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UFF - UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
NOEMI DE JESUS HILLER
SÍNTESE E AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DE BORONO-TIRFOSTINAS
Niterói-RJ
2020
ii
UFF - UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
NOEMI DE JESUS HILLER
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Química da Universidade
Federal Fluminense, como requisito parcial
para obtenção do título de Mestre em
Química. Área de concentração: Química
Orgânica
ORIENTADORA: Prof. Drª. Daniela de Luna Martins
COORIENTADOR: Dr. Robson Xavier Faria
Niterói-RJ
2020
iii
iv
NOEMI DE JESUS HILLER
SÍNTESE E AVALIAÇÃO BIOLÓGICA DE BORONO-TIRFOSTINAS
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Fernando Martins dos Santos Jr.-IQ/UFF
Niterói-RJ
Março/2020
v
Dedico este trabalho à minha família por
compartilhar meus sonhos e por me
incentivar a cada dia a ser uma pessoa e
uma profissional melhor. Aos meus amigos,
que foram decisivos no meu progresso, pelo
companheirismo, ajuda e força que me
deram para que eu pudesse cumprir mais
esta etapa.
vi
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar, agradeço a Deus, o autor da minha vida, por Sua graça e bondade,
pela Sua força nos tempos de dificuldade e por Sua alegria diária. Porque sem Ele nada
disso seria possível.
Agradeço aos meus pais, Alexandre Guimarães Hiller e Virgínia Lucia de Jesus Hiller,
pela sabedoria e ensinamentos transmitidos, por me formar e me educar nos mínimos
detalhes. Muito obrigado pelo carinho, dedicação e preocupação, pelas noites mal
dormidas, pelas orações, por todo esforço, por todo amor, por todo incentivo. Agradeço
a minha família em geral, que não se restringe ao sangue, por estarem sempre presentes.
Ao meu marido, Pedro Henrique V. de Sousa, por acreditar em mim, mesmo quando
eu não acredito. Obrigado por ser meu maior incentivador, por estar ao meu lado em
todos os momentos me dando esperança, alegria e muita comida. Muito obrigado pelo
amor e pela amizade, você é imprescindível.
À minha orientadora, Profª. Drª. Daniela de Luna Martins, por ser um exemplo de
força, dedicação e perseverança. Agradeço pelo incentivo e conhecimento transmitido.
Muito obrigado por sempre me dar o melhor, pelas milhões de correções, pelas horas
sem fim de dedicação com o objetivo de me ensinar e me passar toda sua sabedoria.
Não sei como te agradecer o suficiente.
Ao meu coorientador Prof. Robson Xavier Faria muito obrigado, por todo esforço,
paciência e tempo gasto em me ensinar e em responder minhas infindáveis perguntas
sobre biologia.
A todos que fizeram parte do Grupo de Pesquisa em Catálise e Síntese de pesquisa
(Grupo CSI), e aos alunos de outro(s) grupo(s) de pesquisa com quem compartilhei o
espaço do Laboratório 413, pela amizade, incentivo e ajuda que foram importantíssimas
para realizar este trabalho.
Aos professores da Universidade Federal Fluminense pelos ensinamentos
transmitidos durante o curso de Mestrado em Química no PPGQ-UFF. Aos técnicos que
trabalham no LaReMN fornecendo as análises de RMN e aos técnicos que fornecem as
análises de IV.
À banca examinadora constituída pelos professores Drª. Andréa Luzia Ferreira de
Souza e Dr. Tiago Lima da Silva por aceitarem o convite para compor como titulares a
vii
banca avaliadora de minha dissertação, pelo tempo dedicado a ler meu trabalho e pelas
sugestões e correções. E ao Dr. José Celestino de Barros Neto e ao professor Dr.
Fernando Martins dos Santos Jr. por aceitarem compor como membros suplentes da
banca avaliadora e por suas contribuições.
A todos que, de alguma maneira contribuíram para a realização deste trabalho.
Em geral, a todos que passaram pela minha vida, me influenciando de alguma forma,
meu muito obrigado.
viii
“Feliz o homem que acha sabedoria, e o homem que adquire conhecimento; porque
melhor é o lucro que ela dá do que o da prata, e melhor a sua renda do que o ouro mais
fino. Mais preciosa é do que pérolas, e tudo o que podes desejar não é comparável a
ela.”
(Provérbios 3:13-15)
ix
RESUMO
No presente trabalho, descreve-se a síntese de benzeno-vinilnitrilas conhecidas (R =
81-98%, tirfostinas) e de ácidos borônicos de E-(benzeno-vinilnitrilas) inéditos (R = 84-
91%, borono-tirfostinas) através da condensação de Knoevenagel em água sem uso de
catalisador. Tanto a reação quanto o isolamento foram realizados sem emprego de
solventes orgânicos. Uma vez que as moléculas preparadas possuem em sua estrutura
uma porção benzeno-vinilnitrila, são consideradas membros da família das tirfostinas, as
quais são conhecidas por inibirem a fosforilação de diferentes tirosinas quinases. Essas
proteínas são alvos moleculares importantes em doenças inflamatórias e doenças com
componente inflamatório proeminente, tais como Câncer e Doença de Chagas. O
receptor P2X7 (P2X7R) é um outro alvo terapêutico estratégico para o desenvolvimento
de anti-inflamatórios. Uma série NO composta de quatro análogos de ácidos borônicos
(borono-tirfostinas) e seis benzeno-vinitrilas (tirfostinas sem o boro) foi avaliada quanto
ao seu efeito sobre o P2X7R de humano e de camundongo. Verificou-se a importância
do grupo farmacofórico (B(OH)2) na atividade biológica. Os ácidos borônicos (65a) NO-
01 e (65c) NO-12 inibiram in vitro a função do P2X7R de humano (65a: IC50 = 0,021 μM;
65c: 0,243 μM) e de camundongo (65a: IC50 = 0,042 μM; 65c: 0,537 μM). Esses análogos
apresentaram um efeito melhor, ou similar ao obtido pelos antagonistas do P2X7R BBG
e A740003 nos testes de captação de corante, liberação de IL-1β in vitro e edema de
pata de camundongo induzido por ATP in vivo. O (65a) NO-01 apresentou os melhores
resultados da série, tanto nos ensaios in vitro quanto nos in vivo. O docking molecular
sugere a interação entre os NO’s e a parte superior do poro do P2X7R através de
interações hidrofóbicas e ligações de hidrogênio. Esses resultados indicam que o (65a)
NO-01 pode ser utilizado como protótipo no desenvolvimento de outros inibidores do
P2X7R. A atividade anticâncer (65c: IC50 = 0,14 μM células GH3) e tripanocida (65c: EC50
= 0,795 μM, Cepa Y) in vitro da série NO foi avaliada, demonstrando a importância da
introdução da unidade B(OH)2 no aumento da atividade biológica das tirfostinas obtidas.
Palavras-chave: P2X7R; Tirosina quinase; Ácidos borônicos; Benzeno-vinilnitrilas;
Tirfostinas
x
ABSTRACT
In the present work, it is described the synthesis of well-known cyanovinylbenzenes
(R = 81-98%) and novel E-(cyanovinyl)benzeneboronic acids (R = 84-91%) through
Knoevenagel condensations without catalysts, and in water. This simple protocol
completely avoided the use of organic solvents in the synthesis and in the work-up
process. The molecules synthetized enclose an aryl-cyanovinyl moiety in its structure;
therefore, are recognized as members of the tyrphostins family, that is known to inhibit
inhibit tyrosine kinase family phosphorylation. These proteins are important targets in
inflammatory diseases and inflammation-correlated diseases, such as Cancer and
Chagas’s disease. Another important target in inflammation is the P2X7 receptor
(P2X7R). Currently, the P2X7R has been studied as a potential therapeutic target of anti-
inflammatory drugs. Based on this, a NO series composed of four boronic acids analogs
(boronic-tyrphostins) and six benzene-vinylnitriles (tyrphostins) were evaluated on the
biologic effect on the human and murine P2X7R. The importance of the pharmacophoric
group (B(OH)2) was evaluated. The boronic acids derivatives (65a) NO-01 and (65c) NO-
12 inhibited in vitro human (65a: IC50 = 0,021 μM; 65c: 0,243 μM) and murine (65a: IC50
= 0,042 μM; 65c: 0,537 μM) P2X7R function. These analogs compounds showed better
or similar effects than known P2X7R antagonists BBG and A740003 for inhibiting dye
uptake, in vitro IL-1β release and ATP-induced paw edema in vivo. In both, in vitro and in
vivo assays, the (65a) NO-01 showed the best results. The molecular docking suggests
that the NO derivatives bind into the upper body domain of the P2X7 pore and that the
main intermolecular interaction with the two most active NO derivatives occurs by
hydrophobic interactions and hydrogen bonds. These results indicate that the boronic acid
derivative (65a) NO-01 shows the lead compound characteristics to be used as a scaffold
structure to the development of new P2X7R inhibitors with anti-inflammatory action. In
vitro anticancer (65c: IC50 = 0,14 μM against GH3 cell line) and trypanocidal activities
(65c: EC50 = 0,795 μM; Y strain epimastigote) of the synthesized boronic acids (boronic-
tyrphostins) were also evaluated demonstrating that the introduction of the boronic acid
functionality can improve the activity of the tyrphostins.
Keywords: P2X7R; Tyrosine kinase; Boronic acids; Cyanovinylbenzenes; Tyrphostins
xi
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura Título Página
Figura 1 - Causas e consequências da falha da resolução da inflamação .................... 25
Figura 2 - Exemplos de componentes da inflamação .................................................... 26
Figura 3 - Fase vascular e celular do processo inflamatório .......................................... 28
Figura 4 - Estrutura química de alguns AINES .............................................................. 33
Figura 5 - Estrutura química de alguns glicocorticoides naturais (14) e sintéticos (15, 16
e 17) ............................................................................................................................... 35
Figura 6 - Ativação da rota JAK-STAT e produção de citocinas .................................... 39
Figura 7 - Gráfico de mortalidade proporcional não ajustada por todas as neoplasias, de
homens e mulheres, no Brasil (2014 e 2017) ................................................................. 43
Figura 8 - Sinalização em células normais versus células tumorais .............................. 45
Figura 9 - Correlações entre inflamação e câncer ......................................................... 48
Figura 10 - Estrutura do Benznidazol (18) e do Nifurtimox (19) ..................................... 55
Figura 11 - Ciclo de vida do Trypanossoma cruzi .......................................................... 57
Figura 12 - Agonista natural e sintético do P2X7R ........................................................ 61
Figura 13 - P2X7R como possível alvo terapêutico para diversas doenças .................. 63
Figura 14 - Estrutura química de antagonistas do P2X7R ............................................. 64
Figura 15 - Estrutura básica dos receptores tirosina quinase e características específicas
de algumas famílias ....................................................................................................... 68
Figura 16 - Mecanismo de ativação fisiológica e oncogênica ........................................ 69
Figura 17 - Representação da tirosina quinase não-receptora SRC. ............................ 72
Figura 18 - Primeiros compostos testados como inibidores de tirosina quinase e design
de benzeno-vinilnitrilas ................................................................................................... 75
Figura 19 - Exemplos de benzeno-vinilnitrilas com atividade inibitória frente ao EGFR 76
Figura 20 - Estrutura do Bortezomibe (Velcade®) e do Ixazomibe (Ninlaro®) ................ 80
Figura 21 - Compostos de boro ..................................................................................... 81
Figura 22 - Estrutura dos ácidos borônicos ................................................................... 83
Figura 23 - Semelhanças entre as interações proteína alvo/ácido borônico e
proteína/ácido carboxílico............................................................................................... 88
Figura 24 - Anel β-lactama e inibidores de enzimas β-lactamases ............................... 89
Figura 25 - Estrutura da combretastatina A-4, da colchicina e dos análogos borônicos da
CA-4 ............................................................................................................................... 92
Figura 26 - Z-Estilbenos borônicos com atividade anti-proliferativa .............................. 92
Figura 27 - Ácido arilborônico inibidor de EGFR230 ....................................................... 93
Figura 28 - Ácidos borônicos de quindolinas avaliados para o vírus da influenza A ..... 94
Figura 29 - Ativação do metileno por grupos retiradores de elétrons (GRE), exemplos de
metilenos ativos .............................................................................................................. 96
Figura 30 - Tirfostinas e borono-tirfostinas obtidas por condensação de Knoevenagel
..................................................................................................................................... 100
Figura 31- Híbrido de ressonância do composto 64d .................................................. 107
xii
Figura 32 - Absorção e cores de algumas benzeno-vinilnitrilas no UV/vis .................. 108
Figura 33 - Sistema push-pull (D-π-A) ......................................................................... 108
Figura 34 - Série de cores das benzeno-vinilnitrilas .................................................... 108
Figura 35 - Efeitos que influenciam o valor de estiramento axial das nitrilas............... 114
Figura 36- Espectro de IV do aldeído de partida ácido 4-formilfenilborônico (63a) ..... 115
Figura 37 - Efeitos que alteram a frequência da ligação C=O de ésteres ................... 116
Figura 38 - Espectro de IV do composto 65c e comparação com a figura 36 ............ 117
Figura 39 - Espectros de 1H-RMN dos aldeídos de partida em DMSO, 500 MHz: A) ácido
4-formilfenilborônico (63a) B) ácido 3-formilfenilborônico (63b) ................................... 119
Figura 40 - Espectro de 1H-RMN e comparação das borono-tirfostinas obtidas ......... 121
Figura 41 - Experimento de troca de deutério do composto 65d ................................. 122
Figura 42 - Espectro de HSQC do composto 65d ....................................................... 123
Figura 43 - Cristalização do 65b .................................................................................. 125
Figura 44 - Composto 65a (NO-01) ............................................................................. 127
Figura 45 - Composto 65b (NO-03) ............................................................................. 127
Figura 46 - Composto 65c (NO-12) ............................................................................. 128
Figura 47 - Composto 65d (NO-13) ............................................................................. 128
Figura 48 - Molécula 65a no plano formado pelo anel aromático ................................ 130
Figura 49 - Molécula 65b no plano formado pelo anel aromático ................................ 131
Figura 50 - Molécula 65c no plano formado pelo anel aromático ................................ 131
Figura 51 - Molécula 65d no plano formado pelo anel aromático ................................ 131
Figura 52 - Superfície de Hirshfeld para o 65a ............................................................ 133
Figura 53 - Superfície de Hirshfeld para o 65b ............................................................ 134
Figura 54 - Superfície de Hirshfeld para o 65c ............................................................ 134
Figura 55 - Superfície de Hirshfeld para o 65d ............................................................ 134
Figura 56 - Gráfico “heatmap” ..................................................................................... 136
Figura 57 - Posição de interação entre a borono-tirfostina 65a (NO-01) e a DYRK1a
sugerida pelo estudo de docking. ................................................................................. 137
Figura 58 - Compostos padrão para as linhagens GH3 e U937 .................................. 141
Figura 59 - Transformação do MTT em formazan ....................................................... 143
Figura 60 - Atividade tripanocida. As formas epimastigotas da cepa Y foram tratadas com
os NOs, todos na concentração 10 µM por 72 h. ......................................................... 144
Figura 61 - Atividade tripanocida. ................................................................................ 145
Figura 62 - Estrutura do composto 65c, dos compostos utilizados no tratamento da
Doença de Chagas e seus respectivos EC50 sobre a cepa Y ...................................... 145
Figura 63 - Inibição da liberação de IL-1β induzida por ATP pelos ácidos arilborônicos
em células de humanos e de camundongos. ............................................................... 152
Figura 64 - Avaliação do mecanismo inibitório dos compostos 65a (NO-01) e 65c (NO-
12) como antagonistas do P2X7R. ............................................................................... 153
Figura 65 - Representação dos sítios de interação (S1, S2 e S3) identificados no receptor
P2X7............................................................................................................................. 155
Figura 66 - Superposição dos inibidores 65a (NO-01), 65c (NO-12), 64c (NO-06) e 65d
(NO-13) ancorados na cavidade S2. ............................................................................ 156
xiii
Figura 67 - Representação das principais interações intermoleculares de cada benzeno-
vinilnitrila (65a (NO-01), 65c (NO-12), 64c (NO-06) e 65d (NO-13)) avaliada na cavidade
S2, identificadas por docking molecular. ...................................................................... 157
Figura 68 - Efeito anti-inflamatório em edema de pata induzido por ATP dos compostos
65a (NO-01) e 65c (NO-12). ......................................................................................... 160
Figura 69 - Espectro de 1H-RMN do 64a usando CDCl3 como solvente ..................... 167
Figura 70 - Espectro de APT do 64a usando CDCl3 como solvente (CH e CH3 para cima)
..................................................................................................................................... 168
Figura 71 - Espectro de HSQC 1H versus 13C do 64a usando CDCl3 como solvente .. 169
Figura 72 - Espectro de IV do produto 64a .................................................................. 170
Figura 73 - Espectro de UV do 64a ............................................................................. 171
Figura 74 - Espectro de 1H-RMN do 64b usando CDCl3 como solvente ..................... 173
Figura 75 - Espectro de APT do 64b usando CDCl3 como solvente (CH e CH3 para baixo)
..................................................................................................................................... 174
Figura 76 - Espectro de HSQC 1H versus 13C do 64b usando CDCl3 como solvente . 175
Figura 77 - Espectro de IV do produto 64f................................................................... 176
Figura 78 - Espectro de UV do 64b ............................................................................. 177
Figura 79 - Espectro de 1H-RMN do 64c usando CDCl3 como solvente ..................... 179
Figura 80 - Espectro de APT do 64c usando CDCl3 como solvente (CH e CH3 para baixo)
..................................................................................................................................... 180
Figura 81 - Espectro de HSQC 1H versus 13C do 64c usando CDCl3 como solvente .. 181
Figura 82 - Espectro de IV do produto 64c .................................................................. 182
Figura 83 - Espectro de UV do 64c ............................................................................. 183
Figura 84 - Espectro de 1H-RMN do 64d usando CDCl3 como solvente ..................... 185
Figura 85 - Espectro de APT do 64d usando CDCl3 como solvente (CH e CH3 para baixo)
..................................................................................................................................... 186
Figura 86 - Espectro de HSQC 1H versus 13C do 64d usando CDCl3 como solvente . 187
Figura 87 - Espectro de IV do produto 64d.................................................................. 188
Figura 88 - Espectro de UV do 64d ............................................................................. 189
Figura 89 - Espectro de 1H-RMN do 64e usando CDCl3 como solvente ..................... 191
Figura 90 - Espectro de APT do 64e usando CDCl3 como solvente (CH e CH3 para cima)
..................................................................................................................................... 192
Figura 91 - Espectro de HSQC 1H versus 13C do 64e usando CDCl3 como solvente .. 193
Figura 92 - Espectro de IV do produto 64e .................................................................. 194
Figura 93 - Espectro de UV do 64e ............................................................................. 195
Figura 94 - Espectro de 1H-RMN do 64f usando CDCl3 como solvente ...................... 197
Figura 95 - Espectro de APT do 64f usando CDCl3 como solvente (CH e CH3 para baixo)
..................................................................................................................................... 198
Figura 96 - Espectro de HSQC 1H versus 13C do 64f usando CDCl3 como solvente .. 199
Figura 97 - Espectro de IV do produto 64f................................................................... 200
Figura 98 - Espectro de 1H-RMN do 65a usando DMSO como solvente..................... 203
Figura 99 - Espectro de APT do 65a usando DMSO como solvente (CH e CH3 para baixo)
..................................................................................................................................... 204
xiv
Figura 100 - Espectro de HSQC 1H versus 13C do 65a usando DMSO como solvente
..................................................................................................................................... 205
Figura 101 - Espectro de IV do produto 65a ................................................................ 206
Figura 102 – Difração de raio-x para cristal do composto 65a .................................... 207
Figura 103 - Espectro de 1H-RMN do 65b usando DMSO como solvente .................. 209
Figura 104 - Espectro de APT do 65b usando DMSO como solvente (CH e CH3 para
baixo)............................................................................................................................ 210
Figura 105 - Espectro de HSQC 1H versus 13C do 65b usando DMSO como solvente
..................................................................................................................................... 211
Figura 106 - Espectro de IV do produto 65b................................................................ 212
Figura 107 – Difração de raio-x para cristal do composto 65b .................................... 213
Figura 108 - Espectro de 1H-RMN do 65c usando DMSO como solvente ................... 215
Figura 109 - Espectro de 13C-RMN do 65c usando DMSO como solvente ................. 216
Figura 110 - Espectro de APT do 65c usando DMSO como solvente (CH e CH3 para
baixo)............................................................................................................................ 217
Figura 111 - Espectro de HSQC do 65c usando DMSO como solvente ..................... 218
Figura 112 - Espectro de IV do produto 65c ................................................................ 219
Figura 113 – Difração de raio-x para cristal do composto 65c .................................... 220
Figura 114 - Espectro de 1H-RMN do 65d usando acetona como solvente ................ 222
Figura 115 - Espectro de 1H-RMN do 65d usando DMSO como solvente .................. 223
Figura 116 - Espectro de APT do 65d usando DMSO como solvente (CH e CH3 para
cima)............................................................................................................................. 224
Figura 117 - Espectro de HSQC do 65d usando DMSO como solvente ..................... 225
Figura 118 - Espectro de IV do produto 65d................................................................ 226
Figura 119 – Difração de raio-x para cristal do composto 65d .................................... 227
xv
ÍNDICE DE ESQUEMAS
Esquema Título Página
Esquema 1 - Via de síntese de algumas prostaglandinas e alvo molecular dos AINES e
AIES10 ............................................................................................................................ 31
Esquema 2 - Fases clínicas e estágios da Doença de Chagas ..................................... 52
Esquema 3 - Representação do mecanismo de ativação dos receptores P2X ............. 60
Esquema 4 - Fosforilação do resíduo de tirosina (Y) pela tirosina quinase (TK) ........... 66
Esquema 5 - Reações de desidratação e esterificação sofridas por ácidos borônicos . 82
Esquema 6 - Reação entre a água e ácidos borônicos ................................................. 83
Esquema 7 - Acidez de Lewis dos ácidos borônicos e analogia ao estado de transição
(E.T.ǂ) de proteases ....................................................................................................... 85
Esquema 8 - Esquema de intermediários da hidrólise de um antibiótico β-lactâmico por
uma serino β-lactamase ................................................................................................. 90
Esquema 9 - Primeira reação de condensação de Knoevenagel .................................. 95
Esquema 10 - Esquema de intermediários da reação de Knoevenagel em meio básico
....................................................................................................................................... 95
Esquema 11 - Utilização da condensação de Knoevenagel para síntese de compostos
com importância farmacêutica ........................................................................................ 97
Esquema 12 - Catalisadores ambientalmente benignos ............................................... 98
Esquema 13 - Estratégias adotadas no trabalho ......................................................... 100
Esquema 14 - Benzeno-vininitrilas por condensação de Knoevenagel em água ........ 102
Esquema 15 - Obtenção de benzeno-vinilnitrilas sem boro......................................... 104
Esquema 16 - Obtenção de ácidos borônicos ............................................................. 110
Esquema 17 - Processo de desidratação e ciclização do composto 65d .................... 113
Esquema 18 - Transformação do ambiente químico do hidrogênio ............................ 120
Esquema 19 - Avaliação da viabilidade celular por redução de resazurina ................. 138
Esquema 20 - Possíveis interações entre a cruzaína e as tirfostinas sintetizadas ...... 146
xvi
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela Título Página
Tabela 1 - Diferenças entre o processo inflamatório agudo e o crônico ........................ 25
Tabela 2 - Efeitos colaterais comuns devido ao uso prolongado ou altas concentrações
de GC ............................................................................................................................. 36
Tabela 3 - Diferentes tipos de doenças inflamatórias crônicas e seu local de inflamação
....................................................................................................................................... 41
Tabela 4 - Números estimados para 2018 dos dez tipos de câncer mais incidentes
separados por gênero .................................................................................................... 44
Tabela 5 - Oncogenes como alvos moleculares no tratamento de câncer .................... 46
Tabela 6 - Estimativa de gastos federais com serviços oncológicos nos anos de 1999,
2009 e 2018 ................................................................................................................... 50
Tabela 7 - Família das tirosinas quinases ...................................................................... 66
Tabela 8 - Moléculas inibidoras de tirosina quinase aprovadas pela FDA ..................... 78
Tabela 9 - Energias e comprimentos de ligação padrão ................................................ 81
Tabela 10 - Constante de ionização para alguns ácidos borônicos ............................... 84
Tabela 11 - Benzeno-vinilnitrila sintetizadas ................................................................ 105
Tabela 12 - Benzeno vinilnitrilas contendo a porção borono (borono-tirfostinas)
sintetizadas .................................................................................................................. 111
Tabela 13 - Dados cristalográficos ............................................................................... 126
Tabela 14 - Ângulos de torção ..................................................................................... 129
Tabela 15 - Ligações de Hidrogênio ............................................................................ 132
Tabela 16 - Toxicidade e efeito antiproliferativo das benzeno-vinilnitrilas ................... 139
Tabela 17 - Efeito dose-resposta das benzeno-vinilnitrilas frente à proliferação de células
de mamíferos ............................................................................................................... 140
Tabela 18 - Efeito antagonista dos inibidores de P2X7R e da série de compostos NO
frente à captação de corante induzida por ATP em macrófagos peritoneais ............... 148
Tabela 19 - Toxicidade celular e seletividade dos inibidores de P2X7R e dos análogos de
ácidos arilborônicos ...................................................................................................... 149
Tabela 20 - Avaliação do efeito inibitório dos análogos de ácidos borônicos e dos
antagonistas do P2X7R através da avaliação da diminuição da captação de PI em células
HEK 293 e da liberação de IL-1β em células THP-1 e macrófagos de camundongos . 151
Tabela 21- Estabilidade em microssoma hepático (MH) e permeabilidade em Caco-2 dos
compostos 65a (NO-01) e 65c (NO-12) ....................................................................... 154
Tabela 22 - Solubilidade de 65a (NO-01) e 65c (NO-12) em diferentes valores de pH
..................................................................................................................................... 154
Tabela 23 - LogD7,4 das borono-tirfostinas 65a (NO-01) e 65c (NO-12) ...................... 154
Tabela 24 - Volume das cavidades identificadas em P2X7R de humano .................... 155
xvii
ABREVIATURAS E SIGLAS
Abreviatura
Significado
13C-RMN
Ressonância magnética nuclear de carbono 13
1H-RMN
Ressonância magnética nuclear de hidrogênio
AA
Ácido araquidônico
ADMET
absorção, distribuição, metabolismo, excreção e
toxicidade
ADP
Adenosina difosfato
AHMS
Ácido hidroximetanossulfônico
AIES
Anti-inflamatórios esteroidais
AINES
Anti-inflamatórios não-esteroidais
Ar
Arila
Asp
Aspartato
ATP
Adenosina trifosfato
BBG
Brilliant blue G
BzATP
2'3'-(benzoil-4-benzoil)-adenosina-5'-trifosfato
Bzd
Benznidazol
CA-4
Combretastatina A-4
c.c.f.
Cromatografia em camada fina
CC50
Concentração citotóxica para 50% das células
COX
Ciclooxigenase
cP2X7R
Receptor P2X7 de camundongo
DAMPs
Padrões moleculares associados a danos
xviii
D.P.
Desvio Padrão
DMSO
Dimetilsulfóxido
DNA
Ácido desoxirribonucléico
DYRK1a
Dual specificity tyrosine(Y)-phosphorylation-regulated
kinase 1a
EC50
Concentração do fármaco para induzir 50% do efeito
máximo
EGFR
Epidermal growth factor receptor (Receptor de fator de
crescimento epidérmico)
E.T.ǂ
Estado de transição
FDA
Federal Drug Administration (Administração Federal de
Comidas e Remédios)
GC
Glicocorticoides
Gln
Glutamina
Gly
Glicina
GRE
Grupo retirador de elétrons
HER-2
Human epidermal growth factor receptor-type 2
(Receptor do fator de crescimento epidérmico humano-
tipo 2)
hERG
Human Ether-a-go-go-Related Gene
hP2X7R
Receptor P2X7 de humano
HSQC
Heteronuclear single quantum correlation (correlação
heteronuclear de um único quantum)
IC50
Concentração requerida para atingir 50% do efeito
inibitório máximo
IL
Interleucina
INF-γ
Interferon gamma
xix
IP
Iodeto de propídeo
IV
Infravermelho
J
Constante de acoplamento
JAK
Janus quinase
LAME
Laboratório Multiusuário de Espectroscopia
LDH
Lactato desidrogenase
Leu
Leucina
LI
Líquidos iônicos
LPS
Lipopolissacarídeo
LY
Lucifer Yellow (Amarelo de lúcifer)
Lys
Lisina
MAPK
Proteína quinase ativada por mitógeno
MH
Microssoma hepático
MTT
Brometo de tetrazólio
NF-κB
Fator nuclear Kappa B
NRTKs
Non-receptor tyrosine kinase (Tirosina quinase não-
receptora)
PAMPs
Padrões moleculares associados a patógenos
PF
Ponto de fusão
Phe
Fenilalanina
PI
Iodeto de propídeo
PK
Proteína quinase
PMA
Phorbol-12-myristate acetate (Acetato miristato de
forbol)
xx
PRR
Receptores de reconhecimento de padrão
R (%)
Rendimento
RTKs
Receptor tyrosine kinase (Tirosina quinase receptora)
S.I.
Índice de seletividade
Ser
Serina
SNC
Sistema nervoso central
Src
Sarcoma
STAT
Transdutor de sinal e ativador da transcrição
SUS
Sistema único de saúde
T. cruzi
Trypanossoma cruzi
TK
Tirosina quinase
TLR
Receptor semelhante a Toll
TNF-α
Fator de necrose tumoral
TX-100
Triton X-100
Tyr
Tirosina
UV
Ultravioleta
Val
Valina
ass
Deformação axial assimétrica
s
Deformação axial simétrica
Δ
Deformação angular
δ ppm
Deslocamento químico em partes por milhão
δip
Deformação angular no plano
δoop
Deformação angular fora do plano
xxi
CÓDIGO E ESTRUTURA QUÍMICAS DOS COMPOSTOS SINTETIZADOS
Código
Estrutura dos compostos sintetizados
(65a) NO-01
(65b) NO-03
(64a) NO-04
(64b) NO-05
(64c) NO-06
(64d) NO-07
(64e) NO-08
(64f) NO-11
(65c) NO-12
(65d) NO-13
xxii
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS ...................................................................................................... vi
RESUMO ......................................................................................................................... ix
ABSTRACT ...................................................................................................................... x
ÍNDICE DE FIGURAS ..................................................................................................... xi
ÍNDICE DE ESQUEMAS ................................................................................................ xv
ÍNDICE DE TABELAS ................................................................................................... xvi
ABREVIATURAS E SIGLAS ........................................................................................ xvii
CÓDIGO E ESTRUTURA QUÍMICAS DOS COMPOSTOS SINTETIZADOS ............... xxi
SUMÁRIO ..................................................................................................................... xxii
1. INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 24
1.1. Inflamação ............................................................................................................ 24
1.1.1. Ciclooxigenases ................................................................................................ 30
A) AINES ................................................................................................................... 32
B) AIES ..................................................................................................................... 34
1.1.2. A liberação de interleucina-1β via NLP3/P2X7R ............................................... 37
1.1.3. Liberação de mediadores inflamatórios via proteína quinase ........................... 38
1.1.4. Doenças inflamatórias crônicas......................................................................... 40
1.1.5. Câncer ............................................................................................................... 42
1.1.6. Doença de Chagas ............................................................................................ 50
1.2. Receptores purinérgicos ....................................................................................... 58
1.2.1. Receptor P2X7 (P2X7R) ................................................................................... 60
1.3. Tirosina Quinase .................................................................................................. 65
1.3.1. Tirosinas quinases receptoras (RTKs) .............................................................. 67
1.3.2. Tirosinas quinases não-receptoras (NRTKs) .................................................... 71
1.3.3. Tirfostinas .......................................................................................................... 75
1.4. Ácidos arilborônicos ............................................................................................. 79
1.4.1. Ácidos arilborônicos como compostos bioativos ............................................... 87
1.5. Condensação de Knoevenagel ............................................................................. 94
2. ESTRATÉGIAS EMPREGADAS ............................................................................. 99
3. OBJETIVOS ........................................................................................................... 100
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 100
4.1. Preparo das benzeno-vinilnitrilas por condensação de Knoevenagel ................ 101
4.1.1. Benzeno-vinilnitrilas sem o boro (64a-f) .......................................................... 103
4.1.2. Benzeno-vinilnitrilas contendo a porção borono (ácidos borônicos, 65a-d) .... 110
4.2. Estudos in silico direcionados para proteínas quinases ..................................... 135
4.2.1. Quimiogenômica ............................................................................................. 135
4.2.2. Docking molecular ........................................................................................... 136
4.3. Testes biológicos ................................................................................................ 137
4.3.1. Análise de toxidade em células primárias de mamífero .................................. 137
4.3.2. Análise de atividade antiparasitária in vitro ..................................................... 142
4.3.3. Avaliação in vitro da atividade inibitória do receptor P2X7 (P2X7R) pelas
tirfostinas preparadas ................................................................................................... 147
4.3.4. Teste de solubilidade, estabilidade microssomal e permeabilidade in vitro .... 153
xxiii
4.3.5. Docking molecular com foco no Receptor P2X7 ............................................. 154
4.3.6. Estudo ADMET (absorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade)
157
4.3.7. Avaliação in vivo da atividade anti-inflamatória dos compostos 65a e 65c ..... 159
5. CONCLUSÕES ...................................................................................................... 160
6. METODOLOGIA .................................................................................................... 163
6.1. Materiais e Métodos ........................................................................................... 163
6.2. Técnicas empregadas ........................................................................................ 164
6.2.1 Espectroscopia na região do infravermelho .................................................... 164
6.2.2. Espectroscopia de ressonância magnética nuclear ........................................ 164
6.2.3. Difração de Raios-X ........................................................................................ 165
6.3. Procedimento geral para obtenção de benzeno-vinilnitrilas (tirfostinas) através da
reação de Knoevenagel com aldeídos comerciais ....................................................... 165
6.3.1. Utilizando a malononitrila como metileno ativo ............................................... 165
6.4. Obtenção de benzeno-vinilnitrilas contendo uma porção borono (borono-tirfostinas)
através da reação de Knoevenagel com aldeídos de ácidos borônicos comerciais ..... 201
6.4.1. Utilizando a malononitrila como metileno ativo ............................................... 201
6.4.2. Utilizando o cianoacetato de etila como metileno ativo ................................... 214
6.5. Avaliação biológica e in silico ............................................................................. 228
6.5.1. Cultura de células............................................................................................ 228
6.5.1.1. Macrófagos peritoneais ................................................................................ 228
6.5.1.2. Cultura dos protozoários .............................................................................. 228
6.5.2. Avaliação da citotoxicidade em células de mamíferos .................................... 229
6.5.2.1. Ensaio de viabilidade celular pela técnica da redução da resarzurina ......... 229
6.5.2.2. Ensaio de toxicidade celular in vitro por meio da técnica de liberação da Lactato
Desidrogenase (LDH) ................................................................................................... 229
6.5.3. Ensaio de permeabilização celular com corantes ........................................... 230
6.5.3.1. Captação de iodeto de propídeo (PI) ........................................................... 230
6.5.3.2. Captação de brometo de etídeo ................................................................... 230
6.5.4. Determinação de ação tripanocida .................................................................. 231
6.5.5. Ensaio ELISA para detecção de IL-1β ............................................................ 231
6.5.6. Ensaio in vitro de farmacocinética e biodisponibilidade .................................. 231
6.5.6.1. Cultura de células Caco-2 e tratamento ....................................................... 231
6.5.6.2. Teste de solubilidade dependente de pH ..................................................... 232
6.5.6.3. Avaliação da estabilidade microssomal de fígado ....................................... 232
6.5.7. Experimentos in silico ...................................................................................... 233
6.5.7.1. Ensaio das propriedades ADMET ................................................................ 233
6.5.7.2. Docking molecular ....................................................................................... 233
6.5.8. Análise do edema de pata in vivo.................................................................... 233
7. REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 235
APÊNDICE A ................................................................................................................ 260
APÊNDICE B ................................................................................................................ 266
APÊNDICE C ............................................................................................................... 276
24
1. INTRODUÇÃO
1.1. Inflamação
A inflamação é um processo natural do corpo que visa proteger a integridade física
do organismo. É um mecanismo homeostático,
a
uma reação do sistema imune a um
estímulo danoso.1 Este processo altamente regulado protege o organismo não só de
corpos estranhos (inflamação infecciosa: bactérias, vírus, protozoários, entre outros),
como também de estímulos que não envolvem agentes microbianos (inflamação estéril:
agentes químicos, traumas, entre outros). Portanto, a resposta inflamatória é a primeira
linha de defesa do corpo, sendo vital para manutenção da saúde do indivíduo.
Dependendo do estímulo e da resposta do organismo, a inflamação pode ser considerada
aguda ou crônica.1
Na tabela 1, têm-se as principais características que diferenciam os dois processos
inflamatórios, como por exemplo, o agente causador, as células envolvidas no processo
e o tempo de duração. Normalmente, durante a resposta inflamatória aguda, mediadores
pró-inflamatórios e anti-inflamatórios atuam eficientemente de forma a minimizar danos e
infecções, contribuindo para a restauração tecidual e homeostase.1 Entretanto, quando
estes eventos se desenvolvem de forma inadequada, desregulada, a inflamação aguda
pode se tornar uma inflamação crônica, contribuindo para o desenvolvimento de diversas
doenças inflamatórias crônicas (Tabela 1) (artrite e asma, por exemplo) e de outras
enfermidades (câncer e diabetes) (Figura 1). Nesses casos, faz-se necessário o uso de
fármacos anti-inflamatórios para controlar a síntese de mediadores e cessar a resposta
inflamatória que se tornou prejudicial.2
a
Mecansimo homeostático: Processo de regulação através do qual o organismo se mantém em
equilíbrio.
25
Tabela 1 - Diferenças entre o processo inflamatório agudo e o crônico
Inflamação aguda
Inflamação crônica
Agente causador
Patógenos; radiação ionizante;
agentes químicos; trauma
mecânico
Persistência do estímulo
inflamatório inicial,
autoimunidade
Células envolvidas
na resposta ao
agente causador
Neutrófilos; monócitos;
Macrófagos; mastócitos
Macrófagos; linfócitos;
fibroblastos
Resposta
Imediata
Tardia
Duração
Poucos dias
Meses ou anos
Evolução
Cicatrização; formação de
abcesso; cronificação
Destruição tecidual e
fibrose
Figura 1 - Causas e consequências da falha da resolução da inflamação2
De forma geral, a inflamação consiste em 4 componentes: o agente danoso que pode
ser microbiano ou não, os sensores e os mediadores, que serão abordados
posteriormente e por fim, o tecido alvo (Figura 2).
26
Figura 2 - Exemplos de componentes da inflamação1
Apesar da resposta inflamatória variar de acordo com o estímulo, é possível resumir
o processo em 4 etapas. 1) Reconhecimento do estímulo danoso por receptores
presentes na superfície celular; 2) Ativação de rotas inflamatórias; 3) Liberação de
mediadores; 4) Recrutamento de células do sistema imune. Os mediadores de
inflamação atuam em conjunto nas diferentes fases inflamatórias (vascular, celular e de
resolução), induzindo modificações morfológicas e funcionais.3 Inicialmente, no fluxo
sanguíneo normal, os leucócitos e eritrócitos encontram-se na coluna axial centralizada,
envoltos por uma zona periférica de plasma (Figura 3 A). Entretanto, durante a fase
vascular da inflamação, ocorrem algumas modificações nesse fluxo normal, tais como
liberação de mediadores vasoativos que causam vasodilatação com consequente
redução da velocidade de escoamento e aumento do fluxo sanguíneo (hiperemia). Além
disso, ocorre a contração das células endoteliais, aumentando a permeabilidade da
parede dos vasos e permitindo o extravasamento de plasma. Essas modificações geram
os sinais que caracterizam a resposta inflamatória: rubor, calor, edema e dor (Figura 3
B).3 A hiperemia é responsável pelos sinais de rubor e calor e o extravasamento de
plasma produz o edema e dor. Na fase celular da inflamação, a redução da velocidade
de escoamento permite a marginação das células à parede dos vasos sanguíneos. Essa
aproximação, possibilita que células do sistema imune fiquem aderidas à superfície das
células epiteliais através da expressão de moléculas de adesão tais como selectinas e
integrinas (Figura 3 C). Nessa mesma fase, ocorre a liberação de mediadores
quimiotáticos, capazes de atrair um número maior de células do sistema imune. 3 O
27
gradiente de substâncias quimiotáticas no local inflamado, possibilita a diapedese
b
. A
migração dos leucócitos dos vasos sanguíneos para o tecido danificado ou infeccionado
gera um acúmulo dessas células no local da inflamação. Uma vez nos tecidos, as células
fazem fagocitose
c
do patógeno
d
.4 Após a neutralização do agente danoso, ocorre a fase
de resolução. Nessa etapa, diversos mecanismos regulatórios (ex.: citocinas anti-
inflamatórias e fatores de transcrição) são ativados com o objetivo de diminuir o influxo
de neutrófilos
e
e reverter a acumulação de leucócitos nos locais inflamados. A etapa de
resolução é crucial para prevenir efeitos colaterais provenientes de um estado
inflamatório prolongado.5
b
Diapedese: passagem dos leucócitos do sangue para o tecido conjuntivo
c
Fagocitose: processo pelo qual uma célula usa sua membrana plasmática para englobar partículas
sólidas
d
Patógeno: organismos que são capazes de causar doença em um hospedeiro
e
Neutrófilos: células sanguíneas leucocitárias, que fazem parte do sistema imunológico, sendo um
dos principais tipos de leucócitos
28
Figura 3 - Fase vascular e celular do processo inflamatório4
Os receptores de reconhecimento de padrão (PRRs), presentes nas células do
hospedeiro, são ativados ao reconhecer um estímulo danoso. Esse estímulo danoso
pode ser gerado por dois grupos de estruturas moleculares, as estruturas comuns entre
patógenos e as moléculas sinalizadoras de perigo.6 As estruturas moleculares comuns
entre patógenos são denominadas PAMPs - padrões moleculares associados a
patógenos, os quais podem ser lipossacarídeos da parede celular de bactérias e fungos,
resíduos de manose, flagelina ou ácidos teicoicos. Os PRRs reconhecem essas
estruturas como corpo estranho, uma vez que elas são conservadas apenas nos agentes
29
patogênicos, mas não nas células do hospedeiro.6 Dentre os receptores que podem ser
ativados pelos PAMPs, podem ser citados os receptores semelhantes a Toll (TLRs),
receptores scavanger, receptores semelhantes a RIG, entre outros.5,7
Além de reconhecerem os PAMPs, os PRRs também reconhecem as moléculas
sinalizadoras de perigo, também denominadas de DAMPs - padrões moleculares
associados a danos. Os DAMPS são biomoléculas do hospedeiro presentes no meio
intracelular, tais como nucleotídeos (adenosina trifosfato = ATP, difosfato de uridila =
UDP ou adenosina difosfato = ADP). Somente quando liberadas no meio extracelular por
células danificadas, ativam os receptores (ex.: receptores purinérgicos), o que induz à
resposta inflamatória. Apesar desta divisão, alguns receptores como os semelhantes a
Toll, podem tanto ser ativados por fatores endógenos (DAMPs) como por PAMPs.8
A ativação dos PRRs, dependendo do tipo celular, pode gerar diretamente a liberação
de mediadores pró-inflamatórios primários. Não obstante, pode também ativar outras
rotas inflamatórias que induzem à liberação de mediadores inflamatórios posteriores,
contribuindo no processo de inflamação (iniciação, manutenção e resolução).8
O controle da resposta inflamatória depende de diversos mediadores; alguns são
específicos de um determinado tipo celular e outros são mais gerais. Estes mediadores
são oriundos do sistema vascular, das células inflamatórias e dos tecidos danificados.9
Podem ser citados os eicosanoides (prostaglandinas, tromboxanos e leucotrienos);
aminas vasoativas (histamina e serotonina); fator de ativação plaquetária; citocinas pró-
inflamatórias (interleucina: IL-1, IL-8, etc; fator de necrose tumoral: TNF-α); quimiocinas
(CXCl-1, CXCL2). Dentre esses, as citocinas
f
e as prostaglandinas
g
são fundamentais na
regulação do processo inflamatório. Dessa forma, a habilidade de modular a produção e
sinalização destes mediadores é de extrema relevância no desenvolvimento de
tratamentos de patologias relacionadas à inflamação.9
f
Citocinas: polipeptídeos ou glicoproteínas capazes de modular a resposta celular de diversas células.
g
Prostaglandinas: são lipídios sinalizadores tais como os hormônios, porém, as prostaglandinas, não
entram na corrente sanguínea.
30
Algumas rotas inflamatórias passíveis de modulação serão descritas. São estas:
liberação de prostaglandinas via ativação de cicloooxigenases; liberação de interleucina
via receptor P2X7 e liberação de mediadores via proteínas quinase.
1.1.1. Ciclooxigenases
A rota de inibição das enzimas ciclooxigenases é a mais conhecida e estudada até
hoje. Para a modulação desta rota, utilizam-se amplamente os anti-inflamatórios não-
esteroidais (AINES) e os esteroidais (AIES). Estas enzimas são responsáveis pela
produção de prostaglandinas.10 Sua produção se inicia quando o ácido araquidônico 1
(AA, ácido graxo de 20 carbonos), proveniente da bicamada fosfolipídica da membrana
celular, é liberado no plasma por ação da enzima fosfolipase A2. A fosfolipase A2 pode
ser ativada por diversos estímulos fisiológicos, farmacológicos e patológicos. Em
seguida, o AA é metabolizado pelas ciclooxigenases, produzindo a prostaglandina PGH2
(substrato em comum) que após sofrer biotransformações
h
(enzimas e sintetases), gera
diferentes prostaglandinas, onde o perfil dos prostanóides
i
depende do tipo celular
(Esquema 1).10
No processo inflamatório, há 4 prostaglandinas bioativas principais: prostaglandina E2
(2, PGE2); prostaciclina (3, PGI2); prostaglandina D2 (4, PGD2) e prostaglandina F2α (5,
PGF2α). Durante a resposta inflamatória, estes mediadores são sintetizados em maior
quantidade. A PGE2 é a prostaglandina mais abundante no corpo e está envolvida em
diversos processos fisiológicos (ex.: pressão arterial e fertilidade). Durante a resposta
inflamatória, a PGE2 participa de todos os processos que levam à formação dos sinais
clássicos de inflamação: rubor, calor, edema e dor.11 A PGI2 é produzida majoritariamente
por células vasculares, sendo crucial no processo de homeostase cardiovascular. Essa
prostaglandina atua tanto na vasodilatação como na inibição da agregação plaquetária.
h
Biotransformações: transformações na estrutura química de um composto mediada por agentes
biológicos, como enzimas e sintetases.
i
Prostanóides: são uma subclasse dos eicosanoides composta das prostaglandinas, prostaciclinas e
por tramboxanos.
31
Além disso, a PGI2 é um importante mediador no processo de formação de edema e de
dor.12 A PGD2 é sintetizada tanto no sistema nervoso central (SNC) como no periférico,
possuindo função pró ou anti-inflamatória e homeostática. Esta prostaglandina promove
a eosinofilia e a migração de células T, estando envolvida no processo de formação da
inflamação alérgica.13 Por fim, a PGF2α é capaz de induzir a produção de quimiocinas e
citocinas.14
Esquema 1 - Via de síntese de algumas prostaglandinas e alvo molecular dos AINES e
AIES10
32
A síntese destes hormônios locais depende diretamente da ação das enzimas
ciclooxigenases (COXs). As COXs existem, predominantemente, em duas isoformas
j
, a
COX-1 e a COX-2. A COX-1 é uma enzima constitutiva
k
presente na maioria dos tipos
celulares. Os prostanóides liberados por ocasião da ação da COX-1 possuem suas
funções que podem variar de acordo com os locais onde são liberados. No endotélio, por
exemplo, apresentam função anti-trombogênica,
l
enquanto que quando liberados na
mucosa gástrica levam à produção de muco protetor.15 Já a COX-2 é induzida por
estímulos inflamatórios, hormônios ou fator de crescimento.16 Essa isoforma da
ciclooxigenase é a principal fonte de prostaglandinas em inflamação e doenças
proliferativas como câncer.17
Em decorrência da estreita relação entre as prostaglandinas sintetizadas pela COX e
diversos processos que contribuem para o desenvolvimento da inflamação, as
ciclooxigenases e a fosfolipase A2 são os principais alvos moleculares dos anti-
inflamatórios no mercado (Esquema 1). Os chamados AINES e os AIES são anti-
inflamatórios amplamente conhecidos. Eles atuam inibindo a síntese de prostanóides,
por mecanismos distintos. Entretanto, seu uso indiscriminado está associado a uma série
de efeitos colaterais.18
A) AINES
O primeiro AINE (anti-inflamatório não-esteroidal) a ser sintetizado foi o ácido
acetilsalicílico (6), em 1899. Ele foi introduzido como medicamento no mercado com o
nome de Aspirina® pela Bayer.19 Entretanto, apenas na década de 70, foi descoberto o
mecanismo de ação do ácido acetilsalicílico, o qual inibe a conversão de ácido
araquidônico em prostaglandinas através da inibição da COX-1 e/ou COX-2 (Esquema
1).20 Desde então, foram sintetizados diversos inibidores de COX-1 e 2. Apesar da
j
Isofromas: formas distintas de uma proteína.
k
Enzima constitutiva: enzima cuja síntese não dependente da presença de substrato específico.
l
Função anti-trombogênica: impede que o sangue coagule.
33
diversidade de suas estruturas, os AINES possuem as mesmas propriedades
terapêuticas, mitigando os sintomas da inflamação (rubor, dor, calor e edema). São
amplamente utilizados para controlar a febre (efeito antipirético) e diminuir dor de cabeça
(efeito analgésico). Os principais grupos de AINES empregados como anti-inflamatórios
são os derivados de ácido salicílico (ex.: aspirina 6 e diflunisal 7), os derivados de ácido
acético (ex.: diclofenaco 8 e sunlidaco 9) e os derivados do ácido propiônico (ex.:
iburofeno 10 e naproxeno 11) (Figura 4).21
Apesar da COX-2 ser a enzima que está mais envolvida com o processo inflamatório,
a maioria dos AINES tradicionais inibem irreversivelmente as duas isoformas das
ciclooxigenases, possuindo um índice de seletividade maior para inibir a COX-1 (que
também possui função constitutiva) do que a COX-2. Portanto, a utilização destes anti-
inflamatórios por períodos prolongados está associada a diversos efeitos colaterais.
Efeitos adversos incluem toxicidade gastrointestinal, podendo levar ao aparecimento de
úlceras, insuficiência renal e hepática e desordens hematológicas e alérgicas.22
Figura 4 - Estrutura química de alguns AINES
34
Novos AINES como o celecoxibe 12 e o rofecoxibe 13 foram lançados no mercado
com a promessa de, por serem de 325 a 800 vezes mais seletivos para a COX-2,
apresentarem menos efeitos colaterais (Figura 4). No caso do rofecoxibe, após um
grande sucesso de vendas, com arrecadação que excedeu 1 bilhão de dólares em 15
meses, outros efeitos colaterais foram observados. Após novos estudos, foi constatado
que a inibição do COX-2 alterava o equilíbrio natural entre o tromboxano pró-trombótico
A2 e a prostaglandina anti-trombótica PGI2, o que aumenta significativamente a
probabilidade de trombose e outros eventos cardiovasculares.23 Esta descoberta
culminou na retirada do rofecoxibe (Vioxx®) do mercado mundial.24 O celecoxibe
entretanto, permanece no mercado.
B) AIES
Os corticosteroides, também chamados de glicocorticoides (GC) ou esteroides são
hormônios liberados pelas glândulas endócrinas com o objetivo de regular diversos
processos fisiológicos fundamentais. Contribuem na regulação do crescimento de órgãos
e proliferação celular, mudanças na adolescência, resposta inflamatória, reprodução,
entre outros.25 Dentre os liberados pelo corpo, o cortisol 14 (Figura 5) (hidrocortisona) é
o principal, sendo liberado apenas quando necessário, como em situações de estresse,
durante cirurgias, queimaduras, infecções, etc. Os GC podem modular diversos fatores
de transcrição ao se ligarem a receptores de GC (GCR), inibindo a transcrição de diversos
mediadores inflamatórios. Desta forma, a expressão de um gene pode ser ativada (ex.:
produção de annexina-1) ou suprimida (ex: inibição da produção de ciclooxigenase-2) de
acordo com o sinal hormonal.26 A interferência, gênica ou não, do GC em algumas vias
importantes leva à supressão da liberação de diversos mediadores pró-inflamatórios.
Como exemplo, tem-se a supressão da atividade do NF-kB, que faz com que a síntese
de citocinas como a IL-6, IL-2 e TNFα seja reduzida. Já a indução e ativação da proteína
anexinna-1 leva à inibição da enzima fosfolipase A2, responsável pela transformação de
fosfolipídios em ácido araquidônico, o qual é o substrato das ciclooxigenases na síntese
do ácido araquidônico (Esquema 1).27
35
Assim, os glicocorticoides atuam no processo inflamatório de diferentes maneiras,
justificando sua eficácia. No contexto da produção de prostaglandinas, os GC exercem
sua atividade anti-inflamatória de duas formas: impedem a produção do substrato
primário das prostaglandinas, o ácido araquidônico, e inibem a transcrição gênica da
COX-2. Existe também na literatura alguns relatos de que os corticoides podem atuar
diretamente sobre o DNA, funcionando como um fator de transcrição.28
Figura 5 - Estrutura química de alguns glicocorticoides naturais (14) e sintéticos (15, 16
e 17)
Em razão do papel crucial dos glicocorticoides nas vias de inflamação, em especial o
cortisol, essas moléculas foram utilizadas por diversas indústrias farmacêuticas como
protótipos no desenvolvimento de análogos sintéticos tais como a betametasona 15,
prednisona 16 e a dexametasona 17 que mimetizam a ação do cortisol (Figura 5).29
Como dito anteriormente, a eficácia destes compostos está associada, majoritariamente,
à sua habilidade de reduzir a expressão de diversos mediadores inflamatórios ao atuar
sobre os fatores de transcrição.
m
Apesar de sua notável eficácia no tratamento de
diversas doenças inflamatórias crônicas como asma, artrite reumatoide, doenças
m
Fatores de transcrição: proteínas que controlam a taxa de transcrição genética do DNA para o RNA
mensageiro ao se ligar a uma sequência específica de DNA.
36
inflamatórias intestinais, entre outras, o uso terapêutico de glicocorticoides é limitado.30
Isso porque o tratamento prolongado com glicocorticoides pode resultar no
desenvolvimento de resistência e dependência e,31 na maioria dos casos, pode acarretar
efeitos colaterais severos, tais como a síndrome de Cushing,
n
imunossupressão,
osteoporose, etc. (Tabela 2).32
Tabela 2 - Efeitos colaterais comuns devido ao uso prolongado ou altas concentrações
de GC
Sistema
Efeito colateral
Sistema musculoesquelético
Necrose de ossos, osteoporose,
atrofia muscular
Sistema reprodutivo
Retardamento da puberdade e do
crescimento fetal, hipogonadismo
Sistema cardiovascular
Hipertensão, trombose
Sistema imunológico
Imunossupressão, reativação de
vírus latente
Sistema endócrino
Síndrome de Cushing, atrofia
adrenal, hiperglicemia
Apesar de sua eficiência no tratamento de doenças inflamatórias e na mitigação dos
sintomas da inflamação, as classes de anti-inflamatórios AINES e AIES apresentam
profundas limitações, especialmente nos casos de tratamento de doenças inflamatórias
crônicas. Nestes casos, a necessidade da utilização prolongada destes medicamentos
maximiza os efeitos colaterais, colocando em risco o paciente. Diante deste cenário, é de
fundamental importância o desenvolvimento de alternativas mais seguras às terapias
anti-inflamatórias vigentes. Dentre as alternativas que vêm sendo buscadas e que estão
presentes na literatura, no presente trabalho, dar-se-á enfoque à inibição da liberação de
n
Síndrome de Cushing: distúrbios hormonais causados por exposição prolongada a níveis elevados
de glicocorticoides.
37
interleucinas pelo antagonismo do receptor P2X7 e da inibição da liberação de
mediadores pró-inflamatórios pela inibição da transcrição gênicas ativada por proteínas
quinases.
1.1.2. A liberação de interleucina-1β via NLP3/P2X7R
As interleucinas fazem parte de uma família de moduladores de inflamação chamada
citocina. As citocinas participam tanto da inflamação aguda como da crônica, tendo um
papel complexo e muitas vezes conflitante (pró e anti-inflamatório), variando de acordo
com o tipo e localização celular. Dentre as citocinas importantes no processo inflamatório
incluem-se as interleucinas-1 (IL-1α e IL-1β), IL-6 e o fator de crescimento tumoral
(TNFα).33 Dentre esses, a IL-1β, produzida principalmente em macrófagos, destaca-se
devido a sua função central na mediação dos processos inflamatórios, como: indução de
febre,34 indução da transcrição de outras substâncias pró-inflamatórias35 e diferenciação
o
e expansão de células T,36 além de sua associação com o desenvolvimento de
patologias
p
37 como, por exemplo as autoinflamatórias.38 A secreção da interleucina-1β
está intimamente ligada à ativação de inflamassomas. Inflamassomas são complexos
multiproteicos capazes de mediar o processo de ativação de caspases
q
pró-inflamatórias,
como a caspase-1, por exemplo. Dentre os inflamassomas conhecidos, o NLRP3 é o
mais estudado em razão de sua participação no desenvolvimento de doenças
inflamatórias.39 Sua ativação depende de diversos fatores, incluindo o efluxo de potássio
e influxo de sódio.40 Portanto, a ativação de poros capazes de transportar potássio, como
receptor P2X7R e o Kir 6.1, por exemplo41 leva à montagem do NLRP3 e,
consequentemente, à ativação da caspase-1. A caspase-1, ao ser ativada, gera a
clivagem da pro-IL-1β, precursora da IL-1β. Dentro deste contexto, o receptor P2X7
o
Diferenciação celular: processo que todas as células vivas passam para especializar-se em
determinada função.
p
Patologias: alterações da ordem estrutural, bioquímica e funcional em células, tecidos e órgãos que
podem ocasionar uma determinada doença.
q
Caspases: classe de enzimas que decompõe outras proteínas.
38
funciona como iniciador do processo de liberação de IL-1β e portanto, é um alvo
molecular promissor para o desenvolvimento de fármacos com ação anti-inflamatória.
Existem diversas revisões disponíveis que discorrem sobre o importante papel do P2X7
e de sua família de receptores purinérgicos na inflamação.42 Em uma seção separada,
serão abordados diferentes aspectos relacionados aos receptores purinérgicos do tipo
do receptor P2X7R, tais como a classificação, a estrutura e o funcionamento.
1.1.3. Liberação de mediadores inflamatórios via proteína quinase
A ativação de receptores por PAMPs ou DAMPs desencadeia diferentes rotas
intracelulares importantes para a produção de mediadores inflamatórios. Algumas rotas,
como as já descritas aqui, não envolvem mudanças na expressão gênica, diferentemente
daquelas envolvendo algumas proteínas quinases. Algumas das rotas intracelulares que
são ativadas pelos PRRs incluem a MAPK (proteína quinase ativada por mitógeno =
mitogen-activated protein kinase), NF-κB (Fator nuclear Kappa B = Nuclear factor kappa
b); JAK (Janus quinase = Janus kinase)-STAT (Transdutor de sinal e ativador da
transcrição = Signal transducer and activator of transcription) e a Src (Sarcoma).43
Algumas destas rotas envolvem a ativação de proteínas quinases, dentre estas, a JAK-
STAT e a Src são, mais especificamente, denominadas tirosinas quinases, as quais
fosforilam apenas os resíduos de tirosina presente nos substratos.
As tirosinas são importantes para inflamação por dois motivos: são componentes
importantes na cascata de sinalização iniciada pelo PRRs, sendo, portanto, cruciais na
produção de citocinas e adicionalmente, muitas das citocinas como o TNF, IL-6 e IL-10
utilizam tirosinas quinases em suas próprias rotas de sinalização. Com isso, as tirosinas
são importantes não só na produção de citocinas, mas também em seu funcionamento.
44 Para ilustrar a ativação de vias inflamatórias que envolvem ação de tirosinas quinases,
será abordado o processo de ativação da JAK. Essa é uma proteína associada a um
receptor, a qual, ao ser ativada, promove a fosforilação de resíduos específicos de
tirosina do receptor do qual faz parte. A fosforliação do receptor proporciona sítios de
ligação para as STAT - proteínas dos sinais transdutores e ativadores de
transcrição. Após o recrutamento e ligação dessa proteína aos resíduos de tirosina
39
fosforilados no receptor, o STAT é fosforilado pela JAK. Em seguida, o STAT ativado
dimeriza e é transportado para o núcleo, onde atua como fator de transcrição (Figura
6).45 Esta tirosina quinase pode ser ativada pela IL-6, que utiliza a cascata de sinalização
promovida pela JAK para produzir citocinas, incluindo a própria interleucina-6.46
Com este cenário em mente, a constatação de que alguns inibidores de tirosina
quinase (chamados de tirfostinas) são capazes de impedir a produção de alguns tipos de
citocinas,47 tem chamado a atenção da comunidade científica, o que impulsionou o
desenvolvimento de diversos inibidores de tirosina para o tratamento de doenças
inflamatórias como a dermatite.48 Em uma seção à parte será abordada a importância e
o funcionamento das proteínas quinases mais a fundo e, mais especificamente das
tirosinas quinases e seus inibidores (trifostinas). Devido ao crescente interesse por rotas
de regulação inflamatória alternativas, estudamos a ação biológica de inibidores
derivados de tirfostinas tendo como alvo molecular o P2X7R e a tirosina quinase.
Figura 6 - Ativação da rota JAK-STAT e produção de citocinas. 1. Receptor inativado;
2. Ativação do receptor por citocina; 3. Fosforilação do receptor pela JAK e
recrutamento do STAT; 4. Ligação do STAT no sítio fosforilado do receptor e
fosforilação do STAT; 5. Dimerização do STAT e transporte ao núcleo; 6. Interação com
o DNA para regular transcrição gênica e produzir de citocinas
40
A inflamação é um sintoma há muito conhecido de doenças infecciosas. Entretanto,
estudos mais recentes indicam que a inflamação também é um componente importante
em muitas doenças não infecciosas.49 Como já mencionado, a inflamação aguda é
considerada benéfica na maioria dos casos. Entretanto, em alguns casos de infecção,
por exemplo, microrganismos utilizam-se da resposta inflamatória para reproduzirem-se
e potencializar sua colonização. Em outros casos, quando a resposta inflamatória é
persiste e é incapaz de eliminar o patógeno, a inflamação crônica instaura-se. Dessa
forma, surgem as doenças inflamatórias crônicas e diversas outras patologias são
fomentadas. Tendo em vista a dualidade do processo inflamatório (benéfico/maléfico) e
sua importância no desenvolvimento de patologias tais como: câncer, diabetes, doenças
degenerativas, protoozes, arteroesclerose e doenças inflamatórias crônicas, muitas das
pesquisas atuais visam combater e modular o componente inflamatório com o objetivo
de impedir ou sanar essas doenças.49 Nas seções a seguir, serão abordadas algumas
das doenças cujos alvos moleculares foram foco do presente trabalho: as doenças
inflamatórias crônicas, o câncer e a Doença de Chagas. Essas doenças estão
relacionadas a processos inflamatórios.
1.1.4. Doenças inflamatórias crônicas
As doenças inflamatórias crônicas constituem um universo abrangente de doenças,
isso porque, podem afetar qualquer órgão do corpo (Tabela 3). Apesar destas doenças
possuírem fisiopatologias e epidemiologias distintas, a característica em comum entre
elas é o desequilíbrio inflamatório. O desequilíbrio pode ser desencadeado por uma
infinidade de fatores, tanto antropogênicos
r
,50 quanto relacionados ao hospedeiro
(genético, inabilidade de neutralizar ou limpar detritos de microorganismos, mutação,
falha na regulação de mediadores anti e pró-inflamatórios, entre outros). Esses fatores
r
Fatores antropogênicos: derivados da urbanização e industrialização, como a nutrição, a poluição, o
estresse e o sedentarismo.
41
transformam a inflamação aguda em crônica. Essa última caracteriza-se pela destruição
e reparação simultânea dos tecidos. Quando a taxa de destruição excede à de reparação,
diversos tipos de doenças inflamatórias, dependendo do tecido afetado, podem ocorrer.
Adicionalmente, a presença prolongada de grandes quantidades de mediadores e células
inflamatórias por um período prolongado pode desencadear falhas em outros processos
fisiológicos como na replicação celular, na angiogênese, na destruição de neurônios e na
necrose celular.2
Tabela 3 - Diferentes tipos de doenças inflamatórias crônicas e seu local de inflamação
Doença
Tecido/órgão
Artrite Reumatoide
Conjuntivo
Doença pulmonar obstrutiva crônica
Pulmão
Psoríase
Pele
Esclerose múltipla
Cérebro
Alzheimer
Cérebro
Lupus eritematoso sistêmico
Pele
Doença de Crohn
Intestino
Retocolite ulcerosa
Intestino
Granulomatose de Wegner
Vasos sanguíneos
As doenças inflamatórias crônicas constituem um fardo econômico e social, pois
podem incapacitar os indivíduos e requerem tratamentos prolongados, ou até perpétuos.
A ocorrência e prevalência populacional (sexo, camada social, país e idade) varia de
acordo com o tipo de doença inflamatória. Por exemplo, só em 2017 ocorreram no mundo
1204 novos casos de artrite reumatoide, 7300 de Alzheimer e 4049 de doença
inflamatória crônica do intestino.51 Em um outro estudo, Yang e colaboradores
encontraram evidências que apoiam a existência de uma relação entre doenças
inflamatórias crônicas e o aumento da mortalidade entre indivíduos socialmente isolados,
42
levando em consideração a diferença entre gêneros. Ou seja, as doenças inflamatórias
crônicas não só reduzem a qualidade de vida do indivíduo, como podem aumentar os
riscos de mortalidade.52 É possível encontrar evidências substanciais que sustentam a
teoria de que pacientes que sofrem de doenças inflamatórias crônicas são mais
suscetíveis a apresentar comorbidades
s
relacionadas. O aparecimento dessas doenças
secundárias além de complicar ainda mais o estado clínico do paciente e reduzir sua
expectativa de vida, sobrecarrega ainda mais o sistema de saúde (SUS).53 Por exemplo,
pacientes que sofrem com a retocolite ulcerativa por 10 anos têm um aumento do risco
em 2% de ter câncer colorretal. Esse risco sobe para 20% após 30 anos de diagnóstico.54
A fim de diminuir o sofrimento das pessoas afetadas por doenças inflamatórias
crônicas, de melhorar a qualidade de vida das mesmas, bem como reduzir a incidência
de doenças mais danosas fomentadas pela instauração do processo inflamatório e
reduzir os gastos do sistema de saúde associados à inflamação, faz-se necessário o
desenvolvimento de novos anti-inflamatórios que atuem por vias diversas das que são
empregadas na terapia vigente.
1.1.5. Câncer
O câncer é a segunda causa de morte ao redor do mundo, atingindo pessoas de
diferentes faixas etárias e sociais todos os anos. Entretanto, a maior parte das mortes,
cerca de 70%, ocorre em regiões menos desenvolvidas e entre a população de baixa
renda. O número de casos de câncer tem crescido nos últimos anos devido às diversas
mudanças no estilo de vida das populações em geral, como obesidade, baixo consumo
de vegetais, sedentarismo e uso de cigarro e álcool. Em 2018, foi responsável por 9,6
milhões de mortes e o número de casos deve aumentar em 70% nas próximas duas
décadas. Dados da OMS indicam que, até 2020, o câncer será a principal causa de morte
em todo mundo. Globalmente, a cada seis mortes uma é causada por câncer.55 No Brasil,
s
Comorbidades: Co-existência de duas ou mais doenças em um mesmo indivíduo. Em muitos casos,
a patologia de uma provoca a outra, podendo também, se potencializar.
43
segundo o Atlas on-line de mortalidade proporcional não ajustada, cerca de 1,31 milhões
de pessoas morreram em 2017 devido a algum tipo de câncer (Figura 7). As estimativas
do INCA para o biênio de 2018-2019 são de 600 mil novos casos, para cada ano. O
câncer de pele não melanoma é o mais incidente entre os brasileiros. Em segundo lugar,
tem-se o câncer de próstata para os homens e de mama para as mulheres (Tabela 4).56
Figura 7 - Gráfico de mortalidade proporcional não ajustada por todas as neoplasias,
de homens e mulheres, no Brasil (2014 e 2017)57
1,22 M
1,26 M
1,30 M 1,31 M
1.18
1.2
1.22
1.24
1.26
1.28
1.3
1.32
2014 2015 2016 2017
óbitos (em milhões de
indivíduos)
Ano
Mortalidade por ano
44
Tabela 4 - Números estimados para 2018 dos dez tipos de câncer mais incidentes
separados por gênero
Localização
primária
Casos
%
Localização
primária
Casos
%
Mama
feminina
59.700
29,5
Mulheres Homens
Próstata
68.220
31,7
Cólon e reto
18.980
9,4
Traqueia,
brônquio e
pulmão
18.740
8,7
Colo do
útero
16.370
8,1
Cólon e reto
17.380
8,1
Traqueia,
brônquio e
pulmão
12.530
6,2
Estômago
13.540
6,3
Glândula
tireoide
8.040
4,0
Cavidade
oral
11.200
5,2
Estômago
7.750
3,8
Esôfago
8.240
3,8
Corpo do
útero
6.600
3,3
Bexiga
6.690
3,1
Ovário
6.150
3,0
Laringe
6.390
3,0
Sistema
nervoso
central
5.510
2,7
Leucemias
5.940
2,8
Leucemias
4.860
2,4
Sistema
nervoso
central
5.810
2,7
* Dados para câncer de pele não melanoma não foram apresentados
45
Câncer é um termo amplo que descreve um conjunto de doenças heterogêneas.
Apesar dos diferentes tipos de câncer, um aspecto em comum prevalece: o aparecimento
de uma anomalia no processo natural de renovação celular. Essa anomalia provoca o
crescimento e a divisão desordenada das células. Em determinadas condições
fisiológicas, a desregulação desses processos importantes, pode acarretar no
aparecimento de um câncer.58 Os fatores que levam o seu desenvolvimento são
numerosos e distintos, variando de fatores ambientais como dieta, tabagismo, poluição,
compostos químicos, radiação, infecções, entre outros,59 a hereditários. Em ambos os
casos, ocorre ou existe uma mutação genética, a qual não envolve, necessariamente
uma alteração na sequência do DNA. Trata-se, portanto, de uma doença genética.60
Origina-se de uma mudança nos genes que controlam o funcionamento das células,
principalmente no modo como elas crescem e dividem-se. Os principais tipos de genes
afetados são: os proto-oncogenes e os genes supressores de tumores.
Os proto-oncogenes são genes encarregados de expressar proteínas responsáveis
pelo crescimento e divisão celular, entretanto, quando estes genes estão alterados ou
superativados, transformam-se em oncogenes. A mutação permite o aumento
desenfreado da divisão celular (Figura 8), redução na diferenciação celular e inibição da
morte celular. Logo, os oncogenes e as proteínas expressadas por eles são alvos
moleculares importantes no tratamento de câncer (Tabela 5).61
A tirosina quinase é responsável por cerca de um terço dos oncogenes ligados à
ocorrência de câncer em humanos.62
Figura 8 - Sinalização em células normais versus células tumorais. A) Quantidade
normal de receptores HER-2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor-Type 2) que
enviam sinais para a célula se dividir; B) Quantidade anormal de receptores HER-2
(tirosina quinase) que enviam um excesso de sinais para a célula se dividir
46
Tabela 5 - Oncogenes como alvos moleculares no tratamento de câncer63
Alvo
Tipo de câncer
Tratamento
Anticorpos
Fármacos não-biológicos
HER-2+
Mama
Trastuzumabe*
-
BCR/ABL
Leucemia
mieloide crônica
-
C-KIT
Tumor estromal
gastrointestinal
-
Imatinibe
EGFR
Colorretal
Cetuximabe*
-
EGFR
Pâncreas
-
VEGF
Fígado, mama,
colorretal
Bevacizumabe*
-
* Tratamento é feito com uma combinação de agentes citotóxicos
Já os genes supressores de tumores são responsáveis por reduzir a divisão celular,
reparar erros no DNA e induzir morte celular (apoptose ou morte celular programada). Ou
seja, funcionam como um controle negativo de proliferação celular. Desse modo, a
inativação desses genes pode levar ao desenvolvimento do câncer.64 Portanto, no caso
dos proto-oncogenes sua ativação culmina no desenvolvimento do câncer; enquanto que
no segundo caso, esse efeito é produzido pela desativação dos genes supressores. Em
muitos casos, proteínas supressoras de tumor inibem a mesma rota regulatória que é
estimulada pelo oncogene.
O desenvolvimento do câncer é um processo de acúmulo de mutações e envolve
múltiplas etapas que não são completamente conhecidas. Entretanto, sabe-se que tanto
47
a ativação do oncogenes como a desativação de genes supressores de tumores são
etapas necessárias para a iniciação e progressão do tumor.65
Muitos dos fatores ambientais mencionados como causas para o desenvolvimento do
câncer promovem uma resposta inflamatória ou a instauração de uma inflamação
crônica. Esse quadro inflamatório pode ser responsável pela característica carcinogênica
de muitos destes fatores. Diferentes tipos e mecanismos de inflamação podem promover
o desenvolvimento e a progressão do câncer, assim como auxiliar no processo anti-
câncer (Figura 9). Por exemplo, a exposição prolongada por fatores ambientais irritantes
ou obesidade podem resultar em inflamação crônica que promove mutações e
angiogênese.66 Da mesma forma, a inflamação crônica associada com infecções ou
doenças autoimunes promove o desenvolvimento do tumor induzindo mutações
oncogênicas e angiogênese. Entretanto, nem toda inflamação crônica aumenta o risco
de câncer, em alguns casos, como no caso da psoríase pode haver uma redução.67
A inflamação induzida por tumor está intimamente ligada com o desenvolvimento do
tumor, uma vez que a resposta inflamatória promove a progressão do tumor, a metástase
t
e a imunossupressão local. As terapias anticâncer podem também promover uma
resposta inflamatória ao causar trauma e necrose, estimulando o reaparecimento do
câncer e resistência a terapia. Entretanto, em alguns casos inflamação induzida por
tratamento e a inflamação induzida por tumor podem aumentar a apresentação de
antígenos levando a uma erradicação das células tumorais (Figura 9).68 Estima-se que
a inflamação ou infecção promovem cerca de 25% dos casos de câncer, uma vez que
células imunológicas são capazes de regular todos os estágios do desenvolvimento do
câncer.69
t
Metástase: implantação de um foco tumoral à distância do tumor original.
48
Figura 9 - Correlações entre inflamação e câncer68
As células imunológicas afetam as células malignas através da produção de citocinas,
quimiocinas, fatores de crescimento, prostaglandinas e espécies reativas de oxigênio e
nitrogênio, gerando consequências em todas as etapas da tumorigênese
u
. Por exemplo,
na etapa de iniciação do tumor a inflamação pode contribuir através da mutação,
instabilidade genômica e modificações epigenéticas
v
; durante a etapa de progressão do
tumor, a inflamação ativa respostas para reparação de tecido, induz a proliferação de
células pré-malignas e aumenta sua sobrevivência. Além disso, a inflamação promove
angiogênese, pode estar relacionada ao mecanismo da imunossupressão localizada para
u
Tumorigênese: processo pelo qual as células normais são transformadas em células cancerígenas.
v
Mudanças epigenéticas: mudanças genéticas herdáveis que não alteram sequência de DNA.
49
reduzir a resposta do sistema imune do paciente às células cancerígenas e promoção da
migração e implantação das células metástasicas.70
Assim como a inflamação poder ser percussora do câncer, ela pode também ser
promovida pelo câncer. Muitas das massas malignas iniciam um processo inflamatório,
promovendo um microambiente com mediadores inflamatórios. A presença de
mediadores atrai mais células inflamatórias para o local. Essas células liberam mais
mediadores que ajudam no crescimento da massa, promovendo a evolução do câncer.
Dessa forma, um ciclo vicioso é iniciado onde o câncer promove a inflamação e a
inflamação promove o câncer.71
Em outros casos, a resposta inflamatória pode ser iniciada pelo tratamento.
Quimioterapia e a radioterapia causam a morte de muitas células cancerígenas e
saudáveis. A presença de células mortas ativa uma resposta inflamatória que pode ser
benéfica, fomentando uma resposta imune antitumoral, ou promover o crescimento do
tumor.
Em resumo, o papel da inflamação no desenvolvimento do câncer é complexo e
muitas vezes contraditório. Em alguns casos tem ação pró-câncer e em outros, anti-
câncer. Em vista da íntima correlação entre inflamação e câncer, a modulação dos
mecanismos inflamatórios é uma estratégia interessante para prevenir e tratar o câncer.72
Algumas rotas inflamatórias citadas aqui são especialmente interessantes, como a
rota que envolve o receptor P2X7 e a rota que envolve tirosinas quinases. O receptor
P2X7 possui um papel ambíguo. O P2X7R expresso em células dendríticas ajuda na
apresentação de antígenos tumorais aos linfócitos T, promovendo sua diferenciação.
Antagonicamente, o P2X7R pode estimular a angiogênese
w
quando ativado pelo ATP
liberado pelo tumor.73
A tirosina quinase pode ser considerada um alvo com dupla ação, pois além de estar
envolvida na progressão da inflamação, esta proteína está envolvida na regulação do
processo de divisão e proliferação celular.74
w
Angiogênese: mecanismo de crescimento de novos vasos sanguíneos a partir dos já existentes.
50
Apenas 2018, o investimento do Ministério da Saúde em ações para o controle e
tratamento do câncer foi de cerca de R$ 3,8 bilhões de reais (Tabela 6).75 Portanto, o
tratamento desta doença apresenta um elevado custo para o sistema de saúde brasileiro
e, como os dados mostram, a tendência é aumentar. Além disso, os fármacos disponíveis
no mercado para o tratamento do câncer são extremamente agressivos às células
benignas, passíveis de formação de resistência e são custosos. Tendo em vista esse
cenário, faz-se necessária a implantação de políticas de prevenção capazes de reduzir
os gastos com o tratamento dessa doença. Em paralelo, novos fármacos que tenham
menos efeitos colaterais (mais seletivos), mais eficientes e acessíveis para terapia,
devem ser desenvolvidos.
Tabela 6 - Estimativa de gastos federais com serviços oncológicos nos anos de 1999,
2009 e 201876
Tipo de serviço
1999
2009
2017
Cirurgia
oncológica
R$ 87 milhões
R$ 172,81 milhões
R$ 929 milhões
Radioterapia
R$ 77 milhões
R$ 163,72 milhões
R$ 453 milhões
Quimioterapia
R$ 306 milhões
R$ 1.228,41
milhões
R$ 2,474 bilhões
Iodoterapia
R$ 0,048 milhão
R$ 4,15 milhões
R$ 4,62 milhões
Total
R$ 470,5 milhões
R$ 1,6 bilhão
R$ 3,86 bilhões
1.1.6. Doença de Chagas
A Doença de Chagas, também chamada de tripanossomíase americana ou
esquizotripanose é uma enfermidade ocasionada pela infecção humana pelo parasita
protozoário Tripanossoma cruzi. A principal via de transmissão do protozoário é através
dos vetores triatomíneos, insetos hematófagos popularmente conhecidos como barbeiros
51
ou bicudos. Essa antropozoonoze
x
leva o nome do médico que a descobriu, Carlos
Ribeiro Justiniano das Chagas.77
Considerada endêmica em 20 países da América Latina, a Doença de Chagas
representa um grande desafio para a saúde pública do país e do mundo, afetando,
majoritariamente, uma população economicamente vulnerável e com pouco acesso ao
sistema de saúde. Por esse e outros motivos, a tripanossomíase americana faz parte de
um conjunto de 19 doenças denominado doenças tropicais negligenciadas.78 De acordo
com a organização mundial de saúde, este termo refere-se a doenças como malária,
doença do sono, leishmaniose, dengue, entre outras que recebem investimentos
reduzidos em pesquisa para o desenvolvimento de tratamentos e meios de prevenção,
apesar de incapacitarem e matarem milhões de pessoas.79 Isso porque, são
consideradas doenças não-rentáveis para a indústria farmacêutica em razão do perfil
populacional afetado.80
A falta de controle e tratamento tem acarretado epidemias ao redor do globo, não
apenas em países endêmicos. Com a globalização e aumento de movimentos
migratórios, países que antes não eram afetados (EUA, Canadá e alguns países da
Europa) agora sofrem os danos econômicos e sociais causados por essas doenças.81
Em 2013, o custo relacionado com a Doença de Chagas no mundo foi estimado entre 4-
11 bilhões de dólares por ano, incluindo os custos relacionados com perda de
produtividade do indivíduo afetado.82
O curso clínico da doença de Chagas é caracterizado por uma fase aguda curta e
uma fase crônica, responsável por 90% das mortalidades (Esquema 2).83
A fase aguda (fase inicial da infecção), na maioria dos casos, é assintomática e dura
em média de 4 - 8 semanas, sendo que a parasitemia reduz, substancialmente, após 90
dias. Os indivíduos sintomáticos podem apresentar os seguintes sintomas na fase aguda:
febre persistente, inflamação no local de inoculação (chagoma de inoculação), edema de
pálpebra unilateral (sinal de Romaña), linfadenopatia (alteração no tamanho dos
x
Antropozoonoze: doença primária de animais e que pode ser transmitida aos humanos.
52
linfonodos) e hepatoesplenomegalia (aumento do fígado e do baço).84 Casos severos da
fase aguda acontecem em apenas 1-5% dos pacientes e seus sintomas incluem
inflamação do miocárdio, da meninge e/ou do cérebro.
Esquema 2 - Fases clínicas e estágios da Doença de Chagas83
Mesmo sem o uso de medicamentos, a fase aguda é resolvida espontaneamente.
Após a resolução dessa fase, os indivíduos infectados entram na fase crônica que é
dividida em duas formas. A forma indeterminada, caracterizada pela ausência de
manifestações clínicas, ocorre em 60-70% dos infectados, podendo evoluir para a forma
determinada da doença após 10-30 anos da infecção inicial.85
A forma determinada é caracterizada por manifestações cardíacas e/ou digestivas
(Esquema 2). A cardiopatia é a manifestação mais comum e mortal da doença,
apresentando sintomas tais como: arritimia, dilatação ventricular, tromboembolismo e
insuficiência cardíaca.86 Um aspecto em comum nas duas fases, aguda e crônica, é o
aparecimento de uma intensa resposta inflamatória.
53
Um dos grandes desafios do controle e tratamento da Doença de Chagas é o
diagnóstico. Estima-se que menos de 10% dos infectados recebem o diagnóstico
correto.87 Por esse motivo, as estimativas de indivíduos infectados são imprecisas e
subnotificadas, dificultando o planejamento do combate à doença. A Organização
Mundial de Saúde (OMS) estima que cerca de 7-8 milhões de pessoas no mundo tenham
esta doença (sintomática ou não), a qual constitui-se na causa de uma média de 12 mil
mortes por ano.88
Já de acordo com as estimativas da Fiocruz, só nas Américas existem 12 milhões de
portadores da doença em seu estágio crônico.89 Segundo o ministério de saúde, são
estimados entre 1,9 milhões a 4,6 milhões de portadores crônicos no Brasil.90 A faixa
ampla demonstra a incerteza dos dados, uma vez que apenas os casos agudos são de
notificação compulsória e que não há dados sistemáticos relativos à prevalência da
doença. Além disso, a fase aguda onde os protozoários estão em maior quantidade e sua
detecção laboratorial é mais fácil é, na maioria dos casos, assintomática ou os sintomas
são parecidos com doenças virais, dificultando seu diagnóstico correto.91
Apesar de ainda haver grandes desafios a serem enfrentados, os números de casos
da doença em sua forma aguda reduziram drasticamente. Essa redução é em parte
consequência de políticas e cuidados com relação a transmissão por sangue como:
transfusão de sangue, transplante de órgãos e transmissão congênita
(transplacentária).92 Vale ressaltar que a transmissão do parasita por sangue é uma
forma secundária de transmissão, assim como a transmissão por consumo de comida ou
água contaminada (transmissão oral)93 e acidentes laboratoriais94 Além disso, políticas
de combate ao parasita e a substituição de casas de barro por de alvenaria, reduzindo a
proliferação do barbeiro, são outras causas para a redução dos casos da Doença de
Chagas.
Acredita-se que a resposta inflamatória é crucial para manter os parasitas em
controle. O T. cruzi, ao entrar na corrente sanguínea, é reconhecido por células
imunológicas residentes,95 desencadeando a liberação de substâncias pró-inflamatórias
como citocinas e quimiocinas.96 Esses compostos iniciam o recrutamento de macrófagos,
neutrófilos e células exterminadoras naturais. A posterior invasão e destruição de células
pela multiplicação parasitária, aumenta a infiltração celular e consequentemente a
54
inflamação. Entretanto, o parasita é capaz de modular alguns aspectos da resposta
inflamatória a seu favor.97 Por exemplo, ao serem fagocitados por macrófagos, os
protozoários são capazes de escapar do fagolisossoma para o citoplasma e se replicar.98
Também são capazes de interferir na produção de citocinas pró-inflamatórias e anti-
inflamatórias (IL-10 e TGF-β).99
A ausência ou diminuição da resposta inflamatória acarreta na replicação excessiva
do parasita e posteriormente, a morte do hospedeiro. Por outro lado, uma reação imune
excessiva leva a danos irreparáveis nos tecidos e consequentemente a morte do
indivíduo.100 Logo, deve haver uma regulação minuciosa da resposta inflamatória,
permitindo o controle parasitário, sem a destruição tecidual. Nos seres humanos, esse
balanço pode ser alcançado. Entretanto, ele é atingindo de forma que a eliminação do
parasita é impossível. Quando o sistema imunológico consegue controlar a parasitemia,
a doença passa de sua fase aguda, para a crônica. Na maioria dos casos, esse controle
conduz a doença para a forma indeterminada da fase crônica.101 Todavia, em alguns
indivíduos, a forma determinada da doença se instaura como consequência de dois
fatores: inflamação crônica gerada pelo parasita e a presença parasitária persistente.
Esses dois fatores promovem mecanismos de lesão tecidual progressiva.102 Portanto, o
controle da resposta inflamatória e a modulação da liberação (induzida pelo parasita) de
citocinas e quimiocinas é imprescindível para evitar a progressão e mitigar os danos
causados pela Doença de Chagas.
Os únicos tratamentos disponíveis para essa doença são os compostos benzonidazol
18 (Rochagan®) e o nifurtimox 19 (Lampit®). Contudo, só o benznidazol é liberado no
Brasil (Figura 10). Estes compostos estão no mercado há mais de 50 anos e apesar do
grande impacto que esta doença tem sobre o sistema de saúde e qualidade de vida da
população, nenhum outro composto foi colocado no mercado desde então. Essas
terapias estão desatualizadas pois são mais eficazes contra as formas tripomastigota e
amastigota durante a fase aguda da doença, sendo que, atualmente, prevalecem os
casos crônicos da doença. Além disso, os compostos apresentam alta toxicidade e por
isso não podem ser utilizados em grávidas, e requerem tratamentos longos (30-60
dias).103 Alguns efeitos colaterais são: vômito, dor abdominal, insônia e neuropatia
55
periférica, entre outros. Entretanto, esses fármacos ainda são os únicos meios de
tratamento tanto na fase aguda, quanto na crônica.104
Figura 10 - Estrutura do Benznidazol (18) e do Nifurtimox (19)
O T. cruzi tem um ciclo biológico complexo com diferentes variações morfológicas e
funcionais (replicativas, não-replicativas e infectantes). As formas replicativas são:
epimastigotas (presente no hospedeiro invertebrado) e amastigotas (presente no
hospedeiro verterbrado). A forma não-replicativa é a tripomastigota sanguínea, enquanto
que a forma infectante é a tripomastigota metacíclica.
O ciclo inicia-se quando o vetor invertebrado, como o barbeiro, é contaminado ao se
alimentar do sangue de um hospedeiro vertebrado infectado, como o ser humano. Na
corrente sanguínea desse hospedeiro, encontra-se a forma tripomastigota não-replicativa
(Figura 11). Durante a fase no hospedeiro invertebrado, a forma tripomastigota se
diferencia em epimastigota no intestino médio do inseto hospedeiro.105 A forma
epimastigota é capaz de realizar divisões celulares (forma replicativa), mantendo o inseto
infectado. Ao chegar na parte final do intestino, há uma nova diferenciação através de
um processo conhecido como metaciclogênese. Nesse processo, a forma epimastigota
transforma-se na forma infectante do protozoário o tripomastigota metacíclo, que é
liberada pelo inseto através das fezes.106 A infecção do hospedeiro vertebrado ocorre
apenas quando as fezes contaminadas entram em contato com a mucosa ou ferimentos
na pele (ex.: picada do inseto).
Uma vez na corrente sanguínea do hospedeiro vertebrado, os tripomastigotas
invadem as células presentes no local de inoculação, como os macrófagos, fibroblastos
e células epiteliais. Essa invasão ocorre em duas etapas: a adesão e a internalização.107
Substâncias presentes na superfície do parasita se ligam a receptores de membrana
56
específicos (ex.: tirosina quinase C - TrkC) das células imunológicas do hospedeiro,
favorecendo a adesão do invasor. A adesão inicia um processo de sinalização em
cascata que culmina na invaginação da membrana plasmática e, posterior internalização
do parasita.108 Em seguida, o protozoário se diferencia na forma amastigota. Essa forma
é capaz de se dividir por divisão binária, aumentando o número de parasitas no
citoplasma.109 Após a divisão, as formas amastigotas se diferenciam novamente na forma
tripomastigota, sendo liberadas novamente na corrente sanguínea logo após ruptura da
célula hospedeira.
Devido à alta motilidade da forma tripomastigota, o protozoário, ao ser liberado pode
atingir todos os tecidos do hospedeiro, invadindo outros tipos celulares (Figura 11).110
Conhecer o ciclo de vida do parasita, principalmente os mecanismos de invasão e
permanência no hospedeiro vertebrado, é crucial para o desenvolvimento de novos
fármacos capazes de eliminar completamente o parasita sem incapacitar ou matar o
hospedeiro. Considerando o escopo desse trabalho, a influência da inflamação na
progressão da Doença de Chagas e a importância do receptor P2X7 e das tirosinas
quinases em diversos processo regulatórios e inflamatórios, daremos um enfoque maior
nas vias de modulação que envolvem o P2X7R e tirosinas quinases.
57
Figura 11 - Ciclo de vida do Trypanossoma cruzi
Como já mencionado, o protozoário T. cruzi é capaz de interferir em rotas
inflamatórias de forma a favorecer sua proliferação, através da indução da produção de
citocinas, por exemplo. Todavia, as formas como esse parasita altera o processo natural
ainda não são completamente conhecidas.
O protozoário pode enganar o sistema de defesa do corpo de diferentes formas, como
por exemplo, através do reconhecimento e sinalização celular.111 O T. cruzi libera
substâncias que, ao interagirem com receptores de membrana do hospedeiro,
58
desencadeiam cascatas de sinalização, permitindo a entrada do parasita na célula.112
Essa artimanha é essencial para garantir a sobrevivência e proliferação do T. cruzi, uma
vez que ele é um parasita intracelular obrigatório. Em razão disso, tirosinas quinases são
prováveis alvos moleculares no desenvolvimento de fármacos tripanocidas.113
Uma revisão realizada por Souza e colaboradores,108 resume os diferentes tipos de
receptores envolvidos no processo de adesão e internalização do protozoário, tais como
receptores semelhantes a Toll e tirosinas quinases.114
Sabe-se que a forma tripomastigota do T. cruzi libera enzimas chamadas de ecto-
NTPDases (Ecto-Nucleoside Triphosphate Diphosphohydrolase), capazes de hidrolisar
ATP extracelular.115 Adicionalmente, os receptores purinérgicos são ativados pela
presença de nucleotídeos, como ATP, no meio extracelular. Dessa forma, o parasita pode
modular a resposta inflamatória e imune do hospedeiro modificando a concentração de
ATP extracelular (molécula considerada sinalizadora de perigo), através da liberação
dessas enzimas.
Portanto, os receptores purinérgicos, incluindo o P2X7R, podem ser alvos
moleculares promissores, porquanto são peças cruciais na regulação de mediadores pró
e anti-inflamatórios.116
1.2. Receptores purinérgicos
Descritos pela primeira vez em 1976 por Burnstock, os receptores purinérgicos de
membrana são ativados na presença de nucleotídeos e nucleosídeos. Estas moléculas
podem atuar como sinalizadores purinérgicos no meio extracelular.117 Os
purinoreceptores são expressos em quase todos os tipos celulares e participam de
processos fisiológicos importantes como: secreção exócrina e endócrina, resposta imune,
agregação plaquetária, vasodilatação endotelial, cicatrização, proliferação celular,
inflamação e secreção de citocinas,118 e, em processos patológicos, tais como: artrite
reumatoide, disfunção do trato urinário, esclerose lateral amiotrófica (ELA), diabetes e
câncer.119
Dois anos depois, os receptores purinérgicos foram divididos em duas famílias:
aqueles que têm a adenosina como agonista foram denominados P1 e os que eram
59
ativados por ATP, ADP e algumas pirimidinas P2. A família P1 tem, atualmente, 4
subtipos de receptores identificados e clonados, são eles: A1, A2A, A2B, A3. Todos os
membros desta família são chamados de receptores metabotrópicos,
y
ou seja, estão
ligados à proteína G.
Já a família P2 é subdividida quanto a sua farmacologia, estrutura molecular e
mecanismo de ação em dois grandes grupos P2YR e P2XR. O grupo de receptores P2Y,
subdividido em oito subtipos (P2Y1R, P2Y2R, P2Y4R, P2Y6R, P2Y11R, P2Y12R,
P2Y13R e P2Y14R), é metabotrópico e pode ser ativado na presença de ATP e outros
nucleotídeos como ADP, UTP, UDP e UDP-glicose. Os receptores P2X são ativados
apenas por ATP e são descritos sete subtipos (P2X1-7R).120
Os P2XR são proteínas de membrana que atuam como canais iônicos, promovendo
uma troca não seletiva de cátions (Na+, K+, Mg2+ e Ca2+) entre o meio extracelular e o
meio intracelular, quando ativados por ATP.121 O mecanismo de abertura do poro
consiste em 3 etapas: ligação do agonista (ATP), a propagação do sinal com seguinte
mudança conformacional e a abertura do canal (Esquema 3). O receptor, ao interagir
com seu agonista, neste caso, com 2 a 3 moléculas de ATP, sofre mudanças alostéricas
que se propagam por toda sua estrutura. Como resultado, abre-se um canal seletivo
transmembranar que permite a passagem de íons mono e divalentes. Após o processo
de ativação, ocorre uma fase lenta de dessensibilização e, por fim, uma fase rápida de
decaimento da corrente após a saída do ATP do sítio de ligação.122
y
Receptores metabotrópicos: são uma sub-classe de receptores de membrana que não formam um
canal iônico, mas usam mecanismos de transdução de sinal, na maioria dos casos proteínas G, para ativar
uma série de eventos intracelulares usando mensageiros químicos secundários.
60
Esquema 3 - Representação do mecanismo de ativação dos receptores P2X
Alguns P2XR, como P2X2R, P2X4R e o P2X7R, quando ativados por períodos
prolongados de exposição e/ou concentração maior de ATP, são capazes de abrir um
canal transmembranar permeável às moléculas hidrofílicas entre 314 Da e 900 Da. Já
outros P2XR, sobre exposição prolongada de ATP, fecham o canal por consequência da
dessensibilização do receptor. O mecanismo detalhado de abertura do poro é descrito
por Kawate.121, 123
1.2.1. Receptor P2X7 (P2X7R)
O receptor P2X7 faz parte da família P2X. Ele se diferencia em alguns aspectos dos
outros membros desta família. Em termos de sua estrutura, o P2X7R é o membro com
maior número de aminoácidos, 595. Este receptor é composto basicamente de um
terminal amino citoplasmático (aminoácidos 1-25), constituído de resíduos de
aminoácidos relacionados com a seletividade e regulação do canal iônico e124 de duas
regiões transmembrana altamente hidrofóbicas a TM1 (aminoácidos 26-46) e a TM2
(aminoácidos 335-355). Apresenta também, uma região de loop extracelular
(aminoácidos 47-334) que é a região de interação com o agonista ATP e de um terminal
carboxílico intracelular rico em cisteína (aminoácidos 356-595). Esse terminal é
constituído de 239 aminoácidos, o mais longo entre os receptores da família P2X, e está
61
envolvido na maioria das funções relacionadas ao P2X7R, como ativação de vias de
sinalização e interação proteína-proteína.125
Outra característica única do P2X7R é sua baixa sensibilidade ao ATP 20 (agonista
z
natural), em relação aos outros membros da família. O EC50 (concentração que produz
metade do efeito máximo) obtido para o P2X7R em diversos trabalhos se encontra na
faixa de 100 µM-2,5 mM, dependendo da espécie.126 Um outro agonista conhecido é o
composto sintético 2,3-O-(4-benzoilbenzoil)-ATP, o BzATP 21. Em receptores de
camundongo e humano, este ligante é cerca de 10 vezes mais potente que o ligante
natural (Figura 12). Um aspecto interessante deste receptor é que ele pode ser ativado
em 2 estágios. Em concentrações nanomolares de ATP extracelular um canal iônico de
baixa condutância seletivo é aberto, permitindo a passagem preferencial de íons mono e
divalentes.127 Já em concentrações na ordem de submicromolar e milimolar por tempo
prolongado, o P2X7R forma um poro (canal iônico de alta condutância) não seletivo de
membrana que possibilita a passagem de moléculas até 900 Da, como corantes (Amarelo
de Lúficer, Brometo de Etídeo, YO-PRO®.128
Figura 12 - Agonista natural e sintético do P2X7R
z
Agonista: substância capaz de ligar-se a um receptor celular e ativá-lo.
62
O P2X7R é expresso em variados tipos de celulares, tais como células oculares,129
ósseas,130 musculares,131 exócrinas,132 entre outras. Entretanto, este receptor é,
predominantemente, expresso em células de linhagem hematopoiética (presente em
células tanto do sistema imune inato como do adaptativo: macrófagos,133 basófilos,
neutrófilos, linfócitos T entre outros.134 Como resultado de sua ampla distribuição, o
P2X7R está associado a diversos eventos fisiológicos como: proliferação celular,135
migração e invasão celular,136 morte celular, neurotransmissão137 e processos
inflamatórios.138 Portanto, a desregulação (superexpressão ou superativação) deste
receptor está relacionada com diversas patofisiologias, podendo gerar resultados
benéficos ou maléficos.
Por estar presente, majoritariamente, em células do sistema imune, o papel que o
P2X7R exerce sobre o desenvolvimento e manutenção do processo inflamatório é o mais
estudado atualmente. Este interesse é explicado pela importância do processo
inflamatório no desenvolvimento de outras patologias tais como, doenças
neurodegenerativas, câncer, doenças inflamatórias crônicas, doenças parasitórias, entre
outras (Figura 13). As funções que o P2X7R exerce sobre estas patologias podem ser
encontradas em diversos artigos na literatura.119c,139
A ausência do receptor P2X7 altera o funcionamento imune da célula, como
constatado em um estudo realizado por Labasi e seu grupo. Em um modelo de murino
com artrite, os animais com deficiência deste receptor, apresentaram redução da
incidência e severidade da doença.140
63
Figura 13 - P2X7R como possível alvo terapêutico para diversas doenças
O ATP extracelular, agonista do P2X7R, é considerado um padrão molecular
associado a danos (DAMP). Esta molécula, comumente encontrada no meio intracelular
em concentrações na ordem de 5-10 mmol/L, é liberada ao meio extracelular após algum
tipo de estresse ou lesão celular, gerando um sinal de alerta. Por isso, ao redor de locais
de inflamação, o ATP encontra-se em altas concentrações. Por exemplo, na vizinhança
de células danificadas a concentração de ATP extracelular pode chegar a 0,125 - 5
mM.141 Já na microvizinhança de tumores, são encontrados níveis de até 0,700 mM.142
Uma das teorias do porquê o P2X7R só ser ativado em concentrações mais altas do que
os outros membros da família, está relacionada com seu papel crucial na morte celular e
processo inflamatório.
Fisiologicamente, a liberação do ATP intracelular para o meio extracelular pode
ocorrer a partir de células necróticas, sob estresse ou por danos à membrana
plasmática.143 Nesses casos, o ATP alcança o meio extracelular devido à ruptura da
membrana, o que ocasiona a liberação de uma grande quantidade de nucleotídeos de
forma não-específica. A liberação de ATP pode ocorrer também sem lise celular, por
P2X7R
Tuberculose
Doenças do
SNC
Doenças
inflamatórias
crônicas
Protoozes
Câncer
Diabetes
64
exemplo, quando ocorre exocitose vesicular, através de transportadores de membrana
como os transportadores ABC, e por canais iônicos como as pannexinas, possivelmente
o P2X7R, entre outros.143
Tendo em vista a importância do P2X7R no controle de diversos processos
fisiológicos e sua atuação no desenvolvimento de diversas patologias, muitas indústrias
farmacêuticas (ex.: Roche, Actelion Pharmaceutica, Pfizer e AstraZeneca) têm
empreendido esforços na busca por antagonistas do receptor P2X7R. Uma revisão
publicada em 2017 por Park e Kim, reúne patentes de antagonistas
aa
do P2X7R de 2010
até 2015.144 Apesar de existirem diversos antagonistas seletivos, com ação in vitro e in
vivo, a maioria destes não possui ação terapêutica efetiva em humanos, os compostos
CE-224535 22 da Pfzier e AZD9056 23 da AstraZeneca, falharam na fase II e III,
respectivamente (Figura 14).145 Apesar do contratempo, inúmeras moléculas de
diferentes classes ainda se encontram em fases de desenvolvimento e testes clínicos.
Entretanto, não há ainda nenhum antagonista do P2X7R disponível no mercado para
ensaios terapêuticos, apenas para testes biológicos pré-clínicos.146 Sendo assim, o
desenvolvimento de novos fármacos que tenham como alvo o P2X7R é de elevada
relevância no momento.
Figura 14 - Estrutura química de antagonistas do P2X7R
aa
Antagonistas: moléculas que inibem a resposta biológica induzida por um agonista.
65
1.3. Tirosina Quinase
As tirosinas quinases (TQ ou TK, do inglês Tyrosine Kinase) fazem parte de uma
família de enzimas chamadas proteínas quinases (PK, do inglês Protein Kinase). Essas
enzimas catalisam a transferência de um grupamento fosfato do ATP, para resíduos de
aminoácidos presentes em diferentes substratos.147 A fosforilação
bb
transforma a
estrutura do peptídeo, modificando a função ou atividade da proteína-alvo. É um
mecanismo essencial que permite a transmissão de sinais intra e extracelulares através
da célula e para o núcleo. Dessa forma, as proteínas quinases medeiam inúmeras
cascatas de sinalização, regulando processos fisiológicos cruciais, como: divisão
celular,148 metabolismo,149 sobrevivência celular,150 apoptose,151 transcrição,152 entre
outros.
Portanto, a desregulação da fosforilação altera o funcionamento celular. Essas
mudanças patológicas dentro da célula podem resultar no aparecimento de doenças,153
tais como: câncer,154 artrite reumatoide155 e doenças neurodegenerativas.156 Por isso, as
proteínas quinases quinases são consideradas alvos terapêuticos promissores.
Atualmente, são descritas 518 proteínas quinases humanas classificadas de acordo
com o aminoácido que é fosforilado. Quando a fosforilação ocorre em resíduos de
treonina ou serina, a proteína quinase é chamada de proteína serina-treonina quinase
(PSTK em inglês). Já aquelas que fosforilam resíduos de tirosina de substratos
(Esquema 4) são chamadas de proteína tirosina quinase (PTK em inglês).157 A tirosina
quinase retira um fosfato do ATP, autofosforilando-se. Em seguida, transfere o fosfato
para o substrato contendo um resíduo de tirosina (Esquema 4)
bb
Fosforilação: adição de um grupo fosfato (PO4) a uma proteína ou outra molécula.
66
Esquema 4 - Fosforilação do resíduo de tirosina (Y) pela tirosina quinase (TK)
As tirosinas quinases ainda podem ser subclassificadas de acordo com sua
organização e localização celular em: tirosinas quinases receptoras (RTKs, do inglês
Receptor Tyrosine Kinase) e tirosinas quinases não-receptoras (NRTKs, do inglês Non-
Receptor Tyrosine Kinase). Dentre as 90 TKs conhecidas, 58 são RTK, divididas em 19
subfamílias de acordo com o domínio quinase e 32 são do tipo NRTK, divididas em 10
subfamíias (Tabela 7).158
Tabela 7 - Família das tirosinas quinases
Família das tirosinas quinases
Tirosinas quinases receptoras
Tirosinas quinases não-receptoras
ALK (Anaplastic Lymphoma Kinase);
DDR (Discoidin Domain Receptor); EGFR
(Epidermal Growth Factor Receptor);
EPH (Ephrin Receptor); FGFR
(Fibroblast Growth Factor Receptor);
INSR (Insuline Receptor); MUSK
(Muscle-Specific Kinase); PDGFR
(Platelet-Derived Growth Factor); PTK7
(Protein Tyrosine Kinase 7); ROR
(Receptor Tyrosine Kinase-like Orphan
Receptor); RYK (Receptor Like Tyrosine
Kinase); TIE (Tyrosine Kinase with
ABL (The Abelson Kinase); ACK
(Activated Cdc42 Kinases); CSK (C-
terminal SRC Kinases); FAK (Focal
Adhesion Kinase); FES (Feline
Sarcoma); JAK (Just Another Kinase);
SYK (Spleen Tyrosine Kinase); TEC
(Tyrosine Kinase Expressed in
Hepatocellular Carcinoma); FRK (Fyn-
Related Kinase); SRC
TK
67
Immunoglobulin-like and EGF-Like
Domains); TRK (Tropomyosin Receptor
Kinase); VEGFR (Vascular Endothelial
Growth Factor Receptor); AATYK
(Apoptosis-Associated Tyrosine Kinase);
RET; ROS; AXL; MET
1.3.1. Tirosinas quinases receptoras (RTKs)
As tirosinas quinases receptoras são componentes cruciais de rotas de sinalização
celular, realizando a transdução de sinais
cc
extracelulares para o citoplasma. Mediando
assim, a comunicação intercelular e diversos processos biológicos desde do
desenvolvimento embrionário até a vida adulta. Apesar de existirem, até o momento, 58
tipos diferentes de tirosinas quinases receptoras humanas, todas compartilham de uma
estrutura básica composta de um domínio ligante extracelular (N-Terminal), uma hélice
transmembrana e um domínio intracelular (C-Terminal), além das características
específicas de cada família (Figura 15).159
O primeiro domínio recebe o sinal de ativação através da interação com um ligante
(L), o transmembranar conecta o extracelular com o citoplasmático e o último, possui
atividade quinase retirando um fosfato do ATP e fosforilando, seletivamente, resíduos de
tirosina de diferentes substratos (Esquema 4).
cc
Transdução de sinal: Conversão de um tipo de sinal ou estímulo (físico ou químico) em um outro, com
o objetivo de transferir informações.
68
Figura 15 - Estrutura básica dos receptores tirosina quinase e características
específicas de algumas famílias159
As tirosinas quinases receptoras são ativadas quando ligantes específicos interagem
com o domínio extracelular. A interação ligante-receptor induz a dimerização ou
oligomerização do receptor, ativando-o.160 A fosforilação da proteína pode, então, ocorrer
indiretamente por meio de uma proteína adaptadora (Figura 16 A1) ou diretamente
(Figura 16 A2). A fosforilação da proteína sinalizadora inicia uma cascata de sinalização,
gerando uma resposta celular.161
69
Figura 16 - Mecanismo de ativação fisiológica e oncogênica161
Por serem altamente reguladas, estarem envolvidas na regulação de todo o ciclo de
vida celular e funcionarem como receptoras de fatores de crescimento, muitas das RTKs
estão correlacionadas com o desenvolvimento e progressão de vários tipos de câncer.
Estudos genômicos identificaram o envolvimento de diferentes subfamílias de tirosinas
quinases receptoras na progressão do câncer, como: EGFR, VEGFR, PDGFR, MET,
entre outros.162
As RTKs podem ser ativadas indevidamente, ou por processos de mutação que
alteram o funcionamento da proteína fazendo com que ela fosforile sem a presença do
ligante (Figura 16 B), ou por superexpressão do receptor ou de seu ligante
correspondente (Figura 16 C). A superexpressão das RTKs é ocasionada normalmente
pela amplificação genômica que aumenta a quantidade do receptor no local. Em ambos
os casos, há um excesso de substratos fosforilados. Este desequilíbrio altera processos
importantes tais como divisão celular e angiogênese, permitindo o desenvolvimento e
70
crescimento de câncer. Por exemplo, fatores provenientes de tumores podem atuar sobre
as VEGFRs (Vascular Endothelial Growth Factor Receptor) provocando uma maior
vascularização do tumor, potencializando o seu crescimento.163
O descobrimento e o desenvolvimento de terapias tendo como alvo molecular as
RTKs, revolucionaram o tratamento anticâncer. Atualmente, existem diversos fármacos,
no mercado ou em testes clínicos, com ação anticâncer tendo como alvo terapêutico as
tirosinas quinases receptoras.164
Além de seu importante papel no desenvolvimento de câncer, as tirosinas quinases
receptoras também estão envolvidas em processos inflamatórios, por exemplo: O DDR,
que é uma RTK, está envolvido no processo de fibrogênese e é induzido localmente em
células epiteliais, inflamatórias e mesangiais,
dd
após danos mecânicos, químicos ou
infecciosos.165
A desregulação do receptor EGFR, causando anomalias em sua sinalização, está
associada ao desenvolvimento de asma e outras doenças pulmonares. Resultados
patológicos comuns oriundos da ativação anormal do EGFR são a hiperplasia
ee
e
metaplasia
ff
de células calciformes166 com consequente hiperprodução e secreção de
mucos (indução da produção de MUC5AC)167 e remodelamento das vias aéreas (ex.:
espessamento da membrana basal)168 Ademais, o nível de expressão da EGFR no tecido
inflamado é diretamente proporcional ao nível de dano observado no epitélio e, também,
ao grau de severidade da asma.169
Portanto, além de seu já estabelecido papel em terapias anticâncer, as tirosinas
quinases receptoras têm o potencial de se tornarem alvos terapêuticos no tratamento de
doenças inflamatórias ou com componente inflamatório.170
As principais abordagens terapêuticas envolvendo a inibição das RTKs são: o uso de
anticorpos monoclonais, ou o uso de pequenas moléculas inibidoras da tirosina quinase,
chamadas de tirfostinas. Os anticorpos monoclonais bloqueiam a ligação receptor-ligante
dd
Células mesangiais: células encontradas no mesângio do corpúsculo renal.
ee
Hiperplasia: aumento do número de células em um órgão ou em um tecido.
ff
Metaplasia: alteração reversível quando uma célula adulta, seja epitelial ou mesenquimal, é
substituída por outra de outro tipo celular.
71
uma vez que interagem com o domínio extracelular das RTKs. Diferentemente do
mecanismo de ação dos anticorpos monoclonais, as tirfostinas atuam no domínio
intracelular, impedindo a autofosforilação das RTKs, uma vez que essas moléculas
competem pelo sítio de ligação do ATP.171
1.3.2. Tirosinas quinases não-receptoras (NRTKs)
Diferentemente das RTKs, as tirosinas quinases não-receptoras (NRTKs) não
possuem características de receptor, isto é, não possuem um domínio extracelular ligante
e um domínio transmembrana. Na realidade, elas são recrutadas à cascata de
sinalização através de interações com um receptor extracelular independente. Alguns
exemplos de receptores extracelulares que podem recrutar as NRTKs são: as próprias
RTKs mencionadas na seção anterior, os receptores acoplados à proteína G e diferentes
receptores do sistema imune.172 Ou seja, essas proteínas podem funcionar iniciando uma
cascata de sinalização e, em outros casos, como um elemento para amplificar um
estímulo inicial em uma via de sinalização.
As proteínas não-receptoras podem ser encontradas livres no citoplasma ou
ancoradas na membrana celular por via de modificações amino-terminais como a
palmitoilação.173 A família das NRTKs é agrupada em 9 subfamílias de acordo com as
similaridades estruturais de seus domínios (Tabela 7). Esses domínios, como ocorre em
proteínas sinalizadoras, são reunidos em uma só estrutura através de uma sequência de
aminoácidos conectores, não possuindo função separadamente. Além do domínio
quinase (catalítico) que todos os integrantes possuem, as subfamílias apresentam outros
domínios bastante diversificados. Dependendo da subfamília, as NRTKs podem
apresentar domínios sinalizadores adicionais e/ou domínios que medeiam a interação
proteína-proteína, proteína-lipídios ou proteína-DNA, tais como SH2, SH3 e PH (domínio
de homologia com a pleckstrina, do inglês Pleckstrin Homology) (Figura 17 A).174
72
Figura 17 - Representação da tirosina quinase não-receptora SRC. A) Sequência
desnovelada dos domínios que compõem a proteína. B) Presença da fosforilação no
resíduo de tirosina 527, mantém a enzima desativada, ao ser desfosforilada, a enzima
assume conformação ativa e é capaz de fosforilar substratos
O domínio catalítico das NRTKs, aquele com função de fosforilar, possui
aproximadamente 300 resíduos de aminoácidos, parte desses resíduos são dispostos
em 5 folhas beta e uma hélice alfa, constituindo o lobo N-terminal, enquanto que o
restante dos resíduos de aminoácidos constitui o lobo C-terminal, os quais são
organizados, majoritariamente, em hélices alfa. O ATP liga-se na cavidade existente
entre os dois lobos. O resíduo de tirosina, presente no substrato, interage com os
resíduos do lobo C-terminal. As NRTKs são mantidas em seu estado inativado por
proteínas e lipídios inibidores e/ou por auto-inibição intramolecular (Figura 17 B). Por
exemplo, a NRTK c-ABL é inibida pela proteína retinoblastoma. Já como exemplo do
processo de auto-inibição, pode-se citar a inibição de NRTKs por interação entre os
domínios SH2 e o C-terminal fosforilado, e entre o domínio SH3 e o conector SH2-quinase,
como no caso da SRC (Figura 17 B).175
73
A ativação das NRTKs é mais complexa do que a observada para as RTKs. Essas
proteínas podem ser ativadas por meio de uma variedade de sinais intracelulares que
promovem a dissociação entre as NRTKs e seus respectivos inibidores e pela trans-
fosforilação por outras quinases.176 Além disso, as NRTKs podem ser ativadas também
ao serem recrutadas por receptores transmembrana, como no caso dos receptores de
citocinas. Esses receptores, na maioria dos casos, não possuem um domínio quinase e,
portanto, utilizam as tirosinas não-receptoras como subunidades catalíticas cruciais em
sua rota de sinalização.177 Outro exemplo é o caso da tirosina quinase receptora PDGFR.
Essa RTK, quando ativada, recruta e ativa a família SRC que é essencial para a
propagação do sinal e consequentemente, para a regulação de diferentes processos.178
Assim como as tirosinas quinases receptoras, as não-receptoras são capazes de
regular uma infinidade de respostas e processos celulares tais como a diferenciação e a
adesão celular, a regulação da expressão de genes, a proliferação, a inibição do
crescimento celular, a apoptose, entre outros. Por exemplo, a IL-6 induz a ativação da
JAK que, por sua vez, fosforila o STAT (transdutor de sinal e ativador de transcrição)
ativando-o.179 A c-Abl é igualmente importante, sendo capaz de se ligar ao DNA no núcleo
e aprisionar o ciclo celular em casos de danos no DNA, levando à reparação ou
apoptose.180 Um outro exemplo de importância das NRTKs na regulação de processos
biológicos é a ação da FAK, a qual pode regular o processo de adesão celular e de
proliferação.181
Conforme estabelecido acima, as NRTKs possuem diferentes sistemas de regulação
de suas atividades, além de serem essenciais em diferentes processos celulares. Desta
forma, tem-se que diferentes doenças podem ocorrer como resultado da falha nestes
processos regulatórios, destacando-se o câncer e as doenças de cunho inflamatório.
Grande parte dos esforços no desenvolvimento de terapias onde as NRTKs são tomadas
como alvos terapêuticos destinam-se ao combate do câncer. De fato, muitas das NRTKs
conhecidas já foram identificadas como oncogenes (ex.: ABL, FES e Src). Além do que,
a disfunção da atividade sinalizadora das quinases está associada ao crescimento de
tumores malignos.182 Na última década, o papel das NRTKs no desenvolvimento de
doenças autoimunes e inflamatórias tem sido estudado, devido à importância dessas
proteínas em processos regulatórios-chave no desenvolvimento dessas doenças.183
74
Portanto, as NRTKs não só são alvos terapêuticos importantes no desenvolvimento de
terapias anti-câncer, como são um alvo promissor no tratamento de doenças autoimune
e inflamatórias.
Diversas formas de modulação da atividade das NRTKs vêm sendo descobertas ao
longo dos anos. Isso porque, os papéis e os diferentes caminhos de sinalização em
variados processos regulados por tirosinas quinases não-receptoras, como a ação no
sistema imune, no metabolismo ósseo ou no funcionamento das plaquetas, para citar
alguns, têm sido elucidados. Além disso, avançou-se no conhecimento de novas NRTKs
e do papel que este tipo de proteína exerce nos processos celulares importantes para o
desenvolvimento do câncer como a proliferação celular, a angiogênese e a apoptose,
bem como nos processos não-oncogênicos. As NRTKs foram um dos primeiros fatores
identificados como reguladores do desenvolvimento de doenças autoimunes, em
consequência de seu papel crucial no desenvolvimento e ativação das células B e T.
Essas células respondem à estimulação de citocinas via sinalização mediada por NRTKs
como a JAK, a SRC, a SYK e a CSK. A hiperatividade de células B está associada à
produção de anticorpos auto-reativos
gg
que contribuem para a patogênese do lupus
eritematoso sistêmico e artrite reumatoide.155,184 Já o funcionamento desregulado de
células T pode contribuir para a patogênese da esclerose múltipla e da artrite
reumatoide.177b As NRTKs também estão envolvidas no desenvolvimento e progressão
de diferentes doenças inflamatórias de pele, tais como psoríase e dermatite atópica. Esse
envolvimento com doenças inflamatórias é explicado pela importante contribuição das
NRTKs na regulação de diferentes citocinas, como é explicado no artigo escrito por Page
e colaboradores.44
Visto a importância dessas enzimas (RTKs e NRTKs) na regulação de diferentes
processos cruciais no corpo humano e sua correlação com diferentes patogêneses, a
elaboração de novos inibidores é uma estratégia importante no desenvolvimento de
tratamentos alternativos à terapia vigente. Essas enzimas têm sido objetos das pesquisas
gg
Anticorpos auto-reativos: São anticorpos que reagem contra elementos do próprio corpo.
75
de numerosos programas de desenvolvimento de fármacos nas indústrias farmacêuticas.
De fato, inúmeros compostos são relatados na literatura com atividade inibitória de RTKs
e NRTKs. Até 2019, haviam 52 pequenas-moléculas inibidoras de proteína quinase
aprovadas pela FDA (Federal Drug Administration), das quais 28 eram inibidoras de
RTKs e 11 de NRTKs. Devido à complexidade, à abundância e à variedade dessas
enzimas, o completo entendimento da ação das quinases na comunicação celular ainda
é motivo de pesquisa, e, configura um desafio para a ciência moderna.185
É importante ressaltar que foram dados apenas alguns exemplos neste trabalho, pois,
embora os mecanismos de ação sejam muito semelhantes entre si existem diversas
RTKs e NRTKs, cada uma com seu ativador específico e com sua própria proteína-
substrato.185
1.3.3. Tirfostinas
A primeira menção de inibidores de proteínas quinases ocorreu por volta de 1980,186
quando se demonstrou que vários compostos naturais, como a quercetina 24, a
genisteína 25 e a erbstatina 26 (Figura 18) apresentaram atividade inibitória frente ao
EGFR. Apesar de possuírem baixa seletividade e potência, estes compostos serviram
como base no design de compostos novos e mais potentes.
Figura 18 - Primeiros compostos testados como inibidores de tirosina quinase e design
de benzeno-vinilnitrilas
76
Levitzki187 e colaboradores sintetizaram diversas benzeno-vinilnitirlas que
apresentaram boa inibição competitiva do EGFR, (AG18 IC50 = 40 μM; AG99 IC50 = 4
μM; AG82 IC50 = 3 μM) (Figura 19) e excelente seletividade.188 Essas benzeno-
vinilnitrilas foram sintetizadas com base na estrutura da erbstatina 26 (IC50 = 14 μM)187 e
do ácido benzilidenomalônico 27 (Figura 18), o qual apresentou atividade inibitória frente
a IRK (Ki = 4,84 mM) em um estudo realizado por Levitzki e colaboradores.189 Dessa
forma, surgiu a classe de pequenas-moléculas denominada tirfostinas (do inglês,
tyrphostins - Tyrosine Phosphorylation Inhibitors). A partir dos resultados obtidos para
as tirfostinas, concluiu-se que era possível obterem-se inibidores de tirosinas quinases
com baixíssima toxicidade tanto in vitro quanto in vivo, o que alavancou o interesse por
esta classe de moléculas.
Figura 19 - Exemplos de benzeno-vinilnitrilas com atividade inibitória frente ao EGFR
No estudo de Levitzki com as benzeno-vinilnitrilas foi observado que a presença da
dupla ligação era necessária para a atividade inibitória. Além disso, a introdução de uma
hidroxila no anel aromático resultou em um aumento de 10-15 vezes na potência dos
compostos.188 Posteriormente, a estrutura das moléculas foi sendo modificada para
mimetizar o ATP e aumentar sua potência. Na maioria dos casos, foram adicionados
núcleos quinazolínicos.
As tirfostinas podem ser separadas em três classes: aquelas que competem com o
substrato e não competem com ATP, as que competem com o ATP, e as que competem
tanto com o ATP quanto com o substrato. Entretanto, grande parte dos inibidores
avaliados compete com o ATP. Apesar das similaridades estruturais dos sítios de
interação com ATP entre as diferentes tirosinas quinases, as pequenas diferenças
77
existentes, permitem que determinados fármacos atuem em uma subclasse sem atuar
sobre toda a família. Essa característica confere seletividade às tirfostinas.186 Acredita-
se que inibidores competitivos pelo substrato são mais seletivos, devido a maior
diversidade existente no domínio de interação com o substrato.
Desde então, diferentes classes de moléculas têm sido avaliadas com relação a sua
atividade inibitória de tirosinas quinases, ampliando, significativamente, o universo de
tirfostinas conhecidas. Como já menciondo, atualmente, existem diferentes tirfostinas
aprovadas para usos terapêuticos destinados aos mais diferenciados alvos, tais como:
imatinibe, cabozantinibe, fedratinibe, alectinib, entre outros. Alguns exemplos podem ser
vistos na Tabela 8.185
A classe das tirfostinas é composta de moléculas estruturalmente bem diversas, de
forma que, no presente trabalho serão enfatizadas as tirfostinas mais próximas em
estrutura àquelas relatadas por Levitzki187 no seu trabalho pioneiro (Figura 19). Essas
tirfostinas originais foram empregadas como protótipos para a síntese das moléculas
avaliadas nesta dissertação.
78
Tabela 8 - Moléculas inibidoras de tirosina quinase aprovadas pela FDA
Inibidor
Alvo molecular
Aplicação terapêutica
BCR-Abl
leucemia eosinofílica
crônica, doença
mieloproliferativa (uso
liberado em 2001)
Ret; VEGFR2
câncer de tireoide
medular, carcinoma de
células renais (uso
liberado em 2012)
JAK 1/2
artrite reumatóide (uso
liberado em 2018)
JAK 2
mielofibrose (uso
liberado em 2019)
ALK, Ret
câncer de pulmão de
células não pequenas
(uso liberado em 2015)
Syk
trombocitopenia imune
crônica (uso liberado
em 2018)
79
1.4. Ácidos arilborônicos
Compostos contendo boro, como os ácidos arilborônicos, têm ganhado a devida
atenção na química medicinal nas últimas décadas. O aumento do interesse por essa
classe de moléculas é devido, em grande parte, às propriedades únicas desse elemento.
Historicamente, os ácidos arilborônicos são conhecidos apenas como intermediários
versáteis na síntese orgânica. Esses intermediários facilitam a formação de diferentes
tipos de ligação através de reações como hidroboração190 (C-H, C-OH), acoplamento de
Suzuki-Miyaura191 (C-C) e acoplamento de Chan-Lam192 (C-N e C-O). Apesar da grande
importância dos ácidos borônicos como intermediários na síntese orgânica, as aplicações
e as potencialidades para novos usos não estão restritas à síntese. Ao contrário, esses
compostos podem ser empregados na química supramolecular, na química medicinal, na
medicina diagnóstica, como ligantes em colunas cromatográficas ou géis de eletroforese
para análise química, na determinação do excesso enantiomérico de moléculas quirais
por ressonância magnética nuclear, como sensores químicos por fluorescência,
colorimetria, etc.
No que diz respeito à Química Medicinal, o potencial dos ácidos borônicos foi ignorado
por muito tempo, em parte, pela convicção de que o boro fosse tóxico. Contudo,
diferentes estudos indicam que esta concepção de que o boro é inerentemente tóxico é
infundada. Na realidade, o boro é um elemento valioso para o emprego em Química
Medicinal.193 A utilidade dos compostos de boro para a Química Medicinal tem sido
comprovada nas últimas duas décadas à medida que o conhecimento sobre a química
dos compostos de boro avançou. Neste período, ficou estabelecido o papel que o boro
exerce em diversos sistemas vivos, como as plantas por exemplo, além de terem sido
publicados dados e estudos sobre a toxicidade dos compostos de boro. Finalmente, em
2005 foi aprovado pelo FDA o bortezomibe, um boronopeptídeo empregado no
tratamento do mieloma múltiplo e comercializado pela Millennium Pharmaceuticals com
o nome de Velcade 28 (Figura 20).194 Mais recentemente, em 2015, a FDA aprovou o
ixazomibe 29 (Figura 20), cuja estrutura é semelhante ao bortezomibe. Este foi
desenvolvido para o tratamento de pacientes com recaída ou refratários. O seu
mecanismo de ação está correlacionado com a inibição da atividade do tipo
80
quimiotripsina do proteosoma 20S, que induz à apoptose das linhagens das células do
mieloma múltiplo.195 A aprovação desses compostos impulsionou o interesse da
sociedade científica em direção ao desenvolvimento de novos fármacos baseados na
química do boro, de tal maneira que nos últimos anos diversos estudos relatam diferentes
atividades biológicas promissoras como: antifúngica, antiviral, anti-inflamatória,
antiparasitária entre outros.196
Figura 20 - Estrutura do Bortezomibe (Velcade®) e do Ixazomibe (Ninlaro®)
Dentre os compostos com boro (Figura 21), os ácidos borônicos 31 são
particularmente relevantes para a química medicinal, em razão de suas características
peculiares, tais como: fácil interconversão da forma trigonal planar neutra sp2 para a
forma sp3 tetraédrica carregada negativamente, dependendo da condição fisiológica,
interação forte com compostos contendo a unidade diol, sua acidez de Lewis e
capacidade biomimetização.197 Grande parte das características únicas dessa classe de
moléculas advém da presença do boro. Em razão dessas propriedades, os ácidos
borônicos têm sido usados como inibidores de enzimas, sensor, e transportadores
transmembrana, por exemplo.198
Ácidos borônicos são compostos que apresentam um grupo orgânico (R) ligado a
uma unidade B(OH)2: R-B(OH)2. O grupo R orgânico pode ser derivado de um alcano
(alquila), de um alqueno (alquenila), de um alquino (alquinila) ou de um aromático (arila).
Como possuem uma ligação C-B, são considerados organoboros ou organometálicos de
boro. Trata-se de compostos sintéticos e que podem ser considerados derivados do ácido
bórico 30 (Figura 21), isto porque a troca de uma das hidroxilas do ácido bórico geraria
um ácido borônico. De fato, em muitos casos, a degradação desses compostos produz
ácido bórico. Portanto, estruturalmente, os ácidos borônicos são compostos trivalentes
81
onde o boro, átomo central com hibridização sp2, liga-se a duas hidroxilas (ligação B-O)
e a um grupo orgânico (Figura 21).
Figura 21 - Compostos de boro
Com relação à força das ligações, a ligação B-O é favorecida termodinamicamente
em comparação com a ligação C-B. Essa diferença de força pode ser evidenciada pelos
comprimentos e pela energia da ligação (Tabela 9), já que a ligação B-O é mais forte do
que a ligação C-B.197,199
Tabela 9 - Energias e comprimentos de ligação padrão197,199
Ligação B-X
E (kJ/mol)
Comprimento da ligação (Å)
B-C
323
1,55-1,59
B-O
519
1,35-1,38
Os ácidos borônicos são propensos à desidratação quando aquecidos (Esquema 5
A).200 Essa reação ocorre quando três moléculas de ácido borônico reagem entre si,
liberando três moléculas de água. A liberação de água permite a formação de um anidrido
cíclico chamado de boroxina 34 (Figura 21). Os ácidos borônicos também reagem com
álcoois e fenóis gerando ésteres borônicos 33 (Esquema 5 B).201 Tanto a formação de
anidridos como a esterificação são características úteis da química do boro que têm sido
82
bem aproveitadas na química supramolecular para o desenvolvimento de novos materiais
com propriedades eletrônicas, catalíticas ou de armazenamento de gases, para citar
algumas.202
Esquema 5 - Reações de desidratação e esterificação sofridas por ácidos borônicos
A formação dessas estruturas oligoméricas a partir dos ácidos borônicos, apesar de
interessante para a química de materiais, dificulta a caracterização dos mesmos. Por
exemplo, o processo de aquecimento em estado sólido, necessário à determinação do
ponto de fusão pode levar à desidratação dos ácidos borônicos com consequente
formação de boroxinas. Desta forma, o ponto de fusão obtido reflete o ponto de
desidratação e/ou decomposição.200c Adicionalmente, deve-se ter em mente que cada
amostra de ácido borônico pode apresentar diferentes graus de hidratação, podendo
existir um percentual da amostra sob a forma de ácido borônico e outro sob a forma de
um anidrido de boro. Isso se deve tanto à forma de obtenção deste ácido quanto ao
processo de armazenamento. Uma vez que o grau de hidratação das diferentes amostras
não é conhecido, essa incerteza irá refletir-se na falta de reprodutibilidade dos pontos de
fusão relatados. Desta forma, fazem-se necessários métodos mais sofisticados para
determinação dos pontos de fusão desses compostos.203
Quanto à espectroscopia na região do infravermelho, as bandas de estiramento
características para ligação OH são observadas entre 3300 e 3200 cm-1. Por outro lado,
uma banda forte em 680-705 cm-1 é indicativa da presença de anidrido.204
83
Outra característica peculiar dos ácidos borônicos é sua acidez. Apesar da presença
de duas hidroxilas, é o átomo de boro, deficiente em elétrons, responsável pelo caráter
ácido moderado dessas moléculas. Essa acidez é justificada pela presença de um orbital
p vazio, pertencente ao boro, disponível para receber pares de elétrons (Figura 22).205
Isto é, pelo menos no primeiro momento, não é a doação de um próton (acidez de
Brönsted) de uma das hidroxilas com liberação de H3O+ que caracteriza a acidez dos
ácidos borônicos. O processo começa com o ácido borônico agindo como um ácido de
Lewis, recebendo a doação de um par de elétrons da água em seu orbital p vazio. O
aduto gerado age como um ácido de Brönsted, ao interagir com uma segunda molécula
de água, liberando H3O+ (Esquema 6).205 Isso permite a determinação do pH do meio
pela alteração da concentração de H3O+ e, consequentemente, a determinação de uma
constante de acidez (Ka). O Ka dos ácidos borônicos é influenciado pela natureza do
grupo orgânico ligado ao boro, em geral, podendo variar de 4,0 a 8,8 (Tabela 10).206 O
produto da reação ácido-base que envolve um ácido borônico tem geometria tetraédrica,
com o boro hibridizado em sp3 e carregado negativamente.
Figura 22 - Estrutura dos ácidos borônicos
Esquema 6 - Reação entre a água e ácidos borônicos205
84
Tabela 10 - Constante de ionização para alguns ácidos borônicos197, 207
R-B(OH)2
pKa
R-B(OH)2
pKa
B(OH)3 (ácido bórico)
9,0
8,6
CH3-B(OH)2
10,4
9,1
Ph-B(OH)2
8,9
7,8
9,0
7,1
9,1
5,3
9,3
4,0
Além da água, outras bases de Lewis podem interagir com ácidos borônicos para
gerar adutos tetraédrico (Esquema 7 A). Por exemplo, íons como o fluoreto ou o
hidróxido podem coordenar-se ao boro, além de álcoois, fenóis, aminas, etc.208 Esse
mecanismo ácido-base pode ocorrer pela interação de grupos hidroxila ou amino
presentes em resíduos dos aminoácidos de uma enzima, o que pode ser uma via de ação
pela qual um ácido borônico atue como um inibidor enzimático. (Esquema 7 B).
Além da possibilidade de interações covalentes com bases de Lewis, os ácidos
borônicos podem também realizar ligações de hidrogênio, tornando o grupamento B(OH)2
85
altamente versátil em termos de possibilidades de interação com sítios ativos de enzimas
(Esquema 7 C).
Esquema 7 - Acidez de Lewis dos ácidos borônicos e analogia ao estado de transição
(E.T.ǂ) de proteases. A) Mudança de hibridização sp2 em sp3 após coordenação com
um ânion. B) Interação ácido-base de Lewis entre a hidroxila de uma enzima e o ácido
borônico. C) Interação enzima/ácido borônico através de ligação de hidrogênio. D)
Interação enzima com seu substrato natural209
86
Outra característica importante dessa classe de moléculas é a possibilidade de
biomimetização. O boro e o carbono possuem muitas similaridades com respeito a sua
estrutura e às propriedades eletrônicas, mas não com relação a sua reatividade. Isso
significa que o boro pode mimetizar o carbono no processo de interação com estruturas
bioativas. Entretanto, o efeito gerado por essa interação pode ser totalmente distinto já
que pela diferença de reatividade entre o boro e o carbono, a sequência de reações
subsequentes à formação do aduto entre o composto de carbono e a enzima é diferente
do que ocorre para o aduto entre esta enzima e o composto de boro.209 Esse é um dos
princípios em que se baseia o design de inibidores de hidrolases análogos do estágio de
transição. Os ácidos borônicos, em particular, mimetizam ácidos carboxílicos e seus
derivados, presentes em substratos naturais das enzimas. Ao interagir com uma base de
Lewis presente no sítio ativo da hidrolase, o ácido borônico forma um intermediário
tetraédrico carregado negativamente da mesma forma que o substrato da enzima (uma
amida, por exemplo) forma um intermediário tetraédrico carregado ao interagir com a
enzima (Esquema 7 B e D).209 Os ácidos borônicos, como as amidas, são centros
eletrofílicos que podem ser atacados pelos nucleófilos presentes nos sítios ativos das
hidrolases. As hidrolases podem possuir resíduos de serina ou treonina, por exemplo, no
seu sítio ativo, os quais possuem uma hidroxila que age como um nucleófilo frente ao
substrato natural. Outras hidrolases podem possuir outros resíduos de aminoácidos no
seu sítio ativo, onde outros grupos como SH, COOH, NH2, por exemplo, exercem a
função de nucleófilos para atacarem o centro eletrofílico presente no substrato. Na reação
com o substrato natural, a acil-enzima gerada é hidrolisada, liberando a enzima livre
(Esquema 7 D). Na reação da enzima com um composto de boro, a enzima permanece
ligada ao aduto tetraédrico gerado, não havendo a etapa da hidrólise que ocorre com o
substrato natural e que é responsável pela liberação da enzima livre para interagir com
outra molécula de substrato (Esquema 7 B).209 Assim, pode-se considerar que a ligação
com o ácido borônico promoveu a inibição da enzima. A reação ácido-base entre um
ácido borônico e um grupo presente em uma enzima é reversível. Esse fato, é importante,
uma vez que a inibição promovida pelo ácido borônico é reversível, podendo-se recuperar
a enzima. Isso tem um impacto grande na toxidez de um inibidor. Inibidores irreversíveis,
como os agentes alquilantes, não permitem a recuperação da enzima necessária aos
87
processos biológicos normais do organismo, resultando em uma toxidez mais elevada.
Desta forma, o ácido borônico proporciona um tipo de inibição vantajosa em comparação
a outros inibidores.209
A química dos ácidos borônicos é bastante ampla tanto no que tange aos processos
de preparação, quanto nas propriedades197,196b, 210 e aplicações destes compostos.211
Entretanto, como no presente trabalho, objetiva-se o preparo de compostos para fins
medicinais, serão abordados nas seções seguintes exemplos e informações relativas ao
uso dos ácidos borônicos como fármacos.
1.4.1. Ácidos arilborônicos como compostos bioativos
Uma classe de inibidores enzimáticos importantes no desenvolvimento de fármacos
é a dos análogos dos estados de transição de hidrolases. Os ácidos borônicos podem
formar adutos tetraédricos carregados negativamente com o sítio ativo de enzimas
envolvidas em processos biológicos importantes, levando a um estado de transição
semelhante àquele do intermediário tetraédrico negativamente carregado proveniente da
interação do substrato natural com a enzima. Outras formas de interação destes
compostos com alvos-moleculares importantes para o desenvolvimento de terapias,
como as enzimas e receptores, são as ligações de hidrogênio formadas entre a unidade
B(OH)2 e resíduos de aminoácidos presentes na estrutura do alvo e a formação de um
aduto tetraédrico por interação desta unidade com um grupo da enzima que atue como
uma base de Lewis. Essas interações contribuem para o ancoramento do inibidor no alvo
(Figura 23). Os relatos dos ácidos borônicos como inibidores enzimáticos212 não se
restringem apenas às proteases.213 Há relatos da atuação dos ácidos borônicos na
inibição de diversos alvos. Por exemplo, esses compostos podem ser inibidores de
proteassomas,214 de arginases,215 de óxido nítrico sintases,216 de transpetidases,217 entre
outros. Nos inibidores enzimáticos contendo ácidos borônicos, a porção borono é
essencial para a sua atividade. Isso porque confere à molécula seletividade frente a
outras enzimas, além de mimetizar a função ácido carboxílico presente nos substratos
naturais (Figura 23).
88
Figura 23 - Semelhanças entre as interações proteína alvo/ácido borônico e
proteína/ácido carboxílico
Embora o início das pesquisas sobre a aplicabilidade dos ácidos borônicos em
química medicinal tenha sido com ácidos borônicos simples, como os arilborônicos;
atualmente, não é mais assim. Ao contrário, relatam-se estruturas muito elaboradas
contendo a unidade B(OH)2. Isso se deve ao fato de que o conhecimento de ferramentas
de síntese para instalar o grupo B(OH)2 aumentou bastante. Uma vez que esses
compostos se tornaram mais disponíveis a partir da síntese, os estudos relativos às
aplicações desses compostos em diferentes campos também cresceram. No presente
trabalho, será dado um enfoque nos ácidos arilborônicos, relatando-se a seguir, algumas
das aplicações dos mesmos na química medicinal.218
Nas terapias de doenças causadas por bactérias patogênicas, é comum utilizar-se um
inibidor de -lactamase (ex.: ácido clavulânico, tazobactam ou sulbactam) em conjunto
com um antibiótico -lactâmico. O anel -lactâmico (Figura 24) é essencial no antibiótico
no processo de inibição da construção da parede celular das bactérias.219 Um dos
fenômenos de resistência responsáveis por diminuir a eficácia deste tipo de abordagem
terapêutica consiste no desenvolvimento por parte dos micro-organismos de -
lactamases capazes de hidrolisarem o anel -lactâmico dos antibióticos.220 No esquema
89
8, tem-se um exemplo de uma lactamase do tipo serino-protease, a qual utiliza um
resíduo de serina presente em seu sítio ativo para atuar como um nucleófilo no processo
de hidrólise e, portanto, inativação, do antibiótico -lactâmico. Os inibidores de -
lactamases disponíveis no mercado não fazem frente à diversidade de -lactamases
apresentadas pelos micro-organismos, tornando necessária a pesquisa por novos
inibidores.221 Ácidos arilborônicos têm sido relatados na inibição de -lactamases,
mostrando-se úteis no design de novos fármacos, inclusive demonstrando eficácia sobre
lactamases para as quais o ácido clavulânico e os demais inibidores de lactamases
disponíveis falham. O mecanismo pelo qual os ácidos arilborônicos parecem agir para
inibirem as lactamases das bactérias consiste na mimese da carbonila lactâmica do
antibiótico (substrato das lactamases). Neste caso, a serina presente na lactamase ataca
o boro do ácido arilborônico formando um intermediário tetraédrico negativamente
carregado, ou seja, o composto mimetiza o estado de transição que leva ao intermediário
tetraédrico do substrato natural destas enzimas. Na figura 24, mostram-se alguns dos
ácidos arilborônicos (35-40) relatados com atividade frente a lactamases (ex. de enzimas
liberadas por bactérias patogênicas: TEM-1, AmpC, P99, KCP-2).222
Figura 24 - Anel β-lactama e inibidores de enzimas β-lactamases
90
Esquema 8 - Esquema de intermediários da hidrólise de um antibiótico β-lactâmico por
uma serino β-lactamase223
Diferentes estratégias podem ser abordadas no desenvolvimento de fármacos
anticâncer. Há relatos da utilidade dos ácidos arilborônicos como anticânceres que
abordam diferentes alvos moleculares.224
O uso de agentes antimitóticos que tenham como alvo o sistema de microtúbulos de
células eucarióticas,225 e, portanto, atuem no processo de divisão celular, é uma
estratégia de terapia anticâncer. Os microtúbulos são formados por α e β-tubulinas.226 A
tubulina possui diferentes sítios de ligação, os quais quando acessados, resultam na
inibição da polimerização dos microtúbulos, desestabilizando o processo de formação
dos mesmos. Como exemplos de ligantes de tubulinas que são empregados como
antimitóticos na terapia do câncer são os alcaloides da vinca, vincristina e vimblastina, os
taxanos (paclitaxel, docetaxel) e as colchicinas.227
A combretastatina A-4 41 (CA-4) é um exemplo de produto natural que interage com
a tubulina no sítio de ligação conhecido como sítio da colchicina 42 (Figura 25 A e B).
Embora possua atividade antimitótica potente, a combretastatina A-4 não pôde avançar
nos testes clínicos por possuir uma lipofilicidade demasiado elevada.196a A fim de se
91
obterem compostos com melhor perfil famacocinético, a combretastatina A-4 tem sido
empregada como um protótipo a partir do qual outros ligantes de tubulina são
desenhados. O grupo de Kong, por exemplo, substituiu as hidroxilas presentes na
estrutura da combretastatina A-4, no anel fenólico B, por unidades B(OH)2. Esse grupo
preparou borono derivados diastereoisoméricos (cis e trans) da combretastatina A-4
(Figura 25, 43a e 43 b).228 No estudo de Kong, ficou demonstrado que o borono derivado
cis 43a apresenta potência superior à da combretastatina A-4 na inibição da
polimerização da tubulina (IC50 = 2,0 ± 0,1 µM), e, maior citotoxidade para linhagens de
células MCF-7 de câncer de mama humano (IC50 = 32 ± 21 nM). Além disso, o
estereoisômero cis 43a não foi somente mais potente na inibição da polimerização de
tubulina (cisIC50 = 1,5 ± 0,2 µM versus transIC50 = 7,8 ± 1,4 µM) do que o trans 43b, mas
também mais citotóxico quando avaliado frente às linhagens de células MCF-7 de câncer
de mama humano (cisIC50 = 17 ± 5 nM versus transIC50 = 470 ± 140 nM). Outra
característica importante que o derivado borônico cis apresentou foi uma maior
solubilidade em água em pH = 2 que a combretastatina A-4, o que representa um ganho
sob o ponto de vista famacocinético. O grupo de Kong, empregando um estudo de
docking molecular, fez inferências quanto ao mecanismo de ação do derivado 43a,
relatando que a ação do mesmo se dá por deslocamento competitivo ao ligar-se por meio
de ligações de hidrogênio fortes a resíduos de aminoácidos da subunidade da
tubulina.228
92
Figura 25 - Estrutura da combretastatina A-4, da colchicina e dos análogos borônicos
da CA-4
O grupo de Nakamura também verificou o efeito da unidade B(OH)2 no anel aromático
B da cis-combretastatina A-4, relatando que a ação dos derivados de boro na proliferação
celular pode ocorrer tanto por diminuição da formação de microtúbulos quanto por
indução da apoptose (Figura 26).229 O teste de inibição de crescimento celular foi
realizado com as linhagens B-16 e 1-87, para as quais os derivados que continham a
unidade B(OH)2 na posição meta (44a-d) apresentaram um resultado superior (células B-
16: IC50 = 0,0063 µM; Células 1-87: IC50 = 0,013 µM), comparativamente aos para-
substituídos (45a-b).
Figura 26 - Z-Estilbenos borônicos com atividade anti-proliferativa229
O EGFR exerce um papel muito importante na proliferação celular, sendo um alvo
molecular importante no desenvolvimento de terapias de tipos diversos de câncer. As 4-
anilinoquinazolinas são úteis como inibidores reversíveis dessa tirosina quinase, tal como
o composto Iressa 46 (Figura 27).230 Ao investigar o efeito da introdução de unidades
B(OH)2 no anel aromático da 4-anilinoquinazolina (Figura 27), o grupo de Nakamura230
93
verificou que o crescimento das células de câncer foi inibido por meio do aprisionamento
do ciclo celular G1, com consequente indução de apoptose. O composto 47 (Figura 27)
inibiu a fosforilação da EGFR mediada por EGF com um tempo de ação prolongado de 5
h após a lavagem celular. Com base em estudos de docking molecular, atribuiu-se a
atividade anticâncer prolongada à formação de uma ligação covalente B-O entre o
resíduo de ácido aspártico 800 e o boro.
Figura 27 - Ácido arilborônico inibidor de EGFR230
A influenza A (IAV) é uma doença viral, a qual é ameaçadora principalmente para
pessoas idosas, crianças e indivíduos imunocomprometidos devido, por exemplo, a
doenças crônicas. Wang e colaboradores231 sintetizaram borono quindolinas e avaliaram-
nas frente ao vírus da influenza A (IAV), tendo verificado que os borono derivados 48a e
48b (Figura 28) não somente evitaram o acesso dos vírus ao núcleo celular, como
também diminuíram a quantidade de vírus nas células infectadas. O fosfato de oseltamivir
49 é um inibidor de neuraminidases virais empregado correntemente na terapia da
influenza. Em ensaios com cobaias vivas, Wang e colaboradores verificaram que a taxa
de sobrevivência era maior para os animais tratados com 48b do que para os animais
tratados com o oseltamivir. O bloqueio da infecção por IAV com o composto de boro 48b
ocorre através de um espectro amplo de ação, pois o mesmo, além de inibir
neuraminidase, inibe as vias de sinalização NF-B (fator nuclear kappa B) e MAPK
(“mitogen-activated protein kinases” = proteínas quinases ativadas por mitógenos).231
94
Figura 28 - Ácidos borônicos de quindolinas avaliados para o vírus da influenza A231
A partir de estudos da literatura, como aqueles relatados anteriormente, pode-se
observar que a introdução de unidades B(OH)2 na estrutura de inibidores pode ser uma
estratégia interessante no design de fármacos.
1.5. Condensação de Knoevenagel
A reação de condensação de Knoevenagel foi relatada pela primeira vez em 1894
pelo químico alemão Emil Knoevenagel. O primeiro artigo sobre essa reação descreve a
condensação entre o formaldeído 50 e o metilenos ativo, malonato de dietila 51, dando
origem ao aduto bis 52 (Esquema 9 A). Essa reação foi realizada na presença de
etilamina como catalisador.232
Em estudos posteriores empregando o benzoilacetato de etila 53 em reação com o
formaldeído 50 na presença de piperidina a 0 °C, somente verificou-se a formação do
produto insaturado 54 (Esquema 9 B). Os estudos de E. Knoevenagel o levaram a
concluir que o produto primário da reação é um composto insaturado e que a formação
do “produto bis” depende das condições de reação. Esse produto provém da adição de
Michael do composto nucleofílico (malonato de dietila ou denzoilacetato de etila, para
utilizar os exemplos anteriores) sobre o produto insaturado. O desenvolvimento desta
reação por E. Knoevenagel levou à seguinte generalização: trata-se da condensação de
β-cetoésteres ou malonatos com aldeídos e cetonas sob catálise de aminas primárias e
secundárias, ou ainda de seus sais.232
95
Esquema 9 - Primeira reação de condensação de Knoevenagel
Atualmente, a reação conhecida como condensação de Knoevenagel é a reação entre
um metileno ativo (composto com unidade CH2 formada de H’s ácidos) e
aldeídos/cetonas na presença de uma base fraca para formar um composto α,β-
instaurado. Neste tipo de reação, o aldeído ou cetona sofre adição nucleofílica de um
nucleófilo de carbono, com posterior desidratação (Esquema 10). Em meio básico, o
nucleófilo de carbono (metileno ativo) é um enolato ou análogo e, em meio neutro ou
ácido, esse nucleófilo é um enol ou análogo (Figura 29).
Esquema 10 - Esquema de intermediários da reação de Knoevenagel em meio básico
Por serem melhores eletrófilos, os aldeídos reagem muito mais rapidamente que as
cetonas. Já a ativação do metileno ativo 55 é consequência da ligação direta a um grupo
96
retirador de elétrons (GRE) como o nitro, ciano, acila, entre outros, e na maioria dos
casos, faz-se necessária a presença de dois grupamentos retiradores de elétrons (Figura
29). A presença de grupos GRE torna os hidrogênios-alfa ácidos, possibilitando a
formação de um nucleófilo melhor. Isso acontece devido aos efeitos estabilizadores que
atuam na base conjugada negativa (carbânion): efeito indutivo retirador de elétrons do
grupo GRE e efeito mesomérico, já que, normalmente, o GRE, é, também, um retirador
de elétrons por efeito mesomérico (Esquema 10). Exemplos típicos de metilenos ativos
são malonato de etila 56, cianoacetato de etila 57, malononitrila 58 ou acetilacetona 59.232
Dentre os exemplos citados, a malononitrila 58 possui o metileno com hidrogênio mais
ácido (pKa = 11,1) sendo, portanto, mais reativa frente a um eletrófilo (Figura 29). Além
disso, a natureza do catalisador e do solvente são importantes para obtenção do produto
desejado com bons rendimentos. Tradicionalmente, utilizam-se solventes orgânicos
tóxicos como o tolueno e catalisadores básicos como a piridina e a piperidina.233
Figura 29 - Ativação do metileno por grupos retiradores de elétrons (GRE), exemplos
de metilenos ativos232
Em razão de sua simplicidade, condições moderadas, versatilidade e economia
atômica, a condensação de Knoevenagel tornou-se uma das metodologias mais
empregadas para formação de ligações C=C. Os compostos α,β-insaturados obtidos
através dessa reação são intermediários-chaves para obtenção de diversos produtos
naturais, fármacos, polímeros, cosméticos e perfumes.234 Por exemplo, a reação de
Knoevenagel é uma das etapas na produção de atorvastatina235 60 e da pioglitazona236
61 (Esquema 11).
97
Esquema 11 - Utilização da condensação de Knoevenagel para síntese de compostos
com importância farmacêutica
Com o advento da Química Verde, a química orgânica clássica tem sido modificada
com o objetivo de tornar os produtos e processos industriais mais sustentáveis. Alguns
dos princípios estabelecidos são: prevenção de resíduos, economia atômica, produtos e
processos mais seguros, eficiência energética, solventes atóxicos, mais seguros e menos
poluentes, entre outros.237 Consequentemente, muitas reações clássicas, como a
condensação de Knoevenagel foram adaptadas para essa nova realidade. Na literatura,
é possível encontrar diversas metodologias alternativas para essa reação. O uso de
irradiação de micro-ondas pode reduzir significativamente o tempo de reação, e, em
muitos casos, aumenta o rendimento sem a necessidade de utilização de solventes.238
Diferentes compostos foram sintetizados utilizando essa metodologia.238 A utilização de
catalisadores alternativos como a argila (montmorillonita K-10) e o fermento de pão
(levedura), por exemplo, também já foi relatada por Chakrabarty239 e Pratap,240
respectivamente (Esquema 12).
98
Esquema 12 - Catalisadores ambientalmente benignos
Um dos grandes problemas da reação clássica de Knoevenagel é a utilização de
solventes tóxicos. Portanto, metodologias sem solvente são bastante interessantes e há
muitos relatos da aplicação desta abordagem à reação de Knoevenagel. Diferentes
metodologias sem a necessidade de utilização de solventes já foram relatadas.
Entretanto, essas metodologias, na maioria dos casos, não podem ser generalizadas
para uma grande quantidade de reagentes.241
Líquidos iônicos (LI), como o nitrato de etilamônio, também tem ganhado espaço
como solventes e catalisadores na química verde em razão de suas propriedades únicas
tais como, baixa viscosidade e pressão de vapor, e alta estabilidade térmica e química.242
A reação com solventes atóxicos, como a água, é uma alternativa viável para a reação
de condensação de Knoevenagel como já relatado em diferentes artigos.243 A água além
de ser atóxica e não-inflamável, é barata, facilmente acessível e possui propriedades que
podem facilitar a reação. Na maioria dos casos, a água é um bom solvente apenas para
compostos contendo um grupamento polar, sendo seu uso, portanto, restrito na química
orgânica sintética. Entretanto, existem relatos na literatura que apesar dessa
característica ser considerada, a princípio, negativa, a presença da água pode acelerar
determinadas reações, aumentar ou diminuir rendimentos e/ou aumentar ou inverter
seletividade de reações. As reações onde os reagentes se encontram em suspensão na
água são chamadas de “on water reactions”. Outros inconvenientes que restringem o uso
da água na química orgânica são a incompatibilidade dos intermediários com a água e a
competição das reações desejadas com processos de hidrólise dos reagentes. Por outro
99
lado, a alta polaridade da água, sua capacidade de solvatação de íons e de formar
ligações de hidrogênio, além de seu efeito hidrofóbico (agregação de moléculas apolares
dissolvidas) tornam a água um excelente solvente alternativo para diversas reações, tais
como: rearranjo de Claisen, condensação aldólica, reações tipo Michael, entre outras.244
Além disso, em muitos casos relatados na literatura em que a água foi utilizada como
solvente, não houve a necessidade de catalisadores. Portanto, essa foi a abordagem
escolhida para o presente trabalho: utilização de água como solvente, sem o uso de
catalisadores.
2. ESTRATÉGIAS EMPREGADAS
Conforme abordado anteriormente (Seção 1.4.1), alguns grupos empregaram a
estratégia de trocar a hidroxila de esqueletos comuns a estruturas químicas cujas
atividades almejadas já estavam bem estabelecidas por unidades B(OH)2. Desta forma,
no que diz respeito à parte deste trabalho referente à Química Medicinal, seguiu-se a
abordagem na qual as tirfostinas, como aquelas dos trabalhos pioneiros de Levitzki
(Figura 19), foram empregadas como esqueletos-bases e as hidroxilas das posições 3 e
4 foram substituídas por grupos B(OH)2 (Esquema 13 A). A atividade inibitória das
tirfostinas sobre tirosinas quinases já está bem estabelecida na literatura (Seção 1.3.3).186
Como estratégia sintética para obtenção das benzeno-vinilnitrilas, empregou-se a
reação de Knoevenagel (Seção 1.5) entre aldeídos aromáticos e a malononitrila ou o
cianoacetato de etila (Esquema 13 B). Foram preparadas tirfostinas onde a unidade
B(OH)2 estava presente (borono-tirfostinas) e também onde esta unidade estava ausente.
Para tanto, foram empregados aldeídos aromáticos com diferentes substituintes no anel.
A intenção foi de comparar as propriedades das borono-tirfostinas com aquelas dos
compostos sem boro, tanto do ponto de vista biológico como de algumas propriedades
químicas.
100
≠
Esquema 13 - Estratégias adotadas no trabalho
3. OBJETIVOS
- Preparar benzeno-vinilnitrilas (tirfostinas) sem o boro e benzeno-vinilnitrilas contendo o
grupo B(OH)2 (borono-tirfostinas) por reações Knoevenagel (Figura 30).
- Estudar a influência dos diferentes grupos funcionais presentes nas benzeno-vinilnitrilas
preparadas.
- Obter cristais e estudar as interações intermoleculares no estado cristalino dos ácidos
borônicos (Figura 30, G = B(OH)2) obtidos.
- Avaliar as atividades anticâncer, tripanocidas, anti-inflamatórias e a ação sobre o
receptor P2X7 de humanos e de camundongo das benzeno-vinilnitrilas preparadas.
Figura 30 - Tirfostinas e borono-tirfostinas obtidas por condensação de Knoevenagel
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
101
4.1. Preparo das benzeno-vinilnitrilas por condensação de Knoevenagel
A reação de condensação de Knoevenagel é uma ferramenta sintética muito utilizada
para obter compostos α,β-insaturados (Figura 30). Essa estrutura é comumente
encontrada em inibidores de tirosina quinase (tirfostinas)186 e outros intermediários com
importância química e biológica. 235,236
Apesar de existirem diferentes metodologias disponíveis na literatura para a reação
de Knoevenagel,245 ela é usualmente realizada na presença de catalisadores como
aminas fracamente básicas (alifáticas e aromáticas),246 sais de amônio247 ou hidróxidos
de metais alcalinos em solventes orgânicos apróticos (DMF, piridina ou MeCN) que
podem funcionar como solvente e como catalisador.248
Com o objetivo de tornar a química orgânica sintética mais “verde” e sustentável,
muitos grupos de pesquisa têm se esforçado em desenvolver protocolos menos
agressivos ao meio ambiente. Algumas das estratégias são: redução do uso de
catalisadores ou utilização de biocatalisadores, economia atômica, métodos de
aquecimento alternativos, redução ou eliminação do uso de solventes tóxicos, uso de
solventes atóxicos e renováveis como a água.249
A aplicação de protocolos aquosos é desejável e tem ganhado atenção nas últimas
décadas, uma vez que a água é um solvente não inflamável, átoxico, barato e facilmente
disponível. Outra característica interessante da água é seu chamado “efeito hidrofóbico”,
que, em muitos casos relatados na literatura, acelera a velocidade de reações orgânicas
em sistemas aquosos.250 Adicionalmente, já foi demonstrado por Bigi e colaboradores
que a água é um solvente interessante para a reação de condensação de
Knoevenagel.243b
No presente trabalho, benzeno-vinilnitrilas foram preparadas por condensação de
Knoevenagel entre aldeídos aromáticos e nitrilas contendo um metileno ativo (Esquema
14) em meio aquoso.251 As benzeno-vinilnitrilas contendo a porção borono (ácidos
arilborônicos) foram sintetizadas a partir dos ácidos formilfenilborônicos comerciais
correspondentes. Apesar dos ácidos borônicos serem o foco deste trabalho, outras
benzeno-vinilnitrilas, sem o boro, foram sintetizadas para que fosse possível avaliar a
102
importância do grupamento B(OH)2 na atividade biológica e o efeito dessa porção nas
propriedades das benzeno-vinilnitrilas.
Esquema 14 - Benzeno-vininitrilas por condensação de Knoevenagel em água
Os compostos foram sintetizados de acordo com os princípios da química verde, sem
a utilização de catalisadores e solventes orgânicos tanto na reação, quanto no
isolamento. Isso porque os produtos de reação não eram solúveis no meio aquoso e
precipitaram, de forma que o isolamento consistiu em uma filtração seguida de lavagem
com água. Empregando um protocolo aquoso eficiente e ambientalmente benigno, os
produtos foram obtidos com elevado rendimento (≥ 85%) e grau de pureza (≥ 98%,
aldeído é o único contaminante).
Apesar do aquecimento em refluxo e da presença de ar na reação, não houve
degradação dos reagentes nem quebra da ligação C-B dos ácidos formilfenilborônicos
de partida ou dos produtos. Os aldeídos não foram oxidados ao ácido carboxílico
correspondente e não foi observada hidrólise do éster etílico nas condições reacionais
utilizadas. De fato, as condições empregadas, refluxo de água, ausência de catalisador
ácido e reações de até 6 horas, podem não ser capazes de oxidar o aldeído a ácido
carboxílico.
Apesar de protocolos aquosos já terem sido relatados na literatura para a reação de
Knoevenagel, é importante ressaltar que esta condição não havia sido avaliada para
103
aldeídos contendo a unidade B(OH)2. A preocupação inicial de se utilizar esse protocolo
era a protodesboronação (quebra de ligação C-B).252 Em determinadas condições, com
forte influência do pH, a presença de água promove a quebra da ligação C-B de ácidos
borônicos formando produtos indesejáveis e diminuindo o rendimento da reação.253
Entretanto, os produtos foram obtidos com bons rendimentos e não foi detectado nenhum
produto de desboronação ao utilizar-se o protocolo aquoso na reação de Knoevenagel
com a malononitrila e com o cianoacetato de etila.
Um cenário bem diferente do que normalmente ocorre em reações de Knoevenagel
sob condições clássicas, com solventes e bases orgânicas, onde se fazem necessários
isolamentos trabalhosos. Essa metodologia de isolamento é extremamente conveniente,
pois os compostos sintetizados possuem uma unidade B(OH)2 bastante polar, que fica
retida na sílica de colunas cromatográficas. Além disso, boroxinas (anidridos oligoméricos
produzidos por desidratação) podem se formar na presença de solventes orgânicos como
tolueno e acetonitrila sob refluxo, ou no processo de retirada desses solventes por
destilação. Portanto, o protocolo aquoso utilizado resultou apenas nos ácidos borônicos
em vez dos anidridos correspondentes. Não foi necessária a utilização de excesso de
nenhum reagente. Aliás, o excesso de malononitrila, gerou um subproduto não
identificado amarelo de difícil remoção por recristalização.
4.1.1. Benzeno-vinilnitrilas sem o boro (64a-f)
Inicialmente, foram sintetizadas apenas vinilnitrilas derivadas da malononitrila, sem o
boro. Esta síntese foi realizada através da reação de Knoevenagel entre diversos
aldeídos aromáticos e a malononitrila (Esquema 15), gerando uma classe de compostos
conhecidos na literatura como ilidenomalononitrilas.254 Apesar de já serem relatados,
todos os produtos tiveram seus pontos de fusão determinados e comparados com a
literatura e foram caracterizados por espectroscopia na região do infravermelho,
ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H e 13C.
104
Esquema 15 - Obtenção de benzeno-vinilnitrilas sem boro
As benzeno-vinilnitrilas derivadas da malononitrila foram isoladas por filtração à vácuo
e, na maior parte dos casos, obtidas como sólidos com bom grau de pureza. Nos casos
em que ainda havia traços de aldeído (1-2%), realizou-se recristalização com acetona e
água. Na tabela 11, tem-se a relação das moléculas sintetizadas, dos rendimentos de
reação, pontos de fusão e algumas informações dos espectros de infravermelho (IV) e
de Ressonância Magnética Nuclear de 1H e de 13C.
105
Tabela 11 - Benzeno-vinilnitrila sintetizadas
Produto
Produto
(Estrutura)
R*
(%)
CN (cm-1)
(ppm) 1H-
RMN
(ppm) 13C-
RMN
PF (°C)*
64a
(NO-04)
85
2223
7,780
160,0
82 - 84
64b
(NO-05)
93
2224
7,652
158,9
116 - 118
64c
(NO-06)
98
2225
7,720
159,8
136 - 137
64d
(NO-07)
93
2210
7,458
158,0
185 -188
64e
(NO-08)
97
2226
7,732
158,3
167 - 169
64f
(NO-11)
81
2228;
2226
7,893
157,1
104 - 106
* Média em triplicata
De uma maneira geral, obtiveram-se altos rendimentos (R ≥ 90%) após isolamento,
excetuando-se os compostos 64a (Ph, R = 85%) e 64f (3-NO2, R = 81%), como podemos
observar na Tabela 11.
A espectroscopia na região do infravermelho é importante em síntese orgânica para
identificar mudanças de grupos funcionais que possuem bandas características, como
ocorre no caso das benzeno-vinilnitrilas. Na análise dos produtos da reação de
Knoevenagel entre aldeídos e nitrilas com metilenos ativos, espera-se observar o
desaparecimento de uma banda característica de aldeído (C=O e OC-H) e o
aparecimento de uma banda de nitrila (CN) conjugada (C=C-CN). Dessa forma, é
possível verificar se de fato um produto foi formado, ou não. Bandas de nitrilas saturadas
ou, insaturadas sem conjugação entre a nitrila e o grupo olefínico apresentam bandas de
estiramento axial em torno de 2250 ±10 cm-1. Já na presença de conjugação essa banda
106
se desloca para 2225 ± 8 cm-1. O composto 64a, por não possuir nenhum substituinte no
anel aromático, será considerado, nesse caso, o padrão para a banda de estiramento
axial () de C≡N para fins de comparação. Pode-se observar que todos os compostos
com exceção do 64d (4-NMe2) contendo uma amina terciária na posição para,
apresentaram um aumento no número de onda do C≡N. Esse aumento sugere o
fortalecimento da ligação C≡N em resposta a um efeito retirador de elétrons (Cl e NO2),
ou doador fraco dos substituintes (MeO e Me). Por outro lado, o composto 64d apresenta
um enfraquecimento da ligação. Esse enfraquecimento em comparação com o composto
64a é resultante da doação mais efetiva dos elétrons n do nitrogênio o que gera o híbrido
de ressonância da figura 31. Como se pode ver, a tripla ligação fica com um caráter
intermediário entre dupla e tripla, resultando em uma menor energia para realizar o
estiramento, por isso a vibração ocorre em menor número de onda (64d: 2210 cm-1
versus 64a: 2223 cm-1). Essas observações demonstram a sensibilidade da ligação C≡N
à mudanças de substituinte.
Outra mudança interessante que pode ser observada é o aparecimento de duas
bandas de estiramento de nitrila apenas para o composto com o nitro 64f como
substituinte. Esse substituinte é retirador de elétrons por indução e por efeito
mesomérico. As benzeno-vinilnitrilas analisadas possuem duas nitrilas em posição
germinal uma em relação à outra. Portanto, é de se esperar o aparecimento de uma
banda de estiramento assimétrica (movimento de estiramento dos cianos em direções
opostas, um em relação ao outro), além da banda simétrica. Em um estudo de Raman
publicado em 2020 por Saha e colaboradores,255 os compostos com 4-OH, 4-Cl e o sem
substituinte, apresentaram duas bandas de nitrila, diferentemente do que foi observado
por infravermelho no presente trabalho. Adicionalmente, foi relatada uma característica
particular de moléculas com diciano germinais: dependendo do ângulo entre as duas
nitrilas (< 135 º), a banda de estiramento simétrica ocorre em um número de onda maior
do que a assimétrica. Portanto, é possível que, no composto (64f) que aparecem duas
bandas de nitrila, a de maior número de onda (2228 cm-1) seja do estiramento simétrico,
e não do assimétrico, como esperado.
107
Figura 31- Híbrido de ressonância do composto 64d
As vinilnitrilas obtidas por condensação de Knoevenagel foram ainda caracterizadas
por Ressonância Magnética Nuclear de 1H. Novamente, tem-se como padrão o composto
64a. Neste caso, observa-se que o deslocamento químico () do hidrogênio vinílico é de
7,780 ppm (Tabela 11). O deslocamento químico fornece informações importantes
acerca do tipo de hidrogênio analisado e de seu ambiente químico (rico ou pobre em
elétrons). O hidrogênio aldeídico foi escolhido pois, após a reação, é o que tem seu
ambiente químico mais alterado (H aldeídico para H vinílico). Em geral, observa-se que
todos os compostos com substituintes no anel apresentam um menor deslocamento, o
que significa que o mesmo hidrogênio, em diferentes compostos, encontra-se em um
ambiente mais rico em elétrons do que o hidrogênio da molécula padrão. Sendo o H do
composto contendo o grupamento 4-NMe2 o mais blindado de todos. Apenas o 64f (3-
NO2) apresentou um maior deslocamento, esta informação demonstra que o grupamento
nitro na posição meta possui a capacidade de desblindar o núcleo do hidrogênio. Essa
tendência não se manteve para o espectro de carbono 13, onde todos os carbonos
vinílicos apresentaram um deslocamento químico menor (mais blindado) que o do
composto padrão 64a. Inclusive, o carbono vinílico do composto com nitro foi o mais
blindado de todos. Os hidrogênios foram atribuídos aos seus respectivos carbonos com
a ajuda dos espectros de APT e HSQC.
Através dos valores da figura 32, pode-se observar um deslocamento para o
vermelho (batocrômico) dentro da série de compostos. Esta característica evidencia a
presença de um sistema push-pull (doação-recepção), onde a nitrila é o grupamento
receptor (Figura 33). Isto significa que, quanto maior a capacidade doadora do
grupamento ligado ao anel, menor será a energia necessária (maior comprimento de
onda) para promover um elétron do orbital HOMO (n, não ligante) para o LUMO (π*).
108
Figura 32 - Absorção e cores de algumas benzeno-vinilnitrilas no UV/vis
Figura 33 - Sistema push-pull (D-π-A)
O deslocamento batocrômico, na série de compostos da figura 32, reflete-se na
coloração dos mesmos: aqueles que absorvem abaixo de 400 nm (luz violeta) são
brancos. Quando a absorção se aproxima de 400 nm, a cor torna-se levemente
amarelada. Por outro lado, quando o comprimento da absorção é superior a 400 nm,
pode-se observar uma coloração bem mais intensa. Isto porque, trata-se de uma
absorção da cor azul produzindo um sólido laranja (cor emitida). A série de cores pode
ser observada na figura 34.
Figura 34 - Série de cores das benzeno-vinilnitrilas
109
O ponto de fusão, por ser uma constante física, pode ser utilizado para corroborar a
identificação do produto desconhecido, principalmente nos casos em que a molécula alvo
já foi descrita na literatura. Portanto, ao compararem-se os valores da literatura com os
valores obtidos para o sólido em questão, tem-se um indício se o produto desejado foi
obtido ou não, de forma rápida e sem o uso de técnicas sofisticadas. Além disso, o ponto
de fusão permite fazer uma estimativa grosseira se o sólido analisado está puro ou não.
Em geral, impurezas diminuem o ponto de fusão e ampliam a faixa de fusão. O ponto de
fusão, quando utilizado para analisar a influência de diferentes substituintes, fornece
informações sobre a força das interações intermoleculares envolvidas. Moléculas
orgânicas aromáticas interagem entre si por interações de π-Stacking devido à presença
de uma nuvem de elétrons π deslocalizada sob o anel. Portanto, todos os compostos
sintetizados apresentam esse tipo de interação, entretanto, os pontos de fusão são bem
variados. Isso ocorre, pois, a presença de substituintes no anel possibilita outros tipos de
interações mais fortes. O composto 64a, que apresenta só a fenila, tem o menor ponto
de fusão (81-84°C), isso por que, a interação mais pronunciada nesse caso é a de π-
Stacking. A presença de grupamentos capazes de gerar dipolo, aumenta o ponto de
fusão, como no caso do 4-Cl (64e, 167-169 °C) que apresenta um ponto de fusão
consideravelmente mais alto do que a molécula sem substituinte. O composto com maior
ponto de fusão é aquele que contém a amina (64d, 185-188 °C). Nesse caso, como já
visto na estrutura do híbrido de ressonância da figura 31, o nitrogênio da amina
apresenta uma carga parcial positiva, gerando um dipolo bastante efetivo (momento de
dipolo 5,535 Debye).256 Esta característica permite uma interação dipolo-dipolo mais
intensa do que no restante das moléculas. O composto 64f com a nitrila na posição meta
apresenta o segundo menor ponto de fusão (104-106°C), apesar do substituinte nitro
possuir uma carga positiva efetiva. Essa informação, apesar de parecer contraditória,
está correta. A simetria da molécula possui forte influência no valor do ponto de fusão.
Quanto mais simétrica a estrutura, mais as moléculas aproximam-se e maior a energia
das interações intermoleculares. Se as moléculas não são capazes de se aproximar e
interagir efetivamente, a força ou energia dessa interação diminui e, portanto, a energia
necessária para quebra-las é menor.
110
4.1.2. Benzeno-vinilnitrilas contendo a porção borono (ácidos borônicos, 65a-d)
Após a síntese dos compostos derivados de malononitrilas, sintetizaram-se, a partir
da condensação de Knoevenagel, outras benzeno-vinilnitrilas inéditas, estas contendo a
porção borono, de acordo com o esquema 16. Os produtos foram caracterizados também
para que suas propriedades no estado sólido fossem analisadas. Na tabela 12, tem-se a
relação das moléculas sintetizadas, dos rendimentos de reação e algumas informações
dos espectros de infravermelho (IV) e de Ressonância Magnética Nuclear de 1H e de 13C.
Esquema 16 - Obtenção de ácidos borônicos
111
Tabela 12 - Benzeno vinilnitrilas contendo a porção borono (borono-tirfostinas)
sintetizadas
Produto
Produto
(Estrutura)
R*
(%)
CN (cm-1)
(ppm) 1H-
RMN
(ppm) 13C-
RMN
65a
(NO-01)
86
2247,3;
2228
8,484
161,5
65b
(NO-03)
91
2242,9;
2225
8,505
162,0
65c
(NO-12)
84
2226
8,383
161,7
65d
(NO-13)
87
2237,3
8,347
161,8
*Média em triplicata
As benzeno-vinilnitrilas com boro derivadas de malononitrila (65a e 65b) e de
cianoacetato de etila (65c e 65d) foram isoladas por filtração à vácuo e, na maior parte
dos casos, obtidas como sólidos brancos com bons rendimentos (R ≥ 80%) e grau de
pureza (≥ 98%). Em razão da similaridade entre as solubilidades do aldeído e de seu
produto; da proximidade entre os fatores de retenção; e da alta retenção de compostos
com B(OH)2 em sílica de colunas cromatográficas, a separação dos produtos contendo
boro de seus respectivos aldeídos para teste biológico (pureza necessária > 99%) é
particularmente difícil. Em alguns casos, após o isolamento e a análise de RMN, foi
constatada a presença de 1% de aldeído que deveria ser removido para realizar os testes
biológicos sem interferências. Foram testadas algumas estratégias para retirada do
contaminante. A primeira tentativa foi a recristalização utilizando água/etanol;
água/acetona e água/metanol, em algumas tentativas com a mistura água/etanol foi
possível retirar o aldeído restante (1%), entretanto, algumas vezes o mesmo
112
procedimento não funcionava. Em busca de uma metodologia mais consistente e com
menos perdas de produto, retornou-se o produto para o balão de reação e adicionou-se
mais do metileno ativo necessário (malononitrila ou cianoacetato de etila). Após o
segundo isolamento, porém, não foi possível retirar o aldeído residual. Uma outra
estratégia adotada foi a de oxidação do aldeído com bissulfito de sódio ou metabissulfito
de sódio em um ácido hidroximetanossulfônico (AHMS). 257 Esperava-se que a formação
desse ácido facilitasse a separação. Entretanto, em todas as metodologias adotadas
(lavagem ou extração) a massa do produto reduzia significativamente, e não era possível
recuperá-la. Argüello e colaboradores, publicaram em 2019 um artigo em que relatam a
transformação de ácidos arilborônicos em fenóis intermediada por um agente redutor, o
sulfito de sódio, na presença de oxigênio molecular. Portanto, é possível que ao lavar os
produtos, não só o aldeído fosse oxidado. Havendo formação de fenóis, justificando a
redução de massa e impossibilidade de recuperar o produto sólido.258 Uma vez que todas
as tentativas de remover o aldeído através de reações para transformá-lo em outra
substância falhou, optou-se por purificar por meio de recristalizações sucessivas.
Os valores de pontos de fusão capilar não aparecem na tabela, pois, apesar da
análise ter sido realizada, não foram determinados com precisão. Os ácidos borônicos
possuem uma característica particular de formarem anidridos (boroxinas) sob
aquecimento, dificultando a determinação do ponto de fusão pela liberação de água.200c
Dessa forma, o ponto de fusão observado pode ser do anidrido e não do produto inicial.
Além disso, compostos com boro são utilizados como retardantes de chama259 e,
portanto, possuem elevado ponto de fusão, fazendo com que seja improvável a
determinação do ponto de fusão capilar em aparelhos comumente encontrados em
laboratório (temperatura máxima de 300 ºC). Quanto aos ácidos borônicos preparados
no presente trabalho, foram obtidos pontos de decomposição e não de fusão. Análises
térmicas estão sendo realizadas a fim de avaliar o comportamento térmico desses
compostos. O resultado preliminar da análise térmica do compostos 64d, demonstra três
eventos térmicos independentes. Dois, desses três, estão associados com mudança de
massa. O primeiro evento ocorre na faixa de 107-147 ºC onde se verifica a desidratação
e ciclização das moléculas (Esquema 17), já no segundo evento entre 199-229 ºC,
ocorrem, possivelmente rearranjos internos ou processos de fusão. No último evento
113
(230-525 ºC) ocorre a carbonização e formação do resíduo B2O3. Os pontos de fusão dos
aldeídos de partida 63a e 63b também variam de acordo com a literatura pesquisada. Em
um artigo o composto 63a apresenta faixa de fusão entre 235-237 ºC200d, em outro 240
ºC200e, já no site da Sigma Aldrich a faixa relatada é bem larga 237-247 ºC. Já para o
composto meta substituído 63b, a faixa de ponto de fusão encontrada no site da Sigma-
Aldrich é 109-113 ºC.200
Esquema 17 - Processo de desidratação e ciclização do composto 65d
Através do espectro é possível ter uma noção sobre o consumo do aldeído e formação
de uma nitrila conjugada. Para isso, observou-se a presença ou ausência da banda de
estiramento C≡N e de C=O. De acordo com os dados da literatura260 espera-se uma
banda de intensidade média para C≡N na faixa de 2.273 - 2.000 cm-1. O valor da banda
depende da estrutura da molécula (substituintes e conjugação). Por exemplo, a presença
de substituintes doadores de elétrons, como no caso do dimetilamino, aumentam o
comprimento da ligação e diminuem a constante de força. Dessa forma, é necessária
uma energia menor para o estiramento da ligação. O contrário ocorre com grupamentos
que atraem elétrons, como no caso do cloro. Já a conjugação da nitrila pela presença de
uma insaturação adjacente pode reduzir a frequência de absorção (maior comprimento
de onda, menor número de onda) e pode aumentar a intensidade da banda (Figura
35).261 Como este tipo de deformação não aparece nos espectros dos aldeídos de partida
(Figura 36) é possível inferir a formação de uma nova ligação. Em comparação com os
metilenos ativos utilizados, as borono-trifostinas sintetizadas apresentam valores de
C≡N menores (2247-2225 cm-1) do que o observado no espectro da malononitrila (2274
114
cm-1) e do cianoacetato de etila (2266 cm-1). Essa diferença entre o estiramento da nitrila
observado nos reagentes de partida e o observado nos espectros dos produtos obtidos,
sugere a formação de uma nova ligação.
Figura 35 - Efeitos que influenciam o valor de estiramento axial das nitrilas
A banda característica de C≡N, existente nos espectros dos ácidos borônicos (65a:
C≡N = 2247 cm-1; 2228 cm-1, 65b: C≡N = 2243 cm-1; 2225 cm-1, 65c: C≡N = 2226 cm-
1, 65d: C≡N = 2237 cm-1) obtidos, apresentou valores de número de onda maiores do
que o observado na benzeno-vinilnitrila padrão 64a (G = H) sem substituinte (64a: C≡N
= 2223 cm-1). O composto 65c, derivado de cianoacetato de etila com a porção borono
na posição para, foi aquele que apresentou um valor mais próximo de C≡N (65c = 2226
cm-1) ao da molécula 64a (64a = 2223 cm-1). Portanto, esse composto possui a ligação
tripla nitrílica mais enfraquecida da série de ácidos borônicos. A diferença entre os valores
obtidos (64a: C≡N = 2223 cm-1 e 65a: C≡N = 2247 cm-1) na série sem o boro e na série
com o boro é impressionante. As moléculas 65a e 65b derivadas de malononitrila
possuem a ligação tripla mais fortalecida da série, já que estas possuem os dois maiores
número de onda. Seus valores se assemelham àqueles encontrados em nitrilas
saturadas ou, nas insaturadas não conjugadas (C≡N = 2250 ±10 cm-1). Dessa forma, é
possível deduzir que a unidade B(OH)2 funciona como um grupamento retirador de
elétrons. Outra evidência desse caráter retirador é a presença duas bandas de
estiramento de nitrila, observada nos compostos derivados de malononitrila contendo
boro (65a e 65b). Essa característica também é encontrada na benzeno-vinilnitrila com o
grupamento nitro (64f).
115
Figura 36- Espectro de IV do aldeído de partida ácido 4-formilfenilborônico (63a)
No caso dos derivados de cianoacetato de etila (65c e 65d), além do aparecimento
da banda de nitrila, observa-se o aparecimento de uma banda de intensidade forte
característica de C=O de ésteres (1750-1735 cm-1, faixa para ésteres alifáticos sem
conjugação).261 A faixa de aparecimento de C=O de éster é diferente daquela observada
em aldeídos (1740-1725 cm-1, faixa para aldeídos alifáticos sem conjugação),261
permitindo assim sua diferenciação. A ligação C=O de éster apresenta valores de
números de onda maiores, portanto esta ligação encontra-se fortalecida em comparação
com a do aldeído. Esse fenômeno é resultado da presença de um átomo eletronegativo
(oxigênio) adjacente ao carbono da carbonila (efeito indutivo retirador de elétrons), que
acaba por encurtar (fortalecer) a ligação (Figura 37). Como resultado, têm-se bandas
com maiores frequências. Outro efeito importante a ser considerado é o da conjugação.
Todas as moléculas sintetizadas são compostos α,β-insaturados, no caso dos compostos
Ausência de
bandas nessa
região, facilita a
identificação de
formação de
produto
Observar o
desaparecimento
desta banda
C-H de aldeído
116
65c e 65d esta insaturação está conjugada com o éster. A introdução de uma ligação
dupla adjacente a uma carbonila resulta na deslocalização dos elétrons entre as
ligações C=C e C=O. Portanto, a conjugação aumenta o caráter de ligação simples, como
pode ser visto no híbrido de ressonância na figura 37. O aumento do caráter de ligação
simples reduz a constante de força e, consequentemente, o número de onda da
absorção. Em geral, a introdução de uma insaturação α, β reduz a frequência da ligação
C=O em 15-45 cm-1 (faixa de ésteres α, β-insaturados 1740-1715 cm-1) e da ligação C=C
em 10 cm-1.261
Figura 37 - Efeitos que alteram a frequência da ligação C=O de ésteres
Nos compostos derivados de cianoacetato de etila, a ligação C=O é conjugada com
uma ligação dupla, que por sua vez, é conjugada com um anel aromático, por isso,
espera-se que os valores de absorção dessa ligação sejam baixos (Figura 38). Para os
compostos sintetizados, o efeito da conjugação (diminuição da frequência) prevalece
sobre o efeito indutivo (aumento da frequência), 65c C=O = 1710 cm-1 e 65d C=O =
1720 cm-1. É interessante notar que, para os compostos 65c e 65d, a unidade B(OH)2 na
posição meta fortalece as ligações C≡N e C=O. Já para os compostos 65a e 65b, a
posição da unidade B(OH)2 não parece afetar significativamente a força da ligação C≡N.
Outra modificação importante e de fácil identificação no espectro de IV é o
desaparecimento da banda de estiramento característica de carbonila de aldeído
conjugado (1700-1680 cm-1).261 Após a reação de Knoevenagel, há a transformação do
grupo funcional aldeído em uma vinilnitrila (Figura 39). Portanto, a ausência das bandas
características de aldeído (C=O e OC-H) nos espectros dos produtos confirma o consumo
do reagente.
117
Figura 38 - Espectro de IV do composto 65c e comparação com a figura 36
Além dessas informações, a análise por espectro de IV nos permite inferir se houve
perda da unidade B(OH)2 ou não. Ácidos arilborônicos apresentam 2 bandas
características: a banda de deformação axial de hidroxilas (em alguns casos, essa banda
pode se dividir em duas ass e s da ligação O-H) e a banda de deformação axial de B-O.
A primeira banda é tipicamente larga e ocorre na faixa de 3500-3200 cm-1.260 A largura e
o número de onda da banda dão indícios da presença de ligações de hidrogênio
intermoleculares nestas moléculas. A presença destas ligações promove, da mesma
forma que acontece com ácidos carboxílicos, um alargamento das bandas (maior número
de transições possíveis) e uma diminuição no número de onda (hidroxila livre: 3700-3584
cm-1; hidroxila com ligação de hidrogênio: 3500-3200 cm-1).260 Entretanto, dependendo
da forma de isolamento do produto, é possível obter o anidrido do ácido (boroxina). Neste
caso, não há a banda de hidroxila entre 3500 e 3200 cm-1 no espectro. A presença do
anidrido é constatada pela presença da banda forte em 680-705 cm-1.200c A banda
Aparecimento
da banda de
nitrila
Desaparecimento
da banda de C=O
de aldeído e
aparecimento de
C=O de éster
Banda de
C=C
Permanência da
banda de O-H
118
referente ao estiramento assimétrico (ass) da ligação B-O, é, normalmente, a banda mais
intensa do espectro e ocorre entre 1380-1310 cm-1.262
Bandas de estiramento de ligações duplas são, comumente, bastante intensas. Dessa
forma, é possível que a alta intensidade do ass B-O esteja correlacionada com a presença
de um caráter de ligação dupla.262b Já a banda de estiramento simétrico da ligação B-O
é mais difícil de ser determinada, por ser menos intensa e ser uma combinação de
vibrações de diferentes ligações. Essas duas bandas relatadas foram identificadas nos
espectros de IV dos produtos, como pode ser visto no espectro de IV representativo
(Figura 38). O espectro de IV do ácido 4-formilfenilborônico 63a, que é o aldeído de
partida dos compostos 65a e 65c, apresenta duas bandas referentes ao estiramento
simétrico (O-Hs = 3370 cm-1) e assimétrico (O-Hass = 3201 cm-1) da ligação O-H da
unidade B(OH)2. Os seus derivados 65a e 65c apresentam o mesmo padrão com duas
bandas de O-H. Entretanto, a ligação desses produtos encontra-se fortalecida (maior
número de onda), em comparação com o aldeído de partida 63a. Os valores de número
de onda do composto 65a são, O-Hs = 3433 cm-1 e O-Hass = 3341 cm-1 e para o
composto 65c são, O-Hs = 3390 cm-1 e O-Hass = 3334 cm-1. Este fortalecimento deve-
se ao caráter retirador de elétrons das vinilnitrilas. Já o ácido 3-formilfenilborônico 63b
apresenta apenas uma banda de O-H, no valor de 3291 cm-1. Todavia, seu derivado 65b
apresenta duas bandas de estiramento, uma mais fortalecida, referente a vibração
simétrica (O-Hs = 3433 cm-1) e outra com a mesma força (O-Hass = 3292 cm-1). O
derivado 65d, por outro lado, apresenta apenas uma banda de O-H, da mesma forma
que o seu aldeído de partida 63b, contudo, sua ligação apresenta um maior número de
onda, indicando um fortalecimento desta ligação.
As borono-tirfostinas também foram caracterizadas por 1H-RMN. No espectro do
aldeído 4-formilfenilborônico 63a (Figura 39 A), é possível observar a presença de um
simpleto em 10,15 ppm (O=C-H) e dois dupletos (8,11-7,96 ppm, CAr-H) característicos
da substituição para (63a). No caso do ácido 3-formilfenilborônico (63b), além do simpleto
do hidrogênio aldeídico (10,15 ppm), observa-se o padrão meta de substituição com um
simpleto (8,44 ppm), 2 dupletos (8,23-8,04 ppm) e um tripleto (7,72-7,67 ppm), cada um
integrando 1 H. Além dos sinais dos hidrogênios do anel meta substituído, observa-se
um sinal integrando 2 H, provavelmente, esse sinal é referente aos hidrogênios da
119
hidroxila do grupamento B(OH)2. Supreendentemente, os hidrogênios da hidroxila só são
observados no espectro do ácido 3-formilfenilborônico 63b. Possivelmente, a ausência
do sinal correspondente aos dois hidrogênios da unidade B(OH)2 no ácido 4-
formilfenilborônico 63a seja consequência da maior quantidade de água no solvente de
RMN utilizado, pois hidrogênios ácidos podem ser trocados com a água, não aparecendo
no espectro. O hidrogênio aldeídico é, normalmente, bastante desblindado (sinal entre 9
e 10 ppm). Portanto, a ausência de sinais nessa região mais desblindada do espectro,
indica o consumo do aldeído.
Figura 39 - Espectros de 1H-RMN dos aldeídos de partida em DMSO, 500 MHz: A)
ácido 4-formilfenilborônico (63a) B) ácido 3-formilfenilborônico (63b)
A
B
120
A formação do produto desejado pode ser evidenciada pelo aparecimento de um novo
pico referente ao hidrogênio vinílico o qual apresenta deslocamento químico entre 8,347-
8,383 ppm para os produtos com o B(OH)2 na posição meta e entre 8,484-8,505 para os
produtos na posição para (Figura 40). Esses hidrogênios estão mais blindados do que o
H aldeídico dos respectivos aldeídos de partida (Esquema 18).
Esquema 18 - Transformação do ambiente químico do hidrogênio
Na análise dos deslocamentos químicos do hidrogênio vinílico por RMN, observa-se
que o hidrogênio vinílico do composto 65b (G1 = CN; G = 3-B(OH)2) é o mais desblindado
já que ele apresenta o maior deslocamento (8,505 ppm). Essa informação indica que
esse hidrogênio está em um ambiente químico mais pobre em elétrons do que os das
demais borono-tirfostinas. Já o hidrogênio vinílico de composto 65d (G1 = CO2Et; G = 3-
B(OH)2), encontra-se no ambiente mais rico em elétrons da série, com o deslocamento
de 8,347 ppm. Portanto, para as moléculas 65a e 65b, a posição meta desblinda mais o
H vinílico e para as moléculas 65c e 65d é a posição para que desblinda mais o H vinílico.
Além disso, observa-se que os picos dos hidrogênios dos produtos com malononitrila 65a
e 65b são mais blindados do que os hidrogênios aromáticos dos produtos com o
cianoacetato de etila 65c e 65b (Figura 40). Os derivados de cianoacetato de etila, além
de apresentarem os picos na região de aromáticos, apresentam dois picos (um tripleto e
um quarteto) na região de alifáticos. Adicionalmente, os produtos com o cianoacetato de
etila apresentam dois conjuntos de sinais (quarteto entre 4,50-4,31 ppm e tripleto entre
1,50- 1,30 ppm) referentes à etila do éster.
Em todos os espectros de 1H-RMN dos produtos é possível observar um pico
sobressalente. Após a realização de experimentos de troca de deutério, constou-se que
estes picos são referentes aos hidrogênios das hidroxilas da unidade B(OH)2 (Figura 41).
O padrão de picos encontrados nos espectros dos produtos 65c e 65d mostram, que
apesar de ser possível obter dois diasteroisômeros (E e Z), apenas um é obtido. De
121
acordo com dados da literatura, espera-se o favorecimento diasteroisômero E. Observou-
se que os grupamentos mais volumosos da vinilnitrila ficam trans em relação à fenila.263
Rodrigues, em sua dissertação de mestrado realizou um estudo da preferência
diastereoisomérica da reação de Knoevenagel com o cianoacetato de etila. Após
diferentes avaliações teóricas e experimentais, constatou que a preferência pelo isômero
E, no caso do cianoacetato de etila, é independente do caráter doador ou retirador de
elétrons do substituinte do anel aromático. A predileção ao diasoisômero E foi atribuído
ao equilíbrio de isomerização e não ao mecanismo da reação.263
Figura 40 - Espectro de 1H-RMN e comparação das borono-tirfostinas obtidas
a
122
Figura 41 - Experimento de troca de deutério do composto 65d
Foi realizada a análise de 13C-RMN para caracterização dos produtos. Por questões
de simetria, esperava-se a presença de 8 picos de carbono para o 65a, 10 para o
composto 65b, 10 para o 65c e 12 para o composto 65d. Entretanto, observou-se um
pico a menos em todos os espectros. Inicialmente, a ausência destes picos causou certa
estranheza, uma vez que, não havia explicações de simetria para o ocorrido. Após busca
na literatura, constatou-se que, na maioria dos casos, o carbono ligado diretamente ao
boro (carbono ipso) não aparece no espectro de 13C-RMN, ou aparece como um pico
pequeno e largo.263 Esse fenômeno ocorre devido às propriedades magnéticas únicas do
boro: tempo de relaxamento curto e momento de quadrupolo do 11B (I = 3/2) que acopla
com o carbono, gerando um pico pouco resolvido, principalmente por estar ligado um
carbono quaternário.264 Essa particularidade de compostos organoborados, presente nos
espectros dos produtos sintetizados, é mais uma informação que sugere a presença do
boro na molécula.
Além dessa análise, realizou-se também a análise de HSQC. O espectro de HSQC,
dependendo da estrutura (se os carbonos forem suficientemente diferentes), permite a
confirmação do assinalamento dos H aos seus respectivos carbonos. O HSQC é uma
ferramenta importante quando há dúvida na atribuição dos hidrogênios ou dos carbonos.
62d com D2O
62d sem D2O
123
Por exemplo, no caso dos produtos meta substituídos, havia dúvida na atribuição de dois
simpletos. O simpleto do hidrogênio vinílico e o simpleto do padrão de substituição meta
do anel. Ambos se encontravam na região mais desblindada do espectro (com
deslocamentos próximos). A única diferença observada no espectro de hidrogênio era a
largura dos picos, o que nos dava apenas indícios da atribuição correta. Entretanto, o
carbono aos quais esses hidrogênios estavam atrelados, possuíam diferenças de
deslocamento químico significativas (carbono de anel aromático e carbono vinílico).
Portanto, o espectro de HSQC, que demonstra a correlação entre o carbono e seu
hidrogênio adjacente, sana essa dúvida (Figura 42). O espectro de HSQC do composto
65d correlaciona o pico do carbono mais desblindado, próximo de 160 ppm, ao simpleto
mais blindado do espectro, permitindo a atribuição do deslocamento químico do
hidrogênio vinílico.
Figura 42 - Espectro de HSQC do composto 65d
124
Apesar da análise de RMN de 11B não ter sido feita, têm-se dados suficientes para
afirmar a permanência da unidade B(OH)2 na estrutura sintetizada. Os dados de IV com
suas bandas características, o comportamento térmico das moléculas, a ausência de um
pico de carbono no 13C-RMN, e, além disso, a análise de Raio-X.
Os ácidos borônicos inéditos foram cristalizados para que suas propriedades no
estado sólido fossem estudas. Obtiveram-se informações sobre as interações
intermoleculares, ângulos e comprimentos de ligação, confirmou-se a presença da
unidade B(OH)2 e determinou-se qual foi o diasteroisômero obtido.
As moléculas foram cristalizadas em diferentes sistemas de solventes, com o objetivo
de obter cristais com tamanho favorável para serem medidos através da técnica de
difração de Raios-X.
O cristal do 65b foi obtido empregando-se de uma mistura entre THF e pentano. O
processo utilizado para cristalizar é melhor compreendido observando a figura 43.
Solubilizou-se o produto em THF e o frasco contendo a solução foi colocado dentro de
outro frasco contendo pentano. Este sistema foi vedado e colocado no freezer até
cristalizar. O fenômeno envolvido nesta cristalização consiste na diminuição da
polaridade da solução. A atmosfera dentro do frasco é saturada pelo líquido de ponto de
ebulição mais baixo, neste caso, o pentano. Com o aumento da pressão interna, o
pentano é forçado a condensar na superfície do THF, desta forma, a solução contendo o
produto torna-se mais apolar. Com esta mudança de polaridade do solvente, as
moléculas do soluto, o composto 65b, reorganizam-se aumentando as interações
intermoleculares, o que favorece a formação de monocristais. A temperatura baixa
também favorece a formação de cristais, uma vez que, diminui a entropia do meio.265
125
Figura 43 - Cristalização do 65b265
Os cristais dos produtos 65a, 65c e 65d foram obtidos pela mesma técnica. A única
diferença foi o solvente utilizado: os produtos 65a e 65c foram obtidos em uma mistura
água/etanol, já o composto 65d, foi obtido em água/acetona.
Os produtos foram colocados em frascos com água destilada e então, adicionou-se
etanol ou acetona gota a gota até a completa solubilização. Utilizou-se o ultrassom com
aquecimento para facilitar a solubilização. À medida que o solvente volátil evapora à
temperatura ambiente, as moléculas dos ácidos borônicos, presentes na solução,
interagem com maior energia, uma vez que, estes compostos são insolúveis em água,
desta forma, o monocristal é formado pelo aumento da insolubilidade no sistema
supersaturado.
Os dados cristalográficos e a representação ORTEP (elipsóides em 50% de
probabilidade)266 das estruturas se encontram-se na tabela 13 e nas figuras 44, 45, 46
e 47.
126
Tabela 13 - Dados cristalográficos
65a
65b
65c
65d
Fórmula
Empírica
C10H7N2O2B
C10H7N2O2B.
H2O
C12H12NO4B
C12H12NO4B
Massa
Molecular
(g/mol)
197,99
216,00
245,04
245,04
Sistema
Cristalino
Monoclínico
Triclínico
Monoclínico
Monoclínico
Grupo Espacial
C2/c
P-1
P21/n
P21/n
Dimensões da
Célula Unitária
a = 11,1500 (8) Å
α = 90,00°
a = 3,752 (3) Å
α = 104,08 (2)°
a = 7,573 (12) Å
α = 97,63 (3)°
a = 4,055 (5) Å
α = 90,00°
b = 10,0434 (9) Å
β = 92,084 (3)°
b = 10,113 (7) Å
β = 96,26 (2)°
b = 7,713 (9) Å
β = 93,48 (4)°
b = 15,168 (2) Å
β = 90,00°
c = 17,1086 (15)
Å
ϒ= 90,00°
c = 14,374 (9) Å
ϒ= 94,47 (2)°
c = 11,332 (18)
Å
ϒ = 112,06 (6)°
c = 19,581 (2) Å
ϒ= 90,00°
Volume (Å)3
1914,6 (3)
522,8 (6)
603,62 (15)
1204,4 (3)
Z
8
2
2
4
Densidade
(g/cm3)
1,374
1,372
1,348
1,351
Dimensão dos
cristais (mm3)
0,746 × 0,294 ×
0,07
0,215 × 0,069 ×
0,065
0,547 x 0,230 x
0,186
0,275 x 0,075 x
0,060
Reflexões
coletadas\ Refl.
independentes
11056/ 1746
[Rint = 0,0790;
Rsigma =
0,0526]
9500/1903
[Rint = 0,1204;
Rsigma =
0,0884]
5898/2099
[Rint = 0,0443;
Rsigma =
0,0515]
7527/2120
[Rint = 0,0374;
Rsigma =
0,0330]
Nº de refl.
úni./par.
refinados
1746/142
1903/150
2099/165
2120/170
R1/wR2[I>=2σ(I)]
0,0639/0,1694
0,1304/0,3723
0,0528/0,1271
0,1013/ 0,2716
GooF
1,081
1,227
1,057
1,181
127
Figura 44 - Composto 65a (NO-01)
Figura 45 - Composto 65b (NO-03)
128
Figura 46 - Composto 65c (NO-12)
Figura 47 - Composto 65d (NO-13)
Os resultados apresentados na tabela 13 nos permitem inferir que as estruturas
cristalinas dos compostos puderam ser descritas adequadamente. Os cristais dos
compostos m-substituídos 65b e 65d apresentaram parâmetros estatísticos de
129
refinamento com pior qualidade. GooF = 1,227 e 1,181 e R1 = 0,13 e 0,10,
respectivamente (valores ideais: GooF = 1 e R1 = 0,02-0,06).267 Possivelmente, este fato
está relacionado às interações intermoleculares mais fracas nestes compostos,
impossibilitando a formação de cristais com poucos defeitos estruturais, ou com o
tamanho dos cristais obtidos. Outro fator relevante no cristal de 65b foi a presença da
molécula de água de cristalização (maior massa molecular, MM = 216,0 g/mol). Esta
molécula ocupa uma cavidade no empacotamento cristalino, porém foi descrita com uma
desordem ocupacional com fracas interações intermoleculares. A representação ORTEP,
gerada pelos dados cristalográficos obtidos, mostra que os compostos com cianoacetato
de etila foram obtidos na configuração E.
Nenhuma anomalia com relação aos comprimentos de ligação é observada nesse
grupo de moléculas, ou seja, não há nenhuma grande distorção. Os valores encontram-
se dentro do esperado, segundo a literatura,268 para estes tipos de ligação. Os valores
dos comprimentos de ligações dos produtos obtidos e da literatura, encontram-se no
apêndice A.
A disposição da molécula no espaço dependerá dos seus substituintes (C≡N ou
CO2Et). Estes grupos funcionais podem promover torções nas ligações devido a forças
atrativas ou repulsivas. O padrão de substituição (para ou meta) do anel aromático
também influenciará diretamente nesta organização espacial. Analisando as figuras 48,
49, 50 e 51 e a tabela 14, é possível comparar os efeitos destes substituintes na
molécula.
Tabela 14 - Ângulos de torção
Ângulo
65a
65b
65c
65d
CxCyC7C8
0,2 (4)°
-8,0 (14)°
174,8 (2)°
-19,3 (11)°
C2C1BO1
23,0 (3)°
-8,4 (12)°
8,4 (3)°
31,5 (10)°
- No 65a e no 65c x = 3 e y = 4, no 65b e no 65d x= 4 e y = 3.
130
Observa-se que a torção entre o anel e o grupamento vinilnitrila é menor nos produtos
para substituídos (65a e 65c) do que nos meta substituídos (65b e 65d). O desvio da
planaridade com respeito ao anel aromático foi analisado durante o refinamento e
observa-se que as moléculas meta substituídas saem mais do plano. Por outro lado, as
para substituídas aproximam-se da planaridade, quanto mais distante do plano formado
pelo anel aromático, maior é o desvio. De fato, no composto 65a p-substituído os átomos
de nitrogênio das nitrilas estão situados a 0,036(5) Å, para N1, e da 0,097(6) Å para N2
do plano formado pelo grupamento fenila. No composto 65b, os átomos de nitrogênio das
nitrilas estão situados a 0,670(19) Å para N1 e da 0,308(23) Å para N2 do plano formado
pelo grupamento fenila. Para o composto 65a, os maiores desvios de planaridade são
observados para os átomos de oxigênio do grupamento borono localizados a - 0,5334(4)
Å para O1e 0,418(4) Å, para O2 do plano do anel aromático. Dentre os produtos com o
cianoacetato de etila aquele que apresenta maior desvio é o 65d, também m-substituído.
Neste, os átomos que mais se distanciam do plano formado pelo grupamento fenila são
o nitrogênio e o carbono da nitrila descritos a: - 1,23 (14) Å e a - 0,845(13) Å. O produto
65c também apresenta desvios na nitrila com relação ao plano do anel aromático.
Entretanto, estes valores são menos pronunciados do que no 65d localizando-se a
0,418(5) Å. Muito provavelmente, o que determinará a torção e os desvios de planaridade
serão as ligações de hidrogênio realizadas com outras moléculas do cristal.
Figura 48 - Molécula 65a no plano formado pelo anel aromático
131
Figura 49 - Molécula 65b no plano formado pelo anel aromático
Figura 50 - Molécula 65c no plano formado pelo anel aromático
Figura 51 - Molécula 65d no plano formado pelo anel aromático
As interações intermoleculares são responsáveis pela auto-organização das
moléculas no estado sólido, portanto, as suas características devem ser avaliadas para
que seja possível uma melhor compreensão do empacotamento cristalino de cada
produto. As características das interações intermoleculares estão expostas na tabela 15.
132
Tabela 15 - Ligações de Hidrogênio
D—H···R
D—H (Å)
H···R (Å)
D···R (Å)
D—H···R (º)
O1—H1···O2i
0,84
1,99
2,814 (2)
167
O2—H2···N1ii
0,84
2,05
2,878 (3)
170
Código de Simetria: (i) –x-1, 2-y, 3-z; (ii) -1-x, 1-y, 2-z
O1—H1···O2i
0,84
1,94
2,755(8)
164
O2—H2···N2ii
0,84
2,39
2,794(10)
110
O1W1-H1WA···O1iii
0,87
2,105
2,891(4)
150
Código de Simetria: (i) -x, -y+2, -z+1; (ii) x-1, y+1, z; (iii) -x+1, -y+1, -z+1
O1—H1···O2i
0,84
2,00
2,815 (2)
174
O2—H2···N1ii
0,84
2,06
2,831 (3)
156
Código de Simetria: (i) –x-1, 2-y, 3-z; (ii) -1-x, 1-y, 2-z
O1—H1···O2i
0,84
1,95
2,809 (6)
162
O2—H2···N1ii
0,84
2,14
3,019 (7)
164
C11—H11A···O1iii
0,97
2,64
3,249 (8)
120
Código de Simetria: (i) 1-x, 1-y, 2-z; (ii) 1-x, -y, 2-z; (iii) 1/2-x, -1/2+y, 3/2-z
As estruturas cristalinas dos compostos obtidos e a formação dos dímeros de ácidos
borônicos são estabilizadas por ligações de hidrogênio do grupamento nitrila com o ácido
borônico. Essas são as principais interações intermoleculares observadas nos
empacotamentos cristalinos. Os ângulos das ligações de hidrogênio são importantes na
determinação da força destas, quanto mais próximos de 180° (mais frontal), mais efetiva
é a ligação. Além do ângulo, outro fator que influencia a força desta interação é o
133
comprimento da ligação. Em geral, as ligações de hidrogênio apresentam energias
semelhantes, isto é, observa-se que a distâncias doador-receptor (D···R) dessas
interações apresentam valores parecidos. O produto 65d foi o único que apresentou um
valor destoante de 3,02 Å (maior comprimento de ligação) na interação O2—H2···N1,
este resultado pode ser consequência do impedimento espacial causado pelo acetato de
etila associado ao efeito da substituição na posição meta que dificulta a aproximação das
moléculas. Os contatos dessas interações podem ser visualizados por meio das
superfícies de Hirshfeld, apresentadas nas figuras 52, 53, 54 e 55. Estas superfícies têm
como propósito definir o espaço ocupado pelas moléculas em um cristal, segmentando
as suas densidades eletrônicas em fragmentos moleculares. Atualmente, diferentes tipos
de superfícies são utilizadas na química cristalográfica. Por exemplo: CPK (CPK = Iniciais
dos idealizadores, Robert Corey, Linus Pauling e Walter Koltun) e a superfície Connolly.
A superfície de Hirshfeld define o volume ao redor da molécula de forma similar à
superfície de van der Waals. Entretanto, o diferencial dessa superfície é que ela leva em
consideração não só a molécula, como no caso da superfície de van der Waals, mas
também a sua vizinhança. Dessa forma, este tipo de superfície apresenta informações
sobre as interações intermoleculares.269
Figura 52 - Superfície de Hirshfeld para o 65a
134
Figura 53 - Superfície de Hirshfeld para o 65b
Figura 54 - Superfície de Hirshfeld para o 65c
Figura 55 - Superfície de Hirshfeld para o 65d
135
4.2. Estudos in silico direcionados para proteínas quinases
4.2.1. Quimiogenômica
Estudos de quimiogenômica foram realizados pelo grupo de pesquisa da Dr.a Nelilma
Romeiro, com o objetivo de obter mais informações sobre o potencial de interação das
benzeno-vininitrilas com tirosinas quinases. Utilizou-se nesse estudo o protocolo do
Software PIDGIN270 e o banco de dados ChEMBL,271 disponível na literatura.
A técnica utilizada combina informações químicas e biológicas através de métodos
computacionais para investigar bibliotecas moleculares, capazes de interagir com alvos
moleculares de interesse. Portanto, a quimiogenômica é uma estratégia interdisciplinar
que visa acelerar o processo de descobertas de fármacos. Esse método tem possibilitado
o desenvolvimento racional de fármacos para o tratamento de diversas doenças, com
destaque para o tratamento do câncer e de doenças inflamatórias, apesar das limitações
envolvidas em um cálculo teórico. Através dos estudos de quimiogenômica, foram
apontados alvos moleculares em potencial para a série de benzeno-vinilnitrilas
preparadas, os quais alvos pertencem à família das proteínas quinases (Figura 56)
Um dos alvos sugeridos para as moléculas 64d (NO-07), 64e (NO-08), 65a (NO-01)
e 65b (NO-03) foi DYRK1a (dual specificity tyrosine(Y)-phosphorylation-regulated kinase
1a). Essa tirosina, pertencente à família DYRK, é conhecida por ser ativada através da
autofosforilação de resíduos de tirosina, apesar de fosforilar resíduos de serina e treonina
de seus substratos. Além disso, a DYRK1a é estudada por seu papel no desenvolvimento
de câncer272 e sua ação regulatória sobre a EGFR.273
136
Figura 56 - Gráfico “heatmap”
4.2.2. Docking molecular
De modo a identificar os sítios de ligação potenciais em tirosinas quinases para os
ligantes ativos (compostos sintetizados), foram realizados estudos de docking molecular
utilizando a tirosina DYRK1a como modelo. A função ChemPLP foi escolhida para a
realização dos estudos. Na figura 57, é possível observar a interação teórica do NO-01
(65a) com o sítio ativo da enzima escolhida. O estudo teórico prevê a interação do
grupamento cianovinílico do NO-01 com o resíduo de lisina LYS188 e com o grupo -NH
do aspartato ASP307, através de ligação de hidrogênio. O NO-01 também pode interagir
por ligação de hidrogênio com o grupo -NH da leucina LEU242 e com a cadeia lateral da
serina SER242, através da unidade B(OH)2. Adicionalmente, foram previstas interações
de van der Waals entre o anel aromático do NO-01 e a VAL173, a LEU241, a LEU294 e
a PHE238 no sítio ativo. No anexo A encontram-se os estudos de docking para as outras
moléculas sintetizadas.
137
Figura 57 - Posição de interação entre a borono-tirfostina 65a (NO-01) e a DYRK1a
sugerida pelo estudo de docking. As ligações de hidrogênio estão representadas em
linha pontilhada azul
4.3. Testes biológicos
As benzeno-vinilnitrilas sintetizadas foram avaliadas quanto a sua atividade
anticâncer, tripanocida, anti-inflamatória e inibitória do receptor P2X7 pelo grupo de
pesquisa do Dr. Robson Xavier na FIOCRUZ. Tanto as benzeno-vinilnitrilas com o boro,
quanto as sem boro foram avaliadas com o objetivo de investigar o efeito da introdução
da unidade B(OH)2 na atividade biológica das tirfostinas. Adicionalmente, a toxidade dos
compostos em células de mamíferos também foi examinada.
4.3.1. Análise de toxidade em células primárias de mamífero
Inicialmente, avaliou-se a citotoxicidade das moléculas sintetizadas em células de
mamíferos por ensaio colorimétrico. No teste, foi medida a capacidade das células de
macrófagos peritoneais de camundongos de reduzir a resazurina (conhecida
comercialmente como Alamar blue), na presença do composto analisado. Células viáveis,
com metabolismo ativo, são capazes de reduzir a resazurina (azul e não-fluorescente)
138
em resorufina (rosa e fluorescente) (Esquema 19). Portanto, é possível estimar a
citotoxicidade da substância e quantificar as células viáveis, uma vez que, o número de
células viáveis após o teste é proporcional à resorufina produzida. Como controle positivo
foi utilizado o detergente não-iônico Triton X-100 (Tx-100), que provoca o rompimento da
membrana plasmática e, por isso, a redução de resazurina é mínima. No controle
negativo, não há adição de nenhuma substância. Na tabela 16, é possível observar a
citotoxicidade dos compostos e seus efeitos antiproliferativos em linhagens de células
malignas.
Esquema 19 - Avaliação da viabilidade celular por redução de resazurina
Nenhuma das benzeno-vinilnitrilas sintetizadas apresentou toxicidade (≥ 99,30%) na
concentração de 100 µM, quando testadas frente a macrófagos peritoneais primários
selvagens por 72 h. O mesmo aconteceu para a linhagem macrofágica J774.G8 de
camundongo, a qual foi insensível ao tratamento com os compostos. No caso da
linhagem de células de rato GH3 (células originárias de tumor pituitário de rato), as
células foram parcialmente afetadas por 64a (NO-04) (G1 = CN, G = H), apresentando
um percentual de redução de resazurina de 50%. As benzeno-vinilnitrilas 64f (NO-11) (G1
= CN, G = 3-NO2) e 65c (NO-12) (G1 = CO2Et, G = 4-B(OH)2) foram mais eficazes em
reduzir a proliferação em 23,56% e 32,8%, respectivamente (Tabela 16). Isto é, a melhor
atividade antiproliferativa obtida para essa linhagem de célula foi alcançada com uma
borono-tirfostina, indicando o efeito benéfico da introdução do boro na estrutura da
tirfostina, comparando-se com os demais substituintes testados. Nenhum dos outros
compostos, contendo outros substituintes diferentes de boro e nitro, foi capaz de danificar
a atividade proliferativa das células GH3.
139
As moléculas 64b (NO-05) (G1 = CN, G = 4-OMe), 64c (NO-06) (G1 = CN, G = 4-Me),
64f (NO-11) (G1 = CN, G = 3-NO2) e 65d (NO-13) (G1 = CO2Et, G = 3-B(OH)2) foram
altamente eficientes em reduzir a capacidade proliferativa (> 80%) da linhagem de células
de humanos U937, proveniente de linfoma histocítico. Nota-se, que das benzeno-
vinilnitrilas com boro, apenas as derivadas de cianoacetato de etila (65c e 65d)
apresentaram efeito antiproliferativo sob as linhagens testadas.
Tabela 16 - Toxicidade e efeito antiproliferativo das benzeno-vinilnitrilas
Tratamento
% proliferação depois de 72 h
Macrófagos
peritoneais
Células
J774.G8
Células GH3
Células U937
Células não tratadas
100,38 ± 0,4
99,81 ± 0,13
110,58 ± 0,05
95,43 ± 1,65
0,1% Triton X-100
12,77 ± 1,01
16,64 ± 1,18
14,40 ± 2,5
13,07 ± 2,22
65a (NO-01)a
99,51 ± 0,33
100,44 ± 0,11
100,07 ± 0,4
98,10 ± 1,04
65b (NO-03)a
100,05 ± 0,12
99,70 ± 007
99,80 ± 0,3
96,31 ± 1,33
64a (NO-04)a
99,35 ± 0,56
102,68 ± 0,03
50,13 ± 3,5
91,01 ± 3,08
64b (NO-05)a
105,75 ± 0,1
100,65 ± 0,06
99,40 ± 1,09
17,87 ± 2,79
64c (NO-06)a
99,69 ± 0,06
102,53 ± 0,05
93,28 ± 1,88
16,28 ± 1,36
64d (NO-07)a
100,43 ± 1,26
94,65 ± 0,08
99,78 ± 0,8
92,01 ± 2,8
64e (NO-08)a
100,52 ± 0,47
100,25 ± 0,02
97,75 ± 0,06
97,23 ± 1,51
64f (NO-11)a
99,59 ± 0,22
100,23 ± 0,15
23,56 ± 2,11
14,29 ± 3,32
65c (NO-12)a
99,37 ± 0,71
99,93 ± 0,44
32,87 ± 1,93
82,95 ± 3,71
65d (NO-13)a
99,38 ± 0,46
98,95 ± 0,2
100,20 ± 0,99
18,95 ± 0,52
- Ácidos borônicos em vermelho; a[NO] = 100 µM. As células de macrófagos peritoneais de camundongo, J774.G8 de
camundongo, GH3 de rato e U937 de humanos, foram tratadas com os compostos NO na concentração 100 µM por
72 h. Os dados relatados representam a média ± DP de 4 experimentos independentes.
As moléculas 64a, 64b, 64c, 64f, 65c e 65d, que apresentaram efeito antiproliferativo
nas linhagens GH3 e/ou U937, foram escolhidas para testes posteriores. As linhagens
GH3, U937 e de macrófagos peritoneais foram expostas, separadamente, a diferentes
concentrações [1 nM a 10 mM] de cada composto escolhido. Os resultados obtidos foram
representados graficamente em curvas dose-resposta. Através destes testes, foi possível
a determinação da concentração inibitória de 50% dos indivíduos (IC50). A linhagem de
140
macrófagos peritoneais foi utilizada como controle. Os resultados podem ser encontrados
na tabela 17. Os altos valores de IC50, obtidos para a linhagem de macrófagos
peritoneais, dos compostos 64a (NO-04), 64b (NO-05) e principalmente do 64f (NO-11)
(372,31 M) e do 65c (NO-12) (387,87 M), revelam como essas células são resistentes
às moléculas testadas. Altos valores de IC50 para células benignas são altamente
favoráveis. Indicam a necessidade de altas concentrações da molécula testada para que
haja dano. Já os compostos 64c (NO-05) e 65d (NO-13) apresentaram, relativamente,
valores mais baixos, mas ainda assim, aceitáveis.
Tabela 17 - Efeito dose-resposta das benzeno-vinilnitrilas frente à proliferação de
células de mamíferos
Produto
Estrutura
Macrófagos
peritoneais IC50 (M)
Células GH3
IC50 (M)
Células U937
IC50 (M)
64a (NO-04)
99,63 8,54
0,29 0,01
-
64b (NO-05)
147,77 14,73
-
0,88 0,02
64c (NO-06)
41,87 8,76
-
0,69 0,07
64f (NO-11)
372,31 11,08
0,12 0,06
0,47 0,08
65c (NO-12)
387,87 7,28
0,14 0,09
-
65d (NO-13)
78,91 6,45
-
9,83 1,07
Relação dose-resposta para os análogos de nitrila. A linha de células GH3 de rato foi tratada com 64a, 64f e 65c. A
linhagem U937 foi tratada com 64b, 64c, 64f e 65d. A linha de macrófagos peritoneais foi tratada com todos os
compostos citados acima. Para todas as células testadas, as concentrações variaram de 1 nM a 10 mM por 72 h. A
citotoxicidade foi medida usando a redução da resazurina em resorufina como índice proliferativo. Os dados relatados
representam a média ± DP de 4 experimentos independentes.
Os valores de IC50 dos derivados 64a (NO-04), 64f (NO-11) e 65c (NO-12), testados
nas células GH3, foram 0,29 ± 0,01 μM, 0,12 ± 0,06 μM e 0,14 ± 0,09 μM, respectivamente
141
(Tabela 17). O ácido borônico 65c (NO-12) (G1 = CO2Et, G = 4-B(OH)2) e o composto
nitrado 64f (NO-11) foram extremamente potentes frente à célula GH3, apresentando IC50
na mesma ordem de grandeza do composto padrão resveratrol 66 (Figura 58). Além
disso, os IC50 para células GH3 foram, aproximadamente, 2700 vezes menores que os
IC50 para macrófagos peritoneais. Apesar da alta eficiência do composto 64a (NO-04) (G1
= CN, G = H), sem substituinte no anel aromático, seu efeito foi inferior aos outros dois
compostos testados. Esses dados sugerem que a presença de grupos doadores ou
receptores de ligação de hidrogênio é importante para o reconhecimento molecular
desses compostos. Através dos resultados obtidos pelo teste de dose-resposta para as
células GH3, é possível inferir a relevância dos ácidos borônicos como candidatos no
desenvolvimento de fármacos para o tratamento de tumor pituitário.
Figura 58 - Compostos padrão para as linhagens GH3 e U937
Na linhagem de células U937 de humanos, foram testados os compostos: 64b (NO-
05), 64c (NO-06), 64f (NO-11) e 65d (NO-12) que apresentaram, respectivamente, os
seguintes valores de IC50 0,88 ± 0,02 μM, 0,69 ± 0,07 μM, 0,47 ± 0,08 μM e 9,83 ± 1,07
μM (Tabela 17). Todos os compostos apresentaram valor de IC50 menor do que o
observado pelo composto padrão Crizotinib 67 (Figura 58). As eficácias dos compostos
64b (G1 = CN, G = 4-OMe), 64c (G1 = CN, G = 4-Me) e 64f (G1 = CN, G = 3-NO2) foram
parecidas, por outro lado, o ácido borônico 65d (G1 = CO2Et, G = 3-B(OH)2) demonstrou
uma potência menor. Apesar do resultado, a estrutura dessa molécula pode servir como
protótipo para o desenvolvimento de outros ácidos borônicos com maiores potências.
Através dos dados expostos na tabela 17, nota-se que os valores de IC50 de macrófagos
peritoneais foram 60 a 2700 vezes superiores aos obtidos para as linhagens malignas,
dependendo do derivado avaliado. Surpreendentemente, apenas o composto 64f (NO-
142
11) apresentou atividade significativa para ambas as linhagens, GH3 e U937. Esse
resultado aponta para um mecanismo hipotético geral de ação. Além disso, esse derivado
foi o mais potente nas duas linhagens (Tabela 17). Em comparação, a linhagem de
células primárias de macrófagos peritoneais foi extremamente resistente ao 64f.
Possivelmente, os compostos 64a (NO-04) e 65c (NO-12), seletivos para células GH3,
reduzem a proliferação dessas células ao atuar sobre a EGFR e/ou a Ras.274
Os compostos 64b e 64c inibiram potentemente a proliferação das células U937. O
composto 65d (NO-13), demonstrou seletividade para a linhagem U937, apesar da baixa
potência. Esse tipo celular expressa tirosinas quinases como EGFR275, FES 276 e SYK277
que são possíveis alvos para as moléculas 64b, 64c e 65d.
4.3.2. Análise de atividade antiparasitária in vitro
Todas as benzeno-vinilnitrilas sintetizadas também foram testadas quanto sua
atividade antiparasitária. Investigou-se a viabilidade dos parasitas mediante tratamento
com as moléculas sintetizadas em culturas in vitro de T. cruzi na forma epimastigota, em
comparação com o benznidazol 18. A cepa Y foi tratada por 72 h com 100 µM de solução
das benzeno-vinilnitrilas, e sua viabilidade após 72 h foi quantificada pelo teste MTT 68
(Brometo azul de tetrazólio/Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium). O
teste MTT é um ensaio colorimétrico usado para avaliar a viabilidade celular. Células ou
organismos metabolicamente viáveis possuem desidrogenases mitocondriais capazes de
clivar o anel do tetrazólio. A clivagem do anel do MTT (coloração amarela) resulta na
formação de cristais de formazan 69 (E,Z-5-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-1,3-difenilformazan) de
coloração azul escura, insolúvel em água (Figura 59). Assim, a formação do formazan
reflete o estado funcional da cadeia respiratória. No ensaio realizado, o Triton X-100
(0,1%) e o benzonidazol (Bzd) (100 µM) foram utilizados como controle positivo para
reduzir a viabilidade dos protozoários. Como controle negativo, foi utilizada a forma
epimastigota não tratada.
143
Figura 59 - Transformação do MTT em formazan
Não houve diferença estatística entre os valores de redução da viabilidade
tripanossomas apresentados pelos compostos 65b (NO-03) (G1 = CN, G = 3-B(OH)2),
64a (NO-04) (G1 = CN, G = H), 65c (NO-12) (G1 = CO2Et, G = 4-B(OH)2) e 65d (NO-13)
(G1 = CO2Et, G = 3-B(OH)2). Entretanto, o 65c foi a molécula mais potente, com ação
similar ao controle positivo e ao tratamento com Bzd (Figura 60). Os derivados 64b (G1
= CN, G = OMe) e 64c (G1 = CN, G = Me) diminuíram a viabilidade do tripanossoma com
menor eficácia que os derivados previamente citados. Já os compostos 65a (G1 = CN, G
= 4-B(OH)2), 64d (G1 = CN, G =NMe2), 64e (G1 = CN, G = Cl), e 64f (G1 = CN, G = 3-
NO2), não promoveram a diminuição da viabilidade do tripanossoma, apresentando
valores comparáveis ao controle negativo (forma epimastigota não tratada). Construíram-
se curvas dose-resposta para as benzeno-vininitrilas que reduziram a viabilidade do
tripanossoma na concentração 100 µM. As curvas foram obtidas após exposição das
células por 24 h aos compostos avaliados. Os valores de EC50 (Concentração do fármaco
para induzir 50% do efeito máximo) alcançados pelos compostos 65b (NO-03), 64a (NO-
04), 64b (NO-05), 64c (NO-06), 65c (NO-12) e 65d (NO-13) foram de 14,5 μM; 10,2 μM;
530,6 μM; 508,4 μM; 0,795 μM e 78,4 μM, respectivamente (Figura 61). Entre estas
moléculas, o ácido borônico 65c apresentou potência nanomolar, resultando na morte do
T. cruzi. Apesar de menos potentes que o 65c, os ácidos borônicos 65b e 65d também
foram eficientes em reduzir a viabilidade do tripanossoma. Dentre os quatro ácidos
borônicos testados, três apresentaram boa atividade tripanocida, sendo os compostos
65b e 65c os mais eficientes entre eles. Esses resultados promissores dão indícios da
relevância de derivados de ácidos borônicos como protótipos na busca por novos
fármacos tripanocidas mais eficientes. Ademais, os resultados parecem indicar que o
144
posicionamento da unidade B(OH)2 na posição para com respeito à vinilnitrila melhora a
eficácia da borono-tirfostina derivada do cianoacetato de etila (65b = NO-12 versus 65c
= NO-13). Essas boronotirfostinas foram ambas mais eficientes do que aquelas derivadas
da malononitrila (65a = NO-01 e 65b = NO-03). O valor de EC50 do 65c (NO-12) (0,795
μM) é 20 vezes superior ao EC50 descrito para benzonidazol 18 (EC50 = 20,63 μM)278 e 4
vezes superior ao EC50 do nifurtimox 19 (EC50 = 3,5 μM)279 para a forma epimastigota
(Figura 62). Esses dois compostos são utilizados atualmente no tratamento de Doença
de Chagas. O composto 65c demonstrou potência menor que o bortezomibe280 e o
DDD85646,281 ambos inibidores potentes de proteases com atividade tripanocida frente
ao T. brucei. Possivelmente, a mudança de cepas e/ou um mecanismo de ação distinto,
uma vez que são espécies diferentes que assumem formas distintas, sejam as causas
para essa diferença de valores.
Figura 60 - Atividade tripanocida. As formas epimastigotas da cepa Y foram tratadas
com os NOs, todos na concentração 10 µM por 72 h. O gráfico representa tratamentos
em triplicata em 4 dias diferentes. ***p < 0,01 relativo ao controle negativo, *p < 0,05
relativo ao controle negativo; S.D.S. sem diferença estatística em relação ao controle
positivo ou Bzd-benznidazol
145
Figura 61 - Atividade tripanocida. As formas epimastigotas da cepa Y foram tratadas
com os NOs, todos na faixa de concentração 1 nM -1 mM por 24 h. Gráfico representa
tratamentos em triplicata em 4 dias diferentes
Figura 62 - Estrutura do composto 65c, dos compostos utilizados no tratamento da
Doença de Chagas e seus respectivos EC50 sobre a cepa Y
Apesar desse trabalho ter sido focado na possibilidade de inibição da tirosina quinase
para obtenção de atividade tripanocida, outros alvos moleculares importantes para o T.
cruzi podem estar envolvidos no mecanismo de ação da tirfostinas sintetizadas.
Diferentes proteassomas e proteases surgiram como alvos moleculares em potencial
146
desde a descoberta da importância dessas estruturas nos caminhos metabólicos de
protozoários.281, 282 Por exemplo: serino-proteases estão envolvidas no mecanismo de
invasão celular do hospedeiro; metalopeptidases e proteassomas (treonino-proteases)
também estão correlacionadas com a virulência do parasita.283 Ácidos arilborônicos são
capazes de mimetizar o estado de transição de serino e treonino-proteases, uma vez que
o boro se liga fortemente a nucleófilos de oxigênio, como as hidroxilas presentes no sítio
ativo de serino e treonino proteases. Existem diferentes relatos sobre a inibição de
proteases por ácidos arilborônicos e outras classes de organoboros.213,284
A cruzaína é uma cisteíno-protease com papel essencial na virulência do T. cruzi.
Essa protease é considerada um importante alvo no desenvolvimento de agentes
antichagásticos, pois está presente em todas formas de vida do parasita.285 Sabe-se que
vinilsulfonas funcionam como inibidores irreversíveis da cruzaína.286 Essa classe de
moléculas é aceptora de Michael, assim como as tirfostinas sintetizadas nesse trabalho.
Nesse caso, a cruzaína pode interagir com as benzeno-vinilnitrilas através de seu
grupamento tiol localizado no sítio ativo. O tiol, ao atacar o carbono vinílico, promove a
formação de uma ligação S-C entre a enzima e seu inibidor (Esquema 20 A).
Outra forma possível de interação entre a cruzaína e as tirfostinas é através da nitrila,
como ocorre com as dipeptidilnitrilas. As dipeptidilnitrilas são conhecidos inibidores das
cisteíno proteases.287 Nesse caso, o grupamento tiol presente no sítio ativo da enzima
interage com a nitrila presente na dipeptidilnitrila, resultando em um intermediário
tioimidato (Esquema 20 B). Portanto, em princípio, as nitrilas das tirfostinas sintetizadas
podem ser um ponto de interação com a cruzaína.
Esquema 20 - Possíveis interações entre a cruzaína e as tirfostinas sintetizadas
147
De acordo com os resultados obtidos, as tirfostinas derivadas de ácidos borônicos
apresentaram um perfil de atividade melhor do que o observado para as tirfostinas sem
o boro. Provavelmente, se a cruzaína for de fato um alvo para as tirfostinas com o boro
sintetizadas nesse trabalho, o grupamento borônico deverá agir como um grupo
auxofórico.
4.3.3. Avaliação in vitro da atividade inibitória do receptor P2X7 (P2X7R) pelas tirfostinas
preparadas
As benzeno-vinilnitrilas sintetizadas foram avaliadas quanto a sua capacidade de inibir
(efeito antagonista) o funcionamento do P2X7R. Para isso, realizou-se um ensaio de
permeabilização celular induzida por ATP. De forma geral, macrófagos peritoneais de
camundongo foram pré-incubados por 10 min com os diferentes compostos analisados,
com o BBG (Briliant Blue G) e o A740003. Em seguida, as células foram tratadas com
uma dose de 5 mM de ATP por 25 min. Nos 5 min finais, uma dose ou do corante iodeto
de propídeo (PI) ou brometo de etídio (EB) foi administrada. O tratamento com ATP nessa
concentração induz à abertura do poro associado a este receptor. Dessa forma, íons e
moléculas orgânicas de até 900 Da (como o iodeto de propídeo) podem passar pela
membrana e entrar no citoplasma. O iodeto de propídeo e o brometo de etídio são
intercalantes de DNA, comumente usados como marcadores fluorescentes. Esses
corantes, ao entrarem em contato com ácidos nucléicos, emitem luz fluorescente que
pode ser medida por métodos analíticos. O BBG e o A740003 foram utilizados nos testes
como padrões para o efeito antagonista sobre o receptor P2X7 de camundongo (cP2X7R)
e de humano (hP2X7R). Os testes iniciais foram realizados em macrófagos peritoneais
devido à facilidade de obtenção e por se aproximarem mais ao sistema real. O efeito
antagonista dos compostos testados pode ser encontrado na tabela 18.
148
Tabela 18 - Efeito antagonista dos inibidores de P2X7R e da série de compostos NO
frente à captação de corante induzida por ATP em macrófagos peritoneais
Inibidores do P2X7R e série
NO
cP2X7 IC50
(µM)
BBG
15,23 ± 1,65
A740003
0,897 ± 1,12
65a (NO-01)
0,639 ± 0,11
65b (NO-03)
46,88 ± 5,24
64a (NO-04)
11,84 ± 2,08
64b (NO-05)
75,44 ± 4,55
64c (NO-06)
102,3 ± 3,02
64d (NO-07)
88,41 ± 5,47
64e (NO-08)
6,61 ± 0,41
64f (NO-11)
54,68 ± 4,77
65c (NO-12)
0,939 ± 0,21
65d (NO-13)
91,02 ± 1,33
Valores são a média de 2-4 experimentos. Compostos foram
testados em macrófagos peritoneais de camundongo. Os valores de
IC50 = Concentração requerida para atingir 50% do efeito inibitório
máximo foram obtidos através de curvas de concentração-resposta.
cP2X7R = P2X7R de camundongos
Os compostos 65b (NO-03), 64b (NO-05), 64c (NO-06), 64d (NO-07), 64f (NO-11) e
65d (NO-13), tiveram valores de IC50 superiores ao BBG e ao A740003. Os IC50 dos
compostos 64a (G = CN, G1 = H) e 64e (G = CN, G1 = Cl) apresentaram valores entre os
obtidos pelo BBG e A740003. Já os compostos 65a (G = CN; G1 = 4-B(OH)2) e 65c (G =
CO2Et; G1 = 4-B(OH)2) demonstraram uma eficiência inibitória maior que dos outros
compostos da série NO, do que o BBG (IC50 = 15,23 µM) e similar ao A740003 (IC50 =
0,897 µM) (Tabela 19). Seus valores de IC50 foram de 0,639 µM e 0,939 µM,
respectivamente. Esses valores são similares ao de outras moléculas inibidoras de
P2X7R descritas na literatura.42b,118a Apenas as borono-tirfostinas 65a e 65c
apresentaram potência comparável com inibidores de P2X7R comerciais. Portanto, as
moléculas restantes não foram selecionadas para testes posteriores.
149
Construíram-se curvas dose-resposta medindo-se a toxicidade celular dos compostos
65a e 65c em macrófagos peritoneais após 72 h de tratamento. Ambos compostos
apresentaram baixa toxicidade com altos valores de CC50 (concentração citotóxica). O
valor de CC50 do composto 65a (NO-01) (CC50 = 443 µM) foi mais alto do que o observado
para o BBG (CC50 = 85,62 µM) e A740003 (CC50 = 351µM), indicando que a benzeno-
vinilnitrila testada é menos tóxica que os antagonistas padrão. O CC50 do 65c (NO-12)
(CC50 = 443 µM) foi muito maior que do o CC50 do BBG e similar ao do A740003 (Tabela
19). Quando comparados, o índice de seletividade (S.I.) dos ácidos borônicos (borono-
tirfostinas) foi maior do que os exibidos pelos inibidores comerciais de P2X7R (BBG e
A740003) (Tabela 19). O análogo 65c (S.I. = 392,8) exibiu valores de S.I. similares ao
inibidor seletivo de P2X7R, o A740003 (S.I. = 391,4). Já o S.I. do análogo 65a (S.I. =
693,2), foi 1,77 vezes maior que o composto A740003, indicando uma atividade
promissora. Para obter mais informações sobre os análogos de ácidos borônicos, outros
testes foram realizados. Curiosamente, os compostos sintetizados apresentaram valores
de IC50 maiores do que outros inibidores de P2X7R já descritos na literatura. Entretanto,
em razão do elevado S.I. obtido, esse análogo de ácidos arilborônicos permanecem como
bons candidatos.
Tabela 19 - Toxicidade celular e seletividade dos inibidores de P2X7R e dos análogos
de ácidos arilborônicos
Antagonistas do
P2X7R e ácidos
arilborônicos
Estrutura
cP2X7 CC50 (µM)
(macrófagos)
Índice de
seletividade
(aCC50/IC50)
BBG
-
85,62 2,77
5,62
A740003
-
351,1 11,76
391,4
65a (NO-01)
443 25,7
693,2
65c (NO-12)
329,6 16,68
392,8
a CC50 (concentração citotóxica) foi obtida por curvas de concentração-resposta.
150
Outra forma de medir a inibição da funcionalidade do receptor é através da liberação
de IL-1β, uma vez que, a liberação desta citocina, induzida por ATP, é uma função
característica da ativação do P2X7R. Esse método foi aplicado em macrófagos
peritoneais selvagens de camundongo e na linhagem de células monocíticas de
humanos, THP-1.
O composto 65a inibiu potentemente a liberação de IL-1β induzida por ATP no P2X7R
de camundongo (IC50 = 0,042 µM) e de humano (IC50 = 0,021 µM), entretanto, o 65c inibiu
fracamente a liberação de IL-1β mediada pela ativação do cP2X7R (IC50 = 0,537 µM)
(Tabela 20). A diferenciação das células monocíticas de humanos THP-1 em macrófagos
M1, foi promovida pela utilização de INF-γ (Interferon gamma) e PMA (phorbol-12-
myristate acetate) e pela incubação com LPS (lipopolissacarídeo) por 4 horas. O ATP só
foi adicionado nos últimos 30 minutos de incubação com LPS e os ácidos borônicos foram
adicionados 30 minutos antes da adição de ATP. Os compostos 65a (NO-01), e 65c (NO-
12) apresentaram uma potência maior/ou similiar que o BBG e o A740003 em inibir a
liberação de IL-1β mediada por hP2X7R (Figura 63 A). A liberação da IL-1β induzida por
ATP em camundongo, também foi inibida pelos análogos de ácido borônico (Figura 63
B). No caso do 65c (NO-12), houve uma redução de inibição em comparação com a
inibição do hP2X7R (IC50 = 0,243 µM). Por outro lado, o 65a (NO-01) manteve uma
potência de inibição do cP2X7R elevada, inclusive com valores de IC50 menores do que
o observado para o antagonista de referência A740003 (Figura 63, Tabela 20). Os dois
análogos também inibiram a liberação de IL-1β induzida por BzATP (2'3'-(benzoil-4-
benzoil)-adenosina-5'-trifosfato), entretanto, esses dados não serão descritos e
detalhados no presente trabalho encontram nesse trabalho. Esses resultados indicam um
mecanismo seletivo de inibição da liberação IL-1β mediada por ativação do P2X7R, como
ocorre com outros antagonistas de P2X7R relatados na literatura.42b, 288
151
Tabela 20 - Avaliação do efeito inibitório dos análogos de ácidos borônicos e dos
antagonistas do P2X7R através da avaliação da diminuição da captação de PI em
células HEK 293 e da liberação de IL-1β em células THP-1 e macrófagos de
camundongos
Antagonistas do
P2X7R e ácidos
arilborônicos
Captação de PI
em células
HEK293
transfectadas com
hP2X7R IC50 (μM)
Liberação de IL-1β
em células THP-1
IC50 (μM)
Liberação de IL-1β
em macrófagos
peritoneais de
camundongo IC50
(μM)
BBG
4,97 0,62
0,783 0,063
0,907 0,077
A740003
0,129 0,041
0,087 0,031
0,114 0,02
65a (NO-01)
0,031 0,002
0,021 0,011
0,042 0,013
65c (NO-12)
0,105 0,011
0,243 0,034
0,537 0.065
PI = Iodeto de propídeo; hP2X7 = P2X7 humano; THP-1: linhagem de monócito humano derivada de paciente com
leucemia monocítica aguda.
Células HEK 293 não expressam naturalmente receptores da família P2X. Alguns dos
receptores dessa família atuam da mesma forma que o P2X7R, sendo ativados por ATP
e possibilitando a passagem de moléculas orgânicas, portanto, a presença desses
receptores pode interferir nos resultados obtidos. Por isso, ao transfectar o P2X7R
humano em células HEK 293, obtêm-se valores de inibição oriundos unicamente do
P2X7R, sem interferências. O poder inibitório dos ácidos arilborônico 65a (NO-01) e 65c
(NO-12) foi medido através da captação de PI. Ambos apresentaram valores de IC50 de
0,031 μM para o 65a e 0,15 μM para o 65c (Tabela 20). Esses valores baixos
demonstram a alta potência inibitória desses compostos. Inclusive, o valor de IC50 dos
dois foi maior do que o observado para o A740003.
152
Figura 63 - Inibição da liberação de IL-1β induzida por ATP pelos ácidos arilborônicos
em células de humanos e de camundongos. A) Células diferenciadas de THP-1 foram
tratadas com 1 mM de ATP (30 min) e com LPS (4 h) na presença de diferentes
concentrações do BBG, A740003, 65a (NO-01) e 65c (NO-12). B) Macrófagos
peritoneais de camundongos foram tratados com 1mM de ATP (30 min) e LPS (4 h) na
presença de diferentes concentrações de BBG, A740003, 65a (NO-01) e 65c (NO-12).
As curvas representam os valores obtidos em 3-5 experimentos independentes
Um possível mecanismo de ação para as borono-tirfostinas foi avaliado usando a
técnica chamada de “whole cell patch clamp”. Avaliou-se através de uma curva do tipo
dose-resposta a corrente induzida por diferentes concentrações de ATP em células de
macrófagos peritoneais. A concentração de ATP foi variada de 100 μM até 25 μM na
presença de 500 nM dos antagonistas A740003, 65a, 65c (Figura 64 A e B). Quando a
concentração das borono-tirfostinas ou do A740003 foram fixadas em 500 nM e testadas
na presença de ATP, houve um aumento do EC50 em comparação com o teste apenas
com o ATP. Nos testes com 65a (NO-01) e 65c (NO-12) observa-se um perfil de corrente
induzida pelo ATP, parecido com aquele obtido no teste realizado com o A74003, que
inibe o P2X7R ligando-se no sítio alostérico.289 Esses resultados sugerem um mecanismo
de inibição não competitiva do P2X7R no sítio alostérico da maneira semelhante à forma
como o A740003 inibe o receptor, ou uma interação irreversível no sítio de interação do
ATP.
153
Figura 64 - Avaliação do mecanismo inibitório dos compostos 65a (NO-01) e 65c (NO-
12) como antagonistas do P2X7R. Mecanismos competitivos foram avaliados através
da corrente iônica em macrófagos peritoneais de camundongos onde (●) = teste apenas
com ATP; (▲) = teste com 500 ng/mL de 65a (NO-01) (A) ou 65c (NO-12) (B) à 37 °C.
Os gráficos são a representação de 3-4 experimentos independentes
4.3.4. Teste de solubilidade, estabilidade microssomal e permeabilidade in vitro
Os derivados de ácido arilborônico 65a (NO-01) e 65c (NO-12) foram moderadamente
estáveis em microssomas de camundongo e de humano (Tabela 21). Provavelmente, o
composto 65a (NO-01) deve exibir um tempo de ação menor in vivo do que o 65c (NO-
12) em razão dos valores obtidos. Adicionalmente, em comparação com o propranolol, o
65a (NO-01) foi permeável em Caco-2 com porcentagem maior que 75% e o 65c (NO-
12) apresentou permeabilidade superior a 55% (Tabela 21). Quando solubilizados em
soluções com pH variando de 2-10, o 65a (NO-01) apresentou solubilidade em torno de
250 μM e o 65c (NO-12) superior a 250 μM (Tabela 22).
O coeficiente de distribuição (LogD) mede a lipofilicidade efetiva de uma molécula em
um determinado pH, no caso, pH = 7,4. Quanto menor o valor de LogD, mais hidrofílica
é a molécula. O composto 65a (NO-01) apresentou uma maior hidrofilicidade (LogD7,4 =
−2,25 ± 0,09) do que o composto 65c (NO-12) (LogD7,4 = −0,96 ± 0,11), portanto, uma
maior solubilidade em água (Tabela 23). A lipofilicidade reduzida do 65a (NO-01) pode
estar associada com a pequena estabilidade microssomal, entretanto, essa característica
pode aumentar a permeabilidade tecidual, como foi observado no teste com células
Caco-2. Em contraste, o 65c (NO-12) apesar de mais lipofílico, exibiu maior estabilidade
microssomal e permeabilidade tecidual reduzida.
154
Tabela 21- Estabilidade em microssoma hepático (MH) e permeabilidade em Caco-2
dos compostos 65a (NO-01) e 65c (NO-12)
aEstabilidade em
MH de camundongo
aEstabilidade MH de
humano
bCaco-2
65a (NO-01)
20,2
19,97
76,6 ± 1,8
65c (NO-12)
36,3
35,79
59,79 ± 1,7
a Estabilidade em microssomas de fígado de camundongo e humano. Dados relatados como CLint (µL/min/mg de
proteína). bValores de permeabilidade aparente (Papp) foram medidos usando compostos com alta e baixa
permeabilidade de absorção, vinblastina e propranolol, respectivamente, como referências. Os dados são relatados
em 106 cm/s. Os valores indicam uma direção de apical para basolateral (A-B). Os compostos foram testados ao
mesmo tempo. Os valores são a média ± D.P. de 3 experimentos.
Tabela 22 - Solubilidade de 65a (NO-01) e 65c (NO-12) em diferentes valores de pH
Composto
pH 2(a)
pH 4(b)
pH 7.4(c)
pH 10(d)
65a (NO-01)
250 µM
250 µM
<250 µM
<250 µM
65c (NO-12)
250 µM
250 µM
<250 µM
250
(a) pH 2: ácido clorídrico; (b) pH 4: tampão de citrato; (c) pH 7.4: tampão de fosfato; (d) pH 10: hidróxido de sódio, n =
3 dias distintos.
Tabela 23 - LogD7,4 das borono-tirfostinas 65a (NO-01) e 65c (NO-12)
Composto
LogD7.4
65a (NO-01)
-2.25 ± 0.09
65c (NO-12)
-0.96 ± 0.11
4.3.5. Docking molecular com foco no Receptor P2X7
De modo a identificar possíveis sítios de ligação ao redor das cavidades (S1, S2 e S3)
encontradas no canal iônico do P2X7R (Figura 65) para os ligantes ativos 65a (NO-01)
e 65c (NO-12), foram realizados dockings moleculares às cegas para cada um deles.
Esses testes in sílico foram realizados em colaboração com o grupo do Dr. Murilo Bello
na UFRJ.
Com o objetivo de obter informações sobre a relação estrutura-atividade, realizou-se
o mesmo docking às cegas para os ligantes menos ativos 64c (NO-06) e 65d (NO-13)
155
(resultado dos testes para P2X7R no tópico 4.3.3.). A cavidade com maior volume S1
está localizada dentro do poro do P2X7 e engloba o domínio inferior das 3 subunidades
interligadas. A segunda maior cavidade é a S2, também localizada no poro, porém no
domínio superior. As cavidades S3’, S3’’ e S3’’’ são os sítios de ligação com o ATP,
localizados entre as subunidades. Figura 65 representa as cavidades identificadas e na
tabela 24 encontram-se os volumes de cada cavidade.
Figura 65 - Representação dos sítios de interação (S1, S2 e S3) identificados no
receptor P2X7. A) Visão frontal; B) Visão superior. As cavidades S1, S2 e S3 são
ordenadas de acordo com seu volume. Existem três sítios de interação S3 idênticos
formados por 3 subunidades idênticas, portanto, os sítios são diferenciados pelas
legendas S3’, S3” e S3’’’
Tabela 24 - Volume das cavidades identificadas em P2X7R de humano
Cavity
Volume (Å3)
S1
2204,67
S2
1320,96
S3`
442,88
S3``
394,24
S3```
308,22
156
Os resultados do docking molecular indicam que a cavidade S2 é o sítio de interação
mais favorável para os inibidores 65a (NO-01), 65c (NO-12), 64c (NO-06) e 65d (NO-13).
A cavidade S2 é a mesma revelada no trabalho de Karasawa e Kawate em 2016, onde 4
inibidores (A740003, A804598, AZ10606120, GW791343, JNJ47965567) conhecidos
interagem com o receptor.289 As quatro benzeno-vininitrilas testadas apresentam um
modo de interação similar na cavidade S2, onde a fenila interage com resíduos de
fenilalanina 95, 103 e 293 da cadeia B. Essas interações se assemelham àquelas
observadas no trabalho de Karasawa,289 uma vez que esses resíduos também estão
envolvidos em interações hidrofóbicas. Adicionalmente, as borono-tirfostinas (65a (NO-
01), 65c (NO-12), e 65d (NO-13)) orientam-se em direção à cadeia lateral da serina 101
da cadeia B (Figura 66). Apesar de todas as benzeno-vinilnitrilas interagirem da mesma
maneira (interações hidrofóbicas) com os resíduos de fenilalanina, é possível que as
ligações de hidrogênio com os resíduos Gln98, Leu97 e especialmente com a Ser101
sejam as responsáveis pelo aumento de atividade inibitória observada para as borono-
tirfostinas 65a (NO-01) e 65c (NO-12) em comparação com os 64c (NO-06) e 65d (NO-
13). Além dessas interações, o análogo 65c (NO-12) apresentou ligações de hidrogênio
extras com os resíduos de Gly98 e 99 da cadeia A, o que pode contribuir para a
seletividade do composto. Na figura 67 são demonstradas as interações
intermoleculares entre as benzeno-vinilnitrilas analisadas e a cavidade S2 sugeridas pelo
docking molecular.
Figura 66 - Superposição dos inibidores 65a (NO-01), 65c (NO-12), 64c (NO-06) e 65d
(NO-13) ancorados na cavidade S2. As benzeno-vinilnitrilas se encontram em azul e os
principais resíduos em verde
157
Figura 67 - Representação das principais interações intermoleculares de cada
benzeno-vinilnitrila (65a (NO-01), 65c (NO-12), 64c (NO-06) e 65d (NO-13)) avaliada na
cavidade S2, identificadas por docking molecular. As setas indicam as ligações de
hidrogênio e as áreas em azul, a exposição ao solvente
4.3.6. Estudo ADMET (absorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade)
A análise do perfil farmacocinético e toxicológico das borono-tirfostinas 65a (NO-01)
e 65c (NO-12) foi avaliada utilizando o programa ADMET Predictor® (Simulation Plus)
pelo grupo de pesquisa do Dr. Murillo Bello da UFRJ. Após a administração por via oral,
o fármaco deve ser absorvido e solubilizado durante a passagem pelo trato
gastrointestinal. Assim, um bom candidato a fármaco deve apresentar uma facilidade de
ser absorvido. Quando isso não é possível, outros métodos mais inconvenientes de
158
administração (ex.: injeção) devem ser considerados. Idealmente, a administração oral é
priorizada.
Os estudos in silico têm papel crucial na pesquisa e desenvolvimento de fármacos,
em razão de sua capacidade de avaliar as propriedades físico-químicas e
farmacocinéticas de substâncias bioativas. Os resultados in silico obtidos através do
teste de absorção intestinal humana (do inglês, Human Intestinal Absorption - HIA),
indicam uma alta permeabilidade para os compostos avaliados (65a e 65c).290 Através
do teste de absorção intestinal em células Caco-2 (Adenocarcinoma de cólon humano),
estimou-se uma absorção de 70% e uma alta permeabilidade, maior que 8 × 106 cm/s.291
Do mesmo modo, foi estimada uma alta solubilidade em água para os dois compostos
65a (NO-01) e 65c (NO-12) com valores de logS de -2,04 e -2,20, respectivamente. Por
outro lado, apenas o 65a apresentou alta penetração na membrana hematoencefálica.
O perfil metabólico das enzimas CYP também foi investigado, onde os análogos 65a
(NO-01) e 65c (NO-12) apresentaram potencial de interação apenas com a CYP3A4,
como inibidores. Essa classe de proteínas representa 75% das enzimas responsáveis
por metabolizar fármacos. Grande parte dos fármacos são desativados pelas CYPs
através da conversão de um grupamento bioativo, o que acelera a velocidade de
eliminação destes. Portanto, neste caso, o baixo potencial de interação é favorável para
a manutenção da atividade biológica dos dois compostos. Além disso, sabe-se também
que, a maioria dos fármacos contendo grupos nitrila não são atacados nestes grupos
pelas enzimas, de forma que são eliminados inalterados. Não obstante, a epoxidação de
alceno-nitrilas (caso dos compostos analisados) pode, potencialmente, liberar cianeto,
embora, o grande número de fármacos aprovados, contendo esse grupo, parecem indicar
que é mais provável a metabolização em outro local.292
Em relação aos parâmetros toxicológicos, os compostos avaliados foram classificados
com inibidores fracos (pIC50 ≤ 6.0 mol/L) pelo teste de inibição do hERG (do inglês,
Human Ether-a-go-go-Related Gene). Esse resultado é extremamente favorável, uma
vez que, a inibição desses canais pode causar morte súbita (hERG).293 Além disso, os
compostos demonstraram um baixo potencial mutagênico pelo teste AMES e, por fim,
nenhuma característica carcinogênica foi identificada pelo teste Carcinogens.294 Com
relação à porção B(OH)2, não há nenhuma toxicidade aparente identificada na literatura.
159
De fato, o Bortezomibe (Velcade), primeiro fármaco derivado de ácido borônico aprovado
pela FDA (Federal Drug Administration) para o tratamento de mieloma múltiplo, apresenta
baixa toxicidade. Na eventual metabolização dos compostos contendo a unidade B(OH)2,
o ácido bórico, composto com baixa toxidade para humanos, é geralmente formado.295
4.3.7. Avaliação in vivo da atividade anti-inflamatória dos compostos 65a e 65c
Tendo em vista a capacidade excelente das borono-tirfostinas 65a (NO-01) e 65c
(NO-12) in vitro a liberação de IL-1β mediada pela ativação do P2X7R, e o importante
papel do P2X7R nos processos inflamatórios, avaliaram-se as propriedades anti-
inflamatórias in vivo desses compostos. As propriedades foram avaliadas utilizando-se o
modelo de edema de pata induzido por ATP em camundongo. Diclofenaco de sódio e as
borono-tirfostinas foram administrados intraperitonealmente uma hora antes do
tratamento com ATP por 30 min. Utilizou-se como padrão de inibição da resposta
inflamatória induzida por ATP, o ATP oxidado (ATPox), um antagonista irreversível, e o
diclofenaco (Diclofenac), um anti-inflamatório geral. Ambos inibiram o edema na pata
(Figura 68). As borono-tirfostinas também inibiram eficientemente o edema. O composto
65a (NO-01) inibiu mais efetivamente a resposta inflamatória que o ATPox e o diclofenaco
em concentrações menores (Figura 68 A). Já o 65c (NO-12) promoveu um efeito anti-
inflamatório similar aos padrões em uma concentração menor (Figura 68 B). Em
concordância com as análises in vitro, o análogo 65a (NO-01) inibiu o edema de pata
induzido por ATP com maior potência do que o análogo 65c (NO-12).
160
Figura 68 - Efeito anti-inflamatório em edema de pata induzido por ATP dos compostos
65a (NO-01) e 65c (NO-12). Grupos de 5 camundongos da linhagem Swiss Webster
foram tratados com ATP intraplantar ou pré-incubados por 30 min com diclofenaco (10
m/kg), ATP oxidado (10mg/kg), ou doses de 65a (NO-01) (0,001–1 mg/kg) (A) ou 65a
(NO-01) (B) e depois tratados com ATP. O edema da pata foi medido 60 minutos após
a aplicação do ATP. Os dados relatados representam a média ± DP de experimentos
realizados em 3 dias distintos. ### P<0, 05 comparação em relação ao grupo salino. ***
P < 0,05 comparação com relação ao grupo ATP
5. CONCLUSÕES
Constatou-se que a condensação de Knoevenagel em meio aquoso é um excelente
protocolo para obtenção de benzeno-vinilnitrilas contendo boro, uma vez que, esses
compostos foram obtidos com elevada pureza, sem a necessidade de utilização de
solventes orgânicos, inclusive nos procedimentos de isolamento. Os compostos E-
arilcianovinílicos inéditos (borono-tirfostinas) foram obtidos com rendimentos elevados
(84-91%). As tirfostinas sem o boro foram sintetizadas através da reação em água entre
diferentes aldeídos e a malononitrila (R = 81-98%).
161
Os pontos de fusão das benzeno-vinilnitrilas sem o boro, coincidem com os valores
encontrados na literatura. Quanto às borono-benzeno-vinilnitrilas, somente foi possível
determinar o ponto de decomposição ao invés do ponto de fusão.
Todos os compostos foram caracterizados por espectroscopia na região do IV e por
ressonância magnética nuclear de 1H e de 13C. De uma forma geral, assim como a
presença do grupo nitro fortemente retirador causa o fortalecimento da ligação CN,
conforme verificado no espectro de IV, os ácidos borônicos comportam-se de forma
semelhante. Verificou-se que através do protocolo de reação e de isolamento aquoso, os
compostos de boro foram obtidos sob a forma dos ácidos borônicos e não dos respectivos
anidridos cíclicos (boroxinas) devido à presença da banda em 3500-3200 cm-1
característica do estiramento do OH e à ausência da banda forte de estiramento de B-O
de anidridos em 680-705 cm-1. Este fato evidenciou a presença do boro nas estruturas,
o que foi corroborado pela presença dos H’s da hidroxila no espectro de 1H RMN e pela
ausência do sinal do carbono ligado ao boro no espectro de RMN de 13C. Tais
informações significam que o procedimento aquoso não resultou em protodesboronação,
sendo adequado à síntese de compostos de boro.
Adicionalmente, a análise de 1H RMN apenas nos permite identificar a presença de
um estereoisômero para as borono-tirfostinas derivadas do ácido cianoacetato de etila.
A análise de raio-X de monocristal destes compostos permitiu determinar a
estereoquímica dos mesmos como E.
A análise dos cristais das borono-tirfostinas obtidas evidenciou que a rede cristalina é
mantida, principalmente, por meio das ligações de H. Os compostos onde a unidade
B(OH)2 estava na posição meta, devido ao impedimento espacial, geraram cristais
menores, com ligações de hidrogênio mais fracas e com maiores torções dos diedros do
que os análogos para-substituídos.
A estratégia de unir ácidos borônicos com as tirfostinas na mesma molécula resultou
em boas atividades biológicas. O 65c (NO-12) (G1 = CO2Et e G = 4-B(OH)2) apresentou
um excelente potencial antiproliferativo (0,14 ± 0,09 μM) para células da linhagem GH3,
proveniente de tumor pituitário de rato. O composto 65d (NO-13) (G1 = CO2Et e G = 3-
B(OH)2), apesar de menos eficiente em comparação com as benzeno-vinilnitrilas 64b
(NO-05) (4-MeO), 64c (NO-06) (4-Me) e 64f (NO-11) (3-NO2), também exibiu atividade
162
antiproliferativa contra a linhagem de células U937, originária de linfoma histocítico de
humano.
Os estudos de quimiogenômica reforçam a teoria de que a família de proteínas
quinases, particularmente, as tirosinas quinases, são possíveis alvos moleculares para
os compostos sintetizados em linhagens de células malignas. Dentre as tirosinas
quinases identificadas como possíveis alvos nesse estudo, a DYRK1a apresentou-se
como um alvo promissor, devido ao seu papel no desenvolvimento do câncer e na
regulação da EGFR.
Já os estudos de docking molecular com a tirosina quinase DYRK1a, indicam que os
compostos contendo a unidade B(OH)2 como o 65a (NO-01) e 65c (NO-12), podem
interagir com o sítio ativo dessa proteína.
No que tange à atividade anti-chagásica in vitro, as borono-tirofostinas foram
superiores às tirfostinas sem boro, demonstrando que a presença da unidade B(OH)2
nestas estruturas representou um ganho para a ação antiparasitária desta classe de
compostos. O Composto 65c (NO-12) foi o mais eficiente entre eles, exibindo um EC50
(0,795 μM) 25 vezes menor que o obtido para o benzonidazol (20,63 μM), que é o fármaco
atualmente utilizado no tratamento de Chagas.
Os resultados referentes a atividade anticâncer e tripanocida e os estudos de docking
molecular para proteínas quinases foram publicados recentemente na revista
ChemMedChem: Hiller, N, J.; e Silva, N. A. A.; Faria, R. X.; Souza, A. L. A; Resende, J.
A. L. C.; Farias, A. B.; Romeiro, N. C.; Martins, D. L. Synthesis and evaluation of
anticancer and trypanocidal activities of boronic tyrphostins. ChemMedChem 2018, 13,
1395-1404 (Apêndice B).251
Os resultados apresentados nesse trabalho evidenciam os ácidos arilborônicos como
uma nova classe de inibidores de P2X7R. Vale ressaltar que, de acordo com pesquisas
na literatura, é primeira vez que o potencial inibitório de ácidos arilborônicos frente ao
P2X7R é avaliado.
As borono-tirfostinas 65a (NO-01) e 65c (NO-12) atuaram como antagonistas
potentes dos P2X7R de humano e de camundongo. O composto 65a (NO-01) foi o mais
potente tanto in vitro como in vivo. Inclusive, esse composto inibiu mais eficientemente o
funcionamento do P2X7R e a resposta inflamatória do que os antagonistas conhecidos
163
BBG e A740003. O índice de seletividade (S.I.) calculado para estas substâncias (65a =
693,2; 65c = 392,8) indicou um bom potencial para investimentos em testes futuros mais
detalhados.
Os estudos ADMET in silico realizados para as duas moléculas que apresentaram
atividade frente ao P2X7R indicam que os perfis farmacocinéticos dos compostos são
aceitáveis e os efeitos toxicológicos para ambas as substâncias são baixos, sugerindo
um perfil de “druglikeness” das moléculas.
Os resultados de docking molecular sugerem que os locais de interação para os
compostos 65a (NO-01) e 65c (NO-12) estão localizados na parte superior do poro do
P2X7R. Tanto o docking quanto o teste de “whole cell patch clamp” parecem indicar que
as borono-tirfostinas atuam como inibidores não-competitivos, atuando sobre o sítio
alostérico de forma semelhante ao do A740003.
Nos testes in vivo o composto 65a foi aquele que apresentou o melhor resultado,
inibindo a formação do edema de pata mais eficientemente que o diclofenaco, conhecido
anti-inflamatório, e o antagonista ATPox.
Portanto, esses resultados corroboram a teoria inicial do presente trabalho que
tirfostinas, associadas com a unidade B(OH)2, apresentam um alto potencial terapêutico
e podem funcionar como protótipos no desenvolvimento de uma nova classe de inibidores
de P2X7R e anti-inflamatórios. Os resultados biológicos referentes à atividade como
antagonista do P2X7 e ação anti-inflamatória foram publicados recentemente na revista
Journal of Bioenergetics and Biomembranes: Faria, R. X.; Hiller, N. J.; Salles, J. P.;
Resende, J. A. L. C.; Diogo, R. T.; von Ranke, N. L.; Bello, M. B.; Rodrigues, C. R.; Castro,
H. C.; Martins, D. L. Arylboronic acids inhibit P2X7 receptor function and the acute
inflammatory response. J. Bioenerg. Biomembr. 2019, 51,277-290.296
6. METODOLOGIA
6.1. Materiais e Métodos
Solventes e reagentes foram utilizados sem purificação prévia. Utilizaram-se os
seguintes solventes: etanol, metanol, acetato de etila, diclorometano, todos da marca
164
Próquimios. Empregaram-se os seguintes reagentes: malononitrila (Aldrich, > 99%),
cianoacetato de etila, ácido 3-formilfenilborônico (Combi-Blocks, 98%) e ácido 4-
formilfenilborônico (Combi-Blocks, 98%).
O acompanhamento da reação foi realizado através de cromatografia em camada
fina (c.c.f.), empregando uma solução de 10% acetona/clorofórmio, em alguns casos a
porcentagem de acetona foi aumentada. As análises de c.c.f. foram realizadas em folhas
de alumínio recobertas com gel de sílica (cromatofolhas F254), da Silicycle Ultrapure
Silica Gels. Para revelar as placas, foram utilizados os seguintes métodos: exposição da
cromatofolha à luz ultravioleta (254 nm), exposição aos vapores de iodo e exposição a
uma solução alcoólica acidificada de 2,4-dinitrofenilhidrazina.
6.2. Técnicas empregadas
6.2.1 Espectroscopia na região do infravermelho
Os espectros de infravermelho foram obtidos em um dos dois espectrofotômetros
disponíveis no laboratório Multiusuário de Espectroscopia (LAME) da UFF. O
espectrofotômetro de infravermelho por transformada de Fourier, modelo Varian FT-IR
660 e o espectrofotômetro de infravermelho da Thermo ScientificTM modelo NicoletTM iS50
FT-IR. Desta forma, é possível obter espectros de infravermelho via transmitância ou
reflectância total atenuada (ATR) na faixa 400-4000 cm-1, através da leitura direta de
amostras sólidas, sem a necessidade de pastilhas de KBr.
6.2.2. Espectroscopia de ressonância magnética nuclear
Os espectros de ressonância magnética nuclear foram registrados em aparelho
Varian VNMRS 500 MHz e 300 MHz. As amostras foram dissolvidas em solventes
deuterados indicados em cada espectro. No caso das análises em CDCl3, o
tetrametilsilano foi empregado como padrão interno. Os deslocamentos químicos (δ ppm)
foram apresentados em partes por milhão. As áreas dos sinais foram obtidas por
integração automática no programa MestReNova.
165
6.2.3. Difração de Raios-X
Os dados de raios-X foram obtidos em um difratômetro para análise de monocristais,
modelo Bruker D8Venture com detector CMOS PHOTON100, utilizando radiação MoKα
(λ=0,7169Å). As estruturas descritas nesse trabalho foram resolvidas por método direto,
e refinadas por mínimos dos quadrados, utilizando o software SheIX. As análises foram
realizadas no laboratório Multiusuário de difração de Raio X do Departamento de Física
da Universidade Federal Fluminense.
6.3. Procedimento geral para obtenção de benzeno-vinilnitrilas (tirfostinas)
através da reação de Knoevenagel com aldeídos comerciais
6.3.1. Utilizando a malononitrila como metileno ativo
Em um balão de 50 mL com agitador magnético adicionaram-se 6 mmols do aldeído
(63c-h). Em seguida, adicionaram-se 6 mmols da malononitrila 62a e 30 mL de água
destilada. Acoplou-se um condensador de refluxo ao balão e a mistura foi mantida sob
refluxo.
Após o término da reação, a mistura foi deixada em repouso até a temperatura ambiente
e, em seguida, realizou-se uma filtração sob vácuo, lavando-se o precipitado com água
gelada.
Os produtos foram caracterizados por 1H RMN, IV, UV e os pontos de fusão capilar
foram medidos.
166
O produto 64a foi obtido com a metodologia 6.3.1. em 4 horas com um rendimento de
85%. Este produto apresenta-se como um sólido de coloração branca e ponto de fusão
de 82-84°C.
1H-RMN (500 MHz, ẟ ppm, CDCl3): 7,92-7,90 (2 H, d, J = 7,6 Hz, Ar-H); 7,78 (1 H, s,
C=C(Ph)H); 7,65-7,62 (1 H, t, J = 7,5 Hz, Ar-H); 7,56-7,53 (2 H, t, J = 7,8 Hz, Ar-H).
13C-RMN (126 MHz, ẟ ppm, CDCl3): 160,02; 134,65; 130,95; 130,74; 129,64; 113,74;
112,59; 82,80.
IV (cm-1): 3037 ( de sp2 C-H); 2223 ( de C≡N); 1591 ( de C=C vinílico); 1568 ( de
C=C de anel Ar); 755; 679 (δoop de C-H, padrão de monossubstituição).
167
Figura 69 - Espectro de 1H-RMN do 64a usando CDCl3 como solvente
168
Figura 70 - Espectro de APT do 64a usando CDCl3 como solvente (CH e CH3 para cima)
169
Figura 71 - Espectro de HSQC 1H versus 13C do 64a usando CDCl3 como solvente
170
Figura 38 - Espectro de IV do produto 13a
Figura 72 - Espectro de IV do produto 64a
171
Figura 73 - Espectro de UV do 64a
172
O produto 64b foi obtido com a metodologia 6.3.1. em 4 horas com um rendimento de
90%. Este produto apresenta-se como um sólido de coloração amarela e ponto de fusão
de 116-118°C.
1H-RMN (500 MHz, ẟ ppm, CDCl3): 7,921-7,903 (2 H, d, J = 8,9 Hz, Ar-H); 7,652 (1 H,
s, C=C(Ph)H); 7,024-7,006 (2 H, d, J = 9,0 Hz, Ar-H); 3,916 (3 H, s, CH3).
13C-RMN (75 MHz, ẟ ppm, CDCl3): 164,84; 158,91; 133,46; 124,02; 115,15; 114,45;
113,38; 78,46; 55,82.
IV (cm-1): 3025 ( de sp2 C-H); 2854 ( de sp3 C-H); 2224 ( de C≡N); 1558 ( de C=C
vinílico); 1605; 1571; 1513 ( de C=C de Ar); 1279 (ass de C-O); 1022 (s de C-O); 834
(δoop de C-H, padrão de substituição para).
173
Figura 74 - Espectro de 1H-RMN do 64b usando CDCl3 como solvente
174
Figura 75 - Espectro de APT do 64b usando CDCl3 como solvente (CH e CH3 para baixo)
175
Figura 76 - Espectro de HSQC 1H versus 13C do 64b usando CDCl3 como solvente
176
Figura 77 - Espectro de IV do produto 64f
177
Figura 78 - Espectro de UV do 64b
178
O produto 64c foi obtido com a metodologia 6.3.1. em 2 horas com um rendimento de
98%. Este produto apresenta-se como um sólido de coloração branca e ponto de fusão
de 136-137°C.
1H-RMN (300 MHz, ẟ ppm CDCl3): 7,83-7,80 (2 H, d, J = 9 Hz, Ar-H); 7,72 (1 H, s,
C=C(Ph)H); 7,35-7,32 (2 H, d, J = 9 Hz, Ar-H); 2,46 (3 H, s, CH3).
13C-RMN (75 MHz, ẟ ppm, CDCl3): 159,78; 146,39; 130,91; 130,38; 128,47; 114,02;
112,87; 81,17; 22,01.
IV (cm-1): 3036 ( de sp2 C-H); 2222 ( de C≡N); 1586 ( de C=C vinílico); 1605;1554
( de C=C de anel Ar); 1375 (δ de CH3); 812 (δoop de C-H, padrão de substituição para).
179
Figura 79 - Espectro de 1H-RMN do 64c usando CDCl3 como solvente
180
Figura 80 - Espectro de APT do 64c usando CDCl3 como solvente (CH e CH3 para baixo)
181
Figura 81 - Espectro de HSQC 1H versus 13C do 64c usando CDCl3 como solvente
182
Figura 82 - Espectro de IV do produto 64c
183
Figura 83 - Espectro de UV do 64c
184
O produto 64d foi obtido com a metodologia 6.3.1. em 2 horas com um rendimento de
93%. Este produto apresenta-se como um sólido de coloração laranja e ponto de fusão
de 185-188°C.
1H-RMN (300 MHz, ẟ ppm DMSO): 7,826-7,796 (2 H, d, J = 9,0 Hz, Ar-H); 7,458 (1 H,
s, C=C(Ph)H); 6,705-6,674 (1 H, d, J = 9,2 Hz, Ar-H); 3,141 (6 H, s, CH3).
13C-RMN (75 MHz, ẟ ppm, CDCl3): 158,0; 154,28; 133,80; 119,23; 116,04; 114,97;
111,61; 71,61; 40,09.
IV (cm-1): 3025 ( de sp2 C-H); 2854 ( de sp3 C-H); 2224 ( de C≡N); 1558 ( de C=C
vinílico); 1605; 1571; 1513 ( de C=C de Ar); 1279 (ass de C-O); 1022 (s de C-O); 834
(δoop de C-H, padrão de substituição para).
185
Figura 84 - Espectro de 1H-RMN do 64d usando CDCl3 como solvente
186
Figura 85 - Espectro de APT do 64d usando CDCl3 como solvente (CH e CH3 para baixo)
187
Figura 86 - Espectro de HSQC 1H versus 13C do 64d usando CDCl3 como solvente
188
Figura 87 - Espectro de IV do produto 64d
189
Figura 88 - Espectro de UV do 64d
190
O produto 64e foi obtido com a metodologia 6.3.1. em 4 horas com um rendimento de
97%. Este produto apresenta-se como um sólido de coloração branca e ponto de fusão
de 167-169°C.
1H-RMN (300 MHz, ẟ ppm CDCl3): 7,87-7,84 (2 H, d, J = 6 Hz, Ar-H); 7,73 (1 H, s,
C=C(Ph)H); 7,54-7,51 (2 H, d, J = 6 Hz, Ar-H).
13C-RMN (75 MHz, ẟ ppm CDCl3) 158,31; 141,14; 131,84; 130,07; 129,28; 113,45;
112,34; 83,35.
IV (cm-1): 3033 ( de sp2 C-H); 2226 ( de C≡N); 1581 ( de C=C vinílico); 1556 ( de
C=C de anel Ar); 1094 ( de sp2 C-Cl); 826 (δoop de C-H, padrão de substituição para).
191
Figura 89 - Espectro de 1H-RMN do 64e usando CDCl3 como solvente
192
Figura 90 - Espectro de APT do 64e usando CDCl3 como solvente (CH e CH3 para cima)
193
Figura 91 - Espectro de HSQC 1H versus 13C do 64e usando CDCl3 como solvente
194
Figura 92 - Espectro de IV do produto 64e
195
Figura 93 - Espectro de UV do 64e
196
O produto 64f foi obtido com a metodologia 6.3.1. em 4 horas com um rendimento de
81%. Este produto apresenta-se como um sólido de coloração branco e ponto de fusão
de 104-106°C.
1H-RMN (300 MHz, ẟ ppm CDCl3): 8,67-8,65 (1 H, m, Ar-H); 8,49-8,46 (1 H, ddd, J =
8,3; 2,1; 0,9 Hz, Ar-H); 8,34-8,31 (1 H, m, Ar-H); 7,89 (1 H, s, C=C(Ph)H); 7,82-7,77 (1 H,
t, J = 8,1 Hz, Ar-H).
13C-RMN (75 MHz, ẟ ppm, CDCl3): 157,10; 148,65; 134,92; 132,03; 131,01; 128,23;
125,51; 112,70; 111,67; 86,72.
IV (cm-1): 3087( de sp2 C-H); 229, 2226 (ass e s de C≡N); 1596 ( de C=C vinílico);
1528 (ass de N-O); 1356 (s de N-O).
197
Figura 94 - Espectro de 1H-RMN do 64f usando CDCl3 como solvente
198
Figura 95 - Espectro de APT do 64f usando CDCl3 como solvente (CH e CH3 para baixo)
199
Figura 96 - Espectro de HSQC 1H versus 13C do 64f usando CDCl3 como solvente
200
Figura 97 - Espectro de IV do produto 64f
201
6.4. Obtenção de benzeno-vinilnitrilas contendo uma porção borono (borono-
tirfostinas) através da reação de Knoevenagel com aldeídos de ácidos borônicos
comerciais
Compostos α, β-insaturados (65a-65d), contendo a porção borono e variando o
metileno ativo utilizado, foram obtidos a partir da reação de Knoevenagel.
6.4.1. Utilizando a malononitrila como metileno ativo
Em um balão de 25 mL, com agitador magnético, foram adicionados respectivamente
os seguintes reagentes 2 mmol do ácido formilfenilborônico 63a-b, 2 mmol de
malononitrila 62a e 10 mL de água. Um condensador de refluxo foi acoplado ao sistema
e ele foi mantido sob refluxo em banho de óleo.
Após o término da reação o balão contendo a mistura reacional foi retirado do banho
permitindo assim que o produto resfriasse. Em seguida, realizou-se uma filtração à vácuo
e o produto foi lavado com água gelada. O consumo dos regentes foi acompanhado por
c.c.f., utilizando como eluente uma mistura dicloroetano/metanol e como revelador a 2,4-
dinitrofenilhidrazina e a luz UV de comprimento 254 nm.
Os produtos dessa reação foram caracterizados por 1H-RMN, 13C-RMN, IV e Raio-X.
202
O produto 65a foi obtido com a metodologia 6.4.1. em 2,5 h com um rendimento de
86%. O composto apresenta-se como um sólido de coloração branca e ponto de
decomposição de 301-303 °C.
1H-RMN (500 MHz, ẟ ppm, DMSO): 8,484 (1 H, s, C=(Ph)H); 8,175 (2 H, s, B(OH)2);
7,962-7,945 (2 H, d, J = 8,2 Hz, Ar-H); 7,894-7,877 (2 H, d, J = 8,2 Hz, Ar-H).
13C-RMN (75 MHz, ẟ ppm, DMSO): 162,03; 135,12; 132,85; 129,63; 114,55; 113,59;
82,35.
IV (cm-1): 3433 (ass de O-H); 3341 (s de O-H); 3040 ( de sp2 C-H); 2244, 2228
(ass e s de C≡N); 1589 ( de C=C); 1340 ( de B-O).
203
Figura 98 - Espectro de 1H-RMN do 65a usando DMSO como solvente
204
Figura 99 - Espectro de APT do 65a usando DMSO como solvente (CH e CH3 para baixo)
205
Figura 100 - Espectro de HSQC 1H versus 13C do 65a usando DMSO como solvente
206
Figura 101 - Espectro de IV do produto 65a
207
Figura 102 – Difração de raio-x para cristal do composto 65a
208
O produto 65b foi obtido com a metodologia 6.4.1. em 2,5 h com um rendimento de
91%. O composto apresenta-se como um sólido de coloração branca e ponto de
decomposição de 265-268°C.
1H-RMN (500 MHz, ẟ ppm, DMSO): 8,505 (1 H, s, C=C(Ph)H); 8,306 (1 H, s, Ar-H);
8,181 (2 H, s, B(OH)2); 8,068-8,053 (1 H, d, J = 7,5 Hz, Ar-H); 8,005-7,989 (1 H, d, J = 7,5
Hz, Ar-H); 7,603-7,572 (1 H, dd, J = 7,5; 8,0 Hz, Ar-H).
13C-RMN (75 MHz, ẟ ppm, DMSO): 161,77; 139,42; 136,37; 131,16; 130,33; 128,19;
113,92; 112,85; 81,00.
IV (cm-1): 3380 (ass de O-H); 3292 (s de O-H); 3020 ( de sp2 C-H); 2245,2225 (ass
e s de C≡N); 1596, 1574 ( de C=C); 1352 (ass de B-O).
209
Figura 103 - Espectro de 1H-RMN do 65b usando DMSO como solvente
210
Figura 104 - Espectro de APT do 65b usando DMSO como solvente (CH e CH3 para baixo)
211
Figura 105 - Espectro de HSQC 1H versus 13C do 65b usando DMSO como solvente
212
Figura 106 - Espectro de IV do produto 65b
213
Figura 107 – Difração de raio-x para cristal do composto 65b
214
6.4.2. Utilizando o cianoacetato de etila como metileno ativo
Em um balão de 25 mL, com agitador magnético, foram adicionados,
respectivamente, os seguintes reagentes: 2 mmol do ácido formilfenilborônico 63a-b, 2
mmol de cianoacetato de etila 62b e 10 mL de água. Um condensador de refluxo foi
acoplado ao sistema e a mistura foi mantida sob refluxo e agitação.
Após o término da reação, o balão contendo a mistura reacional foi retirado do banho
permitindo assim que o produto resfriasse. Em seguida, realizou-se uma filtração à vácuo
e o produto foi lavado com água destilada gelada. O consumo dos regentes foi
acompanhado por c.c.f., utilizando como eluente uma mistura dicloroetano/metanol e
como revelador a 2,4- dinitrofenilhidrazina e a luz UV de comprimento 254 nm.
Os produtos dessa reação foram caracterizados por 1H-RMN, 13C-RMN, IV e Raio X.
O produto 65c foi obtido com a metodologia 6.4.2. em 5 h com um rendimento de
84%. O composto apresenta-se como um sólido de coloração branca e ponto de
decomposição de 242-243 °C.
1H-RMN (500 MHz, ẟ ppm, DMSO): 8,383 (1 H, s, C=(Ph)H); 8,258 (2 H, s, B(OH)2);
7,998-7,981 (2 H, d, J = 8,2 Hz, Ar-H); 7,949-7,932 (2 H, d, J = 8,2 Hz, Ar-H); 4,353-4,310
(2 H, q, J = 7,1 Hz, OCH2CH3); 1,331-1,303 (3 H, t, J = 7,1 Hz, OCH2CH3).
13C-RMN (126 MHz, ẟ ppm, DMSO): 161,71; 154,99; 140,20; 134,54; 132,45; 129,48;
115,48; 102,85; 62,32; 13,90.
IV (cm-1): 3334 ( de O-H); 2966 ( de sp2 C-H); 2238 ( de C≡N); 1719 ( de C=O);
1607; 1549 ( de C=C); 1331 ( de B-O); 1264 ( de C-O) .
215
Figura 108 - Espectro de 1H-RMN do 65c usando DMSO como solvente
216
Figura 109 - Espectro de 13C-RMN do 65c usando DMSO como solvente
217
Figura 110 - Espectro de APT do 65c usando DMSO como solvente (CH e CH3 para baixo)
218
Figura 111 - Espectro de HSQC do 65c usando DMSO como solvente
219
Figura 112 - Espectro de IV do produto 65c
220
Figura 113 – Difração de raio-x para cristal do composto 65c
221
O produto 65d foi obtido com a metodologia 6.4.1. em 5 h com um rendimento de
87%. O composto apresenta-se como um sólido de coloração branca e ponto de
decomposição de 202-206 °C.
1H-RMN (500 MHz, ẟ ppm, (CD3)2CO): 8,549 (1 H, s, Ar-H); 8,482 (1 H, s, C=(Ph)H);
8,350-7,334 (1 H, d, J = 7,9 Hz, Ar-H); 8,226-8,211 (1 H, d, J = 7,4 Hz, Ar-H); 7,730-7,700
(1 H, t, J = 7,6 Hz, Ar-H); 7,548 (2 H, s, B(OH)2); 4,509-4,466 (2 H, q, J = 7,1 Hz,
OCH2CH3); 1,497-1,469 (3 H, t, J = 7,1 Hz, OCH2CH3).
1H-RMN (300 MHz, ẟ ppm, DMSO): 8,353 (1 H, s, Ar-H); 8,347 (1 H, s, C=(Ph)H);
8,114-8,078 (1 H, m, Ar-H); 8,031-8,000 (1 H, dt, J = 7,5; 1,0 Hz, Ar-H); 7,584-7,533 (1 H,
t, J = 7,6 Hz, Ar-H); 4,376-4,305 (2 H, q, J = 7,1 Hz, OCH2CH3); 1,353-1,306 (3 H, t, J =
7,1 Hz, OCH2CH3).
13C- RMN (75 MHz, ẟ ppm, DMSO): 162,35; 155,87; 139,23; 137,62; 131,91; 131,06;
128,76; 115,81; 103,03; 62,76; 14,40.
IV (cm-1): 3365 ( de O-H); 3034 ( de sp2 C-H); 2225 ( de C≡N); 1721 ( de C=O);
1597; 1579 ( de C=C); 1362 ( de B-O); 1206 ( de C-O) .
222
Figura 114 - Espectro de 1H-RMN do 65d usando acetona como solvente
223
Figura 115 - Espectro de 1H-RMN do 65d usando DMSO como solvente
224
Figura 116 - Espectro de APT do 65d usando DMSO como solvente (CH e CH3 para cima)
225
Figura 117 - Espectro de HSQC do 65d usando DMSO como solvente
226
Figura 118 - Espectro de IV do produto 65d
227
Figura 119 – Difração de raio-x para cristal do composto 65d
228
6.5. Avaliação biológica e in silico
Os ensaios in vitro foram realizados no Laboratório de Toxoplasmose e outras
Protozooses da FIOCRUZ. Os estudos de quimiogenômica e docking molecular focados
em proteínas quinases foram realizados no Núcleo de Pesquisas em Ecologia e
Desenvolvimento Social (NUPEM) na UFRJ. Os estudos in silico focados no P2X7R
foram realizados no Laboratório do Dr. Murilo Bello na UFRJ.
6.5.1. Cultura de células
6.5.1.1. Macrófagos peritoneais
Os macrófagos peritoneais de camundongos foram colhidos de camundongos Swiss
Webster machos através do lavado da cavidade peritoneal com 3 mL de meio RPMI-
1640. As células isoladas foram centrifugadas e ressuspensas.
A contagem de células foi feita na câmara de Neubauer. Alíquotas (0,5 mL) da
suspensão de células foram adicionadas aos poços da microplaca de 96 poços e
colocadas durante 1 h em uma atmosfera úmida (37 °C, 5% de CO2) para a adesão
celular. As células não aderentes foram removidas por lavagem com meio RPMI-1640
com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e gentamicina (1 µL/mL). Células aderidas com
firmeza foram ressuspensas em meio RPMI e usadas para procedimentos experimentais
subsequentes.
Os animais utilizados para todos os protocolos foram camundongos da linhagem
Swiss Webster, machos saudáveis com cerca de 4 semanas (CEUA L039/2016).
6.5.1.2. Cultura dos protozoários
Formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi (cepa Y) foram obtidas após inoculação
de 2 x 105 parasitas em camundongos Swiss–Webster, adultos, fêmeas por via
intraperitoneal. Esta metodologia foi aprovada pela Comissão de Ética no Uso de Animais
(CEUA – Fiocruz) sob o número de licença L015/18. Após o pico da parasitemia, os
229
animais foram eutanasiados por superdosagem de anestésico para obtenção do sangue,
através de punção cardíaca, com a forma infectante do protozoário. Além disso, os
parasitos obtidos foram isolados em meio Novy-MacNeil-Nicolle (NNN), e mantidos a
28ºC durante 7 dias, para obtenção das formas epimastigotas que foram mantidas em
meio Liver Infusion Tryptose (LIT) através de passagens semanais durante no máximo 6
passagens.
6.5.2. Avaliação da citotoxicidade em células de mamíferos
6.5.2.1. Ensaio de viabilidade celular pela técnica da redução da resarzurina
Para avaliação do metabolismo celular, foi realizado ensaio colorimétrico de redução
do corante resazurina. Brevemente, 20 µL (0,15 mg/mL) foram adicionados em cada poço
na ausência de luz e as placas foram levadas à estufa por um período de 4-6 h. Como
controle negativo, foram mantidos poços somente com células sem tratamento algum e
como controle positivo, foi utilizado TritonX-100 a 0,5% (macrófagos e epimastigotas) e
10 µg/mL de benzonidazol (epimastigotas). A leitura foi feita em espectrofotômetro com
o comprimento de onda de excitação de 570 nm e emissão 595 nm, utilizando o software
Softmax pro (versão 5.1). A análise estatística dos dados foi feita no GraphPad Prism 5.
6.5.2.2. Ensaio de toxicidade celular in vitro por meio da técnica de liberação da
Lactato Desidrogenase (LDH)
A presença de LDH no meio foi detectada neste experimento utilizando um kit de
detecção de citotoxicidade (kit Sigma para LDH) seguindo as instruções do fabricante.
Os sobrenadantes celulares (5x105 células) foram incubados em uma placa de 96 poços
com meio DMEM sem fenol red. Foram testados para LDH que reduz o NAD+, que então,
converte um corante de tetrazólio (MTT) em um derivado de formazano colorido e solúvel.
230
6.5.3. Ensaio de permeabilização celular com corantes
6.5.3.1. Captação de iodeto de propídeo (PI)
Os ensaios de captação de corante fluorescente foram realizados com macrófagos
peritoneais utilizando um citômetro de fluxo e o intercalante de DNA iodeto de propídeo
(PI). As análises foram realizadas no software Summit (BeckmanCoulter). As células
retiradas do lavado peritoneal foram centrifugadas a 1500 rpm por 5 min. O sobrenadante
foi retirado e, em seguida, foi feita a contagem das células na câmera de Neubauer. A
quantidade de células por tubo é de 2 x 105. Incubaram-se os antagonistas, BBG ou o
A740003, em concentrações variando de 1nM- 500 µM, e a série NO em concentrações
0,01 nM- 10 µM 10 min antes de iniciar o experimento. O processo foi realizado em um
banho Maria a 37 ºC. O ATP foi adicionado em uma concentração de 5 mM, depois da
incubação com os antagonistas e com a série NO por 25 min e o PI (0,05 mM) nos 5
minutos finais da incubação com ATP. O Triton 0,5% foi adicionado nos seus devidos
poços, nos 5 min finais da incubação antes do PI. Ao término da incubação realizou-se a
leitura no FACS Calibur.
6.5.3.2. Captação de brometo de etídeo
Epimastigotas foram semeadas em placas de 96 poços (pretas de fundo preto),
numa concentração de 2 x 106/ mL, juntamente com as amostras em 3 concentrações,
em triplicata. As placas foram incubadas em estufa BOD a 28 ºC por 72 h. Como controle
positivo foram mantidos poços com 10 µg/mL de benzonidazol e com Triton TX-100 a
0,5%. Como controle negativo foram mantidos poços com parasito e DMSO a 0,5%. Após
esse período, brometo de etídeo foi adicionado a cada poço numa concentração de 2,5
µM. A leitura foi feita em espectrofotômetro utilizando comprimentos de onda de excitação
de 520 nm e emissão de 600 nm.
231
6.5.4. Determinação de ação tripanocida
A partir de uma cultura de T. cruzi com 24 h de incubação em meio LIT, foram
adicionadas em uma placa de 96 poços 1 x 106 células/200 μL para todos os poços. Em
seguida, adicionou-se 1 μM da série NO, DMSO ou o benzonidazol por 24 e 72 h. Os
parasitas vivos foram contados em uma câmara de Neubauer. Pelo menos três ensaios
foram realizados para cada substância e para cada dose. O EC50 foi determinado pelo
programa Prisma GraphPad 5.0.
6.5.5. Ensaio ELISA para detecção de IL-1β
Detecção de IL-1β nos sobrenadantes de macrófagos diferenciados por PMA (1uM)
e primados com LPS (100 ng/mL) previamente incubadas por 1 h na presença ou
ausência do fármaco. Posterior a esta incubação o ATP foi adicionado nos 30 min finais
de incubação até completar as 4 h de tratamento do LPS. Em seguida, o sobrenadante
recolhido dos tratamentos foi revelado seguindo as instruções do fabricante do kit ELISA
para detecção de IL-1β (eBioscience, San Diego, CA, USA).
6.5.6. Ensaio in vitro de farmacocinética e biodisponibilidade
6.5.6.1. Cultura de células Caco-2 e tratamento
A cultura das células Caco-2 (linhagem celular de adenocarcinoma de cólon humano)
foi similar ao descrito por Faria e colaboradores em 2018297 As soluções das borono-
tirfostinas 65a (NO-01) e 65c (NO-12), do propranolol e da vimblastina foram preparadas
com tampão de permeabilidade em uma concentração de 100 μM e 0,5% (v/v) de DMSO.
As soluções foram tamponadas em pH 7,4 ou 6,5. Após incubação das células Caco-2
por 30 min, 0,3 mL do tampão foi retirado dos poços apicais, sendo substituído com as
soluções contendo as borono-tirfostinas por 60 min. A concentração de LY (Lucifer
Yellow) contida nos poços doadores e receptores foi medida através de um leitor de
232
microplacas M5 em um comprimento de onda de excitação de 485 nm e um comprimento
de onda de emissão de 530 nm.
6.5.6.2. Teste de solubilidade dependente de pH
A solubilidade dos compostos 65a (NO-01) e 65c (NO-12) foi avaliada na faixa de
concentração 1-250 μM utilizando-se 5 μL de DMSO em 995 μL de tampão (pH 2,0 =
ácido hidroclorídrico; pH 4,0 = 100 mM de tampão de citrato; pH 7,4 = 100 mM de tampão
de fosfato; pH 10,0 = hidróxido de sódio). Essa solução foi distribuída em uma placa de
96 poços na temperatura ambiente por duas horas. Os padrões de calibração foram
preparados utilizando-se 5 μL de DMSO em 995 μL de uma mistura de
acetonitrila/tampão (1:1). Após a centrifugação (10.000 rpm; 20 min; 25 °C), as amostras
foram diluídas em acetonitrila 1:1.
6.5.6.3. Avaliação da estabilidade microssomal de fígado
Microssomas de fígado de camundongo e de humano (0,5 mg/mL em 0,1 M tampão
de fosfato em pH 7.4), as borono-tirfostinas 65a (NO-01) e 65c (NO-12) (1 μM) e DMSO
(0,5 μM) foram pré-incubados a 37 °C antes da adição de 1 mM de NADPH para iniciar
a reação, totalizando um volume de incubação de 50 μL. Um tampão contendo 0,1 M de
fosfato com pH =7,4 foi usado com controle negativo. Os compostos Diazepam e
Verapamil foram usados como controle positivo para os microssomas de humano e
camundongo, respectivamente. Os fármacos foram incubados por 0, 5, 15, 30 e 45 min
com os microssomas, o controle negativo, menos o NADPH, foi incubado por 45 min. A
adição de 50 μL de metanol foi utilizada para parar a reação nos tempos apropriados. Em
seguida, as amostras foram centrifugadas (1640×g por 20 min à 4 °C) para precipitar as
proteínas. O clearance intrínseco (CLint) microssomal para os compostos 65a e 65c foi
calculado através das instruções dadas pelo Biosystem.297
233
6.5.7. Experimentos in silico
6.5.7.1. Ensaio das propriedades ADMET
O perfil farmacocinético e toxicológico dos derivados foi avaliado utilizando o
programa ADMET Predictor® (Simulation Plus).
6.5.7.2. Docking molecular
O programa Molegro Virtual Docker (MVD) 6.0 (CLC Bio, 8200, Aarhus, Dinamarca)
foi utilizado para realizar o acoplamento molécular. 298 O algoritmo de pontuação MolDock
[GRID] com uma resolução de grade de 0,30 Å e o algoritmo de busca MolDock Simplex
Evolution foram aplicados nas execuções. As cargas parciais do átomo foram atribuídas
de acordo com o esquema de cargas MVD. As interações eletrostáticas internas (ES), a
ligação interna de hidrogênio (HBond) e as torções de Sp2-Sp2 foram consideradas na
avaliação dos ligantes. Cada encaixe molecular foi realizado durante 200 execuções. Os
modos de ligação de poses dos ligantes foram selecionados com base na melhor
pontuação de rerank. O espaço de busca do raio de 15 Å foi inserido ao redor da área a
ser analisada no receptor P2X7. As moléculas ligantes foram encaixadas no local de
ligação do ATP conhecido.
6.5.8. Análise do edema de pata in vivo
Modelo de edema de pata/animais e grupo controle: no ensaio de edema de pata
foram utilizados camundongos (Swiss Webster) machos, pesando em média 30 g,
tratados com ração balanceada PURINA-LABINA, água, ad libitum, e ciclo claro-escuro
de 12 h. A realização destes ensaios está de acordo com CEUA-FIOCRUZ com o número
de licença LW-58/14. Modelo de edema de pata induzido pelo ATP extracelular: os
camundongos receberam injeção subplantar em uma das patas posteriores de ATP (10
mM/pata) no volume de 20 μL. A aplicação de solução de NaCl 0,9% foi feita na pata
contralateral. Anterior aos 60 min da aplicação do agente flogístico foram realizados os
234
tratamentos: controle NaCl 0,9% intraperitoneal, Diclofenaco 10 mg/Kg/intraperitoneal,
ATPox 10mg/Kg/intraperitoneal e, dos compostos antagonistas 65a (NO-01) e 65c (NO-
12) em diferentes concentrações (1 - 0,001 mg/Kg). Decorridos 60 min de pré-incubação
com os antagonistas e 60 min após a aplicação do ATP, foi realizada a leitura do volume
das patas com auxílio do aparelho pletismômetro (UGO-BASILE).
235
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260
APÊNDICE A
Tabela A1 - Valores de comprimento de ligação médio da literatura268
Ar (C=C)
C=C
C≡N
B-O
B-C
Literatura
1,384
1,331
1,136
1,350
1,580
Tabela A2 - Comprimento de ligação do NO-01 (65a)
Ligação
Comprimento
(Å)
Ligação
Comprimento
(Å)
O1 - B1
1,340(3)
C4 - C5
1,404(3)
O2 - B1
1,366(3)
C5 - C6
1,382(3)
N1 - C9
1,142(3)
C1 - C6
1,385(3)
N2 - C10
1,144(3)
C4 - C7
1,450(3)
C1 - B1
1,576(3)
C7 - C8
1,350(3
C1 - C2
1,399(3)
C8 - C9
1,433(3)
C2 - C3
1,379(3)
C8 - C10
1,441(3)
C3 - C4
1,396(3)
Tabela A3 - Comprimento de ligação do NO-03 (65b)
Ligação
Comprimento
(Å)
Ligação
Comprimento
(Å)
O2 - B1
1,357(11)
C3 - C4
1,383(11)
O1 - B1
1,345(12)
C4 - C5
1,385(11)
N1 - C9
1,145(11)
C5 - C6
1,381(11)
N2 - C10
1,131(11)
C3 - C7
1,442(11)
C1 - B1
1,586(12)
C7 - C8
1,356(11)
261
C1 - C2
1,377(11)
C8 - C9
1,426(12)
C1 - C6
1,393(11)
C8 - C10
1,431(12)
C2 - C3
1,398(11)
Tabela A4 - Comprimento de ligação do NO-12 (65c)
Ligação
Comprimento
(Å)
Ligação
Comprimento
(Å)
O2 - B1
1,354(3)
C1 - C6
1,402(3)
O1 - B1
1,354(3)
C4 - C7
1,462(3)
N1 - C9
1,144(3)
C7 - C8
1,348(3)
C1 - B1
1,578(3)
C8 - C9
1,427(3)
C1 - C2
1,380(3)
C8 - C10
1,494(3)
C2 - C3
1,385(3)
C10 - O3
1,330(3)
C3 - C4
1,400(3)
C10 - O4
1,197(3)
C4 - C5
1,381(3)
C11 - O3
1,459(2)
C5 - C6
1,388(3)
C11 - C12
1,503(3)
Tabela A5 - Comprimento de ligação do NO-13 (65d)
Ligação
Comprimento
(Å)
Ligação
Comprimento
(Å)
O2 - B1
1,367(8)
C1 - C6
1,393(8)
O1 - B1
1,349(8)
C3 - C7
1,460(8)
N1 - C9
1,137(8)
C7 - C8
1,347(8)
C1 - B1
1,572(8)
C8 - C9
1,433(8)
C1 - C2
1,393(8)
C8 - C10
1,494(8)
C2 - C3
1,382(8)
C10 - O3
1,313(7)
C3 - C4
1,413(8)
C10 - O4
1,210(7)
C4 - C5
1,382(8)
C11 - O3
1,460(7)
C5 - C6
1,371(8)
C11 - C12
1,495(9)
262
263
Figura A1 - Interações do NO-01 (65a)
Figura A3 - Interações do NO-04 (64a)
Figura A2 Interações do NO-03 (65b)
Figura A4 - Interações do NO-05 (64b)
264
Figura A5 - Interações do NO-06 (64c)
Figura A7 - Interações do NO-08 (64e)
Figura A6 - Interações do NO-07 (64d)
Figura A8 - Interações do NO-11 (64f)
265
Figura A9 - Interações do NO-12 (65c)
Figura A10 - Interações do NO-13 (65d)
APÊNDICE B
Accepted Article
Title: Synthesis and evaluation of anticancer and trypanocidal activities of boronic tyrphostins
Authors: Daniela Martins, Noemi Hiller, Nayane Silva, Robson Farias, André Souza, Jackson
Resende, André Farias, and Nelilma Romeiro
This manuscript has been accepted after peer review and appears as an Accepted Article
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Synthesis and evaluation of anticancer and trypanocidal activities
of boronic tyrphostins
Noemi de J. Hiller,[a] MSc. Nayane A. A. e Silva,[a] DSc. Robson X. Faria,[b] DSc. André
Luís A. Souza,[c] DSc. Jackson A. L. C. Resende,[d] MSc. André Borges Farias,[e] DSc. Nelilma
Correia Romeiro,[e] DSc. Daniela de Luna Martins*[a]
[a]
Research Group on Catalysis and Synthesis (CSI), Universidade Federal Fluminense, Laboratório 413, Instituto de
Química, Campus do Valonguinho, Centro, Niterói, RJ 24020-141, Brazil, dlmartins@id.uff.br (ORCID: 0000-0001-6657-
040X)
[b]
Laboratory of Toxoplasmosis and other Protosooses – Oswaldo Cruz Institute (Fiocruz), Brasil
[c]
Laboratory of Biochemistry of Peptides, Oswaldo Cruz Institute (Fiocruz), Brazil.
[d]
Laboratory of Solid State Chemistry Universidade Federal do Mato Grosso, Instituto de Ciências Exatas e da Terra,
Campus Universitário do Araguaia, Barra do Garças – MT, 78600-000, Brazil.
[e]
Núcleo de Pesquisas em Ecologia e Desenvolvimento Social (NUPEM), Universidade Federal do Rio de Janeiro, Campus
de Macaé, Av. Rotary Club s/n; São José do Barreto, Macaé, RJ 27901-000, Brazil.
Supporting information for this article is given via a link at the end of the document.
Abstract: Molecules containing the aryl-cyanovinyl moiety are
known as tyrphostins because of their action inhibiting proteins
from the tyrosine kinase family, an interesting target for the
development of anticancer and trypanocidal drugs. In the present
work, E- (cyanovinyl)benzeneboronic acids were synthesized by
Knoevenagel condensations without catalysts, and in water;
through a simple protocol that completely avoided the use of
organic solvents in the synthesis and in the work-up process. In
vitro anticancer and trypanocidal activities of the synthesized
boronic acids were also evaluated demonstrating that the
introduction of the boronic acid functionality can improve the
activity of the boronic tyrphostins. In silico target fishing using a
Chemogenomic approach suggested the tyrosine-
phosphorylation-regulated kinase 1a (DYRK1A) as a potential
target for some of the designed compounds.
Introduction
Boronic acids are boron organometallics which have a
B(OH)2 unit attached to an organic group (R-B(OH)2).[1]
Although they were firstly reported in 1860, by Frankland and
Duppa,[2] boronic acids have just gained notoriety after the
development of the palladium-catalyzed Suzuki-Miyaura C-C
couplings.[3,4]
Until recently, the application of boronic acids in
medicinal chemistry was very restricted to their uses as
chemosensors[5] or as reagents for the synthesis of active
molecules.[6] In 2003, however, bortezomib (Figure 1) was
approved for the treatment of people affected by multiple
myeloma (MM), a type of blood cancer whose development
takes place in the bone marrow.[7] Bortezomib is marketed as
Velcade by Millennium Pharmaceuticals and, according to
Global Data, along with lenalidomide, it dominates the MM
markets, tending to grow between 2013 and 2023 while being
among the top 50 pharmaceutical products by global sales.[8]
The entry of bortezomib into the pharmaceutical market
provided the necessary confidence regarding the safety in the
use of organoborons as pharmaceuticals and boosted
research in both academia and industry for new bioactive
boronic acids.[9]
Figure 1. Structure of bortezomib
The expansion of the applicability of boronic acids
comes from their unique features which enable the
development of antibody mimics in the recognition of
biologically relevant sugars and potent enzyme inhibitors.
Carbon and boron have many similarities in terms of their
structures and electronic aspects, but they are different in
terms of reactivity. Therefore, boron mimics carbon in binding
processes, but not in the reactivity. This is one of the
foundations upon which the construction of protease inhibitors
analogues of transition states is based. In the process of
amide bond hydrolysis, a trigonal planar (sp2) carbon is
transformed into a tetrahedral (sp3) intermediate (Scheme
1A). In boronic acids, boron is trigonal planar (sp2) with an
open shell: boron has an empty p orbital perpendicular to the
attached groups. Depending on the nature of the organic
group attached to boron, the pKa of the arylboronic acids can
vary from 4.5 to 8.8. Hence, under physiological conditions,
boronic acids can be converted from the neutral and trigonal
planar (sp2) to the tetrahedral (sp3) boron (Scheme 1B), what
can naturally lead to an analogy with the process of amide
bond cleavage by hydrolases in the body (Scheme 1A).
Another important characteristic of boronic acids is their
ability to make hydrogen bonds and covalent bonds with
Lewis bases, providing an interesting platform for binding to
the active centre of enzymes,[9c] making of the boronic moiety
an interesting auxophoric group in the rational drug design.
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Scheme 1 - Conversion of the boron atom from sp2-hybridized neutral
form to sp3-hybridized anionic form (analogous to the transition state of
hydrolases)[9,10]
Several arylboronic acids with anticancer activity are
reported in the literature.[11] Combrestatins are cis-stylbenes
with anticancer properties. Nakamura and his group[12] have
introduced a boronic acid group into the aromatic ring B of
combrestatins and obtained boronic combrestatins with an IC50
value of 0.0063 μM against B-16 cells. These boronic acids
inhibited tubulin polymerization in vitro. Introduction of B(OH)2
units into the aromatic rings of chalcones has also been
successfully used as a strategy to obtain chalcones with
anticancer activity.[13]
Steroid sulfatase (STS) is an enzyme associated to the
steroid sulphates metabolism and its inhibition is considered an
interesting strategy for the development of anticancer drugs for
the cases where the tumor growth depends on estrogen
stimulation. Taylor and co-workers[14] substituted hydroxyls
bonded to aromatic rings of known STS inhibitors by a B(OH)2
unit
and observed an increased potency (23-fold higher than the
original inhibitors). In this case, the way by which STS was
inhibited was also changed.
There are evidences of the implication of EGFR
(Epidermal growth factor receptor tyrosine kinase) in the
pathogenesis of several types of carcinoma. Nakamura’s
group[15] has introduced a B(OH)2 unit on the aromatic ring of 4-
anilinoquinazoline. The resulting boronic acid inhibited EGF-
mediated phosphorylation of EGFR tyrosine kinase, as well as
presented a prolonged action time which was attributed to the
formation of a covalent B-O bond with Asp800 and hydrogen
bonds with Asp800 and Cys797. In another work, Nakamura’s
team substituted the hydroxyl of the tyrosine kinase inhibitor
lavendustin, obtaining a boronic acid which selectively inhibited
EGFR (1.0 µg/mL).[16]
Several arene vinylnitriles are referred as members of the
tyrphostins family (tyrosine phosphorylation inhibitors) due to
their inhibitory effect on the transduction signals via EGFR
(epidermal growth factor receptor).[17] Tyrosine kinases[18] are
involved in the activation of many proteins by signal
transduction cascades, when inhibiting protein phosphorylation.
Many of the processes involved in the growth, progression,
angiogenesis and metastasis of tumors are blocked by the
inhibition of receptors of the tyrosine-kinases family.
Consequently, kinases have become an important target for
cancer therapy.
Trypanosoma cruzi (T. cruzi) is the etiological agent of
Chagas disease, a widespread neglected disease in Latin
America. Nifurtimox and benznidazole are two old drugs used
in chemotherapy which display several side effects, are
effective only in the acute phase and almost ineffective in the
chronic cases. Additionally, drug-resistance has been reported
for some trypanosome strains.[19] Therefore, it is of outmost
importance to develop new, safer and more efficient drugs for
Chaga’s disease chemotherapy. Souza and his co-workers[20]
portrayed the importance of tyrosine-kinases in the invasion of
T. cruzi into primary resident macrophages and they have also
found that tyrphostin 23 (3, Figure 2) inhibited trypomastigote
uptake.
Figure 2 –
Structure of arene vinylnitriles
Considering the potential of aryl-cyanovinyl compounds
as anticancer and trypanocidal agents, frequently related to
the inhibition of tyrosine kinases; and the anticancer and
trypanocidal activity of bortezomib and several arylboronic
acids, we decided to attach the boronic moiety to the core
structure of aryl- cyanovinyl compounds and evaluate the
effect of this hybridization into the anticancer and trypanocidal
activities of the resulting compounds. Additionally, a target
fishing study was performed with the aim of investigating the
binding potential of the aryl-cyanovinyl towards tyrosine
kinases and docking studies were conducted as well to
hypothesize their binding mode with the potential targets.
Results and Discussion
Knoevenagel condensations
Knoevenagel condensation[21, 22] is traditionally
performed in the presence of catalysts such as amines
(aromatic or aliphatic), ammonium salts, or alkali metal
hydroxides in organic solvents.[23] Although the solventless
mechanochemical approach is useful for the active reagents,
organic solvents are employed to remove the products from the
reaction mixtures.[24]
In the 1980s, Breslow[25] demonstrated that hydrophobic
effects could greatly enhance the rate of organic reactions
carried out in aqueous medium. Recently, in order to solve the
drawbacks associated with the use of water as reaction
medium, such as hydrolysis or decomposition, experimental
procedures included the employment of surfactants, benign
co-solvents, and microwave or ultrasound irradiation. The
applications of aqueous chemistry protocols are highly
desirable since water is cheap, non-flammable, nontoxic and
plentifully available. Therefore, the use of water in organic
synthesis has attracted a great deal of attention. Furthermore,
it has already been shown that water is an interesting solvent
for Knoevenagel condensations.[26]
In the present work, aryl-cyanovinyl compounds were
prepared by Knoevenagel condensation between aromatic
aldehydes and nitriles containing active methylene (Scheme 2)
in aqueous conditions.[27] The aryl-cyanovinyl compounds
containing the boronic moiety were prepared using the
corresponding formylbenzeneboronic acids. Although boronic
acids are the main focus of the present work, other
cyanovinylbenzenes were also prepared for comparison, with
the aim of evaluating the role of boronic acids in the biological
activities as well as the effect of the boronic moiety on the
properties of the cyanovinyl compounds. Reaction yields are
outlined in Scheme 2.
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Scheme 2. Synthesis of aryl-cyanovinyl compounds
Aryl-cyanovinyl compounds were obtained, without using
any catalyst or organic solvent, in high yields with a simple,
environmentally benign and efficient aqueous protocol where
products crashed out from the reaction mixture and were
isolated by vacuum filtration followed by washing with cold
water. Formylbenzeneboronic acids were stable in the reaction
conditions and no oxidation of the aldehydes to the
corresponding carboxylic acids was observed. Hydrolysis of
the ethyl esters was not observed.
Although other Knoevenagel aqueous protocols have
already been reported, it is important to highlight that boronic
acids were not evaluated in the previous works. Arylboronic
acids can undergo protodeboronations[28] in aqueous
conditions which results into undesirable products in Suzuki
cross-couplings and pH of the reaction mixture can influence
the rate of the C-B bond break. In the present work, high yields
were achieved using the aqueous protocols in Knoevenagel
with malononitrile and ethyl cyanoacetic acid. In these cases,
no deboronation has been detected.[29]
Under the conditions employed in the present work,
products crashed out from the reaction mixture, being obtained
in high purity by filtration (>98% by NMR, aldehyde the unique
contaminant). Tedious separation of the products is common
for Knoevenagel reactions under classic conditions using
organic solvents and organic bases. Boronic acids, because of
their polar B(OH)2 units, are highly retained by silica in column
chromatography purification. Besides that, boroxines
(oligomeric anhydrides produced by dehydration) can be
formed using organic solvents like toluene or acetonitrile under
reflux, or in the process of removing these solvents by
distillation. Therefore, usage of the aqueous protocol reported
in the present work resulted only in boronic acids instead of the
corresponding anhydrides or a mixture between the acids and
the anhydrides.
Excess of malononitrile or cyanoacetate was not
necessary. When malononitrile was employed in excess, a
yellow unidentified byproduct was generated which was
difficult to remove from the boronic products by
recrystallization and with a retention factor near to the product
in silica TLC plates.
In the case of the derivatives of ethylcyanoacetate or
cyanoacetic acid (entries 9-11), although it is possible to obtain
diastereoisomers E and Z, only one diastereoisomer (E) was
detected in the 1H-NMR spectrum. The assignment of the E
configuration by NMR was confirmed by X-ray diffraction of
single crystal (Figure 3), Figures S1-S3 – Supplementary
material).
For biological tests, products were subjected to
recrystallization in ethanol/water or acetone/water mixtures.
It was not possible to obtain the cyanovinyl product (NO-
16) from the reaction between 4-formylbenzeneboronic acid
and the cyanoacetic acid and low reaction yield was achieved
for the product (NO-15) of the reaction of 3-
formylbenzeneboronic acid with the cyanoacetic acid (entry
11). Other reaction conditions were applied[30,
31] in the attempt
to obtain NO-15 and NO-16, but they were not successful as
well.
NO-01
Figure 3 –
ORTEP represen tations (50% probability ellipsoids) of the
molecular struc ture of the boronic acid
NO-01
Target Fishing using a Chemogenomics
Approach
In an effort to provide additional support to the
potential binding of aryl-cyanovinyl compounds to tyrosine
kinases we have performed Chemogenomics studies,
which have been successfully applied in a variety of in silico
target fishing approaches.[32], [33] The results showed a few
potential targets belonging to the large protein kinase
family, among others (Supplementary Material). One of the
targets that have been suggested for the designed
compounds, including NO-01 and and NO-03, was dual
specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase 1a
(DYRK1A). This tyrosine kinase belongs to the dual
specificity tyrosine (Y) phosphorylation regulated kinase
(DYRK) family which is known to be activated through
autophosphorylation of tyrosine residues in the activation
loop and that phosphorylates their substrates on serine and
threonine residues.[34] In addition, its role in cancer has
been investigated by a number of groups,[35] and its action
on EGFR signaling regulation has been highlighted.[36]
Although it is true that chemogenomics results depend on
the molecular scaffolds originally used to classify the ligands
into their protein targets and that this influences the
prediction results in target fishing of molecules not yet
tested for their isolated targets, they give us extra support
to the original design idea behind the set of molecules
presented in this work.
Molecular Docking
In order to try to hypothesize the binding mode of the
designed compounds with tyrosine kinases, we have
selected DYRK1A to perform docking studies. ChemPLP
function generated rmsd values in the redocking of co-
crystallized ligands below 0.5 Å and thus was chosen for
this study (data not labelled). Figure 4 shows NO-01, a
representative of the planned boronic acid compounds, in
the active site of DYRK1A. The theoretical binding pose of
NO-01 shows hydrogen bond interactions of the yanovinyl
groups with LYS188 and with the –NH group of the
backbone of ASP307, which belongs to the catalytic triad
(DFG). Also, NO-01 makes hydrogen bonds involving the
boronic acid function, the –NH group of LEU242 and the
side chain of SER242. Finally, Van der Waals interactions
involving the aromatic ring of NO-01, VAL173 LEU241,
LEU294 and PHE238 in the active site can be suggested
(Figure 8). It is worth of note that the studied compounds
present, in general, a similar putative binding mode, in spite
of the structural differences (Supplementary Material S23-
S36).
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Table 1 – Antiproliferative effects of vinylnitriles
Figure 4 – Putative binding pose between NO-01 and DYRK1A as
suggested by docking studies. Hydrogen atoms have been omitted for
clarity. Hydrogen bonds are shown in blue dashed lines.
Biological assays
Aryl-cyanovinyl compounds with different substitution
patterns on the aromatic rings were evaluated with respect to
their anticancer and trypanocidal activity in order to compare
and to investigate the effect of the introduction of the B(OH)2
moiety into the so- called tyrphostins. In addition, the toxicity
of the compounds in mammalian cell lines was also checked
out.
Toxicity assay in mammalian primary cell lines
Vinylnitriles-induced injuries to mice primary peritoneal
macrophages were tested in terms of the capacity of
decreasing resazurin. Viable cells whose metabolism is active
are capable of reducing resazurin (blue and weakly
fluorescent) into resofurin (pink and high fluorescent). The
number of viable cells present iin the sample can be quantified
since it is proportional to the resofurin produced. None of the
vinylnitriles displayed toxicity at the concentration of 100 µM,
when tested against wild primary mice peritoneal cells for 72 h
(Table 1). The macrophagic cell line J774.G8 was also
insensitive to the treatment with the vinylnitriles (Table 1). Rat
GH3 derived from pituitary tumor cell line was partially affected
by NO-04 (G1 = CN, G = H) derivative with resazurin reduction
of 50%. The derivatives NO-11 (G1 = CN, G = 3-NO2) and
NO-12 (G1 = CO2Et, G = 4-B(OH)2) were more effective
reducing the proliferation in 23.56 % and 32.87 %, respectively
(Table 1). None of the other NO derivatives damaged the
proliferative activity of GH3 cells. With respect to the human cell
line U937, obtained from histiocytic lymphoma, four NO
derivatives: NO-05 (G1 = CN, G = 4-OMe), NO-06 (G1 = CN,
G = 4-Me), NO-11 (G1 = CN, G = 3-NO2), and NO-13 (G1 =
CO2Et, G = 3-B(OH)2), displayed potent effects, resulting in a
decrease of the cell viability in more than 80% (Table 1).
Treatments % proliferation after 72 h
a[NO] = 100 M. Vinylnitries-induced injury. Mice peritoneal macrophages, murine
J774.G8 cells, rat GH3 cells and human U937 cells were treated with the compounds NO
(100 M) for 72 h. Citotoxicity was measured using resazurin reduction to resofurin as a
proliferation index. Data shown are mean SD of four independent experiments.
The derivatives with action against GH3 and U937 cells
were tested in increasing doses for 72 h of exposition. We
tested these substances in peritoneal macrophages as a
health control. The derivatives NO-04 and NO-11 and NO-12,
added in the presence of GH3 cells, gave IC50 values of 0.29
± 0.01 µM, 0.12 ± 0.06 µM and 0.14 ± 0.09 µM, respectively
(Table 2). The boronic acid NO-12 (G1 = CO2Et, G = 4-
B(OH)2), was extremely potent against GH3 cells (IC50 = 90
nM). Similarly, the nitrated compound NO-11 exhibited potency
comparable to NO-12. Although the compound NO-04 (G1 =
CN, G = H), whose aromatic ring has no substituents, also
reached high efficiency, with action in nanomolar
concentration; its effect was inferior compared to the nitro-
substituted NO-11 and the boronic acid NO-12. These data
suggest that hydrogen bonding donor or acceptor groups are
important for the molecular recognition of these compounds.
These results revealed boronic acids as relevant candidates to
develop molecules against the pituitary tumor. In relation to
the human U937 cells, NO-05, NO-06, NO-11 and NO-13
exhibited IC50 values of 0.88 ± 0.02 µM, 0.69 ± 0.07 µM, 0.47
± 0.08 µM and 9.83 ± 1.07 µM, respectively (Table 2). The
efficacies of NO- 05 (G1 = CN, G = 4-OMe), NO-06 (G1 = CN,
G = 4-Me) and NO- (G1 = CN, G = 3-NO2) were similar. Albeit
the boronic acid NO- 13 (G1 = CO2Et, G = 3-B(OH)2), has
demonstrated lower potency than NO-05, 06 and 11, its effect
indicates a potential to develop new boronic acids based upon
this structure. As we can observe from the Table 2 data, the
IC50 values in peritoneal macrophages were 60 to 2270 times
superior to that of the cancer lineages depending on the
derivative evaluated. Surprisingly, only the derivative NO-11
acted on rat GH3 and human U937 cell pointing to a
hypothetical general mechanism of action. In addition, this
derivative was the most potent in both cell lines (Table 2). In
contrast, the primary cell was extremely resistant to NO-11
toxicity when compared to the cancer lineages. NO-04 and
NO-12 exhibited selectivity for GH3 cells possibly acting on
EGFR or Ras signaling.[37] NO-05 and NO-06 were potent to
inhibit U937 growth. Although NO-13 was not the most potent,
this derivative demonstrated selectivity for U937 cell lineage.
This cell type express EGFR,[38a] FES tyrosine kinase[38b] and
Syk protein tyrosine kinase, enzymes that can be targets for
NO-05, 06 and 13.
Peritoneal
Macrophagesa
J774.G8 cells
GH3 cells
U937 cells
No treated
100.38 ± 0.4
99.81 ± 0.13
110.58 ± 0.05
95.43 ± 1.65
cells
0.1% Triton
12.77 ± 1.01
16.64 ± 1.18
14.40 ± 2.5
13.07 ± 2.22
X-100
NO-01a
99.51 ± 0.33
100.44 ± 0.11
100.07 ± 0.4
98.10 ± 1.04
NO-03a
100.05 ± 0.12
99.70 ± 0.07
99.80 ± 0.3
96.31 ± 1.33
NO-04a
99.35 ± 0.56
102.68 ± 0.03
50.13 ± 3.5
91.01 ± 3.08
NO-05a
105.75 ± 0.1
100.65 ± 0.06
99.40 ± 1.09
17.87 ± 2.79
NO-06a
99.69 ± 0.06
102.53 ± 0.05
93.28 ± 1.88
16.28 ± 1.36
NO-07a
100.43 ± 1.26
94.65 ± 0.08
99.78 ± 0.8
92.01 ± 2.8
NO-08a
100.52 ± 0.47
100.25 ± 0.02
97.75 ± 0.06
97.23 ± 1.51
NO-11a
99. 59 ± 0.22
100.23 ± 0.15
23.56 ± 2.11
14.29 ± 3.32
NO-12a
99.37 ± 0.71
99.93 ± 0.44
32.87 ± 1.93
82.95 ± 3.71
NO-13a
99.38 ± 0.46
98.95 ± 0.2
100.20 ± 0.99
18.95 ± 0.52
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Nitrile analogues dose response relationship. Rat GH3 cells were treated with the
compounds NO-4, NO-11 and NO-12. U937 cells were treated with NO-5, NO-6, NO-11
and NO-13. Peritoneal macrophages were treated with all NO derivatives above. For all
cell types tested, the concentrations tested range from 1 nM to 10 mM for 72 h.
Citotoxicity was measured using resazurin reduction to resofurin as a proliferative index.
Data shown are mean SD of four independent experiments.
Boronic acids may inhibit kinases associated to cancer
migration, generally associated to EGFR activation.[39] Thus,
this prominent activity observed for the boronic acid NO-12
may be due to a possible proliferation inhibition via EGFR, as
previously demonstrated in GH3 cells[40] and U937 cells.[41]
The absence of activity observed for the mice peritoneal
macrophages may be associated to a distinct EGFR function
or signalling regulation in this cell type.[42]
In vitro antiparasitic activity
The aryl-cyanovinyl compounds were investigated
regarding their effect on in vitro cultures of epimastigotes of T.
cruzi in comparison with benznidazole. Y strain was treated for
72 h with 100 µM solution of the cyanovinyl derivatives and its
viability was quantified by the MTT assay. Triton X-100 (0.1%)
and benznidazole (100 µM) were the positive controls to
reduce trypanossomes viability. No treated epimastigote forms
were considered as negative control. NO-03 (G1 = CN, G = 3-
B(OH)2), NO-04 (G1 = CN, G = H), NO-12 (G1 = CO2Et, G = 4-
B(OH)2) and NO-13 (G1 = CO2Et, G = 3-B(OH)2) reduced
trypanosome viability with similar statistical significance, but
NO-12 was the most potent derivative with action similar to the
positive control and benznidazole treatment (Figure 9). NO-05
and NO-06 derivatives diminished T. cruzi survival with a minor
efficacy than the previous NO-03, NO-04, NO-12 and NO-13
derivatives.
Dose-response curves were obtained after cells were
exposed to the vinylnitriles for 24 h. The EC50 values
achieved for NO-03, NO-04, NO-05, NO-06, NO-12 and
NO-13 were 14.5 µM; 10.2 µM; 530.6 µM; 508.4 µM;
0.795 µM and 78.4 µM, respectively (Figure 6). Among
the molecules tested, NO-12 showed a nanomolar potency
that resulted in T. cruzi death. Other boronic acids, like NO-
03 and NO-13 also exhibited good effects, albeit in less
potency than NO-12, and with NO-13 presenting better
performance than NO-03. These results indicate boronic
acids as effective platforms upon which new molecules with
improved actions against T. cruzi can be designed. Also, it
seems that the mechanism of action is more favoured with
para- substituted boronic acids with ester-substituted vinyl-
nitriles. The EC50 value measured for NO-12 (0.795 µM)
was more than 10 times superior to the EC50 described for
benznidazole[43] and more than 4 times superior to the EC50
of nifurtimox,[44] both drugs used in the current therapy of
Chagas disease. The boronic acid NO-12 exhibited lower
potency than bortezomib[45] and DDD85646, both strong
proteasome inhibitors with trypanocidal activity against T.
brucei.[46] A possible reason for this may be attributed to the
difference between the trypanosome strains and/or to a
different mechanism of action. Considering the observed
trypanocidal activities of some boronic acids synthesized in
the present work, especially that of the NO-12, it is
necessary to highlight the potentiality of the vinylnitriles
containing the boronic acid moiety as a new avenue for the
development of new drugs with trypanocidal action.
(10uM NO- analogues) - 72h - Y strain
Negative Control
Positive Control
NO-1
NO-3
NO-4
NO-5
NO-6
NO-7
NO-8
NO-11
NO-12
NO-13
Benznidazol (100uM)
0
20
40
60
80
100
*** ***
***
***
***
* *
***
***
n.s.
n.s.
Treatments
% Trypanocidal activity
Figure 9. Trypanocidal activity (72 h, [vinylnitriles] = 100 µM, Y strain,
n= 3). Graphic representative of triplicate treatments in 4 distinct days.
***p < 0.01 relative to negative control, *p < 0.05 relative to negative
control; n.s. no statistical difference in relation to positive control or
benznidazole.
Y strain - 24h
-10 -8 -6 -4 -2
0
20
40
60
80
100
NO-4
NO-3
NO-5
NO-6
NO-12
NO-13
Benznidazole
[Drug] M
% Trypanocidal activity
Figure 10. Trypanocidal activity in 72 h (100 µM vinylnitriles, n=3, Y strain).
This graph is representative of triplicate treatments in 4 distinct days. ***
p<0.01 in relation to negative control, * p<0.05 in relation to negative
control; n.s. no statistical difference in relation to positive control or
benznidazole.
It is interesting to note that, in the case of trypanocidal
activity, most of the tyrphostins that showed activity contain the
B(OH)2 unit in their structure. Although the rationale of the work
was based on the possible inhibitory action against tyrosine
kinases, other important targets for T. cruzi may also be
involved. Since the annotation of the T. cruzi genome (2004),
proteases have emerged as potential drug targets because of
the important roles they have in the protozoa metabolic
pathways.[47] [46] Serine proteases are involved in host cell
invasion. Metallopeptidases and proteasome (threonine
proteases) also correlates with the parasite’s virulence.[46b]
Arylboronic acids, due the characteristics mentioned before,
mimics the transition states of serine and threonine proteases
since boron binds strongly to oxygen nucleophiles as serine
and threonine residues.[49] There are several reports about the
inhibition of proteases by arylboronic acids and other classes
of boron compounds.[49a]
Cruzain is a cysteine protease with essential action for
virulence of T. cruzi and which are present in all stages of life
of the parasite. Cruzain is considered an important target for
the development of antichagasic agents.[50] It is known that
Peritoneal
macrophages
IC50 (M)
GH3 cells
IC50 (M)
U937 cells
IC50 (M)
NO-04
99.63 8.54
0.29 0.01
-
NO-05
147.77 14.73
-
0.88 0.02
NO-06
41.87 8.76
-
0.69 0.07
NO-11
372.31 11.08
0.12 0.06
0.47 0.08
NO-12
387.87 7.28
0.14 0.09
-
NO-13
78.91 6.45
-
9.83 1.07
Table 2 – Dose-response effects of vinylnitriles against mammalian cells
proliferation
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Michael acceptors, such as vinyl sulphones, for example, are
irreversible inhibitors of this protease. In addition, compound
K777 is a Michael acceptor in the preclinical stage.[51]
Tyrphostins also belong to the Michael acceptor class and in
this case, the thiol group present on the active site of cruzain
can attack the vinylic carbon with formation of a S-C bond
between the enzyme and the inhibitor (Scheme 3A).
Dipeptidylnitriles, for example, are inhibitors of cysteine
proteases which contain a nitrile as warhead. In this case, the
attack of the thiol group present in the active site of the enzyme
interacts with the nitrile group resulting in a thioimidate
intermediate (Scheme 3B). Dipeptidilnitriles are known
reversible inhibitors of cruzain.[52] Therefore, the nitrile group
of the tyrphostins can, in principle, be a point of interaction with
cruzain.
Scheme 3 –
Possible interactions between tyrphostins and cruzain
Differently from what occurs with serine and threonine
proteases, boronic acids are not considered transition state
analogue inhibitors of cysteine proteases of the papain
family such as cruzain.[53] According to our results, however,
the boronic acids presented better profile than the
typhostins that did not contain the boronic group in their
structure. In this case, we hypothesize that, if cruzain is a
target for the boronic tyrphostins prepared in the present
work, the boronic acid should act as an auxophoric group.
In future works, our group intends to better investigate
the probable targets for these boronic acids in order to
design optimized new compounds by taking NO-01, 03 and
12 as prototypes.
Conclusions
Knoevenagel condensations under aqueous conditions
were found to be an excellent protocol to obtain
benzenevinylnitriles containing the boronic acid unit in high
purity levels, since organic solvents were completely avoided,
also in the work-up procedure. E-aryl-cyanovinyl compounds
were obtained in high yields (81- 98 %), except for the
derivative of the cyanoacetic acid NO-15 (20 %). Four of the
five benzenevinylnitriles containing the boronic acid unit
crystallized as single-crystals. The hybridization strategy of the
boronic acid and tyrphostins in the same molecular structure
resulted in good biological activities. NO-12 (G1 = CO2Et and
G = 4-B(OH)2) exhibited high antiproliferative potential (0.14
± 0.09 µM) against cell lines GH3, from rat pituitary tumor.
NO-13 (G1 = CO2Et and G = 3-B(OH)2); although with a
smaller potency in comparison to the 4-methoxy, 4-methyl and
3-nitro-substituted compounds, also displayed antiproliferative
activity against the human leukemic monocyte lymphoma cell
line U937. Three of the boronic acids (NO-03, NO-12 and NO-
13) displayed antichagasic in vitro activity, with the compound
NO-12 showing an EC50 value (0.795 µM) ten times lower than
benznidazole (EC50 = 40 µM), the current drug employed in
the chemotherapy of Chagas disease. Chemogenomics
studies reinforced our expectations that kinases might be the
targets of some of these compounds in cancer cell lines.
Docking studies with DYRK1A, a phosphorylation regulated
kinase, indicated that the boronic acid-containing compounds
such as NO-01, NO-03 and NO-12 can bind to the active site
of this protein. Further investigations will be conducted to
understand which targets of boronic tyrphostins are
responsible for the trypanocidal activities found, in order to
better plan new boronic acids using the NO series as
prototypes.
Experimental Section
Chemicals were purchased from Sigma Aldrich and
Boron Molecular and used without further purification. The
synthesized products were characterized by analysis of their
spectral data (FT-IR and NMR) and by X-ray diffraction.
Infrared spectra were measured using KBr pellets on a Varian
FT-IR 660 spectrophotometer. 1H (500 or 300 MHz) and 13C
(125 or 75 MHz) spectra were recorded on a Varian VNMRS
spectrometer in DMSO-D6 or CDCl3 solution. The chemical
shift data are reported in units of (ppm), in the case of
CDCl3, the peaks appear downfield from tetramethylsilane,
which was used as an internal standard. Coupling constants
(J) are reported in Hertz and refer to apparent peak
multiplicities. The single-crystal X-Ray diffraction data were
collected on a Bruker D8- Venture X-ray single-crystal
difractometer equipped with a CMOS PHOTON100 using 1 S
microfocus MoKα (λ = 0,71073 Å) X-ray radiation. APEX2
software[54] were used to collect, reduce and integrate the
data. Using the SAINT software, the final unit-cell parameters
were determined and refined and the data was integrated.
Absorption correction was performed by a multi-scan method
implemented in SADABS.[55] The structures were solved by
the direct methods and were refined using full- matrix least-
square methods on Fo2 using the SHELX package.[56] All non-
H atoms were refined anisotropically. Hydrogen atoms were
placed in geometrically calculated positions and refined using
riding model. The reaction monitoring was accomplished by
TLC (thin-layer chromatography) on silica gel plates (Silicycle,
250 µm, F-254) and the plots were visualized using UV light or
iodine vapors. Melting points were recorded on a Fisatom
413D apparatus.
Typical Knoevenagel procedure – In a rounded-bottom flask were
added: active methylene containing compound (2 mmol), aldehyde (2
mmol) and distilled water (10 mL). The reaction mixture was
magnetically stirred at 80° C (oil bath) for 2.5-4.5 h. After the completion
of the reaction (TLC), the reaction mixture was cooled to room
temperature, then it was vacuum filtered and the solid obtained was
washed with cold water and dried under air. Boronic acid containing
cyanovinyl moieties were obtained in yields ranging from 84-91% as a
mean of triplicates.
(4-(2,2-dicyanovinyl)phenyl)boronic acid (NO-01): Product was
obtained according to the typical procedure in 2.5 h, as white solid in
86% yield (decomposes 301° C). δH (500 MHz; DMSO-d6; J in Hz)
8.52 (1H, s), 8.33 (2H, s), 7.98-7.95 (2H, d, J = 8.4 Hz), 7.90-7.88 (2H,
d, J = 8.3 Hz). δC (75 MHz; DMSO-d6) 161.5, 134.6, 132.3, 129.2,
114.1, 113.1, 81.8. IR (KBr) ʋmax/cm-1 1344 (B-O), 1590 (C-C), 2228
(C≡N), 2245 (C≡N), 3356 (OH, s), 3434 (OH, as).
Crystallographic data for NO-01: C10H7N2O2B, M = 197.99, colorless
block, size 0.75 × 0.29 × 0.07 mm3, T= 293(2) K, Monoclinic, space
group C2/c, a = 11.1500(8)Å, b = 10.0434(9)Å, c = 17.1086 (15) Å, β
= 92.084 (3)°, V = 1914.6 (3)Å3, Z = 8, Dc = 1.374g/cm3, µ =
0,096 mm−1, F(000) = 816, 11056 reflections measured, 1746
independent, with Rint= 0.079; 142 parameters; Final agreement
factors: R1 = 0.064 [F2 > 2σ(F2)], wR2 = 0.1694 and GOOF = 1.081.
Deposition Number CCDC: 1527385.
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(3-(2,2-dicyanovinyl)phenyl)boronic acid (NO-03): Product was
obtained according to the typical procedure in 2.5 h, as a white solid
in 91% yield (m.p. 265-268° C). δH (300 MHz; DMSO-d6; J in Hz) 8.52
(1H, s), 8.31 (1H, s), 8.26 (1H, s), 8.08-8.05 (2H, d, J = 7.4 Hz), 8.01-
7.99 (2H, d, J = 7.9 Hz), 7.58 (1H, t, J = 7.6 Hz). δC (75 MHz; DMSO-
d6) 162.0, 139.7, 136.7, 131.4, 130.5, 128.5, 114.2, 113.1, 81.1. IR
(KBr) ʋmax/cm-1 1357 (B-O), 1576 (C-C), 1597 (C-C), 2227 (C≡N), 2247
(C≡N), 3318 (OH, s), 3402 (OH, as).
Crystallographic data for NO-03: C10H7N2O2B.H2O, M = 216.00,
colorless block, size 0.22 × 0.07 × 0.06 mm3, T= 293(2) K, Triclinic,
space group P-1, a = 3.752(3)Å, b = 10.113(7)Å, c = 14.374(9)Å, α =
104.08 (2)°, β = 96.26 (2)°, ϒ= 94.47 (2)° V = 522.8 (3)Å3, Z = 2, Dc =
1.372g/cm3, µ = 0,101 mm−1, F(000) = 224, 9500
reflections measured, 1903 independent, with Rint= 0.1204; 150
parameters; Final agreement factors: R1 = 0.1304 [F2 > 2σ(F2)], wR2
= 0.3723 and GOOF = 1.227. Deposition Number CCDC: 1527386.
2-benzylidenemalononitrile (NO-04): Product was obtained
according to the typical procedure in 4 h, as white solid in 85% yield
(m.p. 82-84° C). δH (500 MHz; CDCl3; J in Hz) 7.92-7.90 (2H, d, J =
7.5 Hz), 7.78 (1H, s), 7.65-7.62 (1H, t, J = 7.5 Hz), 7.56-7.53 (2H, t, J
= 7.8 Hz). IR (KBr) ʋmax/cm-1 1450-1568 (C=C Ar), 2224 (C≡N), 3037
(sp2C-H). [57]
2-(4-methoxybenzylidene)malononitrile (NO-05): Product was
obtained according to the typical procedure in 4 h, as a yellow solid in
90% yield (m.p. 116-118° C). δH (500 MHz; CDCl3; J in Hz) 7.92-7.90
(2H, d, J = 8.9 Hz), 7.65 (1H, s), 7.02-7.01 (2H, d, J = 9 Hz), 3.92 (3H,
s). IR (KBr) ʋmax/cm-1 1195 (C-O), 1513-1605 (C=C Ar), 2224 (C≡N),
2854 (sp3 C-H), 3025 (sp2 C-H).[58]
2-(4-methylbenzylidene)malononitrile (NO-06): Product was
obtained according to the typical procedure in 2 h, as white solid in 98%
yield (m.p. 136-137° C). δH (300 MHz; CDCl3; J in Hz) 7.83-7.80 (2H,
d, J = 8.3 Hz), 7.72 (1H, s), 7.35-7.32 (2H, d, J = 8.1 Hz), 2.45 (3H, s).
IR (KBr) ʋmax/cm-1 1413-1589 (C=C Ar), 1605 (C=C), 2225 (C≡N). [59]
2-(4-(dimethylamino)benzylidene)malononitrile (NO-07): Product
was obtained according to the typical procedure in 5 h, as an orange
solid in 93% yield (m.p. 185-188° C). δH (300 MHz; CDCl3; J in Hz)
7.83-7.79 (2H, d, J = 9.0 Hz), 7.46 (1H, s), 6.71-6.67 (2H, d, J = 9.2
Hz), 3.14 (6H, s). IR (KBr) ʋmax/cm-1 1388, 1360 (C-N), 1614 (C=C),
2209 (C≡N).[58]
2-(4-chlorobenzylidene)malononitrile (NO-08): Product was
obtained according to the typical procedure in 4 h, as a white solid in
97% yield (m.p. 167-169° C). δH (300 MHz; CDCl3; J in Hz) 7.87-7.84
(2H, d, J = 8.4 Hz), 7.73 (1H, s), 7.54-7.50 (2H, d, J = 8.6 Hz). IR (KBr)
ʋmax/cm-1 1095 (Ar-Cl), 1409-1595 (C=C Ar), 2229 (C≡N).[58a], [59]
2-(3-nitrobenzylidene)malononitrile (NO-11): Product was obtained
according to the typical procedure in 4 h, as a white solid in 81% yield
(m.p. 104-106° C). IR (KBr) ʋmax/cm-1 1356, 1528 (N-O), 1596 (C=C),
2226 (C≡N). δH (300 MHz; CDCl3; J in Hz) 8.67-8.65 (1H, m), 8.49-
8.45 (1H, ddd, J = 8.3, 2.1, 0.9 HZ), 8.34-8.31 (1H, dt, J = 8.0, 0.7 Hz),
7.89 (1H, s), 7.82-7.76 (1 H, t, J = 8.1 Hz). IR (KBr) ʋmax/cm-1 1095 (Ar-
Cl), 1409-1595 (C=C Ar), 2229 (C≡N).[53b], [54a]
(E)-(4-(2-cyano-3-ethoxy-3-oxoprop-1-en-1-yl)phenyl)boronic acid
(NO-12): Product was obtained according to the typical procedure in
3.5 h, as a white solid in 84% yield (decomposes 242-243° C). δH (300
MHz; DMSO-d6; J in Hz) 8.37 (1H, s), 8.29 (2H, s), 7.99-7.97 (2H, d, J
= 8.4 Hz), 7.95-7.92 (2H, d, J = 8.4 Hz), 4.36-4.29 (2H, q, J = 7.1 Hz),
1.33-1.29 (3H, t, J = 7.1 Hz).δC (75 MHz; DMSO-d6) 161.7, 155.0,
134.5, 132.5, 129.5, 115.5, 102.9, 62.3, 13.91. IR (KBr) ʋmax/cm-1 1259
(O-C-C), 1336 (C-C(=O)-O), 1609 (C-C),1723 (C=O), 2239 (C≡N),
3363 (OH, s),3401 (OH, as).
Crystallographic data for NO-12: C12H12NO4B, M = 245.04, colorless
block, size 0.55 × 0.23 × 0.19 mm3, T= 293(2) K, Triclinic, space group
P-1, a = 7.5728(12)Å, b = 7.7133(9)Å, c = 11.3320(18)Å, α = 97.625
(3)°, β = 93.4877 (4)°, ϒ= 112.06 (6)° V = 603.62(15)Å3, Z = 2, Dc
=1.348g/cm3, µ = 0,100 mm−1, F(000) = 512, 5898 reflections
measured, 2097 independent, with Rint= 0.0369; 165 parameters; Final
agreement factors: R1 = 0.0447 [F2 > 2σ(F2)], wR2 = 0.1228 and
GOOF = 1.038. Deposition Number CCDC: 1527387
(E)-(3-(2-cyano-3-ethoxy-3-oxoprop-1-en-1-yl)phenyl)boronic
acid (NO-13): Product was obtained according to the typical procedure
in 4.5 h, as a white solid in 87% yield (m.p. 202-206° C). δH (300 MHz;
DMSO-d6; J in Hz) 8.36 (2H, s), 8.21 (2H, s), 8.11-8.09 (1H, d, J = 7.9
Hz), 8.02-8.01 (1H, d, J = 7.4 Hz), 7.58-7.54 (1H, t, J = 7.6 Hz), 4.36-
4.29 (2H, q, J = 7.1 Hz), 1.34-1.29 (3H, t, J = 7.1 Hz). δC (75 MHz;
DMSO-d6) 161.8, 155.5, 138.8, 137.1, 131.6, 130.5, 128.3, 115.4,
102.3, 62.29, 13.91. IR (KBr) ʋmax/cm-1 1208 (O-C-C), 1275 (C-C(=O)-
O), 1365 (B-O), 1598 (C-C),1723 (C=O), 3374 (OH, s),3460 (OH, as).
Crystallographic data for NO-13: C12H12NO4B, M = 245.04, colorless
block, size 0.28 × 0.08 × 0.06 mm3, T= 293(2) K, Monoclinic, space
group P21/n, a = 4.055(5)Å, b = 15.168(2)Å, c = 19.581(2)Å, β = 90.155
(5)°, V = 1204.4 (3)Å3, Z = 4, Dc =1.351g/cm3, µ = 0,100 mm−1, F(000)
= 512, 7527 reflections measured, 2120 independent, with Rint= 0.037;
170 parameters; Final agreement factors: R1 = 0.1013 [F2 > 2σ(F2)],
wR2 = 0.2716 and GOOF = 1.181. The structure of NO-13 was refined
as a pseudo merohedral twin (BASF = 0.110). Deposition Number
CCDC: 1527388
(E)-3-(3-boronophenyl)-2-cyanoacrylic acid (NO-15): Produced in
4.5 h as a white solid in 20% yield (m.p. > 300 ° C). δH (300 MHz;
DMSO-d6; J in Hz) 8.34 (1H, s), 8.30 (1H, s), 8,09-8.07 (1H, d, J = 7.6
Hz), 8.01-7.98 (1H, d, J = 7.5 Hz), 7.58-7.53 (1H, t, J = 7.5Hz). IR (KBr)
ʋmax/cm-1 1364 (B-O), 1504 (C-C),1691 (C=O), 2230 (C≡N), 3410 (OH).
Biological assays
Trypanosomatid cultures: T. cruzi epimastigote Y strains were
cultivated in LIT medium (Tryptose liver infusion) supplemented with
10% fetal calf serum. 106 parasites/mL were used and maintained at a
temperature of 28° C under strong agitation (100 rpm). These cells
were treated with boronic acids, DMSO or Benznidazole for 24 and 72
h and live parasites were counted using a Neubauer chamber. At least
3 independent experiments were performed for each drug and dose,
and the 50% effective concentration (EC50) was determined using
Prisma GraphPad 5.0.
Epimastigote viability assay: Formazan formation method was
used to measure cellular viability. MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-
2,5-diphenyltetrazolium bromide] assay, was used as previously
described.[60] Briefly, epimastigotes (1 x 107 cells/mL) were incubated
in RPMI 1640 culture medium at 37° C for 24 h. Boronic acids were
added at a final concentration of 10 µM and then incubated for 24 or
72 h. For this assay, we used concentrations range from 1 nM – 1 mM.
Formation of formazan was monitored at 570 nm in a multi-well reader
(Spectramax M5, Molecular Devices).
Cell cultures: We used 4-week-old Swiss Webster mice to
collect macrophages from peritoneal cavities. Macrophages were
centrifuged and counted using a Neubauer chamber, maintained in
serum-free medium for macrophages (Gibco, USA). These cells were
cultivated at 37° C in an atmosphere of 5% CO2 for 24 h until the
experimentation. Our protocols adhered to the Ethical Principles in
Animal Experimentation adopted by the Brazilian College of Animal
Experimentation and were approved by the Fiocruz Research Ethics
Committee (number L-039/2016).
This article is protected by copyright. All rights reserved.
FULL PAPER
J774.G8 cell line, a murine macrophage line is derived from
the original J774.A1 cell line from the American Type Cell Collection
(ATCC, Rockville, MD). GH3 cell line is derived from rat’s pituitary
tumor cell line and U937 is a human histiocytc lymphoma cell line. J774
and GH3 cells were cultured in Dulbecco's Modified Eagle's Medium
(DMEM) (Sigma, St. Louis, MO) and U937 cultivated in RPMI 1640,
both medium contained 10% fetal bovine serum (FBS) (Cultilab -
Campinas, Brazil). All cell types were maintained at 37° C in a
humidified atmosphere with 5% CO2. On reaching 80-90% confluence,
the cells were detached using a solution of 0.025% trypsin and 0.4%
EDTA (ethylene diamine tetraacetic acid) for 1 min.
Resazurin (Alamar Blue) proliferation assay: Reduction of
the dye resazurin to resorufin was used to measure proliferation of the
cell in cultures. Cells were seeded at 1 x 105 trypan blue excluding
cells/mL in 96-well microtiter plates. After incubating for 24 h, the
DMEM medium was removed and replaced with fresh medium
containing 40 µM resazurin, followed by an incubation period of 24 h,
after which reduction of resazurin to resorufin was determined by
fluorescence (excitation 530 nm; emission 590 nm) using a M5
microplate fluorometer (Molecular Devices, Florida, U.S.A.).
Appropriate cell free controls were included in the test to account for
potential interactions between the derivatives and resazurin.
Chemogenomics: The molecules were submitted to a
chemogenomics approach using protocols of PIDGIN software[61] for
structural similarity analysis of molecules with biological activity
described in the literature and ChEMBL database
(https://www.ebi.ac.uk/chembl/). Standardizer was used for structure
normalization of specific chemotypes, such as charges and tautomers
(ChemAxon Standardizer v.16.5.2.0, 2016,
http://www.chemaxon.com).
Molecular Docking: First, molecules were energy-optimized using
Gaussian 03W, v.6.0 and Hartree-Fock with 6-31G(d) basis set. GOLD
software v. 4.1.2 was used in docking studies.[62] Ten GA runs were
performed and “allow early termination” option has been disabled.
Visual inspection of intermolecular interactions was performed with
Pymol, v.1.8 and Discovery Studio, v.16.1.0.15350. Also, before
docking, determined some appropriate parameters were determined by
analysis of poses obtained by redocking of three different ligands co-
crystallized with DYRK1A (PDB codes 2WO6, 2VX3 and 4NCT;[63]
using Goldscore and ChemPLP scoring functions and different binding
site radii around the oxygen atom of GLU329, the reference atom in
the study.
Acknowledgements
We acknowledge CNPq/Universal (455739/2014-5), PIBIC-
UFF (for the student scholarship) and FAPERJ (Support for
Studies of Neglected and Reemerging Diseases – E-
26/010.001535/2014). We thank Elias Barreto for their
suggestions regarding the writing process.
Keywords: boronic acids • tyrphostins • anticancer •
trypanocidal • tyrosine kinases
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APÊNDICE C
Journal of Bioenergetics and Biomembranes
Robson Xavier Faria1,2 & Noemi de Jesus Hiller3 & Juliana Pimenta Salles1 &
Jackson Antonio Lamounier Camargos Resende4 & Roberta Tosta Diogo1,2 & Natalia Lidmar von Ranke2,5 &
Murilo Lamim Bello5 & Carlos Rangel Rodrigues5 & Helena Carla Castro2 & Daniela de Luna Martins3
Received: 14 January 2019 /Accepted: 26 May 2019
# Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature 2019
Abstract
The P2X7 receptor (P2X7R) is an ion channel which is activated by interactions with the extracellular ATP
molecules. The molecular complex P2X7R/ATP induces conformational changes in the protein subunits, opening
a pore in the ion channel macromolecular structure. Currently, the P2X7R has been studied as a potential
therapeutic target of anti-inflammatory drugs. Based on this, a series of eight boronic acids (NO) analogs were
evaluated on the biologic effect of this pharmacophoric group on the human and murine P2X7R. The boronic
acids derivatives NO-01 and NO-12 inhibited in vitro human and murine P2X7R function. These analogs
compounds showed effect better than compound BBG and similar to inhibitor A740003 for inhibiting dye uptake,
in vitro IL-1β release and ATP-induced paw edema in vivo. In both, in vitro and in vivo assays the compound NO-
01 showed to be the hit compound in the present series of the arylboronic acids analogs. The molecular docking
suggests that the NO derivatives bind into the upper body domain of the P2X7 pore and that the main
intermolecular interaction with the two most active NO derivatives occur with the residues Phe 95, 103 and 293
by hydrophobic interactions and with Leu97, Gln98 and Ser101 by hydrogen bonds.. These results indicate that
the boronic acid derivative NO-01 shows the lead compound characteristics to be used as a scaffold structure to
the development of new P2X7R inhibitors with anti-inflammatory action.
Keywords P2X7R . Boronic acids . Dye uptake . IL-1β release . Paw edema . Molecular docking
Electronic supplementary material The online version of this article(https://doi.org/10.1007/s10863-019-09802-x)
contains supplementary material, which is available to authorized users.
* Robson Xavier Faria salvador@ioc.fiocruz.br
Noemi de Jesus Hiller noemihiller@id.uff.br
Juliana Pimenta Salles julianasalles@id.uff.br
Jackson Antonio Lamounier Camargos Resende jresende@id.uff.br
Roberta Tosta Diogo robertadiogo@id.uff.br
Natalia Lidmar von Ranke natalialidmar@id.uff.br
Murilo Lamim Bello murilolamim@pharma.ufrj.br
Carlos Rangel Rodrigues rangel@pharma.ufrj.br
Helena Carla Castro hcrangel@ib.uff.br
Daniela de Luna Martins dlmartins@id.uff.br
1 Laboratory of Toxoplasmosis and Other Protozoans, Instituto Oswaldo Cruz, Avenida Brasil, 4365, Pavilion
108, room 32, CEP, Rio de Janeiro, Fiocruz 21045-900, Brazil.
2 Postgraduate Program in Sciences and Biotechnology, Instituto de Biologia, Universidade Federal
Fluminense, Niterói, RJ, Brazil
3 Research Group on Catalysis and Synthesis, Laboratory 413, Instituto de Química, Universidade Federal
Fluminense, Niterói, RJ, Brazil.
4 Laboratory of Solid State Chemistry, Instituto de Ciências Exatas e da Terra, Universidade Federal do Mato
Grosso, Barra do Garças, MT, Brazil.
5 Departamento de Fármacos e Medicamentos, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Rio de Janeiro, RJ, Brazil.
Introduction
P2X family takes part in the purinergic signaling network where ATP (adenosine 5′-triphosphate), other
nucleotides and nucleosides are the extracellular signaling molecules (Bartlett et al. 2014). Together with P2Y
family, P2X receptors are involved in the cellular response to extracellular ATP molecules (Baas 2012). P2X
receptors are trimeric ligandgated cation channels whose family consists of seven members of receptors (P2X1–
7). Comparatively, the monomeric unit of the P2X7 receptor (P2X7R) is the highest among members of the P2X
family. This subtype also differs from the others because it has a large number of amino acids residues in the
intracellular C terminus (Baas 2012; Burnstock and Knight 2018). P2X7R is present in many cell types including
hematopoietic lineages, epithelial and endothelial cells, fibroblasts, osteoblasts, astrocytes, Schwann cells, some
populations of neurons, and cells from microglia, among others (Bartlett et al. 2014).
Differently from the other members of the P2X family, P2X7R when activated for micromolar ATP
concentrations leads to the opening of the channels for the flux of small cations (Na+, K+ or Ca2+) through the
plasma membrane. When P2X7R is stimulated for high ATP concentrations (mM range) and, after prolonged or
repeated stimulation, thus a larger permeability state is reached forming or inducing a large conductance ionic
channel (Faria et al. 2017; North 2002). Molecules with a mass of up 900 Da can permeate the membrane by
these large pores, which makes possible the liberation of inflammatory cytokines (Young and Górecki 2018).
Activation of P2X7R gives rise to a sequence of signaling events, which are reliant on the cell type expressing
this receptor, the ATP extracellular concentration and other conditions of the extracellular medium (Bartlett et al.
2014).
According to the cell type, P2X7R activation modulates different signaling pathways leading to the activation
of the caspase-1-containing inflammasome NLRP3, release of proinflammatory molecules; such as interleukin
1β (IL-1β), interleukin-18 (IL-18) and interleukin-36α (IL-36α); activation of metalloproteases and other proteases,
the formation of reactive oxygen species (ROS) and other events. There are many evidences which support that
the P2X7R is an essential target to be investigated for the treatment of a variety of diseases (Bartlett et al. 2014;
Chen et al. 2018; Gorodeski 2012; Savio et al. 2018; Skaper 2011; Sugiyama 2014; Tsuda et al. 2010). Several
diseases states are associated with P2X7R single nucleotide polymorphisms (SNPs) (Volonté et al. 2012) and
other related to the role that P2X7R exerts in disorders such as the inflammatory and immune response, for
instance (Baudelet et al. 2015; Rech et al. 2016). Therefore, the development of P2X7R inhibitors may be a
relevant strategy for the discovery of new drugs for the treatment of inflammatory conditions such as rheumatoid
arthritis (Mehta et al. 2014).
A conserved tyrosine residue (tyrosine-343) in the carboxyl terminus of the P2X7R, when phosphorylated can
affect the function of this receptor (Kim et al. 2001). Taking this information into account, Wiley and co-workers
evaluated the influence of 18 protein tyrosine kinase inhibitors on the 86Rb+ efflux mediated by the human P2X7R.
A phthalazinamine derivative (compound P), which inhibits the vascular endothelial growth factor receptor kinase,
was found to be the most potent compound, blocking the ATP-induced cation efflux by 76% in human B-
lymphocytes and by 66% in erythrocytes in a dose-dependent manner (half-maximum inhibitory concentration -
IC50 ≅ 5 μM) in both cells. The authors suggested that compounds targeting the ATP-binding sites of kinases
would be potential blockers of the P2X7R (Shemon et al. 2006).
An important class of inhibitors of tyrosine kinases is the tyrphostin group which is benzylidene malononitriles
molecules that can inhibit the cell-signaling transduction by decreasing tyrosine phosphorylation. Tyrphostins are
tyrosine kinase (TYK) inhibitors enzymes that play critical roles in the inflammation process. Therefore,
tyrphostins molecules are bioactive compounds which have been shown a promising anti-inflammatory activity
(Fig. 1) (Dimitrova and Ivanovska 2013; Gyurkovska et al. 2014).
Recently, the effect of introducing the boronic acid group B(OH)2 in arylcyanovinyl compounds, that can be
classified as tyrphostins compounds was investigated in their anticancer properties by our research group. A
series of boronic acid derivatives were synthesized, generating the compounds of NO series (Fig. 2). From this
boronic acid analogs series, the compound NO-12 displayed high antiproliferative activity against GH3 cell lines
from rat pituitary tumor (0.14 ± 0.09 μM), whereas compound NO-13 has shown antiproliferative potential against
the human leukemic monocyte lymphoma cell line U937 (9.83 ± 1.07 μM) (Hiller et al. 2018).
In addition to compounds in the NO series, there are other studies showing the introduction of the B(OH)2 unit
into the aromatic ring of known anticancer compounds resulting in better activities or bioavailability or modifying
the performance profile of these compounds (Ahmed et al. 2006; Asano et al. 2004; Ban et al. 2009; Bradke et
al. 2008; Kumar et al. 2003; LeBeau et al. 2008; Modzelewska et al. 2006; Nakamura et al. 2006; Shimizu et al.
2010). Bortezomib, for example, is proteasome inhibitor current in use in multiple myeloma therapy (Buac et al.
2013; Diaz and Yudin 2017; Dou and Zonder 2014). Due to their empty p orbital, boronic acids can coordinate to
the heteroatoms present in enzymes and receptors in a reversible covalent mechanism. These characteristics
are responsible for the recent growing interest both in the industry and in the academy for the development of
new boron-based drugs (Baker et al. 2009; Ban and Nakamura 2015; Das et al. 2013, 2013).
Since arylboronic acids derivatives can show different pharmacological activities, in the present work, the
action of NO series compounds was evaluated on the P2X7R. This study was based on the
Fig. 1 Anti-inflammatory tyrphostins examples and potential activities for this class of TYKs inhibitors
following observations from the literature reports and our group’s results: 1) tyrosine kinase inhibitors may be
potential blockers of the P2X7R; 2) tyrphostins are tyrosine kinase inhibitors whose antiinflammatory activity has
aready been demonstrated; 3) the introduction of the B(OH)2 moiety into known anticancer agents, including
tyrosine kinase inhibitors, led to compounds with improved activity in many cases; 4) tyrphostins containing the
B(OH)2 moiety can interact with residues by both hydrogen and covalent bonds; 5). To the best of our knowledge,
tyrphostins containing B(OH)2 moiety have not yet been evaluated as blockers of the P2X7R (Groziak 2001;
Koehler and Lienhard 1971; Matthews et al. 1975; Philipp and Bender 1971; Suenaga et al. 1996; Weston et
al.1998; Zervosen et al. 2012).
Materials and methods
Chemistry
Materials and apparatus were used for the NO series synthesis. Common and deuterated solvents, ethyl
cyanoacetate, malononitrile, and cyanoacetic acid were purchased from Sigma Aldrich Brazil LTDA. Boronic
acids were purchased from Combi-Blocks. All these substances were employed as received, without being
previously submitted to purification processes. Products (NO series) were purified by recrystallization using a
suitable solvent. The reported yields are an average of triplicates and refer to the isolated ones after
recrystallization. The melting points (mp) of the pure products were recorded on a Fisatom 413D apparatus.
Reaction progress was monitored through analytical thin-layer chromatography (Sillicycle Ultrapure Silica Gels,
F254) and the spots were visualized by UV light or by reaction with 2,4dinitrophenylhydrazine. Nuclear magnetic
Reduced apoptosis (Bax, Bcl-2 expression)
Inhibited STAT phosphorylation
Reduced RANKL mRNA expression
Reduced NO production
Reduced MPO activity
Lowered cytokine levels (TNF-α, IL-1β)
COS 1/2-lowering activity
Reduced iNOS and PAP expression
Reduced ERK activation
resonance (NMR) spectra were recorded on a Varian VNMRS (300 or 500 MHz) instrument in CDCl3 or DMSO-
d6. Chemical shift data were represented in units of δ (ppm) downfield from the internal standard: tetramethyl
silane (TMS). Coupling constants (J) are reported in Hertz and refer to apparent peak multiplicities. Infrared (IR)
spectra were measured on KBr pellets with a Varian FT-IR 660 Spectrophotometer.
Fig. 2 NO series synthesized by Knoevenagel condensation of the aromatic aldehydes (Hiller et al. 2018)
Knoevenagel condensations
Following the procedure previously reported by our group (Hiller et al. 2018), it was prepared different
tyrphostins by Knoevenagel condensations (Bhattacharya et al. 2014; Cabello et al. 1984; de Resende Filho et
al. 2017; Deb and Bhuyan 2005; Li et al. 2011; Mukhopadhyay and Datta 2008; Ren and Cai 2007; Wang et al.
2001). The active methylene containing compound (2 mmol) (malononitrile, ethyl cyanoacetate or cyanoacetic
acid), aldehyde (2 mmol) and distilled water (10 mL) were added to a rounded-bottom flask to which a reflux
condenser was coupled. With the aid of an oil bath, the reaction mixture was kept at 80 °C while being
magnetically stirred for 2.5–4.5 h. The progress of the reaction was monitored by Thin Layer Chromatography
(TLC) using 2,4-dinitrophenylhydrazine to monitor the aldehyde consumption. After the reaction was completed,
the reaction mixture was allowed to reach ambient temperature, and the product was obtained after vacuum
filtration and washing with cold water. Products were dried under air. Pure samples were obtained after
recrystallization with the suitable solvents. Data from the IR and NMR analyzes were compared with data from
the literature, when available, as well as data obtained in our previous work (Hiller et al. 2018).
Biological assays
In vitro experiments
Mice peritoneal macrophages Male Swiss Webster mice suffered peritoneal cavity lavage for harvesting
peritoneal macrophages. This protocol adhered to the Ethical Principles in Animal Experimentation adopted by
the Brazilian College of Animal Experimentation and approved by the FIOCRUZ Research Ethics Committee
(number LW-033/12). The experimental protocol used was similar to Faria and collaborates in 2018 (Faria et al.
2018).
HEK 293 cells expressing human P2X7R HEK293 cells expressing human P2X7R was maintained in
according to describe for Faria and collaborates (Faria et al. 2018).
Dye uptake assay P2X7R inhibitors and NO series compounds were pre-incubated for 10 min. P2X7R
inhibitors doses ranged from 1 ng/mL to 500 μg/mL and, NO series compounds doses fluctuated from 0.01 ng/mL
to 10 μg/mL. Then, mouse peritoneal macrophages (5.0 × 105 cells) were treated with 5 mM ATP for 25 min at
37 °C and propidium iodide (PI) (0.05 mg/mL in phosphate-buffered saline - PBS) or ethidium bromide (EB)
incubation (25 μM in PBS), in the last 5 min of ATP treatment. HEK293 cells expressing human P2X7R (2.5 ×
106 cells/mL) followed the same protocol above. These cells incubated for 24 h suffer antagonists and ATP
treatment, as described for peritoneal macrophages, with posterior in the last 5 min. EB fluorescence measured
with a Gemini fluorescence plate reader at an excitation wavelength of 530 nm and, an emission wavelength of
620 nm. PI fluorescence measured with a FACS Calibur Flow cytometer at an excitation wavelength of 488 nm
and, an emission wavelength of 60 nm.
IL-1b enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) THP-1 (human monocytic cell line derived from an
acute monocytic leukemia patient) cells differentiation, activation and, maintaining were realized in according to
Faria and collaborate in 2018 (Faria et al. 2018). Brilliant Blue G (BBG), A740003 (N-(1-(((Cyanoamino)(5-
quinolinylamino)methylene)ami no)-2,2-dimethylpropyl)-3,4-dimethoxybenzeneacetamide) and NO series
compounds were added after 200 min of lipopolysaccharide (LPS) incubation, and 10 min before 5 mM ATP
addition until complete 240 min of LPS incubation. The treated samples were collected, centrifuged at 1500 RPM
for 5 min at 4 °C and, the supernatants were stored at −70 °C. Measuring IL-1β release using the Human IL-1
beta ELISA Kit (ab46052 -ABCAM, Cambridge). Primed peritoneal macrophages activation and treatment was
similar to THP-1 cells and the mature IL-1β released quantified by sandwich ELISA following the manufacturer’s
protocol (eBioscience, San Diego, CA, USA).
Caco-2 cells culture and treatments Caco-2 cell cultured was similar to describe at Faria and collaborates
in 2018 (Faria et al. 2018). Boronic acids derivatives NO-01 and NO-12, vinblastine and propranolol at 100 μM
were prepared in the transport buffer (HBSS and 25 mM HEPES (4-(2hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic
acid; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay)) at pH 7.4 or 6.5 with 0.5% (v/v) DMSO. After Caco-2 cells
incubation for 30 min, 0.3 mL of the transport buffer in the apical wells were removed and the drugs added for 60
min. LY concentrations contained in the donor and acceptor wells were measured on the plate reader M5
(molecular probes) at an excitation wavelength of 485 nm and the emission wavelength of 530 nm.
pH dependent-solubility of NO-01 and NO-12 NO-01 and NO-12 solubility was assessed from 1 to 250 μM
by using DMSO (5 μL) into 995 μL buffer (pH 2.0-hydrochloride, 4.0– 100 mM citrate buffer and 7.4–100 mM
phosphate buffer). This solution was dispensed in a 96-well plate at room temperature for 2 h. Calibration
standards were prepared by adding 5 μL of DMSO into 995 μL acetonitrile/buffer (1:1) mixture. After centrifugation
(10,000 rpm, 10 min, 25 °C), the reaction samples were diluted 1:1 with acetonitrile.
Distribution coefficient (LogD) in octanol/PBS pH 7.4 A solution containing Octanol and PBS pH 7.4 at a
ratio of 1:1 (v/v) was shaken mechanically for 24 h to reach the pre-saturation. Arylboronic acids analogs NO-01
and NO-12 (25 mM) in a volume of 4 μL added to 396 μL PBS for partitioning with octanol (100–400 μl). The
samples were shacked; centrifuged (3000 rpm for 5 min), and after 1 h of standing the PBS layer was collected.
Acetonitrile (100 μl) was added to a 100 μl aliquot of the PBS layer, and the absorbance sample was measured.
The compounds were evaluated for two standard to validate the assay.
In vitro stability assays in liver microsomes Male mice and humans liver microsomes (0.5 mg/ml in 0.1 M
phosphate buffer at pH 7.4), arylboronic acids analogs NO-01 and NO12 (1 μM) and DMSO (0.5 μM) were pre-
incubated at 37 °C before NADPH addition (1 mM) to initiate the reaction in a final incubation volume of 50 μl. A
buffer containing 0.1 M phosphate at pH 7.4 was used as a negative control and diazepam and verapamil as a
positive control for mice and humans, respectively. Drugs were incubated for 0, 5, 15, 30, and 45 min with the
microsomes and the negative control (minus NADPH) for 45 min. Methanol (50 μL) stopped the reactions at the
appropriate time points and the samples centrifuged (1640×g for 20 min at 4 °C) to precipitate the proteins.
Intrinsic clearance (CLint mic) for NO-01 and NO-12 microsomes was calculated according to Biosystem
instructions (Faria et al. 2018).
Electrophysiological measurements For whole-cell configuration assay was used a pipette with series
resistance set as 5–11 MΏ for all the experiments in standard saline for bath and pipette solutions. Ionic currents
were not compensated for recordings less than 1600 pA, however, they were compensated by 91% for values
above to this value. Macrophage cell capacitance was 19.4 ± 6.24 pF; n = 73 and the holding potential of −60
mV at 37 °C for all recordings.
Fig. 3 Cytotoxicity in mammalian cells. (A) Mice peritoneal macrophages were treated with 100 μM of the NO
derivatives (NO-01, NO03, NO-04, NO-05, NO-07, NO-11, NO-12, and NO-13 for 72 h. The graphic results
represent 3–5 independent, lactate dehydrogenase (LDH) release assays. These results are expressed as
mean ± s.d. ***significantly different from the negative control value at P < 0.05. CP – positive control (cells
treated with 0.1% Triton X-100); CN – negative control (no treated cells)
Saline solutions for electrophysiology The bath solution (in mM) consisted of the following: 150 NaCl, 5
KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2 and, 10 HEPES (pH, 7.4) and the pipette solution (in mM): 150 KCl, 5 NaCl, 1 MgCl2, 10
HEPES and, 0.1 ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) pH, 7.4.
Drug application Perfusion chamber (RC-24 chamber, Warner Instrument Corp.) was used at a rate of 1
mL/min. All the drugs were dissolved immediately before use. Compounds NO and P2X7R inhibitors were added
1–5 min before 1– 5 mM ATP stimulation for 5 min at 37 °C.
In vivo experiments
Paw edema Compounds NO were administered intraperitoneally at 60 min before intrathecal ATP (2.5 mM/
paw) administration. Mouse paw edema was measured after 30 min of ATP treatment using a plethysmometer
(Insight, Brazil). This protocol adhered to the Ethical Principles in Animal Experimentation adopted by the
Brazilian College of Animal Experimentation and approved by the FIOCRUZ Research Ethics Committee (number
LW-58/14).
Statistical analyses
The results are presented as means ± standard deviations of the means (S.D.M.). D’Agostino and Pearson
normality tests were used to test whether data followed a Gaussian distribution. In data following a Gaussian
distribution, we applied an analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey’s test.
Table 1 Antagonistic effects of P2X7R inhibitors and NO series compounds against ATP-induced dye uptake in
mice peritoneal macrophages
P2X7R inhibitors and NO series compounds
mP2X7 IC50 (μM)
BBG
15.23 ± 1.65
A740003
0.897 ± 1.12
NO-01
0.639 ± 0.11
NO-03
46.88 ± 5.24
NO-04
11.84 ± 2.08
NO-05
75.44 ± 4.55
NO-06
102.3 ± 3.02
NO-07
88.41 ± 5.47
NO-08
6.61 ± 0.41
NO-11
54.68 ± 4.77
NO-12
0.939 ± 0. 21
NO-13
91.02 ± 1.33
Values are means of 2–4 experiments. Compounds tested at the mice peritoneal macrophages
aIC50 = 50% inhibitory concentrations were obtained from concentration– response curves
Otherwise, we applied the non-parametric Kruskal–Wallis test followed by Dunn’s test. PRISM® software
(GraphPad, Inc., San Diego, CA, USA) was used for all statistical analyses.
In silico analysis
ADMET properties
The ADMET properties analysis of NO-01 and NO-12 were performed using the admetSAR (Structure-activity
relationship) program, which computes a pharmacokinetic and toxicological profile (Cheng et al. 2012).
Comparative modeling
The human P2X7R model was prepared using the approach described previously (Faria et al. 2018).
Ligands molecular modeling
Chemicalize® software (ChemAxon) (Swain 2012) was used to determine the non-ionized states of the NO
compounds at physiological pH 7.4. The Spartan’10 v.1.0.1 program was used to build the molecular structures.
The MMFF94 (Merck Molecular Force Field) was used to generate the conformer distribution of the compounds
(Halgren 1996). Then the geometry optimization was applied with the semi-empirical RM1 (Recife Model 1)
method (Rocha et al. 2006).
Molecular docking
The molecular docking was performed using the algorithm MolDock (Thomsen and Christensen 2006) with
the Molegro Virtual Docker (MVD) 6.0 program (CLC Bio, 8200, Aarhus, Denmark). The MolDock score [GRID]
algorithm was used as the score function with a grid resolution of 0.30 Å. The partial charges were assigned
according to the MVD charges scheme. The search algorithm used was the MolDock Optimizer with a search
space of 40 Å around the area where the cavities of the P2X7R were found. The ligand evaluation was considered
concerning internal electrostatic interactions (ES), internal hydrogen bond (HBond) and Sp2Sp2 torsions. Every
molecular docking was performed 50 runs with the same parameters set (population size = 50, max iterations =
2000, scaling factor = 0.50 and crossover rate = 0.90), followed by energy minimization. The poses binding modes
were selected based on the best rank score.
Table 2 Cellular toxicity and Selectivity of P2X7R inhibitors and arylboronic acids analogs
P2X7R inhibitors and arylboronic
acids analogs
mP2X7 CC50 (μM)
(macrophages)
Selectivity index
(aCC50/IC50)
BBG
85.62 ± 2.77
5.62
A740003
351.1 ± 11.76
391.4
NO-01
443 ± 25.7
693.2
NO-12
329.6 ± 16.82
392.8
a CC50 = 50% inhibitory concentrations were obtained from concentration response curves
Results and discussion
Synthesis
Benzene vinylnitriles were prepared by Knoevenagel condensations between aromatic aldehydes and
malononitrile or ethyl cyanoacetate without catalysis and employing water as solvent. Products were obtained in
high yields (> 80%) and high purity by simple vacuum filtration after reaction has reached the ambient
temperature, as previously reported by our group. For the biological purposes, products were purified by
recrystallization using water/ethanol or water/acetone as solvents. For the cases where two diastereoisomers (E
or Z) can be formed by the Knoevenagel reactions (NO-12 and NO-13), evidence verified by NMR spectra
analysis that only one stereoisomer was formed, for which E-configuration was attributed by comparison with the
previously obtained datum, which had been confirmed by monocrystal X-ray diffraction.
Biological assay
In vitro
Mouse peritoneal macrophages treated with NO series compounds continuously for 72 h (Fig. 3) in the
concentration of 10 μM. These analogs did not cause LDH release in this concentration, when compared with
positive control for LDH release, the Triton X-100 detergent. This result indicates a low toxicity for these analogs
in mammalian cells, therefore all analogs in sequence were tested in assays to evaluate the capacity of inhibiting
the P2X7R function. This reduced toxicity in primary cell was consistent with previous publication. Mice peritoneal
macrophages treated with the NO series compounds did not affect the cellular metabolism activity after 72 h of
treatment (Hiller et al. 2018).
Table 3 Antagonistic effects of most active NO compounds against ATP-induced PI uptake in HEK 293 cells
transfected with hP2X7R
P2X7R
inhibitors and
arylboronic acids
PI-uptake in HEK293 cells
transfected with human P2X7R
IC50(µM)
THP-1 cells
IC50 (μM)
IL-1β release
Mice Peritoneal macrophages
IC50 (μM) IL-1β release
BBG
4.97 ± 0.62
0.783 ± 0.063
0.907 ± 0.077
A740003
0.129 ± 0.041
0.087 ± 0,031
0.114 ± 0.02
NO-01
0.031 ± 0.002
0.021 ± 0.011
0.042 ± 0.013
NO-12
0.105 ± 0.011
0.243 ± 0.034
0.537 ± 0.065
NO series compounds caused inhibitory action on mice P2X7R activity as observed for dye uptake assay
(Table 1). In addition, NO series compounds activities were compared to BBG and A740003 (selective), both
P2X7R inhibitors. Therefore, the compounds NO-03, NO-05, NO-06, NO-07, NO-11 and NO-13 exhibited IC50
values superior to BBG and A740003. The compounds NO-04 and NO-08 showed IC50 values between BBG and
A740003. The compounds NO-01 and NO-12 demonstrated higher inhibitory efficiency to than other compounds
NO, BBG and A740003 (Table 1). ATP-induced P2X7R dye uptake was inhibited for compounds NO-01 and NO-
12 with IC50 = 0.639 uM and 0.839 µM, respectively. The IC50 values for these compounds were similar to other
molecules inhibitors of the P2X7R described in the literature (North 2002; Rech et al. 2016). The compounds NO-
01 and NO-12 also inhibited BzATP-induced dye uptake (data not shown) with similar IC50 values observed for
ATP-induced dye uptake. Therefore, NO-03, NO-05, NO-06, NO07, NO-11, NO-13, NO-04 and NO-08 were
discarded because of the reduced potency when compared to commercial P2X7R inhibitors. Contrarily,
compounds NO-01 and NO-12 were tested in all complemental assays.
Dose-response curve measuring the compounds NO-01 and NO-12 toxic activity in mice peritoneal
macrophages after 72 h of treatment. NO-01 and NO-12 caused low toxicity with high CC50 value (Fig. 3, Table
2). Both compounds were less toxic than BGG and A740003 when treated in the same time of incubation. When
selectivity index of these both arylboronic acids derivatives were compared with commercial P2X7R inhibitors,
these analogs exhibited values higher than the P2X7R inhibitors (Table 2). NO-12 analog exhibited a S.I. similar
to a selective P2X7R inhibitor, A740003. NO-01 analog showed a S.I. value 1.77 times higher than compound
A740003 indicating an elevate promisor activity. Therefore, these arylboronic acid analogs were tested in the
subsequent assays. Curiously, both compounds showed IC50 values higher than P2X7R inhibitors previously
described (Faria et al. 2018; Pacheco et al. 2018; Kwak et al. 2018; O'Brien-Brown et al. 2017), however in
function of elevated S.I. value for human P2X7R, these arylboronic analogs remain as good candidates.
Fig. 4 ATP-induced IL-1β release inhibition by arylboronic acids in human and mouse cells. (a) Differentiated
THP-1 cells treated with 1 mM ATP (30 min) and LPS (4 h) in the presence of increasing concentrations of
BBG, A740003, NO-01, or NO-12. (b) Mouse peritoneal macrophages treated with 1 mM ATP (30 min) and LPS
(4 h) in the presence of increasing concentrations of BBG, A740003, NO-01, and NO-12. Curves are
representative of 3–5 independent experiments A740003.
Fig. 5 Evaluation of the inhibitory mechanism of compounds NO-01 and NO-12 on P2X7R antagonists.
Competitive mechanisms were evaluated by recording the ionic currents of mice peritoneal macrophages with
(●) ATP alone or (■) with 500 ng/mL of NO-01(A) or NO-12 (B) at 37 °C. Graphics are representative of 3–4
independent experiments
Table 4 Liver microsomal stability and Caco-2 data for NO-01 and NO-12
(a) Stability in mice and human liver microsomes. Data reported as CLint(μL /minutes / mg protein)
(b) Apparent permeability values (Papp) measured using low permeability and high permeability absorption
compounds, vinblastine and propranolol, respectively, as reference. Data are reported in 106 cm/s. These
values indicate an apical to basolateral (A - B) direction. They were tested at the same time as NO-01 and NO-
12. Values are means ± standard error of 3 experiments.
ATP-induced IL-1β release is a characteristic function associated with P2X7R activation. Compound NO-01
potently inhibited ATP-induced IL-1β release in mice and human P2X7R, however NO-12 weakly inhibited IL-1β
release mediated by mP2X7R activation. Human THP-1 monocytes differentiated with INF-γ and PMA were
primed with LPS for 4 h, with ATP added in the last 30 min of LPS incubation. Both arylboronic acids derivatives
were added 30 min before ATP addition inhibited ATP-induced IL-1β release in a similar manner (Table 3). NO-
1 and NO-12 exhibited higher potency than BBG and A740003 to inhibit IL-1β release mediated by hP2X7R
activation (Fig. 4a). ATP-induced IL-1β release mediated by mouse P2X7R also was inhibited by arylboronic acid
analogs (Fig. 4b and Table 3). NO-12 suffered a potency reduction to inhibit the mP2X7R when compared with
hP2X7R. NO1 analog maintained an elevate potency to inhibit mP2X7R with IC50 value higher than A740003
(Fig. 4, Table 3). Both analogs also inhibited BzATP-induced IL-1β release (data not shown). These results
indicate a selective inhibition mechanism inhibiting IL-1β release mediated by P2X7R activation, as observed for
other P2X7R antagonists (Rech et al. 2016; Volonté et al. 2012; Young and Górecki 2018).
A possible mechanism of action for arylboronic acid analogs inhibition was measured using whole cell patch
clamp technique. ATP concentrations ranging from 100 μM to 25 mM induced macroscopic ionic currents in a
doseresponse manner (Supplemental Fig. 1 and 2).
When arylboronic derivatives or A740003 were fixed at 500 nM and tested in the presence of ATP curve,
NO-01 and NO-12 augmented the EC50 value for the ATP doseresponse curve in comparison with ATP
concentrations alone (Fig. 5a, b).
Liver Microsomes
LM stability(a) mouse
LM stability(a) human
Caco-2(b)
NO-01
20.2
19.97
76.6 ± 1.8
NO-12
36.3
35.79
59.79 ± 1.7
Table 5 Solubility of NO-01 and NO-12 at various pH conditions
(a) pH 2: hydrochloride buffer; (b) pH 4: citrate buffer; (c) pH 7.4: phosphate buffer; (d) pH 10: sodium
hydroxide buffer, n = 3 on distinct days
NO-01 and NO-12 compared to A740003, which is a P2X7R allosteric inhibitor acting on the pore allosteric site
(Karasawa and Kawate 2016) showed action profiles similar (Figs. 5a, 4b). The ATP concentrations ranging from
10−4 to 10–1.6 were inhibited for NO-01 treatment (Supplemental Table 1), and NO-12 impaired ionic currents
induced for ATP concentrations ranging from 10−3 to 10–1.7 (Supplemental Table 2).
This result indicates a P2X7R non-competitive inhibition mechanism for NO-01 and NO-12 in the allosteric
site as well as the inhibitor A740003, or an irreversible interaction in the ATP binding site. This inhibitory
mechanism is shared for other P2X7R antagonists recently discovered (Gonzaga et al. 2017; Faria et al. 2018;
Pacheco et al. 2018).
In silico analysis
ADMET studies The in silico pharmacokinetics evaluation indicated that the two most active compounds (NO-
01 and NO12) have a high permeability by the Human Intestinal Absorption test (Shen et al. 2010) with more
than 70% being absorbed and a high permeability by the Caco-2 test (Pham The et al. 2011) with more than 8 ×
10−6 cm/s. Also, high water solubility was estimated for both compounds in which the values of LogS -2.04 and −
2.20 are suggested for compounds NO-1 and NO-12, respectively. On the other hand, only compound NO-01
showed a high permeability through the blood brain barrier.
The CYP enzyme metabolism profile was also investigated in which compounds NO-1 and NO-12 only
presented potential interaction with the CYP3A4 as an inhibitor. In addition, it is known that the nitrile group in
most drugs is not directly metabolized, because the nitrile group is eliminated through the body unchanged.
Despite that, the epoxidation of alkenenitriles compounds (such the case of compounds NO01 and NO-12) can
potentially liberate cyanide, although a large number of approved drug with alkenenitriles groups indicate that the
metabolism at other sites is more likely (Fleming et al. 2010).
Table 6 Log D7.4 of NO-01 and NO-12 boronic tyrphostins
(a) Results are average of three experiments and in all cases individual Log D values were within ±0.3 log units
of the average LogD Propranolol HC
Compound
pH 2(a)
pH 4(b)
pH 7.4(c)
pH 10(d)
NO-01
250 μM
250 μM
< 250 μM
< 250 μM
NO-12
250 μM
250 μM
< 250 μM
< 250 μM
Compound
LogD7.4 (a)
NO-01
NO-12
−2.25 ± 0.09
−0.96 ± 0.11
Fig. 6 Anti-inflammatory effects of NO-01 and NO-12 on ATPinduced paw edema in mice. Groups with
five Swiss Webster mice were treated with ATP (intraplantar) or preincubated for 30 min with Diclofenac
(10 mg/kg), oxidized ATP (10 mg/kg), or increasing doses of NO-01 (0.001–1 mg/kg) (a) or NO-12 (b).
Paw edema was measured at 60 min after ATP application. These results represent three distinct days
and are expressed as mean ± s.d. ### P < 0.05 comparison in relation to saline group. *** P < 0.05
comparison in relation to ATP group
Regarding the toxicological parameter both compounds were labeled as weak inhibitor (pIC50 ≤
6.0 mol/L) of the Human Ether-a-go-go-Related Gene (hERG) Inhibition Test (Marchese Robinson
et al. 2011), also both compounds showed low mutagenic potential by the AMES Test and finally
none carcinogenic features were detected by Carcinogens Test (Lagunin et al. 2009).
Furthermore, no apparent toxicity is identified in the literature for the boronic acids moiety
regarding medical applications. Indeed, the first boronic acid-based FDA approved drug, the
Bortezomib (Velcade), a proteasome inhibitor for the treatment of multiple myeloma, presented
low toxicity issues. Additionally, the eventual final product in the metabolism of boronic acid-
containing compounds is generally boric acid, which has low particularly toxic to humans (Cambre
and Sumerlin 2011).
Solubility, microsomal stability, and permeability in vitro
Arylboronic acids NO-01 and NO-12 were moderately stable in mouse and human microsomes
(Table 4). NO-01 when compared to NO-12 may exhibit a short duration of action in vivo.
Additionally, NO-01 was permeable in Caco-2 at percentages above to 75% (Table 4) and NO-12
was permeable in a range superior to 55%, both when compared with propranolol.
Table 7 The Volume (Å3) of the Cavities Detected in the Human P2X7R Model using MVD
Cavity
Volume (Å3)
S1
2204.67
S2
1320.96
S3`
442.88
S3``
394.24
S3```
308.22
Fig. 7 Representation of the binding sites (S1, S2 and S3) identified in the P2X7R. Frontal view (a) and
Top view (b). The cavities S1, S2 and S3 are ordered based on their volumes. Because there are three
identical S3 binding sites formed by three identical subunits, they are labeled S3`, S3``, S3```
When solubilized in solutions with pH values ranging from 2 to 10, NO-01 demonstrated solubility in turn
of 250 μM (Table 5). LogD7.4 measured for NO-01 gave a value of −2.25 ± 0.09 indicating good solubility in
aqueous solutions (Table 6). In relation to NO-12, it demonstrated solubility at concentrations above 250
μM (Table 5). The LogD7.4 value for NO-12 was −0.96 ± 0.11 (Table 6).
NO-01 reduced lipophilicity may be associated with short microsomal stability, however this
characteristic can increase the tissue permeability as observed in Caco-2 cells. In contrast, NO-12 although
lipophilic exhibited higher microsomal stability and reduced tissue permeability.
In vivo assays
NO-01 and NO-12 anti-inflammatory properties in vivo was evaluated using the ATP- induced paw
edema model in mice. Sodium diclofenac and arylboronic acids were administered intraperitoneally at 1 h
before ATP treatment for 30 min. The oxidized ATP, an irreversible P2X7R antagonist inhibited the ATP-
induced inflammatory response (NO-01, Fig. 6a and NO- 12, Fig. 6b). Sodium diclofenac, a general anti-
inflammatory, also inhibited ATP-induced paw edema (Fig. 6). NO-01 and NO-12 dose-dependently
inhibited the ATP effect (Fig. 6b). In this context, NO-01 promoted an anti-inflammatory effect more potent
than oxidized ATP and diclofenac (Fig. 6a). In accordance with in vitro assays, NO-01 inhibited the
ATPinduced paw edema with higher potency compared to the NO-12 analog. Triazole and naphtoquinone
derivatives inhibiting P2X7R activity also reduced the ATP-induced paw edema (Gonzaga et al., 2017, Faria
et al. 2018). In both papers, at least one dose administered reducing edema formation in μg/kg
concentrations as observed mainly for NO-01. These arylboronic acid analogs also inhibited carrageenan-
induced response in similar manner to ATP stimulation (data not shown).
Molecular docking
The blind molecular docking of the two most active ligands (NO-01 and NO-12), on the ionic channel
P2X7R, were performed around the area where the cavities were identified in the protein molecular structure
(Fig. 7). In order to harness structure activity relationship, the same blind molecular docking was performed
with less active ligands (NO-06 and NO-13). The largest volume cavity is the S1 located into the P2X7 pore
comprised by the lower body domain of the three correlated subunits; the second largest volume cavity is
the S2, also located in the pore, but in the upper body domain and; the cavities S3´, S3´´ and S3´´´ are the
ATP-binding sites located between the protein subunits. Figure 7 depicts the cavities identified in the P2X7R
and the Table 7 indicates the volume of each cavity.
The molecular docking results indicated that the cavity S2 was the most favorable binding site of the
inhibitors NO-01 NO-12, NO-06 and NO-13. The S2 cavity is the same cavity revealed in the work from
Karasawa and Kawate (2016) where the five known P2X7 inhibitors bind (A740003, A804598, AZ10606120,
GW791343, JNJ47965567), based on the elucidation of the panda P2X7R complexed crystal structures.
All the four NO compounds presented a similar binding mode into the S2 cavity, with their phenyl moiety
interacting with the phenylalanine residues 95, 103 and 293 from chain B. Also the boronic acid group from
the inhibitors NO-01, NO12 and NO-13 are orientated towards the serine 101 lateral chain from chain B
(Fig. 8). Some residues interactions with the NO compounds are similar to the known allosteric inhibitors
identified from the Karasawa and Kawate (2016) work, as the phenylalanines 95, 103 and 293 are also
involved in hydrophobic interactions. In addition, the residue Met105 that performs hydrophobic interactions
with the compounds A740003, A804598 and JNJ47965567 is also interacting with the compound NO-06.
Despite the fact that all four NO compounds submitted to molecular docking studies presented similar
hydrophobic interactions with the phenylalanine residues, the hydrogen bond formation with the residues
Gln98, Leu97 and specially with the Ser101 might be responsible for the gain in the activity of the
compounds NO-01 and NO-12 compared with the compounds NO-06 and NO-13. Also, the inhibitor NO-12
presented extra hydrogen bonds with the residues glycine 98 and 99 from chain A, which might contribute
for selectivity. Figure 9 depicts the intermolecular interaction of the NO compounds into de S2 binding cavity
found by molecular docking.
Though the molecular docking results indicate the probable binding site of NO series compounds in the
human P2X7R model and suggest that interactions of the boronic acid moiety with Ser101 and Gln98 may
be determinant to high affinity of the compounds NO-01 and NO-12, other studies in future should be done
to refine these insights in order to increase the information on the properties and inhibitory activity of the
boronic acids derivatives on the P2X7R,
Fig. 8 Superposition of the inhibitors NO-01, NO-12, NO-06 and NO-13 docked into the S2 cavity. In blue
are depicted the NO derivatives and in green the main residues that are in close contact
Fig. 9 Representation of the main intermolecular interactions of each NO compounds into de S2 binding
cavity, identified from the molecular docking. The arrows indicates hydrogen bonds and the blue areas in
the NO structures indicates solvent exposure
Conclusion
In summary, the results exhibited herein demonstrate arylboronic acids as a novel P2X7R inhibitors
class. NO-01 and NO-12 compounds ATP antagonistic effects resulted in potent blockage of mouse and
human P2X7R. The arylboronic acid NO-01 was more potent in vitro and in vivo when compared with BBG
and A740003 to reduce P2X7R activity and the inflammatory response. In according to in silico ADMET
analysis both molecules depicted an acceptable pharmacokinetic profile and low toxicological effects, thus
suggesting its potential drug-likeness characteristic. The molecular docking results suggest that the binding
sites for the compounds NO-01 and NO-12 are located in the upper area of P2X7R pore. Thus, these results
strengthening the therapeutic potential and the feasibility of developing new P2X7R inhibitors based on the
arylboronic acid pharmacophore group.
Acknowledgements CAPES, CNPq, FAPERJ, UFRJ, UFF.
Funding This work was supported by CNPq (National Council of Research of Brazil) (Fellowship Process
Number 304716/2014–6).
Compliance with ethical standards
The authors declare that there are no conflicts of interest.
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