Primary screening of chemically modified immunosuppressive oligonucleotides using in vitro model with spleen lymphocytes

Abstract

Control of immune response following transplantation of cells, tissues, or organs includes reduction negative effects caused by acute graft-versus-host disease (GVHD) developing during bone marrow transplantation, thus being an urgent task of modern clinical practice. In this view, the management of immunological tolerance is a promising approach, in particular, the ability of immune cells (especially, dendritic cells) to induce this response using experimental models of allogeneic transplant rejection, GVHD and autoimmune disorders. Therefore, the search for compounds that can effectively activate or suppress immune cells and regulate immunological tolerance is of importance. The purpose of this work was to study the effects of synthetic immunosuppressive oligodeoxynucleotides (INH-ODN) on in vitro splenocyte proliferation and IL-12 production, in order to select the most promising compounds for subsequent in vivo experiments. We have tested several immunosuppressive agents: thiophosphate oligodeoxynucleotides (A151, ODN2088 and ODN4084-F), which include G-rich regions, as well as their analogues, i.e., thiophosphate oligodeoxynucleotides with mesylphosphoramide (ì) modifications at GpG bonds (ì-A151, ì-ODN2088 and ì-ODN4084-F). The effects of chemically modified oligonucleotides were assessed in the in vitro model of CpG-stimulated splenocytes, using CpG-ODN SD-101 in its complete thiophosphate (PS) version. Primary in vitro screening of immunosuppressive oligonucleotides by their effect on splenocyte proliferation and IL-12 production enabled us to identify the most active compounds and determine the features of sequences with the most pronounced immunosuppressive properties, as well as establish optimal concentrations of the studied oligodeoxynucleotides selected for subsequent in vivo studies.

Full text

25
Российский
иммунологический журнал
2025, Т. 28, № 1, стр. 25-32
Russian Journal of Immunology /
Rossiyskiy Immunologicheskiy Zhurnal
2025, Vol. 28, № 1, pp. 25-32
1 page
Адрес для переписки:
Гаврилова Елена Давидовна
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт
фундаментальной и клинической иммунологии»
630099, Россия, г. Новосибирск,
ул. Ядринцевская, 14, каб. 215.
Тел.: 8 (383) 222-04-38.
Факс: 8 (383) 222-70-28.
E-mail: edav.gavr@mail.ru
Address for correspondence:
Elena D. Gavrilova
Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology
14 Yadrintsevskaya St, Room 215
Novosibirsk
630099 Russian Federation
Phone: +7 (383) 222-04-38.
Fax: +7 (383) 222-70-28.
E-mail: edav.gavr@mail.ru
Образец цитирования:
Е.Д. Гаврилова, Е.В. Гойман, А.Ш. Держалова,
Д.А. Стеценко, Е.А. Буракова «Первичный скрининг
химически модифицированных иммуносупрессорных
олигонуклеотидов на лимфоцитах селезенки в модели
in vitro» // Российский иммунологический журнал, 2025.
Т. 28, № 1. С. 25-32.
doi: 10.46235/1028-7221-16962-PSO
© Гаврилова Е.Д. и соавт., 2025
Эта статья распространяется по лицензии
Creative Commons Attribution 4.0
For citation:
E.D. Gavrilova, E.V. Goiman, A.Sh. Derzalova,
D.A. Stetsenko, E.A. Burakova “Primary screening
of chemically modified immunosuppressive oligonucleotides
using in vitro model with spleen lymphocytes”, Russian Journal
of Immunology/Rossiyskiy Immunologicheskiy Zhurnal, 2025,
Vol. 28, no. 1, pp. 25-32.
doi: 10.46235/1028-7221-16962-PSO
© Gavrilova E.D. et al., 2025
The article can be used under the Creative
Commons Attribution 4.0 License
DOI: 10.46235/1028-7221-16962-PSO
ПЕРВИЧНЫЙ СКРИНИНГ ХИМИЧЕСКИ
МОДИФИЦИРОВАННЫХ ИММУНОСУПРЕССОРНЫХ
ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ НА ЛИМФОЦИТАХ
СЕЛЕЗЕНКИ В МОДЕЛИ IN VITRO
Гаврилова Е.Д.1, 2, Гойман Е.В.1, 2, Держалова А.Ш.1, Стеценко Д.А.1, 3,
Буракова Е.А.1, 3
1 ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр “Институт цитологии и генетики Сибирского отделения
Российской академии наук”», г. Новосибирск, Россия
2 ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии»,
г. Новосибирск, Россия
3 ФГАОУ ВО «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет»,
г. Новосибирск, Россия
Резюме. Контроль за иммунными реакциями, протекающими в организме при трансплантации
клеток, тканей или органов, в том числе для снижения негативных последствий при острой форме
болезни «трансплантат против хозяина» (РТПХ), развивающейся при пересадке костного мозга,
является актуальной задачей на сегодняшний день в клинической практике. В этой связи перспек-
тивным направлением является управление иммунологической толерантностью и способность им-
мунных клеток, в частности дендритных, индуцировать ее в моделях отторжения аллогенного транс-
плантата, РТПХ и аутоиммунных расстройств. Вот почему важен поиск соединений, способных
эффективно активировать или подавлять иммунные клетки и регулировать иммунологическую то-
лерантность. Целью настоящей работы было изучение влияния синтетических иммуносупресорных
олигодезоксинуклеотидов (INH-ODN) на пролиферацию спленоцитов и продукцию IL-12 in vitro
для отбора наиболее перспективных для дальнейших экспериментов in vivo. Для исследования были
синтезированы иммуносупрессорные тиофосфатные олигодезоксинуклеотиды (А151, ODN2088 и
ODN4084-F), которые включают G-богатые участки, а также их аналоги – тиофосфатные олигоде-
зоксинуклеотиды с мезилфосфорамидными (μ) модификациями по GpG связям (μ-А151, μ-ODN2088
и μ-ODN4084-F). Эффекты химически модифицированных олигонуклеотидов оценивали на модели
СpG-стимулированных спленоцитов in vitro. Первичный скрининг иммуносупрессорных олигону-
клеотидов в культуре in vitro по их влиянию на пролиферацию спленоцитов и продукцию IL-12 позво-

26
Gavrilova E.D. et al.
Гаврилова Е.Д. и др.
Russian Journal of Immunology/Rossiyskiy Immunologicheskiy Zhurnal
Российский иммунологический журнал
лил выделить несколько наиболее активных соединений и определить характер последовательности с
наиболее выраженными иммунодепрессивными свойствами.
Ключевые слова: иммунологическая толерантность, реакция «трансплантат против хозяина», аутоиммунные
заболевания, антагонисты TLR9, иммуносупрессорные олигонуклеотиды, регуляторные Т-клетки, аналоги ДНК
PRIMARY SCREENING OF CHEMICALLY MODIFIED
IMMUNOSUPPRESSIVE OLIGONUCLEOTIDES USING
IN VITRO MODEL WITH SPLEEN LYMPHOCYTES
Gavrilova E.D.a, b, Goiman E.V.a, b, Derzalova A.Sh.a, Stetsenko D.A.a, c,
Burakova E.A.a, c
a Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russian Federation
b Research Institute of Fundamental and Clinical Immunology, Novosibirsk, Russian Federation
c Novosibirsk State University, Novosibirsk, Russian Federation
Abstract. Control of immune response following transplantation of cells, tissues, or organs includes
reduction negative effects caused by acute graft-versus-host disease (GVHD) developing during bone
marrow transplantation, thus being an urgent task of modern clinical practice. In this view, the management
of immunological tolerance is a promising approach, in particular, the ability of immune cells (especially,
dendritic cells) to induce this response using experimental models of allogeneic transplant rejection, GVHD
and autoimmune disorders. Therefore, the search for compounds that can effectively activate or suppress
immune cells and regulate immunological tolerance is of importance. The purpose of this work was to study
the effects of synthetic immunosuppressive oligodeoxynucleotides (INH-ODN) on in vitro splenocyte
proliferation and IL-12 production, in order to select the most promising compounds for subsequent in vivo
experiments. We have tested several immunosuppressive agents: thiophosphate oligodeoxynucleotides (A151,
ODN2088 and ODN4084-F), which include G-rich regions, as well as their analogues, i.e., thiophosphate
oligodeoxynucleotides with mesylphosphoramide (μ) modifications at GpG bonds (μ-A151, μ-ODN2088 and
μ-ODN4084-F). The effects of chemically modified oligonucleotides were assessed in the in vitro model of
CpG-stimulated splenocytes, using CpG-ODN SD-101 in its complete thiophosphate (PS) version. Primary
in vitro screening of immunosuppressive oligonucleotides by their effect on splenocyte proliferation and IL-12
production enabled us to identify the most active compounds and determine the features of sequences with
the most pronounced immunosuppressive properties, as well as establish optimal concentrations of the studied
oligodeoxynucleotides selected for subsequent in vivo studies.
Keywords: immune tolerance, graft-versus-host disease, autoimmune disorders, TLR9 antagonists, immunosuppressive
oligonucleotides, regulatory T cells, DNA analogues
Работа выполнена при финансовой под -
держ ке Российского научного фонда (соглаше-
ние № 23-23-00487).
Введение
Управление иммунологической толерантно-
стью является актуальной задачей для решения
проблем, связанных с контролем иммунных ре-
акций при трансплантации клеток, тканей или
органов, в том числе для контроля острой формы
реакции «трансплантат против хозяина» (РТПХ),
являющейся главной причиной смертности при
пересадке костного мозга [6]. Так, широкое ис-
пользование аллогенной трансплантации гемо-
поэтических стволовых кроветворных клеток
ограничено в связи с развитием у 40-60% реципи-
ентов осложнения в виде острой или хронической
РТПХ, несмотря на улучшение режимов транс-
плантации и профилактику осложнений [14].
Современные подходы к профилактике РТПХ
основаны на истощении донорских лимфоцитов/
Т-клеток или общей иммуносупрессии, что неэф-

27
Скрининг иммуносупрессорных олигонуклеотидов в модели in vitro
In vitro screening of immunosuppressive compounds2025, Vol. 28, № 1
2025, Т. 28, № 1
фективно для предотвращения РТПХ. Ключевую
роль в патофизиологии РТПХ играют дендритные
клетки (ДК). В качестве мощных антиген-презен-
тирующих клеток ДК составляют наиболее гете-
рогенную клеточную популяцию со значительной
клеточной фенотипической и функциональной
пластичностью, способностью инициировать
развитие как иммунитета, так и толерантности,
что позволяет рассматривать их в качестве под-
ходящего объекта для иммунотерапевтического
воздействия [4, 7, 8, 9, 12, 13]. Способность ДК
индуцировать толерантность привела к терапев-
тическим исследованиям с использованием этих
клеток с целью контроля иммунных реакций на
моделях отторжения аллотрансплантата, РТПХ и
аутоиммунных расстройств [4].
В последние годы накопилось достаточ-
но разнообразных данных, которые позволяют
прогнозировать положительный эффект от ис-
пользования иммуносупрессорных олигонукле-
отидов – антагонистов TLR9 при острой РТПХ.
Хотя активные последовательности INH-ODN
известны из литературы [5], ключ к возможному
клиническому применению данных олигонукле-
отидов лежит в их химической модификации с
целью обеспечить продолжительный биологиче-
ский эффект in vivo. Впервые полученные нами
олигонуклеотиды с мезилфосфорамидными
группами (μ-ODN), успешно проявившие себя
в роли антисмысловых регуляторов экспрессии
генов [10, 11], а также показавшие высокую им-
муностимуляторную активность in vitro [2], в за-
висимости от нуклеотидного контекста могут
также проявлять иммуносупрессорную актив-
ность. Однако выбор только одной из доступных
групп – тиофосфатной (PS) или мезилфосфора-
мидной (μ), как представляется, не в полной мере
отвечает задаче создания реально действующего
лекарственного препарата. Широко известна
токсичность PS-олигонуклеотидов. В то же время
μ-ODN для наиболее полного проявления своих
преимуществ нуждаются в средствах доставки,
таких как катионные липосомы [11]. Выходом из
такой ситуации представляется сочетание в од-
ном олигонуклеотиде и тиофосфатных, и мезил-
фосфорамидных групп. Эта идея недавно нашла
свое подтверждение, когда олигонуклеотиды со
смешанным набором фосфатных модификаций
оказались наиболее активными [3].
Таким образом, представляется обоснован-
ным выбор олигонуклеотидов со смешанным на-
бором фосфатных модификаций (тиофосфатных
и мезилфосфорамидных групп) как перспектив-
ного объекта исследования в области создания
иммуносупрессорных олигонуклеотидов. В дан-
ном исследовании ODN с μ-модификациями из-
учались как потенциальные иммуносупрессоры
in vitro для применения при РТПХ в дальнейшем.
Одним из наиболее значимых результатов может
стать создание иммуносупрессорных олигону-
клеотидов нового типа с более выраженным и
пролонгированным эффектом и меньшей ток-
сичностью, чем у традиционных тиофосфатных
производных, для использования при развитии
острой РТПХ после пересадки костного мозга.
Материалы и методы
Олигонуклеотиды были синтезированы на
автоматическом синтезаторе ДНК ASM-800Е
(ООО «Биос сет», г. Новосибирск, Россия) с ис-
пользованием стандартных β-цианэтильных
амидофосфитов дезоксинуклеозидов и соответ-
ствующих полимерных носителей с привиты-
ми 3›-нуклеозидами на основе пористого стекла
(CPG). Синтез олигонуклеотидов с модифици-
рованными фосфатными группами проводили с
изменением в протоколе амидофосфитного син-
теза, включающего замену окисления иодом. Ти-
офосфаты (PS-ODN) получали реакцией тиони-
рования с использованием Sulfurizing Reagent II
(3-((диметиламинометилиден)амино)-3H-1,2,4-
дитиазол-3-тион) (Glen Research, США). Оли-
годезоксинуклеотиды с мезилфосфорамидными
модификациями (μ-ODN) получали реакцией
Штаудингера с метансульфонилазидом (мези-
лазидом) в течение 30 мин, как описано в рабо-
те [10].
Очищенные олигонуклеотиды растворяли
в 50%-ном ацетонитриле и определяли кон-
центрацию по оптической плотности раство-
ра с помощью УФ-спектрофотометра Implen
NanoPhotometer N80 (Implen, Германия). Элек-
трофорез для определения чистоты олигонукле-
отидов проводили в 20% ПААГ толщиной 0,4 мм.
Визуализация полос проводилась окрашиванием
геля красителем Stains-All.
Работа in vitro проведена на лимфоцитах се-
лезенки (спленоцитах) мышей линии C57Bl6,
самки. Пролиферативную активность лимфоци-
тов селезенки оценивали с помощью WST-1 cell
proliferation assay Kit (Takara Bio USA, США).
Оценка секреции IL-12p70 лимфоцитами се-
лезенки на фоне добавления INH-ODN была
проведена иммуноферментным методом (Mouse
IL-12р70 ELISA kit, ABclonal, Китай). После со-
вместного культивирования клеток в 96-луноч-
ный круглодонном планшете (0,7 × 106 клеток в
лунке) с СpG-ODN в концентрации 2,5 мкг/
мл
в стандартных условиях (Т = 37 °C, 5% CO2), че-
рез 2 ч добавляли INH-ODN в концентрациях
2,5 мкг/
мл и 5 мкг/мл. Через 24 ч отбирали супер-
натанты и измеряли уровень цитокинов на муль-
тимодальном планшетном ридере LB 941 TriStar
(Berthold Technologies, Германия), при длинах

28
Gavrilova E.D. et al.
Гаврилова Е.Д. и др.
Russian Journal of Immunology/Rossiyskiy Immunologicheskiy Zhurnal
Российский иммунологический журнал
волн 450 нм и 620 нм согласно рекомендациям
производителя.
Модель СpG-стимулированной пролифера-
ции спленоцитов in vitro проводили следующим
способом: вносили клетки селезенки в 96-луноч-
ный плоскодонный планшет (0,1 × 106 клеток в
лунке) одновременно с СpG-ODN в концентра-
ции 2,5 мкг/мл, через 2 ч добавляли INH-ODN в
концентрации от 2,5 мкг/мл до 20 мкг/мл в три-
плексах. Через 72 ч в каждую лунку культураль-
ного планшета вносили 10 мкл WST-1, тщательно
перемешивали, инкубировали в CO2-инкубаторе
в течение 4 ч в стандартных условиях (Т = 37 °C,
5% CO2, увлажненная атмосфера). После этого
производилась детекция показателей оптическо-
го поглощения на мультимодальном планшетном
ридере LB 941 TriStar (Berthold Technologies, Гер-
мания), при длинах волн 450 нм и 620 нм соглас-
но рекомендациям производителя.
Полученные данные использовали для вычис-
ления процента ингибиции:
Aотн = (1-(Aоо/Aок)) × 100%,
где Aоо – значение оптического поглощения
для образца INH-ODN, Aок – значение оптиче-
ского поглощения СpG-ODN.
Исследования повторяли в трех независимых
экспериментах на спленоцитах мышей линии
C57Bl6. Статистическую обработку проводили
в пакете прикладных программ Statistica 6.0 для
Windows. Данные представлены в виде средних
значений. Для выявления значимых значений
сравниваемых показателей использовали непара-
метрические критерии Манна–Уитни. Выявлен-
ные различий считались статистически значимы-
ми при р < 0,05.
Результаты и обсуждение
В качестве иммуносупрессорных олигоде-
зоксинуклеотидов (INH-ODNs) были выбраны
известные из литературы тиофосфатные оли-
годезоксинуклеотиды А151 (2), ODN 2088 (5)
и ODN4084-F (8). Кроме того, были синтези-
рованы их контроли, описанные в литературе,
С151 (3), ODN2088С (7), также содержащие ти-
офосфатные (PS) межнуклеотидные группы. Им-
муносупрессорные ODN выбранные в данной
работе (2, 5 и 8) содержат G-богатые участки, и
механизм их действия может включать образо-
вание G-квадруплекса [5], а как ранее нами по-
казано, G-богатые μ-ODN способны образовы-
вать G-квадруплексы, слабо отличаю щиеся по
устойчивости от нативных [15]. На основе инги-
биторных последовательностей А151, ODN2088,
ODN4084-F были синтезированы аналоги – ти-
офосфатные олигодезоксинуклеотиды с ме-
зилфосфорамидными (μ) модификациями по
GpG-связям, а именно: олигодезоксинуклеоти-
ды μ-А151 (4), μ-ODN2088 (6) и μ-ODN4084-F
(9). Для активации дендритных клеток был
cинтезирован контрольный иммуностимули-
рующий CpG-олигодезоксинуклеотид (CpG-
ODN) SD-101 (1) в полностью тиофосфатном
(PS) варианте.
Таким образом, в исследовании всего были
синтезированы и использованы девять олигоде-
зоксинуклеотидов, в том числе восемь из них –
иммуносупрессорных: SD-101 PS (1) – 5′tscsgs
asascs g
ststs c
sgsas a
scsgs t
stscs g
sasas c
sgsts t
scsgs a
sast3′;
A-151(2) – 5′tstsas g
sgsgs t
stsas g
sgsgs t
stsas g
sgsgs t
stsas
gsgsg3′; C-151(3) – 5′tstscs asasas t
stscs asasas t
stscs asasas
tstscs asasa3′; μ-А151(4) – 5′tstsas gμgμgs tstsas gμgμgs tstsas
gμgμgs tstsas gμgμg3′; ODN2088 (5) – 5′tscscs tsgsgs csgsgs
gsgsas asgst3′; μ-ODN2088 (6) – 5′tscscs t
sgμgs c
sgμgμ
gμgsas asgst 3′; ODN2088С(7) – 5′tscscs tsgsas gscsts tsgsas
asgst3′; ODN4084-F (8) – 5′cscsts gsgsas tsgsgs gsasa 3′;
μ-ODN4084-F (9) – 5′cscsts gμgsas tsgμgμ gsasa3′.
Скрининг иммуносупрессорных свойств ин-
гибиторных олигонуклеотидов INH-ODNs на
СpG-стимулированную пролиферацию сплено-
цитов in vitro был проведен при добавлении INH-
ODNs в дозах от 2,5 до 20 мкг/мл, чтобы варианты
соотношений СpG-ODN: INH-ODN составляли
1:1, 1:2, 1:4, 1:8.
Для оценки пролиферативной активности
спленоцитов мы выбрали метод с использова-
нием соли тетразолия (WST-1). В отличие от
метода с использованием радиактивной метки
(Н3-тимидин) этот способ оценки является аб-
солютно безопасным, а в сравнении с другими
красителями WST используется без дополнитель-
ных стадий при добавлении в культуру клеток и
показываeт лучшую воспроизводимость и более
высокую чувствительность [1]. Данные по сумме
трех независимых экспериментов представлены
в таблице 1. По измеренной оптической плотно-
сти подсчитан уровень ингибиции для каждого из
ODNs по формуле, приведенной в материалах и
методах, и представлен в процентах.
Как видно из таблицы 1, из всех исследуемых
ODN олигонуклеотиды A151 (2) и ODN4084 (8),
описанные в литературе, проявляют наиболее
сильную ингибицию в интервале от 59% до 66,4%.
Во всех дозах подавление достоверное (р = 0,009,
р = 0,009, р = 0,009, р = 0,014), в случае ODN2 и
(р = 0,009, р = 0,047, р = 0,009, р = 0,014) в случае
ODN8. Мы не наблюдали выраженной зависи-
мости ингибиции от дозы, что видно из того, что
дозы в 4 и 8 раз выше дозы для CpG-стимуляции
не дают должного эффекта. Таким образом, для
дальнейших исследований можно брать дозы
INH-ODN в равной концентрации c CpG-ODN
(2,5 мкг/мл), или в концентрации, не превышаю-
щей двукратное увеличение, т. е. 5 мкг/мл. В случае
модифицированного аналога μ-ODN4084-F (9)

29
Скрининг иммуносупрессорных олигонуклеотидов в модели in vitro
In vitro screening of immunosuppressive compounds2025, Vol. 28, № 1
2025, Т. 28, № 1
уровень ингибиции для него сопоставим с уров-
нем оригинального ODN4084-F (8) и составляет
от 58,5% до 64,3%. (табл. 1). Для μ-А151 (4) инги-
биция почти в два раза ниже, чем у оригинального
A151 (2) (рис. 1). Результаты исследования влия-
ния ODN2088 (5) в сравнении с его контролем
ODN2088С (7) и модифицированным аналогом
μ-ODN2088 (6) на пролиферативную активность
CpG-стимулированных спленоцитов представле-
ны в таблице 1. Индекс ингибиции оригинально-
го ODN2088 (5) варьировал от 54,2% до 57,7%, что
несколько ниже, чем ингибиция описанных выше
ODN. При этом его модифицированный аналог
μ-ODN2088 (6) не показывает такой значимой
ингибиции (практически в два раза снижена до
31% в случае соотношения 1:1, 1:4, при двукрат-
ной дозе ODN – ингибиция пролифератиной ак-
тивности составила 42%, достигает 55,4% только
для максимальной восьмикратной дозы (табл. 1).
Возможно, эту модификацию целесообразнее ис-
пользовать в более высоких дозах, чем оригиналь-
ный ODN, что требует дополнительных исследо-
ваний. Оценка пролиферативной активности при
совместном культивировании с ODN2088С (7) не
дает достоверной ингибиции ни в одной из дози-
ровок. ODN7 во всех экспериментах ингибирует
только до 20-30%.
В отдельной серии экспериментов был осущест-
влен скрининг иммуносупрессорных ингибитор-
ных олигонуклеотидов (INH-ODNs) и контролей
на секрецию IL-12 СpG-стимулированными спле-
ноцитов in vitro. Для оценки секреции IL-12 реше-
но было взять только две дозы ODN 2,5 мкг/
мл и
5 мкг/мл (в соотношении 1:1 и 1:2 к CpG-ODN,
соответственно), учитывая описанные выше ре-
зультаты скрининга ODN. Данные измерений
(в пкг/
мл) представлены на рисунке 1.
Относительно CpG-стимулированных спле-
ноцитов, при пролиферации которых секреция
IL-12 достигает 141 пкг/мл, добавление любых
(INH-ODN) снижает секрецию IL-12 в той или
иной степени. ODNА151 (2) снижает наиболее
активно – синтез данного цитокина в этом слу-
чае опускается до 50 пкг/мл и 64 пкг/мл при до-
зах ODN 2,5 мкг/мл и 5 мкг/мл соответственно.
При этом нужно отметить, что A-151 (2) дает
прирост секреции цитокина на 28% в большей,
двойной дозе. В противоположность двойная
доза ODN4084-F (8) существенно снижает синтез
IL-
12 относительно уровня цитокина, синтезиру-
емого при более низких дозах соответствующего
ODN, а именно до 35 пкг/мл в дозе 5 мкг/
мл и
только до 81 пкг/мл в дозе 2,5 мкг/мл. Для его
аналога μ-ODN4084-F (9) тенденция к снижению
наблюдается незначительная, с 105 пкг/
мл до
89 пкг/мл (в дозе 2,5 и 5 мкг/мл соответственно).
Модифицированный аналог μ-А151 (4) снижает
секрецию IL-12 до 90 пкг/мл и 81 пкг/мл в дозе
2,5 и 5 мкг/мл внесения в культуру соответствен-
но). Таким образом, мезильные аналоги μ-А151
(4) и μ-ODN4084-F (9) в данном эксперименте
проявляют несколько более высокую способ-
ность к стимуляции синтеза IL-12 по сравнению
с исходным соответствующим ODN. В случае
ТАБЛИЦА 1. УРОВЕНЬ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ В МОДЕЛИ CpG-CТИМУЛИРОВАННЫХ
СПЛЕНОЦИТОВ ПРИ ДОБАВЛЕНИИ INH-ODN (%)
TABLE 1. LEVEL INHIBITION OF PROLIFERATIVE ACTIVITY IN THE MODEL OF CpG-STIMULATED SPLENOCYTES WITH
THE ADDITION OF INH-ODN (%)
Олигонуклеотиды
Oligonucleotide
Соотношение дозы CpG к INH-ODN
Dose ratio of CpG to INH-ODN
1:1 1:2 1:4 1:8
A 151 64 65 59 66,4
C 151 40,8 36,5 42,7 58,5
μμ-А151 39,2 34,6 47 48,1
ODN 2088 54,2 55,8 55,8 57,7
μμ-ODN 2088 31 42 31,2 55,4
ODN 2088 С 22 25 4,2 30,4
ODN 4084 65,8 60 62,4 64,3
μμ-ODN 4084-F 58,5 62,3 66,2 64,3
Примечание. INH-ODN в дозах 2,5 мкг/мл (1:1), 5 мкг/мл (1:2), 10 мкг/мл (1:4) и 20 мкг/мл (1:8). Полужирным шрифтом
выделены ODN c наиболее высоким процентом ингибирования, курсивом – с наиболее низким.
Note. INH-ODN at doses of 2,5 μg/mL (1:1), 5 μg/mL (1:2), 10 μg/mL (1:4) and 20 μg/mL (1:8). ODNs with the highest percentage
of inhibition are in bold, and the lowest in italics.

30
Gavrilova E.D. et al.
Гаврилова Е.Д. и др.
Russian Journal of Immunology/Rossiyskiy Immunologicheskiy Zhurnal
Российский иммунологический журнал
ODN2088 (5), его модифицированное произво-
дное μ-ODN2088 (6) немного активнее снижает
синтез IL-12. Для μ-ODN2088 (6) синтез цитоки-
на опускается до 100 пкг/мл и 57 пкг/мл – при до-
зах ODN 2,5 мкг/мл и 5 мкг/мл, соответственно,
против 114 пкг/мл и 84 пкг/мл при добавлении
ODN2088 (5).
Наше исследование направлено на разработ-
ку новой стратегии индукции иммунологической
толерантности путем воздействия на сигнальные
пути дендритных клеток с помощью иммуносу-
прессорных олигонуклеотидов, выступающих
как антагонисты TLR9 и обеспечивающих сни-
жение уровня экспрессии ко-стимуляторных
молекул CD40, CD80 и CD86, молекул MHC
класса II, а также снижение секреции провоспа-
лительных цитокинов IL-1, IL-6 IL-12 и TNFα.
В данном исследовании из синтезированных
восьми ODN нам необходимо было определить
наиболее перспективные in vitro для использова-
ния их на модели in vivo в дальнейшем.
Заключение
В данной работе нами изучены 8 химиче-
ски модифицированных ингибиторных оли-
гонуклеотидов. Наибольшей супрессорной
активностью in vitro во всех исследуемых до-
зах обладают описанные в литературе олигону-
клеотиды с PS-межнуклеотидными группами
A151 (2), ODN4084-F (8), а также модифици-
рованный мезильной группой олигонуклеотид
μ-ODN4084-F (9). Были выбраны оптимальные
концентрация INH-ODN 2,5 или 5 мкг/мл в зави-
симости от последовательности олигодезоксину-
клеотида. Была отработана схема оптимального
соотношения иммуностимуляторных CpG-ODN
и иммуносупрессорных INH-ODN (1:1, 1:2) при
внесении в культуру спленоцитов. Первичный
скрининг иммуносупрессорных олигонуклеоти-
дов в культуре in vitro по их влиянию на пролифе-
рацию спленоцитов и продукцию IL-12 позволил
выделить несколько наиболее активных соедине-
ний и определить характер последовательности с
наиболее выраженными иммунодепрессивными
свойствами, а также установить оптимальные
концентрации изучаемых олигодезоксинуклео-
тидов для дальнейших исследований in vitro.
Необходимы дальнейшие исследования в мы-
шиных экспериментальных моделях, в частности
на модели острой РТПХ, чтобы проанализиро-
вать эффективность μ-модифицированных ти-
офосфатных иммуносупресорных ODN на из-
менения баланса Th1/Th2, что позволит снизить
негативные последствия трансплантации и уве-
личить продолжительность жизни животных.
Рисунок 1. Продукция цитокина IL-12p70 СpG-стимулированными лимфоцитами селезенки
Примечание. По оси ординат – концентрация (пкг/мл), по оси абсцисс – группы ODN и cоотношение доз CpG: INH-ODN. Светлый
столбик – СpG-стимулированные спленоциты без INH-ODN; серый столбик – доза 1:1 (2,5 мкг/мл); черный столбик – доза 1:2
(5 мкг/мл). 1 – необработанный контроль; 2 – СpG; 3 – ODN2; 4 – ODN3; 5 – ODN4; 6 – ODN5; 7 – ODN6; 8 – ODN7; 9 – ODN8; 10 –
ODN9.
Figure 1. Production of IL-12p70 cytokine by CpG-stimulated splenic lymphocytes
Note. Y-axis concentration (pg/mL). The abscissa shows ODN groups and the CpG doses ratio: IND-ODN. Light column, CpG-stimulated
splenocytes without ODN; gray column, dose 1: 1 (2,5 μg/mL); black column, dose 1: 2 (5 μg/mL). 1, NTC; 2, CpG; 3, ODN2; 4, ODN3; 5, ODN4;
6, ODN5; 7, ODN6; 8, ODN7; 9, ODN8; 10, ODN9.
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

31
Скрининг иммуносупрессорных олигонуклеотидов в модели in vitro
In vitro screening of immunosuppressive compounds2025, Vol. 28, № 1
2025, Т. 28, № 1
Список литературы / References
1. Головинская О.В., Байкова М.Л., Алпатова Н.А., Зубков Д.А., Фоменко В.В., Гайдерова Л.А. Сравни-
тельный анализ красителей, используемых при оценке специфической активности лекарственных средств
на основе филграстима биологическим методом in vitro // БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, ле-
чение, 2020. Т. 20, № 3. С. 193-201. [Golovinskaya O.V., Baykova M.L., Alpatova N.A., Zubkov D.A., FomenkoV.V.,
Gaiderova L.A. Comparative analysis of dyes used in assessing the specic activity of lgrastim-based drugs using a
biological method in vitro. BIOpreparaty. Prolaktika, diagnostika, lechenie=Biopreparations. Prevention, Diagnosis,
Treatment, 2020, Vol. 20, no. 3, pp. 193-201. (In Russ.)]
2. Останин А.А., Леплина О.Ю., Буракова Е.А., Тыринова Т.В., Фокина А.А., Проскурина А.С., Бога-
чевС.С., Стеценко Д.А., Черных Е.Р. CpG олигонуклеотиды с модифицированными фосфатными группами
индуцируют созревание миелоидных дендритных клеток человека in vitro // Вавиловский журнал генетики
и селекции, 2020. Т.24, № 6. С. 653-660. [Ostanin A.A., Leplina O.Y., Burakova E.A., Tyrinova T.V., Fokina A.A.,
Proskurina A.S., Bogachev S.S., Stetsenko D.A., Chernykh E.R. Phosphate-modied CpG oligonucleotides induce
in vitro maturation of human myeloid dendritic cells. Vavilovskiy zhurnal genetiki i selektsii = Vavilov Journal of
Genetics and Breeding. 2020, Vol. 24, no 6, pp. 653-660. (In Russ.)]
3. Anderson B.A., Freestone G.C., Low A., De-Hoyos C.L., III W.J.D., Østergaard M.E., Migawa M.T., Fazio, M.,
Wan, W.B., Berdeja, A., Scandalis E., Burel S.A., Vickers T.A., Crooke S.T., Swayze E.E., Liang X., Seth P.P. Towards
next generation antisense oligonucleotides: mesylphosphoramidate modication improves therapeutic index and
duration of eect of gapmer antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Res., 2021, Vol. 49, no. 16, pp. 9026–9041.
4. Audiger C., Rahman M.J., Yun T.J., Tarbell K.V., Lesage S. e importance of dendritic cells in maintaining
immune tolerance. J. Immunol., 2017, Vol. 198, pp. 2223-2231.
5. Bayik D., Gursel I., Klinman D.M. Structure, mechanism and therapeutic utility of immunosuppressive
oligonucleotides. Pharmacol. Res., 2016, Vol. 105, pp. 216-225.
6. Gratwohl A., Baldomero H. Trends of hematopoietic stem cell transplantation in the third millennium.
Curr. Opin. Hematol., 2009, Vol. 16, no. 6, pp. 420-426.
7. Hania M., Collin M., Ginhoux F. Ontogeny and functional specialization of dendritic cells in human and
mouse. Adv. Immunol., 2013, Vol. 120, pp. 1-49.
8. Lutz M.B. Induction of CD4(+) regulatory and polarized eector/helper T cells by dendritic cells. Immune
Netw., 2016, no. 16, pp. 13-25.
9. Maldonado R.A., von Andrian U.H. How tolerogenic dendritic cells induce regulatory T cells. Adv.
Immunol., 2010, Vol. 108, pp. 111-165.
10. Miroshnichenko S.K., Patutina O.A., Burakova E.A., Chelobanov B.P., Fokina A.A., Vlassov V.V.,
Altman S., Zenkova M.A., Stetsenko D.A. Mesyl phosphoramidate antisense oligonucleotides as an alternative to
phosphorothioates with improved biochemical and biological properties. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2019, Vol. 116,
no. 4, рр. 1229-1234.
11. Patutina O.A., Gaponova (Miroshnichenko) S.K., Senkova A.V., Savin I.A., Gladkikh D.V., Burakova E.A.,
Fokina A.A., Maslov M.A., Shmendel E.V., Wood M.J.A., Vlassov V.V., Altman S., Stetsenko D.A., Zenkova M.A.
Mesyl phosphoramidate backbone modied antisense oligonucleotides targeting miR-21 with enhanced in vivo
therapeutic potency. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2020, Vol. 117, no. 51, рр. 32370-32379.
12. Qian C., Cao X. Dendritic cells in the regulation of immunity and inammation. Semin. Immunol., 2018,
Vol. 35, no. 2, pp. 3-11.
13. Raker V.K., Domogalla M.P., Steinbrink K. Tolerogenic dendritic cells for regulatory T cell induction in
man. Front. Immunol., 2015, Vol. 6, 569. doi: 10.3389/mmu.2015.00569.
14. Socié G., Blazar B.R. Acute gra-versus-host disease: from the bench to the bedside. Blood, 2009, Vol. 114,
no. 20, pp. 4327-4336.
15. Su Y., Fujii H., Burakova E.A., Chelobanov B.P., Fujii M., Stetsenko D.A., Filichev V.V. Neutral and negatively
charged phosphate modications altering thermal stability, kinetics of formation and monovalent ion dependence
of DNA G-Quadruplexes. Chem. Asian J., 2019, Vol. 14, no. 8, pp. 1212-1220.
Авторы:
Гаврилова Е.Д. – к.б.н., заведующая лабораторией
экспериментальной иммунотерапии ФГБНУ «Научно-
исследовательский институт фундаментальной
и клинической иммунологии»; старший научный
сотрудник лаборатории иммунологии нуклеиновых
кислот ФГБНУ «Федеральный исследовательский
центр “Институт цитологии и генетики Сибирского
отделения Российской академии наук”», г. Новосибирск,
Россия
Authors:
Gavrilova E.D., PhD (Biology), Head, Laboratory of
Experimental Immunotherapy, Research Institute of
Fundamental and Clinical Immunology; Senior Research
Associate, Laboratory of Immunology of Nucleic Scids,
Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch, Russian
Academy of Sciences, Novosibirsk, Russian Federation

32
Gavrilova E.D. et al.
Гаврилова Е.Д. и др.
Russian Journal of Immunology/Rossiyskiy Immunologicheskiy Zhurnal
Российский иммунологический журнал
Гойман Е.В. – к.м.н., научный сотрудник лаборатории
экспериментальной иммунотерапии ФГБНУ «Научно-
исследовательский институт фундаментальной и
клинической иммунологии»; инженер лаборатории
иммунологии нуклеиновых кислот ФГБНУ «Федеральный
исследовательский центр “Институт цитологии и
генетики Сибирского отделения Российской академии
наук”», г. Новосибирск, Россия
Держалова А.Ш. – младший научный сотрудник
лаборатории иммунологии нуклеиновых кислот ФГБНУ
«Федеральный исследовательский центр “Институт
цитологии и генетики Сибирского отделения
Российской академии наук”», г. Новосибирск, Россия
Стеценко Д.А. – к.х.н., заведующий лабораторией
химии нуклеиновых кислот ФГБНУ «Федеральный
исследовательский центр “Институт цитологии
и генетики Сибирского отделения Российской
академии наук”»; заведующий Российско-франко-
японской лабораторией бионанотехнологии ФГАОУ ВО
«Новосибирский национальный исследовательский
государственный университет», г. Новосибирск, Россия
Буракова Е.А. – к.х.н., заведующая лабораторией
иммунологии нуклеиновых кислот ФГБНУ «Федеральный
исследовательский центр “Институт цитологии и
генетики Сибирского отделения Российской академии
наук”»; научный сотрудник Российско-франко-
японской лаборатории бионанотехнологии ФГАОУ ВО
«Новосибирский национальный исследовательский
государственный университет», г. Новосибирск, Россия
Goiman E.V., PhD (Medicine), Research Associate,
Laboratory of Experimental Immunotherapy, Research
Institute of Fundamental and Clinical Immunology; Engineer,
Laboratory of Immunology of Nucleic Acids, Institute of
Cytology and Genetics, Siberian Branch, Russian Academy of
Sciences, Novosibirsk, Russian Federation
Derzalova A.Sh., Junior Research Associate, Laboratory
of Immunology of Nucleic Acids, Institute of Cytology and
Genetics, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences,
Novosibirsk, Russian Federation
Stetsenko D.A., PhD (Chemistry), Head, Laboratory
of Chemistry of Nucleic Acids, Institute of Cytology
and Genetics, Siberian Branch, Russian Academy of
Sciences; Head, Russo-Franco-Japanese Laboratory of
Bionanotechnology, Faculty of Physics, Novosibirsk State
University, Novosibirsk, Russian Federation
Burakova E.A., PhD (Chemistry), Head, Laboratory
of Immunology of Nucleic Acids, Institute of Cytology and
Genetics, Siberian Branch, Russian Academy of Sciences;
Research Associate, Russo-Franco-Japanese Laboratory
of Bionanotechnology, Faculty of Physics, Novosibirsk State
University, Novosibirsk, Russian Federation
Поступила 07.05.2024
Принята к печати 31.07.2024
Received 07.05.2024
Accepted 31.07.2024