PALLA F., FEDERICO C., RUSSO R., ANELLO L. 2002, Identification of Nocardia
restricta in biodegradated sandstone monuments by PCR and nested-PCR DNA
amplification, FEMS Microbiol Ecol., 39, 85-89.
[23] PALLA F., ANELLO L., PECORELLA S., RUSSO R., DAMIANI F. 2003,
Characterisation of bacterial communities on stone monuments by molecular biology
tools. C. Saiz-Jimenez (ed), Molecular Biology and Cultural Heritage,
Lisse/Abingdon/Exton (PA)/Tokyo: A.A: Balkema Publishers, 115-118.
[24] PALLA F., ANELLO L., MARINEO S., LOMBARDO G., 2006. Characterisation of bac-
terial communities in indoor environment, in R. FORT, M. ALVAREZ de BUERGO, M.
GOMEZ-HERAS & C. VAZQUEZ-CALVO (eds), Heritage, Watering and
Conservation, London/Leiden/NewYork/Philadelphia/Singapore, Taylor & Francis
Group, 361-365.
[25] MADIGAN M.T., MARTINKO J.M., PARKER J. 2003, Brock, Biologia dei microrgani-
smi, 10 ed, Milano, Casa Editrice Ambrosiana.
[26] GONZALEZ J.M. 2003, Overview on existing molecular techniques with poten-
tial interest in cultural heritage. C. Saiz-Jimenez (ed), Molecular Biology and
Cultural Heritage, Lisse/Abingdon/Exton (PA)/Tokyo: A.A: Balkema Publishers,
3-13.

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ALTERAZIONI CROMATICHE SU SUPERFICI MARMOREE:
ANALISI MEDIANTE TECNICHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE
1. Introduzione
Le superfici dei manufatti artistici, esposte all’ambiente circostante con cui
interagiscono, attivano un elevato numero di scambi e reazioni che, generando
modifiche della superficie, portano alla formazione delle “patine naturali” – il
nome già ne spiega la genesi – che sono la conseguenza di una naturale alte-
razione superficiale della materia. Cesare Brandi [1] definiva la “patina” come
«quella particolare caratterizzazione della superficie di un manufatto di interes-
se storico, culturale, artistico, dovuta unicamente al naturale e normale proces-
so di assestamento e modificazione che i materiali costitutivi della superficie
subiscono per l’interazione con gli agenti esterni caratterizzanti l’ambiente in cui
è conservato, in particolare con l’energia luminosa, l’aria e i sui componenti, la
temperatura e l’umidità che la caratterizzano». La Raccomandazione NorMal
1/88 la identificava come «alterazione strettamente limitata a quelle modifica-
zioni naturali della superficie dei materiali non collegabili a manifesti fenomeni
di degradazione e percepibili come una variazione del colore originario del
materiale» [2].
La “patina” è certamente un processo molto complesso, dovuto a scambi
di materia ed energia tra due sistemi aperti come il manufatto e l’ambiente, che
genera un fascino aggiuntivo alla superficie dell’opera, a meno che non alteri
profondamente la lettura del manufatto [3] come spesso accade nel caso delle
“patine biologiche”, dovute generalmente a colonizzazioni da macro e/o micror-
ganismi (funghi, batteri, alghe) che, inducendo il biodeterioramento della super-
ficie, portano alla formazione di aree pigmentate [4-5]. In particolare, la pre-
senza di alterazioni cromatiche (aree rosate), conseguenza di colonizzazioni
batteriche, sono state evidenziate in diversi siti come nelle lastre marmoree
delle facciate del Duomo di Siena [6-7] e della Certosa di Pavia [8].
Lo studio qui riportato mostra un esempio di alterazione cromatica della
superficie di manufatti marmorei indotta da alcune specie batteriche con parti-
colare riferimento al genere Micrococcus.
2. Caso di studio
Il complesso monumentale della Fontana Pretoria si trova in uno dei siti del
Centro Storico di Palermo più densi di storia e di significato [9] e ospita la monu-
mentale macchina dell’acqua [10], straordinario apparato scenografico che,
nell’immaginario collettivo, rappresenta con il fluire delle acque una delle anime
della città. Il fascino della Fontana Pretoria è ancor più esaltato dall’insolito
impianto architettonico, adorno di numerosi elementi marmorei, statue dalle
diverse dimensioni, vasche, scalinate e terrazzamenti per permetterne l’ammi-
razione ancor più da vicino (fig. 1): questo l’intento del Senato palermitano che
nel 1573, non badando ai costi, acquistò la fontana dalla famiglia Toledo che
circa un ventennio prima l’aveva commissionata a Francesco Camilliani, scul-
tore manierista toscano, per la propria villa fiorentina. Successivamente, il figlio,
Camillo Camilliani, compose i molteplici elementi marmorei dando vita alla
monumentale macchina d’acqua palermitana.
Fontana Pretoria, a molti nota come “Fontana delle Vergogne“ a causa,
probabilmente, degli elementi scultorei, rappresenta anche un significativo
esempio di manufatti lapidei esposti all’aperto, degradati sia per cause natura-
li sia per non corrette scelte in precedenti interventi di restauro [11]. Nel 1998,
diretto dall’Arch. G. Favara (Sovrintendenza per i BB. CC. AA. di Palermo) e
dalla Dott.ssa M.P. Demma (Centro Regionale di Progettazione e Restauro
della Regione Siciliana), inizia questo ultimo intervento di restauro dell’intera
fontana, compresa la macchina dell’acqua, che fornirà un complesso ordine di
conoscenze, studi e ricerche [12-13].
Il manufatto scultoreo-architettonico mostrava un esteso e complesso stato
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di alterazioni: le superfici marmoree erano quasi completamente ricoperte da
depositi e incrostazioni prevalentemente calcaree grigio-brune, stratificate e
molto coerenti che nascondevano i marmi modellati dello stelo centrale, le teste
zoomorfe della peschiera e grandi porzioni delle statue a tutto tondo. Inoltre,
l’acqua di alimentazione della fontana e la presenza di un inadeguato impianto
idraulico, risalente al restauro degli anni 50 del 1900, avevano creato le condi-
zioni ottimali per la crescita di piante infestanti e di un’abbondante microflora
[14].
Le incrostazioni e i depositi creavano una “cappa uniforme” che ricopriva
l’intera struttura e celava la reale cromia del manufatto non permettendo l’esat-
ta valutazione dello stato di conservazione generale dei sottostanti materiali
marmorei (fig. 2A-B). L’opera di ripulitura e liberazione, effettuata nella prima
fase del più recente restauro (terminato nel 2003), aveva evidenziato fenome-
ni di decoesione nella parte statuaria, porzioni del modellato lapideo appariva-
no gravemente fessurate e fratturate, numerosi interventi e/o rifacimenti erano
stati realizzati ricorrendo all’uso di perni e staffe di ferro che, ossidandosi e
aumentando di volume (fig. 3), avevano causato la rottura delle parti di mate-
riale più debole oltre alla sconnessione dei piani del modellato.
Aree pigmentate erano state riscontrate intorno ai tubi di uscita dell’acqua
e classificate come alterazione cromatica dovuta alla diffusione dei prodotti di
ossidazione del ferro (colore rosso arancio) o correlabili alla presenza di ele-
menti metallici in leghe di rame (colore verde azzurro) [15]. Particolare atten-
zione è stata rivolta alla comparsa, dopo la fase di pulitura, di aree pigmentate
sulle superfici marmoree delle statue di Ebe e Naiade-Caratide, nelle pieghe del
vestito di Cerere (fig. 4 A), del Fanciullo con brocca dello stelo centrale (fig. 4B)
e della balaustra prospiciente il Palazzo Pretorio (fig. 4C), che si diffondevano
e intensificavano nel tempo e che l’analisi chimico-petrografica ipotizzava esse-
re di probabile origine biologica.
La letteratura scientifica riporta che microrganismi epi ed endolitici giocano
un ruolo importante nella maggior parte dei processi sia di alterazione chimico-
fisica dei materiali costituenti sia nella formazione di patine pigmentate sulle
superfici [16-18]. Questi microrganismi sono in grado di produrre pigmenti sta-
bili come clorofille, carotinoidi, melanine in grado di generare variazioni croma-
tiche di colore giallo, arancio, rosso, sino al bruno [4]; ad esempio la reazione
dei pigmenti carotinoidi con la matrice calcarea dà vita alla formazione di lega-
mi chimici molto forti, il cui prodotto è praticamente insolubile sia a solventi orga-
nici che inorganici [7]. Probabilmente i manufatti marmorei della fontana
Pretoria, liberati dalle spesse incrostazioni, si sono ritrovati in quelle condizioni
termoigrometriche, d’illuminazione e di nutrizione che hanno innescato la cre-
scita microbica.
Per la caratterizzazione delle specie che componevano il possibile consor-
zio microbico, i prelievi sulle aree pigmentate sono stati eseguiti sia dalle super-
fici mediante tamponi sterili (inumiditi con sol uzione di 0.9% NaCl-
0.02%.Tween-80-polyoxyethylene sorbitan monooleate) sia eseguendo, quan-
do possibile, microprelievi di materiale mediante attrezzature monouso sterili.
Nel caso in cui il prelievo è stato effettuato mediante tamponi umidi, la solu-
zione in cui era stato immerso il tampone è stata diluita (1:10) con soluzione
fisiologica sterile e un volume pari a 25 ml è stato utilizzato per inoculare pia-
stre di Nutrient-Agar (Nutrient Broth-Difco 25 g/ litro – 2% Agar-Difco), succes-
sivamente incubate a 30°C per 16-24 ore.
L’analisi morfologica delle tipologie batteriche cresciute sui terreni agariz-
zati condotta per osservazione diretta al microscopio ottico delle colonie, ha
permesso di distinguere colonie batteriche sia pigmentate (giallo, rosse) sia
incolori (fig. 4), che al microscopio elettronico a scansione appaiono come bat-
teri bacilliformi e cocchiformi [19].
Nei casi in cui è stato possibile eseguire i micro prelievi, 200 mg di mate-
riale lapideo sono stati sottoposti a cicli di congelamento (– 80°C) e scongela-
mento (+ 55°C) in presenza di 250 ml di 10 mM Tris-HCl pH 8.0 / 1mM EDTA
(1XTE) per indurre la lisi delle cellule microbiche ed estrarre il DNA batterico uti-

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lizzando il kit “QIAmp DNA stool”, secondo il protocollo fornito dalla casa pro-
duttrice QIAGEN e da noi parzialmente modificato. Questa metodologia è stata
utilizzata anche per estrarre il DNA dalle colonie batteriche isolate su terreni
agarizzati.
Successivamente, piccole aliquote di DNA batterico sono state utilizzate
come molecole stampo nelle reazioni di amplificazione molecolare in vitro
(PCR) [19], secondo specifici protocolli.
La determinazione della sequenza nucleotidica dei frammenti PCR e il con-
fronto con le corrispondenti porzioni dei genomi microbici, depositati nella
banca dati EMBL- Germany e NIH-USA [20], ha permesso di identificare
Arthrobacter, Bacillus eMicrococcus come le specie prevalenti nel consorzio
microbico presente sulle aree pigmentate: specie batteriche in grado di produr-
re pigmentazioni, aggregati cristallini, efflorescenze e patine [4].
La caratterizzazione e l’isolamento delle colonie batteriche trova una note-
vole valenza anche nella prospettiva del trattamento con biocidi delle superfici
marmoree, al fine sia di valutare l’efficienza sia per determinare la concentra-
zione più opportuna di ciascun biocida che s’intenda utilizzare. In questo caso
sono stati utlizzati il Benzalconio cloruro in soluzione acquosa e l’Algophase in
alcool isopropilico e, ricorrendo ai saggi di “inibizione della crescita batterica”, è
stata valutata l’azione di ciascun biocida, in concentrazioni comprese tra 0,1 e
3%, nei confronti di ciascuna specie batterica isolata.. In particolare, l’analisi
degli aloni di inibizione della crescita batterica mostra che Bacillus (fig. 6) e
Arthrobacter presentano un elevato grado di sensibilità all’azione sia del
Benzalconio cloruro sia dell’Algophase, mentre le colonie controllo di
Escherichia coli, ceppo 71/18, (fig. 6) sono meno sensibili: infatti, è presente un
alone di inibizione della crescita di gran lunga inferiore.
3. Conclusioni
I manufatti lapidei esposti all’aperto presentano un’accelerazione del natu-
rale invecchiamento dei materiali dovuta essenzialmente a fattori di tipo fisico,
chimico e biologico. Le cause fisiche possono essere ricondotte a fatti pura-
mente meccanici e termici, le cause chimiche sono attribuibili alla conseguente
interazione con composti che reagiscono con gli elementi costituenti dei manu-
fatti, spesso indotti da macro e micro-sistemi biologici (principalmente erbe
infestanti, alghe, funghi e batteri). Questi, in base ai loro processi metabolici e
d’ancoraggio al substrato, inducono il deterioramento del manufatto, noto con il
termine di biodeterioramento, che si manifesta visivamente con il cambiamen-
to delle superfici dell’opera, alterando la leggibilità e la geometria del manufat-
to. Una delle alterazioni superficiali maggiormente riscontrate è la formazione
di patine biologiche, conseguenza spesso di colonizzazioni da parte di diversi
generi batterici, in grado di produrre pigmentazioni, aggregati cristallini e preci-
pitati minerali di carbonato e fosfato, efflorescenze, patine [4].
Nei manufatti marmorei della Fontana Pretoria sono state individuate delle
aree che presentavano un’alterazione cromatica tendente al rosso che si
estendeva e intensificava nel tempo e che, come riportato anche dall’analisi chi-
mico-stratigrafica, era possibile imputare ad un’origine biologica. Questo studio
mostra che nelle aree pigmentate sono presenti diverse specie batteriche le cui
predominanti sono state identificate in Bacillus, Arthrobacter e Micrococcus,
ricorrendo alla combinazione di tecniche di coltura in vitro e di indagini moleco-
lari, secondo protocolli messi a punto nel nostro laboratorio anche per altri casi
di studio [21-24].
Per quanto concerne il genere Bacillus, è noto che comprende specie aero-
bie e aerobie facoltative bastoncelliformi, in grado di produrre endospore che
permettono la sopravvivenza dell’organismo anche se le condizioni ambientali,
in termini di nutrienti, temperatura e attività dell’acqua cambiano in maniera
repentina [25]. I batteri del genere Arthrobacter, nonostante non formino spore
o altre forme quiescenti, sono particolarmente resistenti all’essiccamento e alla
carenza di nutrienti. Essi formano un gruppo eterogeneo di batteri, caratteriz-
zato da notevole versatilità nutrizionale tanto che sono stati isolati ceppi capa-
ci di degradare erbicidi, caffeina, nicotina, fenoli e altri composti organici poco
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Conservation Science in Cultural Heritage
comuni [25]. Alcune specie di Arthrobacter presentano, durante il ciclo vitale,
morfologie diverse che, da singolo elemento coccoide, si trasforma in baston-
cello che costituirà la forma principale della microcolonia, per ritrasformarsi suc-
cessivamente in forme coccoidi [25].
La presenza di batteri del genere Micrococcus, ipotizzata sin dall’inizio è
stata confermata. Infine, non è da escludere la presenza di batteri corineformi
appartenenti al genere Cellulomonas, aerobi facoltativi con morfologia variabi-
le.
I saggi d’inibizione della crescita batterica hanno fornito informazioni sul-
l’efficacia e sulla concentrazione opportuna di biocidi da utilizzare nell’ambito di
questo progetto di restauro e, nello stesso tempo. mostrato quanto sia impor-
tante la caratterizzazione delle specie batteriche presenti in un consorzio
microbico. Infatti, differenti specie batteriche presentano diversa sensibilità ad
uno stesso biocida, come mostrato in questo lavoro dal differente alone d’inibi-
zione della crescita di Arthrobacter eBacillus rispetto a Escherichia coli. Il ricor-
so alle biotecnologie molecolari, per una rapida e precisa caratterizzazione
delle specie batteriche presenti, risulta quindi uno dei punti di partenza in un
progetto di conservazione/ restauro perché fornisce informazioni sostanziali
anche per la scelta del biocida e dell’opportuna concentrazione da utilizzare.
Il cantiere di restauro di Fontana Pretoria ha rappresentato un vero e pro-
prio laboratorio di ricerca, in continua evoluzione, che ha permesso lo sviluppo
d’interessanti applicazioni biotecnologiche per una diagnosi rapida e specifica
di comunità microbiche in opere d’arte marmoree e, senz’altro tali applicazioni,
vista la loro potenzialità [26], costituiscono una metodologia di rivelazione delle
colonizzazioni microbiche da utilizzare dal punto di vista della prevenzione e
conservazione di un bene culturale.
Ringraziamenti
Particolari ringraziamenti vanno alla Direzione dei Lavori (Dott.ssa M.P.
Demma, Arch. Giuseppina Favara) per la continua e proficua collaborazione e
alla Soprintendenza BB.CC. di Palermo per avere parzialmente finanziato que-
sto lavoro di analisi e ricerca. Inoltre, si ringrazia il Prof. F. Tomaselli e l’Arch. L.
Smecca per la preziosa collaborazione.
Studio effettuato nell’ambito dell’attività di ricerca (ex 60%) MUR.
Summary
The patina represents a superficial natural alteration of the constituting matter of the work of art. It
emerges from the natural and usual stabilization process that the materials of the surface undergo
because of the interaction with outdoor agents characterizing the surrounding environment. Besides,
it is not linked to an obvious phenomenon of degradation that can be noticed through the change in
the original colour of the matter.
This is what we intend when we talk about biological patina usually generated by macro and/or
micro-organic colonization (fungi, bacteria, alga) which contributes to surface bio-deterioration and
thus lead to the formation of orange, red or even brown and dark pigmented areas.
The presence of chromatic alterations (rose-coloured areas), as a consequence of bacterial colo-
nization, was most particularly pointed out in different sites, such as in the marble slabs on the
facades of both the Cathedral of Siena (Duomo di Siena) and the Certosa of Pavia.
The present study shows an example of chromatic alteration of the surface of marble works due to
bacterial colonization.
Riassunto
La patina, naturale alterazione superficiale della materia che costituisce un’opera d’arte, è dovuta al
normale processo d’assestamento che i materiali costitutivi della superficie subiscono per l’intera-
zione con gli agenti esterni caratterizzanti l’ambiente in cui è conservata, non collegabile a manife-

sti fenomeni di degradazione e percepibili come una variazione del colore originario del materiale.
Questo è il caso delle patine biologiche, dovute generalmente a colonizzazioni da macro e/o micror-
ganismi (funghi, batteri, alghe) che, inducendo il biodeterioramento della superficie, portano alla for-
mazione di aree con pigmentazione arancione, rossa, sino al bruno e al nero. In particolare, la pre-
senza di alterazioni cromatiche (aree rosate), conseguenza di colonizzazioni batteriche, è stata evi-
denziata in diversi siti come nelle lastre marmoree delle facciate del Duomo di Siena e della Certosa
di Pavia.
Lo studio qui riportato mostra un esempio d’alterazione cromatica della superficie di manufatti mar-
morei indotto dalla colonizzazione batterica.
Résumé
La patine, altération naturelle superficielle de la matière qui constitue une oeuvre d’art, dérive du
processus naturel de stabilisation que les matériaux qui constituent la surface subissent du fait de
l’interaction avec les agents extérieurs caractérisant le milieu dans lequel l’œuvre est exposée. Elle
n’est pas liée à un phénomène évident de dégradation perceptible par une variation de la couleur
d’origine du matériau. C’est ce que nous entendons lorsque nous parlons de patines biologiques,
qui sont généralement dues à des colonisations de macro et/où microorganismes (champignons,
bactéries, algues) qui entraînent la biodétérioration de la surface, d’où résulte la formation de zones
de pigmentation orange, rouge, voire même brune ou noire. La présence d’altérations chromatiques
(zones rosées) suite aux colonisations de bactéries a tout particulièrement été mise en lumière sur
différents sites, comme c’est par exemple le cas sur les plaques en marbre des façades du Duomo
à Siena et de la Certosa à Pavia.
L’étude présente un exemple d’altération chromatique de la surface des oeuvres en marbre du fait
de la colonisation de bactéries.
Zusammenfassung
Die Schicht, natürliche oberflächliche Veränderung des Stoffs, der ein Kunstwerk bildet, ist von dem
üblichen Setzung Verfahren verursacht, dem die konstitutiven Stoffen der Oberfläche sich unterzie-
hen, wegen der Interaktion mit den äußeren Agenten, die die Umgebung charakterisieren, in der es
aufbewahrt wird. Sie ist nicht verbindenbar zu Phänomena von Degradierung, die als ein Wechsel
der Originalfarbe wahrnehmbar sind. Das ist der Fall der biologischen Schichten, die gewöhnlich von
der Besiedelung aus Makro- und/oder Mikroorganismen (Pilze, Bakterien, Algen) verursachte sind,
die zur Entstehung von Zonen mit orange, roter, sogar brauner und schwarzer Pigmentierung brin-
gen, weil sie zur Biobeschädigung der Oberfläche verleiten. Besonders ist das Vorhandensein von
Farbenwechseln (rosa Zonen), Folge von Bakterienbesiedelungen, in verschiedenen Stellen, als in
den Marmorplatten der Fassade des Doms von Siena und der Kartause von Pavia, hervorgehoben
worden.
Die hier wiedergegebene Studie zeigt ein Beispiel von Farbenwechsel der Oberfläche von
Marmormanufakturen, der von der Bakterienbesiedelung verleitet worden ist.
Resumen
La pátina, o sea la natural alteración superficial de la materia que constituye una obra de arte, se
debe al proceso normal de asentamiento que los materiales que constituyen la superficie sufren por
la interacción con los agentes externos del ambiente en que se conserva, sin que sea necesaria-
mente en relación con manifiestos fenómenos de degradación perceptibles como variación del color
originario del material. Es éste el caso de las pátinas biológicas, debidas por lo general a coloniza-
ciones de macro y/o microorganismos (hongos, bacterias, algas) que inducen al biodeterioro de la
superficie y llevan a la formación de áreas con pigmentación naranja, roja, hasta parda y negra. En
particular, la precencia de alteraciones crómaticas (áreas rosadas) por colonizaciones bactéricas se
ha relevado en diferentes sitios, como por ejemplo en las losas de mármol de las fachadas de la
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