Content uploaded by Olga Loginova
Author content
All content in this area was uploaded by Olga Loginova on Feb 14, 2024
Content may be subject to copyright.
Т. 28, № 4, 2023 Вестник Ивановской медицинской академии 23
УДК632.939:612.112.94:612.63 DOI 10.52246/1606-8157_2023_28_4_23
МЕТАБОЛИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ РАЗНЫХ СУБПОПУЛЯЦИЙ
НАТУРАЛЬНЫХ КИЛЛЕРОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ
ПРИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ ПРОТЕКАЮЩЕЙ БЕРЕМЕННОСТИ
Е. Г. Орлова1, доктор биологических наук,
О. А. Логинова1, 3, кандидат биологических наук,
О. Л. Горбунова1, кандидат биологических наук,
Н. В. Каримова2,
Н. П. Логинова3, доктор медицинских наук,
С. В. Ширшев1, доктор медицинских наук
1 Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН – филиал ПФИЦ УрО РАН, 614081, Россия,
г.Пермь, ул. Голева, д. 13
2 ООО «Централизованная клинико-диагностическая лаборатория», 614025, Россия, г. Пермь, ул. Серпу-
ховская, д. 4а, оф. 1
3 ФГБОУ ВО ПГМУ им. академика Е.А. Вагнера Минздрава России, 614990, Россия, г. Пермь, ул. Петро-
павловская, д. 26
РЕЗЮМЕ Цель– оценить метаболическую активность разных субпопуляций натуральных киллеров
(NK-клеток) периферической крови в I и в III триместрах физиологически протекающей беремен-
ности (ФПБ).
Материал и методы. В исследование включены здоровые женщины в I или III триместрах ФПБ.
Группу сравнения составили условно-здоровые небеременные женщины в фолликулярной фазе
менструального цикла.
Объектом исследования являлась периферическая кровь. Метаболическую активность оценивали
по экспрессии белка-транспортера глюкозы Glut-1 и включению митохондриального зонда Mito-
Spy Green, отражающего массу и объем митохондриального компартмента, методом проточной
цитофлюориметрии на регуляторных (CD56brightCD16-), цитотоксических (CD56dimCD16+), минорных
цитотоксических (CD56-CD16hi) NK-клетках.
Результаты и обсуждение. У небеременных количество метаболически активных клеток, экспрес-
сирующих Glut-1 и имеющих большую массу и объем митохондрий (Mito+), значительно выше в
субпопуляции цитотоксических CD56-CD16hiNK-клеток, чем среди регуляторных CD56brightCD16- и
цитотоксических CD56dimCD16+NK-клеток. В I тримеcтре беременности уровень Glut-1+Mito+ ре-
гуляторных CD56brightCD16- и цитотоксических CD56dimCD16+NK-клеток значительно нарастает
по сравнению с таковым у небеременных, тогда как процент цитотоксических Glut-1+Mito+CD56-
CD16hiNK-клеток остается высоким, но не меняется. В III триместре количество Glut-1+Mito+ регу-
ляторных CD56brightCD16-NK-клеток остается выше, чем у небеременных. Количество цитотокси-
ческих Glut-1+Mito+CD56dimCD16+NK-клеток снижается по сравнению с таковым у небеременных, а
Glut-1+Mito+CD56-CD16hiNK – по отношению к I триместру.
Заключение. При ФПБ увеличивается количество метаболически активных цитотоксических и ре-
гуляторных NK-клеток периферической крови.
Ключевые слова: натуральные киллеры, беременность, Glut-1, масса митохондрий.
* Ответственный за переписку (corresponding author): orlova_katy@mail.ru
24 Метаболический статус натуральных киллеров при беременности
Натуральные киллеры (NK-клетки) относятся к
клеткам врожденного иммунитета и участвуют
в противовирусной и противоопухолевой за-
щите. Преобладающая субпопуляция NK-клеток
периферической крови (более 90%) имеет фе-
нотип CD56dim CD16+ и характеризуется высокой
цитотоксичностью [2]. CD56brightCD16-NK-клетки
составляют менее 10 % и являются регулятор-
ными, активно синтезируют цитокины, имеют
ограниченную цитотоксичность [2]. Также при-
сутствует субпопуляция цитотоксических CD56-
CD16hiNK-клеток, которые, очевидно, являются
терминально дифференцированными, но их
функции до конца не изучены [3, 10].
При ФПБ функции NK-клеток существенно ме-
няются, что необходимо для сохранения бере-
менности [7]. В первом триместре клетки тро-
фобласта начинают экспрессировать молекулы
НLA и происходит лютеоплацентарная смена,
что является причиной высокой частоты спон-
танных абортов [9]. Цитотоксический потенци-
ал и продукция провоспалительных цитокинов
NK-клетками периферической крови снижаются
[2, 5, 7]. Регуляторные NK-клетки в ранние сроки
беременности мигрируют из периферической
крови в матку, где трансформируются в деци-
дуальные NK-клетки и подавляют цитотоксиче-
ские реакции к антигенам плода, продуцируют
факторы роста трофобласта [2, 5, 7]. В III триме-
стре изменения иммунореактивности связаны с
подготовкой к родам [2, 5, 7]. Нарастание коли-
чества и цитотоксичности NK-клеток при бере-
менности является одной из причин спонтанных
абортов и других патологий беременности (пре-
эклампсии) [1, 8, 9].
Функции NK-клеток зависят от их метаболиче-
ской активности. Они используют глюкозу как
основной источник энергии, которая поступа-
ет в клетку при участии белков-транспортеров
(Glut-1). Метаболизм глюкозы включает гликолиз
и окислительное фосфорилирование. Незрелые
NK-клетки обладают высокой метаболической
активностью и преимущественно используют
гликолиз даже при достаточном присутствии кис-
лорода. По мере созревания NK-клеток поглоще-
ние глюкозы, экспрессия ферментов гликолиза
снижаются, а окислительное фосфорилирование
становится основной метаболической програм-
мой зрелых нестимулированных NK-клеток. При
их активации увеличивается экспрессия Glut-1 и
потребление глюкозы, интенсивность гликолиза
и окислительного фосфорилирования, нарастает
масса митохондрий. Однако изменение этих по-
казателей при ФПБ не изучены.
Целью данной работы является исследование
метаболической активности разных субпопу-
ляций NK-клеток периферической крови в I и III
триместрах ФПБ.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В исследование включено 20 женщин, среди
которых было 7 беременных в I триместре и 5
пациенток в III триместре ФПБ. В группу сравне-
ния вошли 8 условно-здоровых небеременных
женщин в фолликулярной фазе менструального
цикла.
Критерии включения: наличие одной и более
успешных беременностей; отсутствие патоло-
гии беременности в прошлом и настоящем; от-
сутствие острых и хронических соматических,
эндокринных, аутоиммунных, генетических за-
болеваний; отрицание диет, приема контрацеп-
тивных, гормональных, противовоспалительных
или антибактериальных препаратов; наличие
добровольного информированного согласия на
использование биологического материала.
Характеристика групп представлена в таблице.
Таблица. Клиническая и демографическая характеристика участниц исследования
Исследуемые группы Me(Q1-Q3)
возраст, лет срок беременности, недель
Небеременные женщины (n=8) 29 (20–37) –
Беременные, I триместр (n=78) 26 (21–35) 10 (5–12)
Беременные, III триместр (n=5) 33 (27–41) 35 (28–39)
Т. 28, № 4, 2023 Вестник Ивановской медицинской академии 25
Объектом исследования являлась перифериче-
ская кровь, которую забирали из локтевой вены
утром натощак в вакуумные пробирки с этилен-
диаминтетрауксусной кислотой в качестве анти-
коагулянта.
Количество NK-клеток разных субпопуляций в
периферической крови определяли методом
проточной цитометрии.
В исследуемых субпопуляциях NK-клеток оцени-
вали процент клеток, позитивных по экспрессии
Glut-1 (Glut-1+), и включению митохондриально-
го зонда MitoSpy Green (Mito+) [4].
Увеличение экспрессии Glut-1 происходит при
активации NK-клеток и свидетельствует об уси-
лении потребления глюкозы, интенсивности
гликолиза и/или окислительного фосфорили-
рования, сопровождается нарастанием массы
мито хондрий.
Краситель MitoSpy Green избирательно нака-
пливается в матриксе митохондрий, где связы-
вается белками митохондрий [4]. Накопление
MitoSpy Green в клетке прямо пропорционально
массе и объему митохондриального компарт-
мента. Увеличение массы и объема митохон-
дрий может быть свидетельством преобладания
анаболических процессов над катаболически-
ми, что сопровождается усилением биогенеза
митохондрий.
Статистический анализ проводили с помощью
программы Prism 8.0.1. (Graphpad, США). Для
проверки нормальности распределения ис-
пользовали критерий Колмогорова – Смирно-
ва. Данные представлены в виде медианы (Me),
нижних (LQ) и верхних квартилей (UQ). Досто-
верность различий между группами определяли
с использованием критерия Крускала– Уоллиса
для множественных сравнений независимых пе-
ременных. Различия считали достоверными при
p<0,05.
Исследование одобрено локальным этическим
комитетом ИЭГМ УрО РАН (протокол № 16 от
05.06.2022) и проведено в соответствии с этиче-
скими стандартами национального комитета по
исследовательской этике и Хельсинкской декла-
рации 1964 года с ее последующими изменения-
ми или сопоставимыми нормам этики.
Работа выполнена при поддержке Российского
научного фонда (проект № 22-25-00694).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
У небеременных количество метаболически ак-
тивированных клеток, экспрессирующих Glut-1
и имеющих большую массу и объем митохон-
дрий (Mito+), значительно выше в субпопуляции
цитотоксических CD56-CD16hiNK-клеток, чем
среди регуляторных CD56brightCD16- и цитотокси-
ческих CD56dimCD16+NK-клеток (рис.).
Согласно данным литературы, цитотоксиче-
ские CD56-CD16hiNK-клетки являются конечной
стадией дифференцировки NK-клеток и обла-
дают наибольшей цитотоксичностью, с чем, по-
видимому, связана их высокая метаболическая
активность [3, 10].
В I тримеcтре беременности уровень мета-
болически активных (Glut-1+Mito+) регуля-
торных CD56brightCD16-и цитотоксических
CD56dimCD16+NK-клеток значительно нарастает
по сравнению с таковыми у небеременных. Со-
гласно данным литературы, именно в I триме-
стре происходят наиболее значимые изменения
функциональной активности NK-клеток перифе-
рической крови, что, согласно полученным ре-
зультатам, ассоциировано с увеличением потре-
бления глюкозы и активации метаболизма. Тогда
как процент цитотоксических Glut-1+Mito+CD56-
CD16hiNK-клеток остается высоким, но не меня-
ется по сравнению с таковым у небеременных,
что, по-видимому, связано с их исходно повы-
шенной метаболической активностью.
В III триместре количество Glut-1+Mito+ регулятор-
ных CD56brightCD16- NK-клеток остается повышен-
ным по сравнению с таковым у небеременных,
тогда как уровень Glut-1+Mito+клеток в субпопу-
ляции цитотоксических CD56dimCD16+NK-клеток
снижается и не отличается от аналогичного по-
казателя у небеременных. Можно полагать, что у
регуляторных NK-клеток потребление глюкозы
и, как следствие, метаболическая активность в
III триместре остаются повышенными, тогда как
у преобладающей субпопуляции цитотоксиче-
ских NK-клеток метаболическая активность воз-
вращается к исходным значениям, таким, как у
небеременных. Количество Glut-1+Mito+клеток в
26 Метаболический статус натуральных киллеров при беременности
субпопуляции цитотоксических CD56-CD16hiNK в
III триместре беременности снижается по срав-
нению с I триместром, но в общей популяции
NK-клеток они остаются наиболее метаболиче-
ски активными.
Анализируя полученные результаты, следует
отметить, что ведущими регуляторами функ-
циональной активности клеток иммунной си-
стемы при ФПБ являются гормоны, продуциру-
емые плацентой [6, 9], к большинству которых
NK-клетки экспрессируют рецепторы [6, 9].
Под влиянием гормонов гестации происходит
системное угнетение цитотоксической актив-
ности NK-клеток периферической крови, что
необходимо для успешного протекания бе-
ременности, поскольку цитотоксические NK-
клетки способны атаковать клетки плода, несу-
щие чужеродные антигены [2, 5, 8]. Полученные
результаты свидетельствуют о том, что угнете-
ние цитотоксичности NK-клеток (CD56dimCD16+;
CD56-NKCD16hi), наиболее значимое на ранних
сроках беременности, сопровождается уве-
личением метаболической активности этих
клеток. А к концу беременности метаболиче-
ская активность цитотоксических NK-клеток
снижается до исходных значений, таких, как у
небеременных, что необходимо для защиты
организма матери от инфекций и подготовке к
родам. Регуляторные CD56brightCD16-NK-клетки,
основной функцией которых является про-
дукция цитокинов и фетотрофических факто-
ров, сохраняют повышенную метаболическую
активность до конца беременности. Следова-
тельно, регуляция метаболизма в NK-клетках
является важным механизмом контроля их
функциональной активности. А нарушение этих
механизмов может стать причиной патологий
беременности иммунного генеза. Полученные
результаты имеют важное практическое зна-
чение, поскольку активированные NK-клетки
широко используются для лечения онкологи-
ческих заболеваний.
Рис. Процент клеток, позитивных по экспрессии Glut-1 и включению митохондриального зонда MitoSpy Green
(Glut-1+Mito+), в разных субпопуляциях NK-клеток периферической крови у небеременных (NP), беременных в
I (I) и III (III) триместрах ФПБ.
Примечание: CD56brightCD16-NK– регуляторные, CD16+CD56dimNK и CD56-CD16hiNK– цитотоксические NK-клетки.
Т. 28, № 4, 2023 Вестник Ивановской медицинской академии 27
ЛИТЕРАТУРА
1. Гребнева О.С., Зильбер М.Ю. Особенности субпо-
пуляционного состава иммунокомпетентных кле-
ток плацент после преждевременной отслойки.
Пермский медицинский журнал 2015;32(1):12-17.
https://doi.org/10.17816/pmj32112-17.
2. Михайлова В.А., Белякова К.Л., Сельков С.А., Со-
колов Д.И. Особенности дифференцировки NK-
клеток: CD56dim и CD56bright NK-клетки во время и
вне беременности. Медицинская иммунология.
2017;19(1):19-26. https://doi.org/10.15789/1563-
0625-2017-1-19-26.
3. Cocker ATH, Liu F, Djaoud Z, Guethlein LA, ParhamP.
CD56-negative NK cells: Frequency in peripheral
blood, expansion during HIV-1 infection, functional
capacity and KIR expression. Frontiers in Immunol-
ogy. 2022;13:992723. https://doi.org/10.3389/m-
mu.2022.992723.
4. Cottet-Rousselle C, Ronot X, Leverve X, Mayol JF Cy-
tometric assessment of mitochondria using uores-
cent probes. Cytometry Part A. 2011;79(6):405-425.
https://doi.org/10.1002/cyto.a.21061.
5. Mikhailova V, Grebenkina P, Khokhlova E, Davydova
A, Salloum Z, Tyshchuk E, Zagainova V, Markova K,
Kogan I, Selkov S, Sokolov D Pro- and anti-inamma-
tory cytokines in the context of NK cell-trophoblast
interactions. International Journal of Molecular Sci-
ences. 2022;23(4):2387. https://doi.org/10.3390/
ijms23042387.
6. Shirshev SV, Nekrasova IV, Gorbunova OL, Orlova
EG Hormonal regulation of NK cell cytotoxic activ-
ity. Doklady Biological Sciences. 2017;472(1):28-30.
https://doi.org/10.1134/S0012496617010021.
7. Shojaei Z, Jafarpour R, Mehdizadeh S, Bayatipoor
H, Pashangzadeh S, Motallebnezhad M Functional
prominence of natural killer cells and natural killer
T cells in pregnancy and infertility: A comprehensive
review and update. Pathology Research and Prac-
tice. 2022;238:154062. https://doi.org/10.1016/j.
prp.2022.154062.
8. Sotnikova N, Voronin D, Antsiferova Y, Bukina E In-
teraction of decidual CD56+NK with trophoblast
cells during normal pregnancy and recurrent spon-
taneous abortion at early term of gestation. Scandi-
navian Journal of Immunology. 2014;80(3):198-208.
https://doi.org/10.1111/sji.12196.
9. Szekeres-Bartho J. Progesterone-mediated immuno-
modulation in pregnancy: its relevance to leukocyte
immunotherapy of recurrent miscarriage. Immuno-
therapy. 2009;5:873-882. https://doi.org/10.2217/
imt.09.54. PMID: 20636029.
10. Wijaya RS, Read SA, Schibeci S, Han S, Azardaryany
MK, van der Poorten D, Lin R, Yuen L, Lam V, Doug-
las MW, George J, Ahlenstiel G Expansion of dys-
functional CD56-CD16+ NK cells in chronic hepatitis
B patients. Liver International. 2021;41(5):969-981.
https://doi.org/10.1111/liv.14784.
ВЫВОДЫ
1. При ФПБ регуляторные NK-клетки сохраняют
повышенную метаболическую активность и в
I, и в III триместрах.
2. В I триместре ФПБ цитотоксические NK-клетки
имеют повышенную метаболическую актив-
ность, которая в III триместре снижается до
исходных значений.
28 Метаболический статус натуральных киллеров при беременности
METABOLIC ACTIVITY OF VARIOUS SUBPOPULATIONS OF NATURAL KILLERS OF PERIPHERAL BLOOD IN
PHYSIOLOGICALLY OCCURING PREGNANCY
Е. G. Оrlova, О. А. Loginova, О. L. Gorbunova, N. V. Кarimova, N. P. Loginova, S. V. Shirshev
ABSTRACT Objective – to estimate metabolic activity of various subpopulations of natural killers
(NK-cells) of peripheral blood in the rst and third trimesters of physiologically occurring pregnancy
(POP).
Мaterial and methods. Healthy women in the rst or in the third trimester of POP were enrolled in the
study. Comparison group was formed of conditionally healthy women in the follicular phase of the men-
strual cycle.
Peripheral blood was the object of the research. Metabolic activity was evaluated by expression of glu-
cose transporter protein Glut-1 and activation of the mitochondrial probe MitoSpyGreen, reected the
mass and the volume of mitochondrial compartment, by ow cytouorometry method on regulatory
(CD56brightCD16-), cytotoxic (CD56dimCD16+), minor cytotoxic (CD56-CD16hi)NK-cells.
Results and discussion. In non-pregnant women the quantity of metabolically activated cells express-
ing Glut-1 and having larger mass and volume of mitochondria (Mito+), was signicantly higher in the
subpopulation of cytotoxic CD56-CD16hiNK-cells than among regulatory CD56brightCD16- and cyto-
toxic CD56dimCD16+NK-cells. In the rst trimester of pregnancy the level of Glut-1+Mito+ regulatory CD-
56brightCD16- and cytotoxic CD56dimCD16+ NK-cells signicantly increased in comparison with the same
level in non-pregnant women, then how the percentage of cytotoxic Glut-1+Mito+CD56-CD16hiNK-
cells remained high but did not change. In the III trimester the quantity of Glut-1+Mito+ regulatory
CD56brightCD16-NK-cells remained higher than in non-pregnant women. The quantity of cytotoxic Glut-
1+Mito+CD56dimCD16+NK-cells decreased in comparison with the same parameter in non-pregnant wom-
en, and Glut-1+Mito+CD56-CD16hiNK-cells in relation to the rst trimester.
Conclusion. The quantity of metabolically cytotoxic and regulatory NK-cells of peripheral blood increased
in POP.
Key words: natural killers, pregnancy, Glut-1, мitochondria mass.
