Content uploaded by Heinrich Bollwein
Author content
All content in this area was uploaded by Heinrich Bollwein on Dec 19, 2018
Content may be subject to copyright.
Berliner und Münchener Tierärztliche Wochenschrift 122, Heft 11/12 (2009), Seiten XXX–XXX 10
U.S. Copyright Clearance Center
Code Statement:
0005-9366/2009/12211-XXX $ 15.00/0
Berl Münch Tierärztl Wochenschr 122,
XXX–XXX (2009)
DOI 10.2376/0005-9366-122-XXX
© 2009 Schlütersche
Verlagsgesellschaft mbH & Co. KG
ISSN 0005-9366
Korrespondenzadresse:
heinrich.bollwein@tiho-hannover.de
Eingegangen: 28.01.2009
Angenommen: 30.06.2009
Klinik für Rinder, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover1
Rinderzucht Schleswig-Holstein eG2
Effekte der unterschiedlich starken
Verdünnung auf die individuell- und
ejakulatbedingte Variabilität der
Plasmamembranintegrität, des akro-
somalen Status und die DNA-Integrität
kryokonservierten Bullenspermas
Effects of different dilution levels on bull- and ejaculate
related variability of plasmamembran integrity, acrosomal
damage and DNA-integrity of cryopreserved bull
spermatozoa
Alice Fischer1, Erwin Hasenpusch2, Angelika Weyand2, Heinrich Bollwein1
In der vorliegenden Studie wurden die Auswirkungen drei verschiedener Sper-
maverdünnungen (60, 30 und 15 Mio/ml) auf die Qualität kryokonservierten
Bullenspermas untersucht. Hierbei wurde insbesondere darauf geachtet, ob die
Effekte der Verdünnung in Bezug auf die Spermaqualität auf bullen- oder eja-
kulatspezifischen Faktoren beruhen. Bei je vier Ejakulaten von 42 Bullen wurden
der Anteil plasmamembranintakter Spermien (PMI), der Anteil von Spermien mit
akrosomaler Schädigung (AD) sowie der Anteil an Spermien mit hohem DNA-
Fragmentationsindex (DFI%) nach der Kryokonservierung bestimmt. Die PMI-
Werte waren umso niedriger (p < 0,05), je höher der Verdünnungsgrad war. Die
AD-Werte waren unabhängig (p > 0,05) vom Verdünnungsgrad. Die DFI%-Werte
fielen (p < 0,05) mit steigendem Verdünnungsgrad. Die Variationskoeffizienten der
PMI-, AD- und DFI%-Werte waren unabhängig (p < 0,05) vom Verdünnungsgrad
des Spermas. Die Variabilitäten der PMI- und AD-Werte zwischen den Ejakulaten
waren höher als diejenigen zwischen den Bullen. Bei den DFI%-Werten überwog
bei der höchsten Spermakonzentration der Faktor Bulle und bei der niedrigsten
Konzentration der Faktor Ejakulat. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass
die Verdünnung des Spermas sowohl positive als auch negative Auswirkungen
auf die Spermaqualität hat. Mit zunehmedem Verdün-nungsgrad steigt der
Einfluss des Faktors Bulle gegenüber dem Faktor Ejakulat auf die Plasmamem-
bran- und akrosomale Integrität an, während er hinsichtlich der DNA-Integrität
abnimmt.
Schlüsselwörter: Bullenspermien, Durchflusszytometrie, Spermienkonzentration
In this study the effects of three different dilution levels (60, 30 und 15 Mio/
ml) on quality of cryopreserved bovine sperm were investigated. Particularly it
was tested, if effects of dilution in regard to sperm quality were individual- or
ejaculate related. The following parameters were analysed in four ejaculates
each of 42 bulls: percentage of plasma membrane intact sperm (PMI), percent-
age of sperm with acrosomal damage (AD) as well as percentage of sperm with
a high DNA-fragmetation index (DFI%) following cryopreservation. PMI-values
decreased (p < 0,05) with increasing degree of dilution. AD-values were not
influenced (p > 0,05) by dilution level. There was a decline in DFI% (p < 0,05) with
increasing dilution of the ejaculate. Coefficient of variation for PMI, AD and DFI%
were not (p > 0,05) influenced by dilution. The effects of the factor ejaculate
on the variabilites of PMI and AD were higher than the effects of the factor bull.
Summary
Zusammenfassung
Berliner und Münchener Tierärztliche Wochenschrift 122, Heft 11/12 (2009), Seiten XXX–XXX 11
Variability of DFI% depended at the highest dilution level more on the factor
bull and in the lowest dilution level more on the factor ejaculate. In conclusion,
these results show that dilution of sperm has positive as well as negative effects
on sperm quality. With increasing dilution the effect of the factor bull on plasma
membrane- and acrosomal integrity increased, while it decreased regarding DNA-
integrity.
Keywords: bull sperm, flow cytometry, sperm concentration
Einleitung
Die künstliche Besamung ist die wichtigste Biotechno-
logie in der Tierproduktion, wobei vorwiegend kryokon-
serviertes Sperma eingesetzt wird. Während der Kryo-
konservierung kommt es zu einer drastischen Reduktion
funktionsfähiger Spermien (Bailey et al., 2000). Die erheb-
lichen Qualitätsverluste während der Kryokonservierung
lassen sich auf eine Reihe von Faktoren zurückführen.
Hierbei handelt es sich um Effekte des Verdünners, des
Verdünnungsgrades sowie Einflüsse von Antioxidantien
und bestimmten Protienen im Seminalplasma (Karabi-
nus et al., 1991; Garner et al., 1997; Bilodeau et al., 2000;
Thun et al., 2002; Jobim et al., 2004; Prathalingam et al.,
2006; Stradaioli et al., 2007), wobei auch bullen- (Wat-
son, 1995; Watson, 2000) und ejakulatspezifische (Koess
und Bollwein, 2008) Effekte diskutiert werden. Dies
bedeutet, dass die Spermaqualität sowohl zwischen den
Bullen als auch zwischen den Ejakulaten innerhalb der
Bullen variiert (Koess und Bollwein, 2008). Hinsichtlich
der tierindividuellen Variationen in der Spermaqualität
nach dem Kryokonservierungsprozess wird daher zwi-
schen „good freezern“ und „bad freezern“ differenziert
(Curry, 2000; Watson, 2000).
Bei der Herstellung von Spermaportionen für die
künstliche Besamung wird das Ejakulat mit einem Ver-
dünner versetzt und die Zahl der Spermien pro Besa-
mungsdosis standardisiert (Haugan et al., 2005). Die
Verdünnung des Samens ist einerseits wichtig, um das
Volumen des Ejakulats zu vergrößern, andererseits aber
auch, um durch bestimmte Substanzen im Verdünner
die Spermien während des Kühlens und Gefrierens zu
schützen und deren Lebensspanne zu verlängern (Foote
und Kaproth, 1997; Holt, 2000; Foote, 2001).
Bisher wurde von mehreren Autoren die Effekte der
Verdünnung von Ejakulaten im Hinblick auf die Sper-
maqualität mit zum Teil widersprüchlichen Ergebnissen
untersucht. Garner et al. (1997) beobachteten mit stei-
gendem Verdünnungsgrad eine Abnahme plasmamem-
branintakter Spermien nach der Kryokonservierung.
Dagegen waren in einer anderen Studie (Prathalingam
et al., 2006) keine Unterschiede in der Plasmamem-
branintegrität in Abhängigkeit von der Verdünnung zu
beobachten, während der Anteil von lebenden akroso-
menreagierten Spermien bei den stärker verdünnten
Proben erhöht war. Auch in Bezug auf die DNA-Inte-
grität wurden Untersuchungen mit verschiedenen Ver-
dünnungsstufen durchgeführt. Bei der geringsten Sper-
mienkonzentrationen waren von Khalifa et al. (2008)
die stärksten Veränderungen in der DNA-Integrität zu
beobachten. Im Gegensatz dazu waren in einer ande-
ren Studie keine Auswirkungen des Verdünnungsgrades
auf die DNA-Integrität zu beobachten (Ballester et al.,
2007).
Alle oben genannten Studien zu den Effekten der
Verdünnung auf die Spermaqualität wurden an relativ
beschränkten Tierzahlen durchgeführt. Es wurden daher
in diesen Arbeiten keine Angaben darüber gemacht,
ob es bei der Verdünnung des Spermas bullen- oder
ejakulatspezifische Effekte auf die Spermaqualität gab.
Das Ziel der vorliegenden Studie war es daher, an einer
repräsentativen Bullenanzahl zu testen, ob und inwie-
weit bullen- und ejakulatspezifische Faktoren die Effekte
der Verdünnung auf die Spermaqualität beeinflussen.
Material und Methoden
Tiere und Samengewinnung
Es wurden insgesamt 168 Ejakulate von 42 Bullen einer
Besamungsstation im Norden Deutschlands verwendet.
Von jedem Tier wurden vier an aufeinander folgenden
Sprungtagen gewonnene Ejakulate analysiert. Die Sper-
magewinnung erfolgte in drei- bzw. viertägigen Abstän-
den mit Hilfe einer künstlichen Vagina und einem Bullen
als Sprungpartner. Von den Tieren gehörten 28 Bullen
der Rasse Holstein Friesian, zwölf der Rasse Red Hol-
stein Frisian und zwei der Rasse Angler an. Das Alter
der Tiere lag bei 2,55 ± 1,93 Jahren. Für die vorliegenden
Untersuchungen wurden alle Ejakulate verwendet, auch
wenn diese nicht die Mindestanforderungen der Bullen-
station erfüllten.
Es wurden vor der Abkühlung von jedem Ejakulat
Konzentrationen von 60, 30 bzw. 15 Mio. Spermien/
ml durch Verwendung des Verdünners Andromed® (Fa.
Minitüb, Tiefenbach) hergestellt. Nach dem Abfüllen des
verdünnten Spermas in 0,25-ml-Pailletten wurden diese
kryokonserviert. Hierfür wurden die Pailletten zunächst
über 1,5 Stunden auf 9 °C und danach über weitere
1,5 Stunden auf 4 °C heruntergekühlt. Das Einfrieren
erfolgte in einem Einfrierautomaten (Typ Digitcool 5300,
Fa. IMV, L`Aigle, Frankreich) nach einem festgelegten
Temperaturschema innerhalb von 7,5 Minuten bis zu
einer Temperatur von –140 °C durch Einleitung von
Stickstoffdampf. Hierbei wurde in den ersten drei Minu-
ten mit einer Geschwindigkeit von 4,7 °C/Minute die
Temperatur auf –10 °C erniedrigt. In den nächsten zwei
Minuten wurde mit einer Abkühlungsrate von 29 °C/
Minute weiter bis auf –68 °C abgesenkt, um in der Fol-
gezeit mit einer Abkühlgeschwindigkeit von 10 °C pro
Minute die Pailletten auf eine Temperatur von –140 °C
zu bringen. Abschließend wurden die Pailletten direkt in
ein Behältnis mit flüssigem Stickstoff verbracht und wur-
den dort bis zu den weiteren Analysen für mindestens 24
Stunden gelagert.
Das Auftauen der Pailletten erfolgte für 30 Sekun-
den in einem Wasserbad bei 37 °C. Für die Analyse
der kryokonservierten Proben wurden jeweils 4 Pail-
Berliner und Münchener Tierärztliche Wochenschrift 122, Heft 11/12 (2009), Seiten XXX–XXX 12
letten gepoolt, um eventuell nach der Kryokonservie-
rung bestehende Variabilitäten in der Spermaqualität
zwischen verschiedenen Pailletten desselben Ejakulates
weitgehend auszugleichen.
Durchflusszytometrische Untersuchungen
Für die durchflusszytometrische Analyse der Plas-
mamembranintegrität und des akrosomalen Status
wurde das Sperma mit Hepes-gepuffertem Medium
(0,1 M NaCl, 3 mM KCl, 2,6 mM CaCl2, 0,85 mM
MgCl2, 0,4 mM Na2HPO4, 0,1 mM C3H3NaO3,25 mM
NaHCO3, Natrium-Laktat-Sirup 4,04 ml/1000 ml, 10
mM Hepes, Penicillin K 0,050 g/1000 ml, 0,02 mM PVP,
A B B I L D U N G 1 : Punktwolkendiagramm mit unterschiedlichen
Spermienpopulationen (R) nach FITC-PNA / PI-Färbung und
anschließender durchflusszytometrischer Auswertung.
R 1 = plasmamembranintakte Spermien mit negativem akroso-
malen Status; R 2 =plasmamembrandefekte Zellen mit negativem
akrosomalen Status; R 3 = plasmamembrandefekte Zellen mit
positivem akrosomalen Status; R 4 = plasmamembranintakte
Zellen mit positivem akrosomalen Status.
A B B I L D U N G 2 A : Punktwolkendiagramm (a) bei der durch-
flusszytometrisch durchgeführten Analyse der DNA-Integrität.
Schematische Darstellung der Spermien mit grüner Fluoreszenz
(b), d. h. doppelsträngiger DNA und Spermien mit erhöhter Rot-
fluoreszenz (c), d.h. mit vermehrt vorkommender einzelsträngiger
DNA nach dem SCSA™.
A B B I L D U N G 2 B : Häufigkeitsverteilung der DFI-Werte,
d. h. des Anteils der Rotfluoreszenz an der Gesamtfluores-
zenz (rot + grün) (modifiziert nach Evenson et al., 2002)
ANMERKUNG DER REDAKTION: LIEGEN IHNEN HIERFÜR DIE
COPYRIGHT-RECHTE VOR? ANSONSTEN DÜRFEN WIR DIESE
ABBILDUNG LEIDER NICHT VERÖFFENTLICHEN!!!!
0,007 mM PVA; in Aqua bidest., pH 7,4) auf eine Kon-
zentration von 5,0 x106 Spermien/ml gebracht. Für die
Bestimmung der prozentualen Anteile plasmamem-
branintakter Spermien (PMI) und des positiven akro-
somalen Status (AD) diente die kombinierte Färbung
mittels Fluoreszein-Isothiocyanat-Peanut Agglutinin
(FITC-PNA) und Propidiumiodid (PI). FITC-PNA (Fa.
Sigma-Aldrich, München) wurde in einer Konzentra-
tion von 100 μg/ml Aqua bidest. eingesetzt und PI (Fa.
Sigma-Aldrich, München) lag in einer Konzentration
von 2,99 mM vor. Von der verdünnten Spermiensus-
pension wurden 500 μl mit 3 μl PI und 5 μl FITC-PNA
versetzt. Die Probe wurde anschließend für 15 Minuten
in einem Wärmeblock bei 37 °C inkubiert, bevor die
Analyse erfolgte. Bei der Auswertung des mit Hilfe
des Durchflusszytometers erstellten Punktwolkendia-
gramms, bei der die Intensität der grünen Fluoreszenz
auf der Abszisse und diejenige der roten Fluores-
zenz auf der Ordinate dargestellt wurden, ergeben sich
vier Spermienpopulationen (Abb. 1): die Population
der plasmamembranintakten Spermien mit negativem
akrosomalen Status (R1), die Population plasmamem-
brangeschädigter Spermien mit negativem akrosoma-
len Status (R2), die Population der plasmamembrange-
schädigten Spermien mit positivem akrosomalen Status
(R3) und die Population der plasmamembranintakten
Spermien mit positivem akrosomalen Status (R4). Für
die Auswertung der Daten wurden die plasmamem-
branintakten Spermien (PMI: R1 + R4) und die Sper-
mien mit defektem Akrosom (AD: R3 + R4) errechnet.
Der Prozentsatz an Spermien mit hohem DNA-Frag-
metationsindex (DFI%) wurde anhand des SCSA™
bestimmt (Evenson et al., 2002). Für diesen Test wurde
unmittelbar nach dem Auftauen eine Spermiensuspen-
sion von 2x106 Spermien/ml mit eisgekühltem TNE-
Puffer nach Evenson et al. (2002) hergestellt. Von dieser
Suspension wurden 200 μl für 30 Sekunden mit Säure-
detergenzlösung (pH 1,2; 0,1% Triton X-100, 0,15 mol/l
NaCl, 0,08 N HCl) behandelt und anschließend mit
6 mg/l Akridinorange in Phosphat-Citrat-Puffer (0,2
FL-1 (grüne Fluoreszenz)
0 200 400 600 800 1000
Berliner und Münchener Tierärztliche Wochenschrift 122, Heft 11/12 (2009), Seiten XXX–XXX 13
M Na2HPO4, 0,1 M Citric acid, 0,15 M NaCl, 1 mM
EDTA, pH 6,0) für eine Dauer von drei Minuten gefärbt.
Mit Hilfe einer computergestützten Auswertung der
Punktwolkendiagramme (Abb. 2A) wurde für jedes
einzelne Spermium der Anteil der Rotfluoreszenz
an der Gesamtfluoreszenz, bestehend aus roter und
grüner Fluoreszenz, errechnet. Dieser Wert wird als
DFI-Wert (DNA Fragmentation Index) bezeichnet. Die
DFI-Werte aller analysierten Spermien einer einge-
setzten Probe wurden in einem Verteilungshistogramm
(Abb. 2B) dargestellt. Im nächsten Schritt wurde durch
manuelles Einziehen einer Markierungslinie die Sper-
mien mit erhöhten DFI-Werten von denjenigen mit
niedrigen DFI-Werten abgegrenzt. GRENZWERT DEFI-
NITION? (BITTE ERGÄNZEN BZW. KORRIGIEREN) Das
Computerprogramm berechnete auf dieser Basis den
prozentualen Anteil der Spermien mit erhöhten DFI-
Werten an der Gesamtpopulation (DFI%).
Die Studien wurden mit einem Durchflusszytome-
ter Epics XL der Firma Beckman Coulter (Fullerton,
Californien, USA) durchgeführt. Für die Messungen
wurden zwei verschiedene Filter eingesetzt, einer
für die grüne Fluoreszenz mit einer Bandbreite von
530 ± 30 nm und einer für die rote Fluoreszenz mit
einer Wellenlänge von ≥ 650 nm. Die Bearbeitung und
Auswertung der Daten erfolgte mit den Software-
Programmen EXPO 32 ADC XL 4 Color™ und EXPO
32 Analysis™ (Fa. Beckman Coulter, Fullerton, Cali-
fornien, USA). Die Auswertung der SCSA™-Daten
wurde mit dem Software-Programm DAS Version 4.40
(Beisker, 1994) durchgeführt.
Statistische Analysen
Die Datenverwaltung und die statistischen Auswer-
tungen erfolgten mit dem Programm SPSS 15.0 (Fa.
SPSS Inc., Chicago). In der deskriptiven Statistik wur-
den die Daten mit dem Mittelwert (bˉ), der Standardab-
weichung (sd) und den Minimal- (Min) und Maximal-
werten (Max) beschrieben. Um die interindividuellen
Variationen zu beurteilen, wurde der Variationskoeffi-
zient (CV) ermittelt. Die Variabilitäten der Spermapa-
rameter bei den einzelnen Verdünnungsstufen wurde
mit Hilfe des F-Testes verglichen. Die Überprüfung
des Einflusses des Faktors Verdünnung erfolgte mit-
tels einfaktorieller Varianzanalyse. Ob Unterschiede in
der Spermaqualität zwischen den Verdünnungsstufen
bestehen, wurden anhand des Fisher´s PLSD beurteilt.
Zum Vergleich von ejakulat- oder bullenbedingten Ein-
flüssen auf die Variabilität der Messergebnisse wurden
Varianzkomponentenschätzungen durchgeführt.
Ergebnisse
Zusammenhänge zwischen Spermakonzentration und
Spermaqualität
Die PMI-Werte fielen zwischen den Konzentrationen
60 Mio./ml und 15 Mio./ml um 3,82 % ab (p > 0,0001).
Dagegen unterschieden sich die AD-Werte nicht
(p > 0,05) zwischen den verschiedenen Verdünnungs-
stufen. Der Parameter DFI% sank (p > 0,0001) mit
zunehmender Verdünnung um je 1,13 % zwischen den
Konzentrationen 60 Mio./ml und 15 Mio./ml (Tab.1).
Ejakulat- und individuellbedingte Variabilität der
Spermaqualität
Die Variabilitäten der Parameter PMI, AD und DFI%
zeigten keine Unterschiede zwischen den verschie-
denen Konzentrationen (Tab. 1). Die ejakulatbedingten
Unterschiede in den Parametern PMI und AD waren
mit 52–70 % höher als bullenbedingte Variationen mit
30–48 %. Weiterhin war festzustellen, dass mit stei-
gendem Verdünnungsgrad der Einflussfaktor des Bullen
für PMI um 18 % und für AD um 15 % zunahm. Bei den
DFI%-Werten war bei der höchsten Konzentration der
individuelle Effekt stärker als derjenige des Ejakulates.
Mit steigender Verdünnung änderte sich dies. So hing
die Variabilität der DFI%-Werte bei der höchsten Ver-
dünnungsstufe stärker vom Ejakulat als vom Bullen ab
(Tab. 1).
Diskussion
Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen, dass ein
steigender Verdünnungsgrad sich negativ auf die Plas-
mamebranintegrität auswirkt. Der Abfall von PMI-Sper-
mien mit steigendem Verdünnungsgrad könnte auf die
Verminderung von schützenden Substanzen des Semi-
nalplasmas zurückzuführen sein, da im Zuge der Ver-
dünnung eines Ejakulates neben den Spermien auch das
enthaltene Seminalplasma verdünnt wird (Haugan et al.,
2007). Es wird vermutet, dass es bei der Verdünnung zur
Entfernung von an die Spermien angelagerten Proteinen,
natürlichen Antioxidantien und weiteren bedeutenden
Komponenten des Seminalplasmas kommt, welche für
die Membranintegrität und die Funktion des Spermiums
wichtig sind (Maxwell und Johnson, 1999). Ähnliche
Beobachtungen wurden auch bereits in einer ande-
ren Studie gemacht (Garner et al., 2001). Hier wurden
verschiedene Spermakonzentrationen hergestellt, wobei
es jeweils Ansätze ohne und mit Zugabe von Seminal-
TA B E L L E 1 : Plasmamembranintegrität (PMI), positiver akrosomaler Status (AD), DNA-Integrität (DFI) in
Abhängigkeit von der Konzentration der Spermien. Es wurden von 42 Bullen je vier Ejakulate untersucht
Parameter Konz b
ä±sd Min. Max. VK [%] Schätz wert (%)
Bulle Ejakulat*
PMI [%] 60
30
15
40,15a
38,54b
36,33c
7,48
8,09
7,93
19,89
17,04
15,19
55,21
54,81
54,27
27
28
28
30
41
48
70
59
52
AD [%] 60
30
15
29,51
29,88
30,15
7,43
8,33
8,41
15,89
16,36
16,81
48,36
55,34
57,13
36
37
36
31
41
46
69
59
54
DFI[%] 60
30
15
2,90a
2,48b
1,77c
1,66
1,52
0,98
1,15
0,88
0,53
7,23
7,06
5,04
69
75
72
58
55
44
42
45
56
Kon z. = Ko nzent rati on v on 6 0, 3 0 od er 1 5 Mi llio nen Sper mien/ ml; VK = Vari ation skoe ffiz ient [%]; Sc hätz wert = * = gesch acht elt inne rhalb der Bu llen;
a, b un d c = We rte mit unte rschi edli chen Buc hstab en i nner halb ein er S palte de s en tspre chen den Param eters unt ersc heide n si ch ( p ≤ 0,0 1).
Berliner und Münchener Tierärztliche Wochenschrift 122, Heft 11/12 (2009), Seiten XXX–XXX 14
plasma gab. Ohne Seminalplasmazusatz kam es zu dem
bereits weiter oben beschriebenen Verdünnungseffekt.
Bei den anderen Proben mit Seminalplasma war zwar
auch ein Verdünnungseffekt zu beobachten, dieser fiel
jedoch deutlich geringer aus, als bei den Spermien ohne
Seminalplasmazusatz.
Dagegen nahm der Anteil an Spermien mit gestörter
DNA-Integrität mit zunehmender Verdünnung ab. Die
Auswirkungen der Verdünnung auf die DNA-Integrität
lassen auf einen negativen Einfluss des Seminalplasmas
auf die DNA-Integrität schließen. Ein derartiges Phä-
nomenen wurde bereits bei Hengstsperma beschrieben
(Love et al., 2005). In der genannten Studie von Love
et al. (2005) wurden Untersuchungen an gekühlten
Hengstspermien mit drei verschiedenen Seminalplas-
magehalten durchgeführt. Eine Erhöhung des Gehaltes
an Seminalplasma führte in der oben genannten Arbeit
zu einer Zunahme der DNA-Schädigung. Daher wird
von den Autoren angenommen, dass Seminalplasma
Faktoren enthält, welche sich schädlich auf die Sper-
mien-DNA auswirken. Es ist außerdem bekannt, dass
es Auswirkungen verschiedener Verdünner auf den pro-
zentualen Anteil von Spermien mit Chromatinstruktur-
veränderungen nach der Kryokonservierung gibt (Kara-
binus et al., 1991).
Einleitend wurde bereits darauf hingewiesen, dass
es in der Literatur sehr unterschiedliche Ergebnisse im
Hinblick auf die Verdünnung von Ejakulaten auf die
Spermaqualität gibt (Garner et al., 1997; Prathalingam et
al., 2006; Ballester et al., 2007; Khalifa et al., 2008). Diese
teilweise sehr divergierenden Resultate hinsichtlich
der Auswirkungen unterschiedlicher Konzentrationen
auf die Spermaqualität konservierten Bullenspermas
könnten daran liegen, dass die Anzahl der untersuchten
Tiere in den oben genannten Studien sehr begrenzt
war. Eine andere Ursache könnte darin bestehen, dass
die Versuchsbedingungen, wie die Art des gewählten
Verdünners bzw. der Verdünnungsgrad des Spermas, die
Lagerungsdauer- und temperatur vor dem Einfrieren
sowie das Einfrierprotokoll zwischen den Studien stark
variierten (Garner et al., 1997; Prathalingam et al., 2006;
Ballester et al., 2007; Khalifa et al., 2008). Daher sollten
die Ergebnisse der Verdünnung auf die Spermaquali-
tät jeweils unter den gegebenen Versuchsbedingungen
betrachtet werden.
Die Variabilitäten der PMI-, AD- und DFI%-Werte
unterschieden sich nicht zwischen den in verschiedenen
Spermakonzentrationen eingefrorenen Proben. In der
Literatur sind keine vergleichbaren Studien zu finden.
Bei der Gegenüberstellung der Einflussfaktoren Bulle
und Ejakulat auf die Variabilität des Spermas zeigte sich
bezüglich der Integritäten der Plasmamembran- und des
Akrosoms, dass das Ejakulat einen erheblichen Einfluss
auf die Variabilitäten der Parameter hatte. Dieses Phäno-
men wurde auch bereits in anderen Studien beschrieben
(Hafs et al., 1957; Koess und Bollwein, 2008).
Die Analyse der DNA-Integrität ergab, dass die DNA-
Integrität weit weniger als die anderen Spermaquali-
tätsparameter von ejakulatbedingten Faktoren abhängt.
Viele andere Studien haben gezeigt, dass die DNA-
Integrität bei Individuen in aufeinander folgenden Pro-
ben gleich bleibt und die SCSA-Ergebnisse viel weniger
zeitlich bedingten Schwankungen unterworfen sind als
klassische Spermienparameter (Evenson et al., 1991;
Zini et al., 2001; Smit et al., 2007).
Der bullenbedingte Einfluss auf die Plasmamem-
bran- und akrosomale Integrität war mit steigendem
Verdünnnungsfaktor angestiegen. Dies bedeutet, dass
die Verdünnbarkeit des Spermas tierindividuell variiert.
Man differenziert in der Literatur (Watson, 1995; Curry,
2000; Watson, 2000) zwischen sog. „good freezern“
und „bad freezern“. Als Grund für die unterschiedliche
Einfrierbarkeit bei verschiedenen Individuen wird eine
unterschiedliche Ausstattung der Spermienmembran
mit Lipiden und Proteinen vermutet (Holt et al., 2005).
So gibt es deutliche Unterschiede in der Membran-
permeabilität der Spermien für Wasser und Glycerol
bei verschiedenen Bullen (Chaveiro et al., 2006). Diese
physikalischen Unterschiede werden auf eine unter-
schiedliche Lipidausstattung der Membranen, einen
unterschiedlichen Cholesterolgehalt der Membran oder
auch auf eine unterschiedliche Ausstattung der Spermi-
enmembran mit Membranporen, welche am Transport
von Wasser und kryoprotektiven Substanzen beteiligt
sein könnten, zurückgeführt (Chaveiro et al., 2006). Die
Abnahme der Variabilität der DNA-Integrität bei höheren
Verdünnungsgraden ist auf den niedrigeren Gehalt an
Seminalplasma in den Proben zurückzuführen sein. Wie
bereits oben erwähnt, wird davon ausgegangen, dass
Seminalplasma toxische Substanzen enthält, welche
einen negativen Effekt auf die DNA ausüben.
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse der vor-
liegenden Studie, dass unter den gegebenen Untersu-
chungsbedingungen eine zunehmende Verdünnung des
Bullenspermas negative Auswirkungen auf die Plas-
mamembranintegrität, keinen Einfluss auf die akroso-
male Integrität und einen positiven Effekt auf die DNA-
Integrität hat. Die Integrität der Plasmamembran und
des Akrosoms hängen hauptsächlich von ejakulatbe-
dingten Faktoren ab, während die DNA-Integrität vor-
wiegend eine bullenspezifische Eigenschaft darstellt. Mit
steigendem Verdünnungsgrad nimmt der bullenspezi-
fische Effekt auf die Integrität der Plasmamembran und
des Akrosoms zu, ist dabei aber immer noch niedriger
als der Effekt des Ejakulates. Der bullenspezifische Effekt
auf die DNA-Integrität hatte mit zunehmender Verdün-
nung abgenommen, war aber immer noch stärker als die
ejakulatbedingte Variabilität dieses Parameters.
Schlussfolgerung
Da es mit steigendem Verdünnungsgrad bei PMI zu
einer Erhöhung des bullenbedingten Einfluss auf die
Variabilität der Messergebnisse kommt, gibt es Unter-
schiede in der Verdünnbarkeit der jeweiligen Bullen.
Da der Effekt des Bullen aber immer noch niedriger als
derjenige des Ejakulates ist, ist die Kryokonservierbarkeit
nach Verdünnung weniger vom Bullen als vom jewei-
ligen Ejakulat abhängig. Eine stärkere Verdünnung statt
der heute üblichen Konzentrationen von 60–80 Milli-
onen Spermien/ml würde zwar zu einer höheren Aus-
beute an Pailletten führen, da sich hierdurch aber neben
dem positiven Effekt auf die DNA-Integrität schädliche
Effekte auf die Plasmamembran ergeben, ist eine stär-
kere Verdünnung der Ejakulate nicht anzuraten.
Berliner und Münchener Tierärztliche Wochenschrift 122, Heft 11/12 (2009), Seiten XXX–XXX 15
Literatur
Ballester J, Johannisson A, Saravia F, Haard M, Gustafsson
H, Bajramovic D, Rodriguez-Martinez H (2007): Post-thaw
viability of bull AI-doses with low-sperm numbers. Theriog-
enology 68: 934–943.
Bailey JL, Bilodeau J, Cormier N (2000): Semen Cryopreservation
in Domestic Animals: A Damaging and Capacitating Phenom-
enon. J Androl 21: 1–6.
Beisker W (1994): A new combined integral-light and slit-scan
data analysis system (DAS) for flow cytometry. Comp. Meth.
Programs Biomed. 42: 15–26.
Bilodeau JF, Chatterjee S, Sirard MA, Gagnon C (2000): Levels of
antioxidant defenses are decreased in bovine spermatozoa after
a cycle of freezing and thawing. Mol Reprod Dev 55: 282–288.
Chaveiro A, Liu J, Engel B, Critser JK, Woelders H (2006):
Significant variability among bulls in the sperm membrane
permeability for water and glycerol: possible implications for
semen freezing protocols for individual males. Cryobiology 53:
349–359.
Curry MR (2000): Cryopreservation of semen from domestic live-
stock. Rev Reprod 5: 46–52.
Evenson DP, Jost LK, Baer RK, Turner TW, Schrader SM (1991):
Individuality of DNA denaturation patterns in human sperm
as measured by the sperm chromatin structure assay. Reprod
Toxicol 5: 115–125.
Evenson DP, Larson KL, Jost LK (2002): Sperm chromatin struc-
ture assay: its clinical use for detecting sperm DNA fragmenta-
tion in male infertility and comparisons with other techniques.
J Androl 23: 25–43.
Foote RH (2001): The history of artificial insemination: Selected
notes and notables. Am Soc Animal Sci 1–10.
Foote RH, Kaproth MT (1997): Sperm numbers inseminated
in dairy cattle and nonreturn rates revisited. J Dairy Sci 80:
3072–3076.
Garner DL, Thomas CA, Allen CH (1997): Effect of semen dilu-
tion on bovine sperm viability as determined by dual-DNA
staining and flow cytometry. J Androl 18: 324–331.
Garner DL, Thomas CA, Gravance CG, Marshall CE, DeJarnette
JM, Allen CH (2001): Seminal plasma addition attenuates the
dilution effect in bovine sperm. Theriogenology 56: 31–40.
Hafs HD, Bratton RW, Henderson CR, Foote RH (1957): Estima-
tion of some variance components of bovine semen criteria and
their use in the design of experiments. J Dairy Sci 41: 96–104.
Haugan T, Grohn YT, Kommisrud E, Ropstad E, Reksen O
(2007): Effects of sperm concentration at semen collection and
storage period of frozen semen on dairy cow conception. Anim
Reprod Sci 97: 1–11.
Haugan T, Reksen O, Grohn YT, Kommisrud E, Ropstad E,
Sehested E (2005): Seasonal effects of semen collection and
artificial insemination on dairy cow conception. Anim Reprod
Sci 90: 57–71.
Holt WV (2000): Basic aspects of frozen storage of semen. Anim
Reprod Sci 62: 3–22.
Holt WV, Medrano A, Thurston LM, Watson PF (2005): The sig-
nificance of cooling rates and animal variability for boar sperm
cryopreservation: insights from the cryomicroscope. Theriog-
enology 63: 370–382.
Jobim MI, Oberst ER, Salbego CG, Souza DO, Wald VB, Tra-
montina F, Mattos RC (2004): Two-dimensional polyacrylamide
gel electrophoresis of bovine seminal plasma proteins and their
relation with semen freezability. Theriogenology 61: 255–266.
Karabinus DS, Evenson DP, Kaproth MT (1991): Effects of egg
yolk-citrate and milk extenders on chromatin structure and
viability of cryopreserved bull sperm. J Dairy Sci 74: 3836–3848.
Khalifa TA, Rekkas CA, Lymberopoulos AG, Sioga A, Dimitri-
adis I, Papanikolaou T (2008): Factors affecting chromatin sta-
bility of bovine spermatozoa. Anim Reprod Sci 104: 143–163.
Koess C, Bollwein H (2008): Variabilität in der Plasmamembran-
integrität, im Mitochondrienmembranpotential und im akro-
somalen Status vor und nach der Kryokonservierung von Bul-
lensperma. Berl Münch Tierärztl Wochenschr 121: 73–77.
Love CC, Brinsko SP, Rigby SL, Thompson JA, Blanchard TL,
Varner DD (2005): Relationship of seminal plasma level and
extender type to sperm motility and DNA integrity. Theriog-
enology 63: 1584–1591.
Maxwell WM, Johnson LA (1999): Physiology of spermatozoa at
high dilution rates: the influence of seminal plasma. Theriog-
enology 52: 1353–1362.
Prathalingam NS, Holt WV, Revell SG, Jones S, Watson PF
(2006): Dilution of spermatozoa results in improved viability fol-
lowing a 24 h storage period but decreased acrosome integrity
following cryopreservation. Anim Reprod Sci 91: 11–22.
Smit M, Dohle GR, Hop WC, Wildhagen MF, Weber RF, Romijn
JC (2007): Clinical correlates of the biological variation of sperm
DNA fragmentation in infertile men attending an andrology
outpatient clinic. Int J Androl 30: 48–55.
Stradaioli G, Noro T, Sylla L, Monaci M (2007): Decrease in
glutathione (GSH) content in bovine sperm after cryopreserva-
tion: comparison between two extenders. Theriogenology 67:
1249–1255.
Thun R, Hurtado M, Janett F (2002): Comparison of Biociphos-
Plus and TRIS-egg yolk extender for cryopreservation of bull
semen. Theriogenology 57: 1087–1094.
Watson PF (1995): Recent developments and concepts in the cryo-
preservation of spermatozoa and the assessment of their post-
thawing function. Reprod Fertil Dev 7: 871–891.
Watson PF (2000): The causes of reduced fertility with cryopre-
served semen. Anim Reprod Sci 60-61: 481–492.
Zini A, Kamal K, Phang D, Willis J, Jarvi K (2001): Biologic vari-
ability of sperm DNA denaturation in infertile men. Urology 58:
258–261.
Korrespondenzadresse:
Prof. Dr. Heinrich Bollwein
Klinik für Rinder
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Bischofsholer Damm 15
30173 Hannover
heinrich.bollwein@tiho-hannover.de
