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Analyse biochimique du bis(monoacylglycérol)phosphate dans les cellules monocytiques THP-1 et étude de son rôle sur le trafic intracellulaire du cholestérol

Authors:

Abstract

L’objectif de ce travail a été de caractériser le Bis(Monoacylglycérol)Phosphate (BMP) dans les macrophages issus de la lignée monocytaire humaine THP-1, ainsi que d’appréhender son rôle possible dans la régulation de l’homéostasie du cholestérol. Nous avons montré par immunofluorescence que le BMP est localisé de façon quasi-exclusive au niveau des endosomes tardifs. Dans les macrophages THP-1, le BMP représente environ 1 à 2% des phospholipides totaux. L’analyse en chromatographie en phase gazeuse des esters méthyliques des acides gras du BMP cellulaire révèle une majorité d’acide oléique. Le BMP présente en outre une richesse particulière en acides gras poly insaturés, notamment en acide docosahexaénoïque ou DHA. Lors de l’incubation des macrophages THP-1 avec du DHA exogène, nous avons observé que cet acide gras est incorporé de façon importante dans le BMP comparativement aux autres phospholipides. A l’inverse, bien qu’entrant dans la composition du BMP à l’état basal, nous n’avons constaté aucune incorporation d’acide arachidonique exogène. Nos différents résultats suggèrent une sélectivité d’incorporation du DHA dans le BMP, comparativement aux autres acides gras. Nous avons également observé cette sélectivité dans une lignée cellulaire de fibroblastes de hamster, suggérant un métabolisme commun dans les cellules de mammifères. Ce travail a également mis en évidence l’implication du BMP dans le trafic intracellulaire du cholestérol. Lorsque les macrophages en culture sont incubés en présence de l’anticorps anti-BMP, l’anticorps est internalisé et s’accumule dans les endosomes tardifs. Cette accumulation est associée à celle du cholestérol dans ces endosomes. L’étude des différentes voies métaboliques du cholestérol dérivé des lipoprotéines de basse densité suggère que l’anticorps anti-BMP diminue l’efflux du cholestérol médié par les HDL.
N° d’ordre : 2006-ISAL-00131 Année 2006
THESE
Présentée devant
L’INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON
Pour obtenir
LE GRADE DE DOCTEUR
Spécialité BIOCHIMIE
par
Nelly BESSON
DEA de Biochimie
Analyse biochimique du bis(monoacylglycérol)phosphate dans les cellules
monocytiques THP-1 et étude de son rôle sur le trafic intracellulaire
du cholestérol
Jury : M. le Dr. JM. CHARDIGNY (rapporteur)
M. le Dr. T. KOBAYASHI
M. le Dr. M. LAGARDE
M. le Dr. M. NARCE (examinateur)
M. le Dr. M. RECORD (rapporteur)
M. le Dr. F. THIES (rapporteur)
Mme le Dr. I. VANDENBROUCKE
1
Novembre 2003
INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON
Directeur : STORCK A.
Professeurs :
AMGHAR Y. LIRIS
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BOISSON C. VIBRATIONS-ACOUSTIQUE
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3
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4
INSA DE LYON
DEPARTEMENT DES ETUDES DOCTORALES
Ecoles Doctorales et Diplômes d’Etudes Approfondies
habilités pour la période 2004-2008
(ii) E
COLE
DOCTO
RALE
NOM ET COORDONNEES DU RESPONSABLE
CHIMIE DE LYON M. Denis SINOU
Université Claude Bernard Lyon 1
Lab Synthèse Asymétrique UMR UCB/CNRS 5622
Bât 308
2ème étage
43 bd du 11 novembre 1918
69622 VILLEURBANNE Cedex
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sinou@univ-lyon1.fr
ECONOMIE, ESPACE ET MODELISATION
DES COMPORTEMENTS
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Université Lyon 2
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ELECTRONIQUE, ELECTROTECHNIQUE,
AUTOMATIQUE
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Laboratoire Physique de la Matière
Bâtiment Blaise Pascal
69621 VILLEURBANNE Cedex
Tél : 04.72.43.64.43
Daniel.Barbier@insa-lyon.fr
E2M2
EVOLUTION, ECOSYSTEME,
MICROBIOLOGIE, MODELISATION
http://biomserv.univ-lyon1.fr/E2M2
M. Jean-Pierre FLANDROIS
UMR 5558 Biométrie et Biologie Evolutive
Equipe Dynamique des Populations Bactériennes
Faculté de Médecine Lyon-Sud Laboratoire de Bactériologie BP
1269600 OULLINS
Tél : 04.78.86.31.50
Jean-Pierre.Flandrois@biomserv.univ-lyon1.fr
EDIIS
INFORMATIQUE ET INFORMATION POUR LA
SOCIETE
http://www.insa-lyon.fr/ediis
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EDIIS
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69621 VILLEURBANNE Cedex
Tél : 04.72.43.60.55
lbrunie@if.insa-lyon.fr
INTERDISCIPLINAIRE SCIENCES-SANTE
http://www.ibcp.fr/ediss
M. Alain Jean COZZONE
IBCP (UCBL1)
7 passage du Vercors
69367 LYON Cedex 07
Tél : 04.72.72.26.75
cozzone@ibcp.fr
MATERIAUX DE LYON
http://www.ec-lyon.fr/sites/edml
M. Jacques JOSEPH
Ecole Centrale de Lyon
Bât F7 Lab. Sciences et Techniques des Matériaux et des
Surfaces
36 Avenue Guy de Collongue BP 163
69131 ECULLY Cedex
5
Tél : 04.72.18.62.51
Jacques.Joseph@ec-lyon.fr
MATHEMATIQUES ET INFORMATIQUE
FONDAMENTALE
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M. Franck WAGNER
Université Claude Bernard Lyon1
Institut Girard Desargues
UMR 5028 MATHEMATIQUES
Bâtiment Doyen Jean Braconnier
Bureau 101 Bis, 1er étage
69622 VILLEURBANNE Cedex
Tél : 04.72.43.27.86
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MECANIQUE, ENERGETIQUE, GENIE
CIVIL, ACOUSTIQUE
http://www.lmfa.ec-lyon.fr/autres/MEGA/index.html
M. François SIDOROFF
Ecole Centrale de Lyon
Lab. Tribologie et Dynamique des Systêmes Bât G8
36 avenue Guy de Collongue
BP 163
69131 ECULLY Cedex
Tél :04.72.18.62.14
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6
A mes parents,
Qui avez été présents quels que furent mes choix,
même lorsqu’ils vous échappaient, …
7
Remerciements
Les recherches qui font l’objet de ce mémoire ont été réalisées dans le laboratoire de
Physiopathologie des Lipides et Membranes de l’INSA de Lyon, Unité INSERM 585, dirigé
par le professeur Michel Lagarde.
Je tiens à exprimer mes remerciements à
Monsieur le Professeur Michel Lagarde pour la confiance qu’il m’a accordé en
m’accueillant au sein de son laboratoire.
Madame le Docteur Isabelle Vandenbroucke, que je remercie chaleureusement pour avoir
accepté la ’’co’’-direction des dernières années de ce travail. Je lui suis également
reconnaissante de son implication active dans les étapes fastidieuses de la fin de thèse.
Monsieur le Docteur Toshihide Kobayashi, que je remercie d’avoir accepté d’encadrer ce
travail malgré la longue distance. Je tiens à lui exprimer mes chaleureux remerciements pour
m’avoir accueilli au sein de son laboratoire, sans oublier la visite guidée de Tokyo. Cette
aventure restera un souvenir très fort.
Monsieur le Docteur Jean-François Pageaux. Je tiens à lui exprimer mes vifs
remerciements pour avoir ‘’co’’-encadré les premières années de ce travail ainsi que pour
avoir su me convaincre de l’importance de cette molécule tant mystérieuse qu’est le BMP.
Ainsi qu’aux rapporteurs et examinateur de ce travail.
Messieurs les Docteur Michel Chardigny, Michel Narce, Michel Record et Franck Thies.
Je les remercie chaleureusement pour avoir eu l’obligeance d’être rapporteur de ce travail.
La qualité et la pertinence de leurs remarques m’ont permis d’améliorer la qualité de ce
mémoire. Je les remercie également de m’avoir permis de profiter de leurs connaissances et
compétences.
8
Je tiens à présenter mes remerciements au Pr. AJ. Cozzone, pour sa patience et son
écoute attentive ainsi que m’avoir toujours accordé son soutien et sa confiance.
Je souhaite remercier très chaleureusement les membres du laboratoire Riken au
Japon pour l’excellent accueil qu’ils m’ont réservé au cours de mon périple au pays du soleil
levant et pour m’avoir fait découvrir tant de choses. Je remercie plus particulièrement Asami
Makino, qu’aucune manip’ n’effraie, pour discussions animées, pour m’avoir fait goûter à sa
culture si différente de la mienne, ainsi que pour m’avoir totalement prise en charge pendant
ces deux semaines fabuleuses.
Mes sincères remerciements vont également à l’ensemble des membres du
laboratoire de physiopathologie des lipides et membranes. Je vous remercie tous pour
votre accueil au sein du laboratoire, mais surtout pour la confiance que vous m’avez
témoignée, le soutien indéfectible tout au long de ces 5 années et vos précieux
encouragements.
Marie-Caroline, ma « voleuse » de labo, mais qui n’a finalement volé qu’un peu de la
désolation du rez de chaussée et apporté une bonne dose de bonne humeur et de
dynamisme. Qui aurait cru que nous échangerions nos villes !
Sabine, ma compagne de galère sur le LBPA de synthèse (et ses fameux 3 pics !!!)… j’ai
vraiment eu de la chance de faire ma « rentrée des classes » dans l’U585 en même temps
que toi car…que de bons moments, de fou rires, et de discussions en tout genre !!!! J’espère
toujours suivre, même si c’est à distance, ta charmante petite famille !!!
Fabien, notre Nicolas Hulot de l’informatique : toujours prêt à sauver un PC même le
dimanche contre un gâteau au chocolat. Bon, on s’est beaucoup « charié », mais on a
surtout passé de très bons moments au rez de chaussée. Quel trio infernal avec Sabine !!!!
Et un grand merci pour ta patience pour ces 5 années pendant lesquelles j’ai souvent pris
ton bureau comme refuge pour « vomir » mes soucis de thésarde…et aussi pour avoir mis
ta musculature au service de mon déménagement !!!
Sandrine, pour avoir toujours pris de mes nouvelles et pour m’avoir accordé ton soutien.
Hiba, Saida M., et Amal, le trio du troisième étage, pour nos échanges volubiles
« d’expériences » de thésardes.
9
Alain G., pour nos agréables discussions ainsi que pour la très édifiante visite guidée de
Paris…
Caroline Z., pour nos discussions dans le couloir du RDC, à propos de nos chers « élèves ».
Bader, j’aurais toujours une chtite pensée pour toi le 10 mars
A tous les deux, bon courage, la fin est proche !!!!
Olga, pour avoir, même rapidement, souvent passé la tête dans l’encadrement de ma porte
de bureau sur votre chemin vers l’ascenseur.
Madeleine P. pour nos échanges devant le compteur à scintillation
Madeleine D. pour nos mises au point en catimini du logiciel d’analyse des spectres de la
chromato gazeuse.
Catherine et Evelyne, pour nos quelques rencontres autour d’une poche de sang mais
surtout pour avoir toujours pris de mes nouvelles et m’avoir encouragé à persévérer.
Alain S. pour nos quelques rencontres dans le bureau de Jean François.
Nathalie, pour nos échanges autour de nos expériences japonnaises.
Christophe, le petit dernier de la bande du RDC, en souvenir de cette «fabuleuse »
formation à l’expérimentation animale.
Gabriel et Valérie P., pour avoir éclairé les néophytes que nous étions sur le chemin des
modifications des LDL.
Un grand merci également à mes amis qui, bien que loin des passions de la
recherche scientifique, ont suivi cette aventure.
Eric, je bénie ce soir où je t’ai recroisé place Ampère. Merci pour ces Ôh !!! combien
regrettés moments dans le quartier des antiquaires, pour cette belle aventure parmi les
médecins de notre patrie, pour toutes ces heures passées à fouiller dans ton réseau pour me
trouver une solution mais aussi pour m’avoir initiée au bon vin.
10
Josiane et Christiane, mes mamans de l’école de santé des armées, je vous remercie
vraiment du fond du cœur pour ces 2 années passées au sein de cette jolie institution, et
pour vous être battues pour que je reste le plus longtemps possible et ainsi m’assurer un
revenu pendant les mois difficiles de la fin de thèse.
Un grand merci à mes amis du master, Céline, Julien, Morgan qui ont eu le courage de
venir m’écouter (et ont tenu pendant ces 3heures !!! ) et, pour tout ce qu’ils représentent…
Je finirai par mes « essentiels », mon petit coin de paradis, ces personnes, qui parfois
se confondent avec des anges ou des fées tant ils adoucissent les jours…
Michèle, ma petite maman…Merci pour avoir vécu cette thèse aussi intensément que moi et
pour cette étincelle de fierté dans tes yeux, même dans les pires moments où beaucoup
doutaient de l’issue de cette aventure et tout simplement merci pour tout ce que tu es…Je
suis totalement fan de ce petit bout de femme !!!!!
Caro, merci Arilait pour m’avoir permis de découvrir une amie. Un énorme merci pour ces
nombreux moments passer à tenter de me réconforter, pour m’avoir communiqué un peu de
cette belle capacité à voir le positif, pour m’avoir totalement pris en charge pendant mes
séjours lyonnais (et surtout pendant ces 20 et 21 décembre), et pour être toujours présente
malgré la distance. Qui a dit que wonderwoman n’existait pas !!!!
Delphine, la troisième drôle de dame !!!!! Merci pour être venue jusqu’au RDC où j’étais
consignée et avoir répandu un peu de bonne humeur à cet étage déserté, pour m’avoir fait
partager ton envie de croquer la vie, pour m’avoir longuement écouté, soutenu, motivé et
m’avoir redonné confiance. Décidément, que de belles rencontres dans cette U585!!!!
Courage, la délivrance est proche pour toi aussi !!!!
Patrick, mon Patrick, que serait cette unité sans toi !!! Tu as toujours répondu présent dans
les multiples rebondissements de ma vie que ce soit pour me consoler, me déménager, me
convaincre qu’il y avait encore de l’espoir (la preuve !!!), me trouver un logement parisien au
pied levé, imprimer mes exemplaires de thèse, … et parfois tu répondais tellement
rapidement, je n’avais même pas le temps de décrocher mon téléphone, que l’ascenseur
était déjà là…Enfin, mon héros, quoi !!!
11
Véro, la Référence de cette unité qui répond à toutes nos questions. Merci d’avoir toujours
pris le temps d’écouter mes petits soucis, d’avoir géré certains aspects administratifs de
cette fin de thèse et pour toutes nos sorties (même celle où il a fallu venir me chercher dans
un arbre !!!)
Lilian, décidément Bourg nous réussi : serments, retrouvailles…pas si anodine comme
ville !!!!. Cela aurait été du gâchis de ne pas retrouver notre jolie amitié. Merci pour avoir
écouté toutes mes aventures, pour ton soutien dans tous mes choix (même lorsqu’il a fallu
me déménager de Paris à Rennes) et pour tes petits plats à tomber !!!
Saïda A., ma binôme de tellement d’aventures…par quoi commencer ? Merci, malgré la
distance, d’avoir toujours pris le temps de suivre mes aventures, de me rassurer et me
réconforter. Je sais que tu regrettes autant que moi de n’avoir pas été là ce 21 décembre,
mais qu’elle belle raison !!!!
12
Résumé
L’objectif de ce travail a été de caractériser le Bis(Monoacylglycérol)Phosphate (BMP) dans
les macrophages issus de la lignée monocytaire humaine THP-1, ainsi que d’appréhender son
rôle possible dans la régulation de l’homéostasie du cholestérol.
Nous avons tout d’abord analysé la localisation du BMP par immunofluorescence. Le
marquage à l’aide d’un anticorps anti-BMP et l’utilisation de marqueurs spécifiques montre que le
BMP est localisé de façon quasi-exclusive au niveau des endosomes tardifs. Nous avons optimisé
les conditions de purification du BMP extrait des macrophages THP-1 par chromatographie sur
couche mince et/ou chromatographie liquide à haute performance afin de procéder à son analyse
biochimique. Dans les macrophages THP-1, le BMP représente environ 1 à 2% des
phospholipides totaux. L’analyse en chromatographie en phase gazeuse des esters méthyliques
des acides gras du BMP cellulaire révèle une majorité d’acide oléique (18 :1 n-9). Le BMP
présente en outre une richesse particulière en acides gras poly insaturés, notamment en acide
docosahexaénoïque ou DHA (22 :6 n-3). Lors de l’incubation des macrophages THP-1 avec du
DHA exogène, nous avons observé que cet acide gras est incorporé de façon importante dans le
BMP comparativement aux autres phospholipides. A l’inverse, bien qu’entrant dans la
composition du BMP à l’état basal, nous n’avons constaté aucune incorporation d’acide
arachidonique exogène. Nos différents résultats suggèrent une sélectivité d’incorporation du DHA
dans le BMP, comparativement aux autres acides gras. Nous avons également observé cette
sélectivité dans une lignée cellulaire de fibroblastes de hamster, suggérant un métabolisme
commun dans les cellules de mammifères.
Ce travail a également mis en évidence l’implication du BMP dans le trafic intracellulaire du
cholestérol. Lorsque les macrophages en culture sont incubés en présence de l’anticorps anti-
BMP, l’anticorps est internalisé et s’accumule dans les endosomes tardifs. Cette accumulation est
associée à celle du cholestérol dans ces endosomes. L’étude des différentes voies métaboliques
du cholestérol dérivé des lipoprotéines de basse densité (LDL) suggère que l’anticorps anti-BMP
diminue l’efflux du cholestérol médié par les HDL.
8
Summary
Bis(monoacylglycero)phosphate (BMP), also called as lysobisphosphatidic acid (LBPA), is
a phospholipid highly enriched in the internal membranes of late endosomes, in which it forms
specialized lipid domains. Little is known about the biosynthesis and metabolism of this lipid. We
examined its fatty acid composition and the incorporation of exogenous fatty acids to BMP in the
human monocytic leukemia cell line THP-1. The BMP fatty acid composition in THP-1
macrophages exhibits elevated amount of oleic acid (OA) (18:1n-9) and enrichment of
polyunsaturated fatty acids, especially docosahexaenoic acid (DHA) (22:6n-3). DHA
supplemented to the medium was efficiently incorporated to BMP. In contrast, arachidonic acid
(AA) (20:4n-6) was hardly esterified to BMP under the same experimental conditions. Our
observation suggests that DHA is able to replace other fatty acids in existing pools of BMP, rather
than being incorporated in newly synthesized BMP. DHA turned over in BMP similarly to other
phospholipids. Specific incorporation of DHA to BMP was also observed in baby hamster kidney
(BHK) fibroblasts, although BMP in BHK cells contains very little DHA in normal growth conditions.
Our results, together with published observations, suggest that the specific incorporation of DHA
to BMP is a common phenomenon in mammalian cells. The physiological significance of DHA-
enriched BMP is discussed. It has been suggested that BMP-rich membranes regulate cholesterol
transport. Here we examined the effect of an anti-BMP antibody on cholesterol metabolism and
transport in THP-1, during loading with acetylated LDL (acLDL). Anti-BMP antibody was
internalized and accumulated. Cholesterol staining with filipin and mass measurements indicate
that acLDL-stimulated accumulation of free cholesterol was enhanced in macrophages that have
accumulated the antibody. However, cholesterol efflux to high density lipoproteins (HDL) was
reduced in antibody-treated cells. The present results suggest that the accumulation of anti-BMP
antibody alters cholesterol homeostasis in acLDL-loaded macrophages.
9
SOMMAIRE
AVANT-PROPOS………………………………………………………………..1
ABREVIATIONS………………………………………………………………....3
INTRODUCTION…………………………………………...…………………….6
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
CHAPITRE I : L’ATHEROSCLEROSE…………………………………………..……10
I Epidémiologie de l’athérosclérose..............................................................................10
II Physiopathologie de l’athérosclérose………………………………….………………...12
II-1 La paroi vasculaire artérielle…………………………………………………………12
II-2 Fonctions de la paroi artérielle………………………………………………………13
II-3 Les lésions athérosclérotiques .............. ………………………………………… 14
III L’athérogenèse……………………………………………………………………..………..18
III-1 Le processus athéromateux .............................................................................18
III-2 L’évolution des théories....................................................................................20
III-3 Rôle des macrophages dans le développement de l’athérosclérose............21
III-3-1 Amplification de leur propre recrutement………………………………………21
III-3-2 Fragilisation de la plaque ……………………………………………………….21
III-3-3 Entretien de la réaction inflammatoire………………………………………….22
III-4 Rôle des lipoprotéines dans l’athérosclérose.................................................22
III-4-1 Les lipoprotéines- structure……………………………………………………..22
III-4-2 Classification……………………………………………………………………...24
III-4-3 Métabolisme des lipoprotéines………………………………………………….25
III-5 Athérosclérose et acides gras poly insaturés (PUFA) :..................................30
III-5-1 Les AGPI n-3-généralités………………………………………………………..30
III-5-2 Incorporation et distribution……………………………………………………..30
III-5-3 Etudes épidémiologiques sur les effets des AGPI n-3……………………….32
III-5-4 AGPI n-3 et inflammation………………………………………………………..33
III-5-5 AGPI n-3 et recrutement des monocytes………………………………………34
III-5-6 AGPI n-3 et prolifération cellulaire……………………………………………...34
III-5-7 AGPI n-3, lipides et lipoprotéines plasmatiques…………...………………….35
10
CHAPITRE II : LES MACROPHAGES
I Origine et morphologie................................................................................................36
II Fonctions des macrophages......................................................................................38
II-1 Phagocytose........................................................................................................38
II-2 Présentation d’antigènes ...................................................................................38
II-3 Activation cellulaire et chimiotactisme............................................................38
III Trafic intracellulaire du cholestérol..........................................................................39
III-1 Capture des LDL ................................................................................................40
III-1-1 Endocytose des LDL par récepteur interposé…………………………………40
III-1-2 Phagocytose des LDL……………………………………………………………43
III-2 Transport du cholestérol à partir des endosomes tardifs et/ou lysosomes.44
III-3 Transport du cholestérol à partir du réticulum endoplasmique....................46
III-4 Transport du cholestérol de la membrane plasmique au réticulum
endoplasmique..................................................................................................47
III-5 Voie de l’ACAT : acyl-CoA : cholestérol transférase.....................................49
III-6 Transport du cholestérol à travers l’appareil de Golgi...................................50
III-7 Transport du cholestérol à partir de la membrane plasmique :
efflux du cholestérol.........................................................................................51
CHAPITRE III : LE BMP
I Structure du BMP .........................................................................................................53
I-1 Le squelette glycérophosphate ..........................................................................53
I-2 La composition en acides gras du BMP ............................................................55
II Le métabolisme du BMP.............................................................................................56
III Localisation cellulaire du BMP..................................................................................57
IV Rôle du BMP...............................................................................................................59
11
Objectifs………………………………………………………………………………………….62
MATERIELS ET METHODES
I Produits spécifiques et appareils ...............................................................................64
I-1 Produits utilisés...................................................................................................64
I-2 Appareils...............................................................................................................65
II Le matériel biologique.................................................................................................66
II-1 Les modèles cellulaires......................................................................................66
II-1-1 Lignée monocytaire humaine……………………………………….……………68
II-1-2 Lignée BHK………………………………………………………………………...68
II-2 Les lipoprotéines ................................................................................................69
II-2-1 Préparation des lipoprotéines……………………………………………………69
II-2-2 Modifications des LDL…………………………………………………………….69
II-2-3 Marquage des LDL avec le [H3]cholesteryl oléate…………………………….72
III Traitement des cellules..............................................................................................72
III-1 Incubation avec des acides gras : marquage radioactif des lipides
cellulaires et supplémentation.........................................................................72
III-2 Traitement des cellules avec l’anticorps anti-BMP.........................................73
III-3 Incubation des cellules avec les lipoprotéines ...............................................73
III-3-1 Incubation avec les LDL : captation et métabolisme des LDL………………73
III-3-2 Incubation avec les LDL marquées et les HDL : efflux du cholestérol……..74
III-4 Localisation du BMP par immunodetection et observation au microscope
à fluorescence...................................................................................................74
IV Analyse de lipides......................................................................................................75
IV-1 Extraction des lipides totaux à partir des cellules THP-1..............................75
IV-2 Séparation des classes et sous classes de lipides totaux par CCM.............75
IV-2-1 Séparation des classes de lipides totaux……………………………………...75
IV-2-2 Séparation des classes de phospholipides totaux.......................................76
IV-3 Analyse de la pureté du BMP par HPLC..........................................................77
IV-4 Séparation des lipides par HPLC .....................................................................77
IV-5 Analyse des acides gras par chromatographie en phase gazeuse...............78
IV-5-1 Appareillage et conditions d’analyse ........................................................78
IV-5-2 Préparation des échantillons et identification des acides gras .................78
12
IV-6 Analyse du cholestérol par chromatographie en phase gazeuse.................79
IV-6-1 Préparation des échantillons et identification ...........................................79
IV-6-2 Appareillage et conditions d’analyse ........................................................79
V Analyse statistique des résultats ..............................................................................79
RESULTATS
CHAPITRE 1: VALIDATION DU MODELE CELLULAIRE
DIFFERENCIATION DES MONOCYTES THP-1 EN MACROPHAGES
CAPTATION ET METABOLISME DES LIPOPROTEINES DE FAIBLE DENSITE 81
I Mise au point des conditions de différenciation des monocytes THP-1 en
macrophages.....................................................................................................81
I-1 L’adhérence cellulaire .........................................................................................82
I-2 Expression des récepteurs membranaires CD14 et CD11b ............................84
II Mise au point des conditions de captation et de métabolisme des lipoprotéines de
faible densité dans les macrophages THP-1 ..................................................87
II-1 Captation et métabolisme des LDL natives ou modifiées dans les macrophages
THP-1…..………………………………………………………………………………...……….87
II-2 Analyse de la composition en acides gras des esters de cholestérol...........89
II-3 Mesure de l’estérification du cholestérol..........................................................91
II-4 Analyse de l’efflux de cholestérol .....................................................................93
III Discussion ..................................................................................................................95
CHAPITRE 2 : PROFIL LIPIDIQUE DES CELLULES THP-1
CARACTERISATION DU BMP
METABOLISME COMPARE DE L’ACIDE DOCOSAHEXAENOÏQUE ET DE L’ACIDE
ARACHIDONIQUE...........................................................................................................98
I Profil lipidique des cellules THP-1..............................................................................98
II Caractérisation du BMP dans les macrophages THP-1……………………..101
II-1 Mise en évidence de la localisation subcellulaire du BMP dans les cellules THP-1
par détection immunocytochimique...................................................................101
II-2 Dosage et analyse du BMP dans les macrophages THP-1......................................107
II-2-1 Détection du BMP par HPLC à détection à barrette de diode et
détection radioactive ......................................................................................107
II-2-2 Analyse, quantification et composition en acides gras du BMP :.....110
13
III Métabolisme comparé de l'acide docosahéxaénoique et de l'acide
arachidonique…………………………………………………………………… 116
IV Remodelage des phospholipides riches en DHA…………………………127
V Incorporation sélective du DHA dans le BMP :
étude dans les fibroblastes BHK ...................................................................128
V-1 Mise en évidence du BMP dans les cellules BHK..........................................129
V-2 Sélectivité du BMP vis-à-vis du DHA………………..……………………………130
VI Discussion................................................................................................................133
CHAPITRE 3 : ROLE DU BMP SUR L’HOMEOSTASIE DU CHOLESTEROL
DANS LES MACROPHAGES THP-1: étude des effets de l’anticorps anti-BMP ......137
I Accumulation de l’anticorps anti-BMP dans les endosomes tardifs.....................137
II Effet de l’anticorps anti-BMP sur la distribution et le contenu du cholestérol
intracellulaire...................................................................................................140
III Analyse des effets de l’accumulation de l’anticorps anti-BMP sur le
métabolisme du cholestérol dérivé des LDL..............................................145
III-1 Effets sur le cholestérol libre…………………………………………………………….145
III-2 Effets sur le métabolisme des esters de cholestérol………………………………….147
III-3 Effet sur l'incorporation d'Ac-LDL………………………………………………………..151
IV Analyse des effets de l’accumulation de l’anticorps anti-BMP sur le
métabolisme d’efflux du cholestérol.............................................................152
III Discussion ................................................................................................................154
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES………………… …..…..158
REFERENCES…………………………………………………………………..162
14
PUBLICATIONS…………………………………………………………..…….208
8
AVANT-PROPOS
Le présent travail a fait l’objet des publications suivantes :
BESSON N., HULLIN-MATSUDA F., MAKINO A., MURATE M., LAGARDE M., PAGEAUX JF.,
KOBAYASHI T., and DELTON-VANDENBROUCKE I.
Selective incorporation of Docosahexaenoic Acid into Lysobisphosphatidic Acid in Cultured THP-1
macrophages. Lipids, 2006, 41(2), p189-196
DELTON-VANDENBROUCKE I., BOUVIER J., MAKINO A., BESSON N., PAGEAUX JF.,
LAGARDE M., and KOBAYASHI T.
Anti-bis(monoacylglycero)phosphate antibody induces the accumulation of low density lipoprotein-
derived cholesterol in cultured macrophages through alteration of transport and distribution.
Accepté dans Journal Lipid Research
et des communications affichées suivantes :
BESSON N., PAGEAUX J.F. and KOBAYASHI T.Selective incorporation of docosahexaenoic
acid into lysobisphosphatidic acid in cultured macrophages. 1er Congrès de Lipidomique, Gerli,
Paris, 2003
MAKINO A., MICHAUD S., BESSON N., LAGARDE M., CHANTEGREL B., PAGEAUX J. F.,
DOUTHEAU A., and KOBAYASHI T. Membrane properties of lysobisphosphatidic acid. 1er
Congrès de Lipidomique, Gerli, Paris, 2003.
BESSON N., KOBAYASHI T., PAGEAUX J.F., LAGARDE M. and DELTON-VANDENBROUCKE
I. Lysobisphosphatidic acid regulates cholesterol homeostasis in human macrophages.1er
congrès de la Nouvelle Société Française d’Atherosclérose, Biarritz, 2004
DELTON-VANDENBROUCKE, I., BESSON, N., MAKINO, A., PAGEAUX, J.F., LAGARDE, M.,
KOBAYASHI, T. Role of lysobisphosphatidic acid in LDL cholesterol transport and efflux in
macrophages. 46th International Conference on the Bioscience of Lipids (ICBL), Ajaccio, 2005.
BOUVIER, J., BESSON, N., MAKINO, A., PAGEAUX, J.F., LAGARDE, M., KOBAYASHI, T.,
DELTON-VANDENBROUCKE, I. Characterization of lysobisphosphatidic acid issued from
phosphatidylglycerol in raw macrophages. 46th International Conference on the Bioscience of
Lipids (ICBL), Ajaccio, 2005.
2
ABREVIATIONS
AA Acide arachidonique
ABCA1 ATP-binding cassette
ACAT Acyl-CoA cholestérol Acyl Transférase
Ac-LDL LDL acétylées
AG Acide gras
AGL Acide gras libre
AGMI Acide gras monoinsaturé
AGPI Acide gras polyinsaturé
AO Acide oléique
ApoA-1 Apolipoprotéine A1
ApoB Apolipoprotéine B
ATP Adénosyl triphosphate
AVC Accident vasculaire cérébral
BHK Baby Hamster Kidney
BMP Bis(monoacylglycerol)phosphate
BSA Albumine de sérum de bœuf
CCM Chromatographie couche mince
CE Esters de cholestérol
CML Cellule musculaire lisse
CSPG Protéoglycanne à chondroïdtines sulfates
DAG Diacylglycérol
DHA Acide docosahexaenoique
DHAP Dihydroxyacétonephosphate
DMSO Diméthylsulfoxide
DO Densité optique
DRM Membrane résistante aux détergents
EDTA Acide éthylène diaminetétraacétique
EPA Acide eicosapentaénoique
FACS Cytométre de flux couplé à un détecteur de fluorescence
GC Chromatographie en phase gazeuse
HDL High density lipoprotein, lipoprotéine de haut poids moléculaire
HMG-CoA 3-Hydroxy-3-MethylGlutaryl Coenzyme A
HPLC Chromatographie liquide haute performance
HSL Hormone sensitive lipase
HSPG Protéoglycanne à héparanes sulfates
ICAM-1 Intercellular Adhesion Molecule 1
IDM Infarctus du myocarde
IL interleukine
INFγ Interferon gamma
LBPA Acide lyso(bis) phosphatidique
LCAT Lecithine cholesterol acyl-transferase
LDL Low-density lipoprotein
LN Lipides neutres
LPG Lysophosphatidylglycerol
LPL Lipoprotéine lipase
LTB4 Leucotriene B4
M6PR Récepteur mannose 6 phosphate
MCP-1 Monocyte Chemotactic Protein-1
M-CSF Marophages Colony Stimulating Factor
MM-LDL LDL moyennent oxydées
3
MMP Metalloproteinase de la matrice
NPC Maladie de Niemann Pick C
NPC1 Niemann Pick C protein 1
Ox-LDL LDL fortement oxydées
PA Acide phosphatidique
PAF Platelet Activating Factor
PAM Macrophages alvéolaires pulmonaires
PBS Tampon phosphate 0,01M salin, isotonique, pH 7,4 à 37°C
PC Phosphatidylcholine
PDGF Facteurs de croissance plaquettaire
PE Phosphatidylethanolamine
PFA Paraformaldéhyde
PG Phosphatidylglycérol
PGE2 Prostaglandine E2
PGI2 Prostacycline
PI Phosphatidylinositol
PKC Protéine kinase C
PL Phospholipides
PLA1 Phospholipase A1
PLA2 Phospholipase A2
PMA Phorbol 12-myristate 13-acétate
PS Phosphatidylserine
RAGE Receptor for Advanced Glycation End
RE Réticulum endoplasmique
Rf Référence frontale
ROS Formes réactives de l'oxygène
SCAP SREBP Cleavage Activating Protein
SM Sphingomyeline
SR-A Récepteur "éboueur" de type A
SREBP Sterol Responsive Element Binding Protein
SVF Sérum de veau fœtal
TG Triglycerides
TGN Réseau transgolgien
TNF Tumor necrosis factor
UV Ultraviolet
VCAM-1 Vascular Cell Adhesion Molecule 1
VLDL Very-low density lipoprotein
18 :1 (n-9) Acide oléique, acide 9-octadecanoïque
18 :2 (n-6) Acide linoléique, acide 9,12-octadécadiénoïque
18 :3 (n-3) Acide linolénique, acide 9,12,15 octadécatriénoïque
20: 4 (n-6) Acide arachidonique, acide 8,11,14,17-eicotétraénoïque
22: 5 (n-3) Acide 7,10,13,16, 19 docosapentaénoïque
22: 6 (n-3) Acide 4,7,10,13,16, 19 docosahexaénoïque
4
INTRODUCTION
5
INTRODUCTION
Le cholestérol fait partie des lipides les plus importants de la cellule si on considère ses
rôles essentiels dans le maintien de la viabilité et des fonctions cellulaires. De nature amphiphile,
le cholestérol est un constituant structural essentiel des membranes et de la couche externe des
lipoprotéines plasmatiques.
Le cholestérol cellulaire a deux origines ; il peut être synthétisé de novo dans le réticulum
endoplasmique ou être capté par la cellule lors de l’endocytose des lipoprotéines de faible densité
(LDL) qui contiennent une forte proportion d’esters de cholestérol. Ces esters sont hydrolysés au
niveau des lysosomes/endosomes tardifs pour fournir du cholestérol à la cellule.
Dans les conditions physiologiques, le cholestérol est distribué dans la cellule pour enrichir
les pools de cholestérol des membranes cellulaires et principalement la membrane plasmique. On
estime qu’à l’état basal, 60 à 80% du cholestérol cellulaire se trouve au niveau de la membrane
plasmique. Les voies de transport du cholestérol depuis les pools intracellulaires vers la
membrane plasmique sont complexes. En particulier, les mécanismes mis en jeu dans le
transport du cholestérol à partir des lysosomes/endosomes tardifs ne sont pas complètement
caractérisés et demeurent sujet à controverses. On sait néanmoins que ce transport est crucial ;
en effet, lorsque la fonction endosomale est altérée, comme observé dans le syndrome de
Niemann-Pick de type C, le cholestérol s’accumule dans les endosomes tardifs et l’homéostasie
du cholestérol n’est plus assurée.
L’athérosclérose est une pathologie cardiovasculaire qui se caractérise par une
dérégulation de l’homéostasie du cholestérol au niveau du plasma sanguin et des cellules
vasculaires notamment des macrophages présents dans la paroi artérielle. L’homéostasie du
cholestérol est régulée dans les cellules par un ensemble complexe de mécanismes comprenant
notamment la synthèse de novo du cholestérol, la captation des LDL, les réactions d’hydrolyse et
d’estérification et l’efflux du cholestérol en excès hors de la cellule (Maxfield and Wustner,
2002;Vainio and Ikonen, 2003). Ces différentes étapes ont lieu dans des compartiments
cellulaires distincts et nécessitent donc un transport intracellulaire du cholestérol parfaitement
régulé. Durant l’athérogénèse, les macrophages accumulent massivement des esters de
cholestérol et du cholestérol libre, une caractéristique des cellules spumeuses. Les macrophages
devenus spumeux se déposent alors sur les parois vasculaires et causent l’apparition des
plaques d’athéromes, première étape de l’athérogénèse (Vainio and Ikonen, 2003). Une des
causes de l’accumulation de cholestérol pourrait être un défaut du transport intracellulaire du
cholestérol.
6
Le thème principal de recherche de l’équipe dans laquelle ce travail a été réalisé concerne
l’étude des relations entre les acides gras polyinsaturés, notamment les acides gras de la famille
n-3, le trafic intracellulaire du cholestérol et un phospholipide localisé de façon spécifique dans les
endosomes tardifs, le bis(monoacylglycero)phosphate ou BMP.
La génération d’un anticorps monoclonal (6C4) spécifiquement dirigé contre le BMP
(Kobayashi, et al., 1998) a permis de montrer que le BMP est hautement enrichi dans les
membranes internes des endosomes tardifs multivésiculaires dans lesquelles il forme des
microdomaines (Kobayashi, et al., 2002;Kobayashi, et al., 1998). Cet anticorps a permis par
ailleurs d’envisager des études fonctionnelles. Il a ainsi été montré que lorsque l’anticorps anti-
BMP est internalisé par des cellules BHK, il s’accumule dans les endosomes tardifs et altère
l’organisation des membranes internes ainsi que les propriétés de stockage et de redistribution
des endosomes tardifs, résultant en une accumulation massive de cholestérol dans ces mêmes
endosomes (Kobayashi, et al., 1999). Ces résultats ont été les premiers à suggérer le rôle du
BMP dans le fonctionnement endosomal et dans le transport intracellulaire du cholestérol
Par ailleurs, de nouvelles données biochimiques sur le BMP ont été apportées par des
travaux menés au laboratoire. En particulier, il a été montré que le BMP présente une forte
propension à accumuler l’acide docosahexaénoique (DHA), un acide gras polyinsaturé de la
famille n-3 (Luquain, et al., 2000). Ceci laisse présager un rôle biologique particulier du BMP
enrichi en DHA. Le DHA est un constituant majeur des huiles de poisson, bien connues pour leurs
effets protecteurs contre les maladies cardiovasculaires.
Il nous a paru intéressant de considérer un lien éventuel entre l’enrichissement en DHA du
BMP et l’activité fonctionnelle de ce dernier. Les macrophages étant des acteurs principaux de
l’accumulation de cholestérol dans le processus d’athérosclérose, nous avons choisi comme
modèle d’étude les macrophages issus de la lignée monocytaire humaine THP-1.
Dans ce cadre, mon travail a consisté à 1) identifier et caractériser le BMP dans les
macrophages THP-1, en particulier étudier la composition en acide gras du BMP en conditions
basales puis après incubation avec divers acides gras exogènes ; 2) étudier le rôle du BMP sur
l’homéostasie du cholestérol.
La première partie de ce mémoire est consacrée aux rappels bibliographiques. Après avoir
décrit les mécanismes de l’athérogenèse, nous avons abordé le rôle des macrophages dans ce
processus ainsi que les connaissances accumulées sur le trafic intracellulaire du cholestérol.
Enfin, dans un troisième chapitre, nous avons résumé l’ensemble des connaissances actuelles
sur le BMP.
7
La seconde partie traite des méthodes d’étude et d’analyse utilisées.
La troisième partie fait état des résultats expérimentaux. Elle comprend 3 chapitres, le
premier est consacré à la description et à la validation du modèle cellulaire, le deuxième à la
caractérisation lipidique des cellules et en particulier du BMP et de son métabolisme. Enfin le
troisième chapitre rend compte des données sur le rôle du BMP sur l’homéostasie cellulaire du
cholestérol.
Ce mémoire se termine par une conclusion générale et la présentation des perspectives
de travail.
8
Rappels bibliographiques
9
CHAPITRE I : L’ATHÉROSCLÉROSE
C’est en 1740 que le médecin KRELL a décrit pour la première fois des concrétions
calciques qu’il a appelé « plaques osseuses ». Ce n’est que près de deux cents ans plus tard (en
1904) qu’apparaîtra le terme d’athérosclérose, nom donné par le Dr Marchand, à ce durcissement
de la paroi artérielle.
L’athérosclérose est définie par l’Organisation Mondiale de la Santé comme une lésion
anatomique de l’intima (tunique interne) des artères de gros et de moyen calibre constituée par
une accumulation locale de lipides, de glucides complexes, de sang et de produits sanguins, de
tissu fibreux et de dépôts calcaires associés à des modifications de la média (tunique
intermédiaire). C’est un processus évolutif très long et pendant très longtemps asymptomatique.
Cette pathologie représente, de loin, la principale cause de mortalité et de morbidité dans les
pays industrialisés. Certains auteurs prévoient que l’athérosclérose conservera cette place
pendant au moins les 2 prochaines décennies.
I Epidémiologie de l’athérosclérose
Les complications de l’athérosclérose sont nombreuses (sténose, thrombose,
hémorragie,…) et sont responsables des deux premières causes de mortalité dans le monde ;
Celles-ci se manifestent à différents niveaux et sont responsables d’affections aiguës telles que :
des cardiopathies ischémiques dues à l’athérosclérose des artères coronaires ;
des accidents vasculaires cérébraux (AVC) dus à l’athérosclérose des artères
encéphaliques ;
des ischémies aiguës des membres…
Les cardiopathies ischémiques concernent environ 6 millions de décès par an dans le monde, et
les accidents vasculaires cérébraux (AVC) plus de quatre millions. Ces deux causes représentent
à elles seules plus de 20% des décès. Ces accidents, lorsqu’ils ne sont pas fatals, sont à l’origine
de séquelles fonctionnelles sévères : paralysie, troubles sensitifs, troubles du langage, apparition
d’une insuffisance cardiaque, de troubles du rythme... Les cardiopathies ischémiques et les AVC
sont placés respectivement aux 5e et 6e places des pathologies invalidantes.
10
Si la mortalité coronarienne est à la première place des causes de décès au niveau
mondial, elle peut varier d'un pays à l'autre (Murray and Lopez, 1997). Ces variations sont
même parfois très importantes (figure 1).
Figure 1 : Nombre de décès, par pays, liés aux maladies cardiaques ischémiques
(pour 100000habitants), 1990 ; (Murray and Lopez, 1997).
En France, le nombre de décès provoqués par les maladies cardiovasculaires est estimé à
38%, cela représente la première cause de décès (notamment par infarctus du myocarde (IDM)
et AVC). L'incidence de ces maladies varie selon la région considérée et selon l’étude MONICA
(Cambou, et al., 1996) l’incidence est plus élevée dans le nord de la France que dans le sud.
Certains auteurs (Murray and Lopez, 1997) ont réalisé des prévisions jusqu'en 2020 ; d'après ces
études, les cardiopathies ischémiques et les accidents vasculaires cérébraux devraient conserver
les deux premières places des causes de mortalité dans le monde.
Bien que de nombreuses études aient été et sont encore menées, les mécanismes de
l’athérosclérose ne sont que partiellement élucidés. Nous commencerons notre étude par un
rappel des principales étapes du développement de l’athérosclérose.
11
II Physiopathologie de l’athérosclérose
II-1 La paroi vasculaire artérielle
Structure de la paroi artérielle
Comme nous l’avons mentionné, l’athérosclérose se développe au niveau de la paroi des
artères. Celle-ci est constituée de 3 tuniques : de l’intérieur vers l’extérieur du vaisseau l’intima,
la média et l’adventice (figure 2).
C’est plus précisément au niveau de l’intima, tunique la plus interne et la plus fine, que se
développe l’athérosclérose. Elle est constituée d’une monocouche de cellules endothéliales,
imbriquées les unes dans les autres et formant une couverture étanche.
La tunique moyenne et la plus épaisse est la média. C’est le constituant principal de
l’artère. Elle est formée essentiellement de cellules musculaires lisses, empilées de façon
concentrique en couches appelées unités lamellaires. Le nombre de ces couches varie suivant le
type d’artère.
La tunique la plus externe est l’adventice. Elle est constituée d’un tissu conjonctif peu
organisé, riche en collagène et en fibres élastiques, contenant des fibroblastes et des adipocytes,
et d’une enveloppe qui assure l’ancrage des artères aux structures avoisinantes.
Adventice
Média
Intima
Figure 2 : Structure de la paroi artérielle
12
II-2 Fonctions de la paroi artérielle
Afin de comprendre les mécanismes conduisant au développement de l’athérosclérose, il
apparaît essentiel de rappeler les diverses fonctions assurées par la paroi artérielle. En effet, bien
que le rôle principal des artères soit de convoyer le sang du cœur aux organes et de réguler le
débit sanguin, celles-ci assurent bien d’autres fonctions.
L’endothélium vasculaire
Les cellules endothéliales vasculaires, du fait du système très perfectionné de jonctions
serrées intercellulaires et de nexus, jouent le rôle de barrière mécanique à l’interface sang-paroi.
Cette monocouche filtre et contrôle la pénétration de composants sanguins (molécules, cellules).
L’endothélium vasculaire constitue également une volumineuse glande paracrine capable
d’agir sur les éléments figurés du sang ainsi que sur la paroi vasculaire elle-même. Il sécrète en
effet des molécules aux propriétés diverses et même parfois opposées :
- anti-thrombotiques (prostacycline PGI2, héparane sulfate, anti-thrombine III, α-
macroglobuline…), permettent le maintien de la fluidité sanguine ou procoagulantes
lorsque que l’endothélium est endommagé
- fibrinolytiques (plasminogène)
- vasodilatatrices (prostacycline, NO,…) ou vasoconstrictrices (endothéline,…) régulant
la vasomotricité artérielle
- chemoattractives (VCAM-1, ICAM-1,…) permettant le recrutement cellulaire
- prolifératives (PDGF,…)
- formation du tissu conjonctif (collagène IV, protéoglycannes,…)
Grâce à ses nombreux récepteurs membranaires, l’endothélium détecte les stimuli et
élabore une réponse intégrée par la sécrétion de diverses substances capables d’agir sur le tonus
vasculaire, les fonctions plaquettaires ou encore le recrutement cellulaire. Ainsi, l’endothélium
joue un rôle prépondérant dans la fonction vasculaire.
13
Les cellules musculaires lisses
Les cellules musculaires lisses (CML) assurent la vasomotricité et le tonus artériel grâce à
leurs propriétés contractiles. La vasomotricité est régulée par les molécules sécrétées par
l’endothélium qui transmet l’ordre aux CML. Ces dernières assurent également des fonctions
métaboliques telles que la sécrétion de la matrice extracellulaire de la média et le catabolisme des
lipoprotéines LDL.
II-3 Les lésions athérosclérotiques
D’après les plus récentes descriptions anatomopathologiques, la plaque d’athérosclérose
apparaît comme une lente métamorphose de l’intima artérielle. En 1994, Stary (tableau 1) a
proposé une séquence des différentes étapes de formation de la plaque, en divisant cette
évolution en 7 stades (Stary, et al., 1994).
14
TYPE
LÉSIONEL TERME PROPOSÉ DESCRIPTION
I Macrophages
spumeux isolés
Macrophages spumeux isolés dans l’intima.
Absence de lipides extracellulaires.
II Strie lipidique
Couches de macrophages spumeux. Cellules
musculaires lisses dans l’intima chargées de
lipides. Fines particules lipidiques extracellulaires
disséminées.
III Préathérome
Modifications de type II associées à de multiples
dépôts lipidiques extracellulaires formant de petits
agrégats.
IV Athérome
Modifications de type Il associées à de multiples
dépôts lipidiques extracellulaires massifs et
confluents (noyau lipidique).
V Plaque
athéroscléreuse
Modifications de type IV associées à des dépôts
massifs de collagène (chape fibreuse) recouvrant
le noyau lipidique (type Va), avec calcifications
(type Vb).
VI
Plaque
athéroscléreuse
compliquée
Modifications de type V avec rupture de la chape
fibreuse (VIa), hémorragie intraplaque (VIb) ou
thrombose (VIc).
VII Plaque fibreuse
Épaississement massif de l’intima par sclérose
collagène ; lipides intra- et extracellulaires absents
ou présents en quantité négligeable.
Tableau 1 : Classification des lésions de l’athérosclérose, d’après Stary
(Stary, et al., 1994).
Grâce à l’observation d’un grand nombre d’artères d’enfants et de jeunes adultes, il
apparaît que dès les premières années de la vie, des macrophages s’accumulent au niveau sous-
endothélial. On sait aussi que, outre cette infiltration macrophagique, il existe à ce stade, un début
de prolifération des cellules musculaires lisses (Giral, 1998). Certains des macrophages infiltrés
se chargent de lipides et deviennent spumeux. On parle alors de coussinet intimal (stade I).
Les macrophages spumeux, de plus en plus nombreux s’organisent alors en couches et
vont former des surélévations linéaires, parallèles et de couleur jaune beurre, qui font légèrement
saillie dans la lumière artérielle : ce sont les stries lipidiques (stade II)(figure 3). Celles-ci sont
des lésions pré-athéromateuses qui peuvent être réversibles. Bien que les cellules constituant la
strie lipidique sont essentiellement d’origine macrophagique, on peut également trouver quelques
CML spumeuses.
Figure 3 : Strie lipidique (Stade II) apparaissant sous l'endothélium artériel
(Hennen, 1996)
Les stries lipidiques vont s'étendre progressivement à la média, en provoquant la migration
de CML. La strie, de couleur blanche à jaune clair, augmente de volume, et fait davantage saillie
dans la lumière artérielle. Sa taille est variable et peut atteindre 15 mm. Des lipides, libérés après
dégénérescence de cellules spumeuses (cellules dérivées de macrophages et de cellules
musculaires, chargées de vésicules lipidiques), s'accumulent sur cet épaississement de l'intima
jusqu’à former un noyau lipidique (stade III).
Ces lipides sont :
des esters de cholestérol (50%),
du cholestérol (25%)
des phospholipides (25%).
15
Ce centre athéromateux va s’entourer de tissu fibreux (ou sclérose) qui donne sa rigidité à
la plaque. Cette capsule fibreuse est constituée d’une matrice extracellulaire (collagène,
mucopolysaccharides, élastine, fibrine) et de CML; on peut aussi y trouver des granulomes
inflammatoires (lymphocytes T) (tableau 2). La formation de ce tissu fibreux est assurée
exclusivement par les cellules musculaires lisses. Dans les premiers stades, la chape fibreuse
étant peu importante, on parle de plaque d’athérome simple (stade IV et V) (figure 4). Faisant
saillie dans la lumière artérielle, la plaque simple entraîne des risques de sténoses et d’ischémie.
La formation de cette plaque athéroscléreuse entraîne d’autres modifications de la paroi
artérielle environnante. L’irrigation de la paroi est accrue par la formation de néo-vaisseaux
provenant de ramifications des vasa vasorum de l’adventice. L’organisation structurelle générale
de la paroi est également perturbée : le développement de la plaque entraîne un dédoublement et
une fragmentation de la limitante élastique interne; la media s’amincit. Dans l’adventice, on
retrouve des infiltrats lymphocytaires et des granulomes. Au fur et à mesure, les proportions entre
le centre athéromateux et la chape fibreuse vont s’inverser. La plaque va se calcifier, jusqu’à être
caractérisée par l’absence ou la quasi-absence de centre lipidique ce qui génère une plaque
fibreuse. La média calcifiée perd son élasticité et devient fragile : la paroi peut se dilater
(anévrisme) et risque de rompre. De plus, la progression de la lésion athéromateuse, en faisant
saillie dans la lumière vasculaire, finit par constituer une sténose.
16
Figure 4 : La plaque simple (stade V) (Hennen, 1996)
CHAPE FIBREUSE NOYAU LIPIDIQUE
Macrophages 24 60
Cellules musculaires lisses 60 29
Lymphocytes T 16 10
Tableau 2 : Constitution de la plaque d’athérosclérose
La plaque d’athérosclérose compliquée (stade VI) est caractérisée par l’ulcération c’est
à dire la rupture de la chape fibreuse. Il y a alors contact entre le sang et le matériel
athéromateux. De plus, l’endothélium vasculaire étant rompu, Il y a agrégation plaquettaire
conduisant à la formation d’un thrombus, susceptible de se détacher et d’oblitérer les petites
artérioles des territoires irrigués créant des embolies. Parfois, si la plaque est très volumineuse,
elle peut quasiment interrompre la circulation sanguine provoquant un infarctus ou un accident
vasculaire ou ischémie.
Parmi les hypothèses physiopathologiques de l’évolution de la plaque, certains retiennent les
contraintes mécaniques notamment celles générées par l’hypertension, ou les modifications des
constituants de la plaque (augmentation de l’accumulation lipidique, persistance de l’inflammation,
richesse de l’infiltration…). Ces différents éléments fragilisent la chape fibreuse.
17
III L’athérogenèse
En 1954, Irvine Page donnait une première description très hypothétique sur le déroulement
du processus athéromateux. Aujourd’hui encore, les mécanismes de l’athérogénèse ne sont que
partiellement élucidés ; néanmoins, un certain nombre d’entre eux sont maintenant bien connus. Il
convient donc, dans une première approche de décrire brièvement les mécanismes connus de
l’athérogénèse, avant de les détailler et d’aborder les hypothèses plus récentes.
III-1 Le processus athéromateux
On peut diviser l'évolution de la plaque athéroscléreuse en différentes étapes (Cohen,
1997;Turpin, 1994).
1. Pénétration des LDL au niveau de l'intima.
2. Oxydation de ces LDL.
3. Activation des cellules endothéliales ; adhésion des monocytes à l'endothélium et
pénétration de ces monocytes au niveau de l'intima.
4. Formation des cellules spumeuses à partir des macrophages et des CML (Hennen, 1996).
5. Prolifération et migration des CML de la media vers l'intima.
6. Sécrétion de collagène, de fibres élastiques et de protéoglycannes par les CML.
7. Accumulation de tissu conjonctif, de lipides, de CML et de cellules spumeuses.
8. Formation du noyau lipidique à partir des éléments lipidiques accumulés.
9. Ulcération de la paroi vasculaire et mise à nu du sous-endothélium.
10. Adhésion et activation plaquettaire provoquant une thrombose.
Dans des conditions physiologiques, les particules de LDL plasmatiques, pénètrent et
ressortent librement de l’intima. Grâce aux études menées en 1989 par Schwenke et Carew, il a
été mis en évidence une accumulation précoce et pré-lésionnelle de LDL riches en cholestérol
athérogènes (Schwenke and Carew, 1989). Ces LDL ont tendance à se fixer sur la partie interne
de la paroi artérielle. L’infiltration et la rétention sous-endothéliale des LDL constituent les
évènements initiateurs de l’athérogenèse ( Boren, et al., 2000;Williams and Tabas, 1995).
18
L’accumulation de ces lipoprotéines reflète un déséquilibre entre leurs flux d’entrée et de
sortie. Celui-ci peut résulter de nombreuses modifications telles que l’augmentation de la
perméabilité endothéliale, la présence de protéoglycannes ou de collagène qui fixent les LDL,
d’une concentration plasmatique élevée de LDL (Williams and Tabas, 1995 ; Carew, et al., 1984;
Nordestgaard and Nielsen, 1994).
Enfin, il faut également tenir compte de facteurs hémodynamiques (pression, forces de
cisaillement, turbulences…) qui peuvent également influer sur le transfert des LDL à travers la
paroi et sur le temps de résidence des particules athérogènes (Carew, et al., 1984;Gimbrone,
1999;Williams and Tabas, 1995). Les forces de cisaillement peuvent directement induire une
activation endothéliale selon 3 caractéristiques principales :
- augmentation de la perméabilité endothéliale aux solutés et donc aux LDL
- induction de l’expression d’intégrines ou protéines d’adhésion (VCAM-1, ICAM-1) à la
surface endothéliale, participant à la réaction inflammatoire. En effet, il y a alors adhésion
et pénétration de monocytes dans l’intima.
- induction d’un stress oxydatif qui altère les nombreuses fonctions de l’endothélium dont le
tonus vasomoteur (Gimbrone, 1999). Ce phénomène biologique complexe est également
induit par différents facteurs tels que l’hypertension, le diabète, le tabac…
Ainsi, l’activation endothéliale et le stress oxydant associé constituent des facteurs clé
dans la formation intimale des lésions et de l’oxydation des lipides (PL, AGPI, cholestérol, esters
de cholestérol,…) (Gimbrone, 1999;Nordestgaard and Nielsen, 1994;Williams and Tabas, 1995).
Les LDL oxydées ont un pouvoir chimioattractant sur les monocytes et facilitent leur
différenciation en macrophages résidents (Steinberg, et al., 1989;Young and Parthasarathy,
1994). Ces macrophages vont alors jouer un rôle délétère important dans les différentes étapes
de l'athérosclérose, essentiellement en entraînant une réaction inflammatoire chronique locale et
la production de cytokines pro-inflammatoires. Ces cytokines inflammatoires vont générer à la fois
la croissance de la plaque et sa fragilisation. Les macrophages se chargent en LDL oxydées
grâce à leurs récepteurs « éboueurs » (scavenger) (voir chapitre 2) et se transforment en cellules
spumeuses du fait de leur saturation en gouttelettes de graisse.
Il y a également recrutement de CML, qui pendant leur migration vers l’intima perdent leur
phénotype contractile au profit d’un phénotype sécrétoire. En effet, les LDL oxydées sont
cytotoxiques pour l’endothélium et vont stimuler l’agrégation plaquettaire en entraînant la
sécrétion par les cellules endothéliales de substances vaso-actives (thromboxane A2), pro-
coagulantes (facteur plaquettaire 4, β thromboglobuline), ou encore de facteurs de croissance
19
(PDGF) responsables de la multiplication des CML. Les CML présentent également une forte
activité synthétique de collagène, d’élastine et de mucopolysaccharides, molécules favorisant le
dépôt de lipides et la thrombose. Certains signaux vont accentuer le recrutement de cellules
immunitaires telles que les monocytes qui se faufilent entre les cellules endothéliales jusqu’à
l’intima.
Il y a également recrutement de lymphocytes T qui libèrent des cytokines renforçant les
réactions inflammatoires dans les parois des artères.
L’ensemble des facteurs sécrétés par les macrophages, CML et cellules endothéliales
incitent les CML à se déplacer vers la partie supérieure de l’intima, à se multiplier et à synthétiser
des composants de la matrice extracellulaire. Les cellules de la matrice fusionnent et forment la
chape fibreuse constituée de tissu conjonctif riche en collagène et en cellules musculaires lisses.
La zone sous jacente de la chape fibreuse va au fur et à mesure se modifier; La forte réaction
inflammatoire peut induire l’apoptose des macrophages spumeux et des CML, ce qui contribue à
la croissance du noyau lipidique dans lequel s’accumulent les particules apoptotiques.
III-2 L’évolution des théories
Grâce aux nombreuses études menées, les différentes étapes du processus athéromateux
ont été identifiées cependant, leur ordre d’enchaînement reste encore sujet à controverse. En
effet, nombre d’entre elles sont fortement concomitentes. C’est pourquoi, plusieurs théories quant
à l’origine de l’athérogenèse ont vu le jour, se sont succédées et opposées.
Selon Rudolf Virchow (1891-1902), les lipides plasmatiques sont absorbés directement à
travers l’endothélium vers l’intima et s’y déposent. Cette hypothèse de l’infiltration lipidique
comme facteur déclenchant la formation de la plaque d’athérome, a été confortée par les travaux
d’Anitschkow et Chalatow (1933). Ils ont mis en évidence le rôle du cholestérol dans
l’athérosclérose expérimentale chez le lapin (Goodman, 1989).
Virchow pensait également qu’un traumatisme endothélial d’origine mécanique était à
l’origine de l’infiltration lipidique. C’est ainsi qu’est née la théorie inflammatoire. Cette théorie a
été reprise puis développée en 1976 par Ross (Ross and Glomset, 1976).
Les études expérimentales les plus récentes ainsi que les observations
anatomopathologiques faites sur des plaques humaines permettent d’affirmer que
l’athérosclérose est une pathologie inflammatoire chronique de l’intima des grosses artères (Ross
20
and Glomset, 1976 ; Shi, et al., 2000) et que l’agent d’agression responsable de la réaction
inflammatoire est très probablement le cholestérol-LDL modifié, notamment par oxydation
(Steinberg, et al., 1989).
III-3 Rôle des macrophages dans le développement de
l’athérosclérose
Il est clairement établi que les macrophages jouent un rôle central dans le développement
de l’athérosclérose. Plusieurs expériences sur des modèles animaux ont confirmé leur rôle
majeur. Il apparaît que des souris n’exprimant pas le M-CSF, facteur impliqué dans la
différenciation des monocytes, développent beaucoup moins de lésions athérosclérotiques. De
plus, les lésions lorsqu’elles se développent, sont plus petites et à des stades moins avancés
(Qiao, et al., 1997;Smith, et al., 1995).
III-3-1 Amplification de leur propre recrutement
Suite à la sécrétion de chémoattractants (MCP-1, cytokines, ICAM-1, VCAM-1…) par les
cellules endothéliales, les monocytes vont passer la paroi endothéliale par diapedèse jusqu’à
l’intima où ils se différencient en macrophages sous l’action des formes réactives de l’oxygène ou
ROS (Barbieri, et al., 2003). Les monocytes, par sécrétion de M-CSF et de MCP-1, sont capables
d’amplifier leur propre recrutement (Cushing and Fogelman, 1992). Dans l’espace sous
endothélial, ils phagocytent l’excès de LDL et se transforment en cellules spumeuses.
L’accumulation de cellules spumeuses essentiellement dérivées de macrophages au niveau de
l’intima conduit à la formation du noyau lipidique ou centre athéromateux (accumulation de lipides
au sein d’un noyau nécrotique) (Berliner, et al., 1995).
III-3-2 Fragilisation de la plaque
Les macrophages vont également jouer un rôle important dans la fragilisation de la plaque.
En effet, une fois activés, les macrophages produisent des enzymes appelées MMPs (Matrix
MetalloProteinase) et des glycosidases (comme heparanase) responsables de la dégradation des
21
protéines de la matrice (Wesley, et al., 1998). Il y a alors fragilisation de la chape fibreuse. En
effet, de fortes concentrations de MMPs ont été mesurées à proximité de plaques rompues (Galis,
et al., 1994;Nikkari, et al., 1995). Le contenu lipidique et autres substances toxiques
(hydrolases…) du centre athéromateux peuvent être libérés et provoquer des lésions tissulaires
majeures responsables certainement de la transformation des lésions mineures (stries lipidiques)
en une plaque athéroscléreuse plus menaçante.
Cette production importante d’héparanase et de MMPs va également participer à l’induction du
changement phénotypique des CML en cellules sécrétrices (Fitzgerald, et al., 1999).
III-3-3 Entretien de la réaction inflammatoire
Les monocytes participent également à l’entretien de la réaction inflammatoire par
sécrétion de molécules pro-inflammatoires. Les macrophages activés synthétisent : l’INF γ
(responsable de l’activation des cellules immunocompétentes) et le TNF α (cytokine
proinflammatoire) (Frostegard, et al., 1997) ainsi que les interleukines IL-1 et IL-6 (cytokines pro-
inflammatoires) (Berliner, et al., 1995). Par sécrétion de prothrombine, les macrophages
participent à la formation de thrombus (Okamoto, et al., 2001).
Enfin, tant que les macrophages conservent leurs fonctions d’épuration, il y a phagocytose
des cellules endommagées et apoptotiques : la lésion devient fibreuse et aboutit à la sténose. Si
les macrophages deviennent incapables d’épurer les cellules apoptotiques, la lésion devient
nécrotique et évolue vers une plaque instable.
III-4 Rôle des lipoprotéines dans l’athérosclérose
III-4-1 Les lipoprotéines –structure
Les lipoprotéines sont des macromolécules qui assurent le transport, dans le système
vasculaire et interstitiel, des lipides insolubles en milieu aqueux. Ce sont des particules
sphériques de taille et de composition variables, mais leur structure générale est identique. Elles
sont formées d’un noyau hydrophobe constitué de lipides neutres (TG et CE) et d’une enveloppe
périphérique composée de lipides polaires (PL, cholestérol libre) et de différentes
apolipoprotéines.
22
III-4-1-1 Partie lipidique
Dans chaque lipoprotéine, on trouve :
Des phospholipides :
Ils se situent en périphérie de la lipoprotéine. Leur partie hydrophile est tournée vers
l’extérieur. Ce sont d’importants éléments structuraux de la membrane cellulaire.
Des triglycérides :
Du fait de leur caractère fortement apolaire, ceux-ci sont situés au centre des lipoprotéines.
Du cholestérol libre :
A cause de sa fonction alcool libre faiblement hydrophile, le cholestérol libre se situe à la
surface de la lipoprotéine. Dans le règne animal, le cholestérol est le stérol le plus abondant et le
plus important au plan métabolique (Vance and Van den Bosch, 2000) en tant que précurseur
des hormones stéroïdes. L’hypercholestérolémie est la cause de la genèse de l’athérome.
Du cholestérol estérifié :
La fonction alcool est liée à un acide gras, supprimant ainsi tout caractère hydrophile. Le CE
se situe donc au centre de la lipoprotéine.
Des acides gras libres
III-4-1-2 Partie protéique
Ces apolipoprotéines jouent un rôle important. Elles assurent la stabilité de la
macromolécule et en contrôlent le devenir métabolique. Elles ont une double fonction de structure
et de régulation métabolique : elles assurent la cohésion du complexe lipidique et sa
solubilisation; elles agissent comme cofacteur et/ou activateur de nombreuses enzymes
plasmatiques et elles servent de ligands pour les interactions avec les protéoglycanes
endothéliales et les récepteurs cellulaires des lipoprotéines.
23
III-4-2 Classification
Il existe plusieurs catégories de lipoprotéines. On peut les classer selon :
leur origine ou devenir métabolique
leur composition chimique (nature et quantité de lipides et protéines)
leurs propriétés physiques (dimension, mobilité électrophorétique, densité)
leur pouvoir pathogène
leur réactivité immunologique vis-à-vis d’immuns sérums spécifiques
A l’heure actuelle, le classement est basé sur la densité des lipoprotéines par ultracentrifugation
de flottation. On distingue :
Les chylomicrons
Les lipoprotéines de très basse densité ou VLDL
Les lipoprotéines de densité intermédiaire ou IDL
Les lipoprotéines de basse densité ou LDL
Les lipoprotéines de haute densité ou HDL
Les proportions de lipides et de protéines varient en fonction des différentes lipoprotéines, ce
qui leur confère des coefficients de flottation et des propriétés biologiques différents (Tableau 3).
Lipoprotéines Densité
(g/ml)
Taille
(nm)
Protéines
(%)
Lipides
(%)
Principaux
Lipides
Principales
Apoprotéines
Quantité
à jeun
(%)
Chylomicrons
<0,94
75-1200
2
98
TG
B48, C-II, C-III,
A-I, A-IV
Mineure
VLDL 0,94-1,006 30-80 10 90 TG B100, C-II, E <15
IDL 1,006-1,019 25-35 20 80 TG B 100, E Mineure
LDL 1,019-1,063 18-25 25 75 CST B100, Lp(a) 55
HDL2 1,063-1,125 9-12 50 50 PL A-I, A-II
HDL3 1,125-1,21 5-9 50 50 PL A-I, A-II
30
Tableau 3: Propriétés des lipoprotéines du plasma humain
24
III-4-3 Métabolisme des lipoprotéines
Les lipoprotéines jouent un rôle fondamental dans les mouvements des lipides au sein de
l’organisme. Schématiquement, le métabolisme des lipoprotéines peut se concevoir en 2 courants
opposés : le premier conduit les TG et le cholestérol des lieux de synthèse (foie, intestin) vers les
tissus utilisateurs et le second permet l’élimination du cholestérol par le foie.
Les lipides alimentaires sont absorbés au niveau de l’intestin puis sécrétés par les cellules
intestinales, sous forme de chylomicrons. Les TG situés dans le cœur des chylomicrons sont
hydrolysés par la lipoprotéine lipase conduisant à la formation de remnants qui sont eux-mêmes
captés via des récepteurs spécifiques au niveau du foie. Le foie synthétise alors des VLDL riches
en TG et possèdant une molécule d’ApoB100. Dans la circulation, les TG des VLDL sont
hydrolysés par la lipoprotéine lipase (LPL), ce qui donne naissance aux IDL. Ces dernières sont
recaptées par le foie ou hydrolysées par la lipase hépatique sur les TG donnant naissance aux
LDL. Celles-ci sont ensuite captées par les cellules cibles via des récepteurs spécifiques. Le
retour du cholestérol des cellules vers le foie s’effectue via les HDL.
III-4-3-1 Les lipoprotéines de basse densité (LDL)
Comme nous l’avons vu, l’un des évènements initiateur de l’athérosclérose est la
pénétration de LDL dans l’intima. La corrélation entre la concentration plasmatique élevée de
particules de LDL et le risque athérogène est bien établi.
III-4-3-1-1 structure des LDL
Les LDL sont des particules de forme sphérique d’un diamètre de 20 à 25µm. Elles sont
composées d’un cœur apolaire constitué de cholestérol estérifié (environ 1600 molécules par
molécule de LDL) et de TG (170 molécules par molécule de lipoprotéine), et d’une périphérie
hydrophile formée d’une monocouche mixte de phospholipides (700 molécules) et de cholestérol
non estérifié (600 molécule) dans laquelle est enchâssée une très grosse protéine hydrophobe
appelée Apo-B (figure 5). Les différentes classes lipidiques contiennent 2700 molécules d’acides
gras estérifiés dont la moitié est représentée par des AGPI.
25
Figure 5: Structure d’une LDL (Cooper, 2000).
III-4-3-1-2 LDL oxydées et athérosclérose
L’oxydation des LDL est une étape essentielle dans le processus athéromateux. En effet,
des LDL oxydées sont retrouvées en abondance dans la plaque athéroscléreuse (Chisolm and
Steinberg, 2000). Etant donné la faible concentration de LDL oxydées circulantes, on déduit que
l’oxydation des LDL se produit majoritairement in situ (Steinberg D, 1997).
A l’état normal, les LDL sont éliminées par l’intermédiaire des récepteurs auxquels elles se
lient. Leur absorption par ces récepteurs diminue la synthèse intracellulaire de cholestérol, limite
l’expression de ce récepteur à la surface des cellules par un mécanisme de rétrocontrôle et au
niveau du foie, permet l’élimination du cholestérol par voie biliaire.
Lorsque les LDL sont oxydées (Ox-LDL), elles sont reconnues par d’autres récepteurs, les
récepteurs « éboueurs » (voir chapitre 2), voie qui ne subit aucun rétrocontrôle métabolique.
Ainsi, il n’y a plus de diminution de la synthèse intracellulaire de cholestérol, ni de limitation de
l’expression des récepteurs à la surface des cellules. L’absorption massive de cholestérol par les
macrophages se poursuit et entraîne la transformation de ces derniers en cellules spumeuses.
Les LDL peuvent être oxydées au contact des cellules endothéliales, des CML ou des
macrophages (Chisolm et al., 1999). Schématiquement, les étapes de l’oxydation lipidique des
LDL comportent (Witztum and Steinberg, 1991) :
26
- le démarrage du mécanisme par un radical libre oxygéné (ROS) qui se traduit par une
peroxydation lipidique à la surface de la LDL. Cette peroxydation est au départ limitée et peut être
induite par différents facteurs tels que la présence de malondialdéhydes, de radicaux libres ou
d’extraits de fumée de cigarette…;
- la propagation du phénomène dépend en partie de l’enzyme PAF-AH (Platelet Activating
Factor-Acetylhydrolase ou lipoprotein-associated phospholipase A2) (Navab et al., 1996). Cette
enzyme, principalement associée aux LDL, possède une activité phospholipase A2. Après
peroxydation d’une double liaison (C=C) au sein d’un acide gras polyinsaturé, constituant d’une
molécule d’ester de cholestérol, de phospholipide ou de triglycéride, cette activité peut provoquer
une amplification de la peroxydation lipidique, conduisant à la génération d’aldéhydes et de
cétones. Les cétones sont éliminées, mais les aldéhydes se lient aux résidus lysine de l’apoB,
ligand clé du récepteur cellulaire des LDL (voir chapitre II, § III-1-1). Il s’ensuit une modification
covalente de l’apoB responsable de la perte de la reconnaissance par le récepteur des LDL
natives, mais lui conférant la capacité de se lier au récepteur éboueur (Chisolm et al., 1999 ;
Chisolm and Steinberg, 2000 ; Steinberg D, 1997 ; Witztum and Steinberg, 1991).
Il est également possible que les LDL finissent par s’oxyder lorsque leur temps de séjour
dans l’intima est augmenté, la pO2 dans le sous-endothélium étant relativement élevée
(sensiblement égale à celle du sang). De plus, des travaux récents rapportent que les LDL
immobilisées dans la matrice extracellulaire sous-endothéliale peuvent subir une attaque
enzymatique, avec génération de particules non oxydées, de 10 à 200 nm de diamètre, capables
d’activer le complément et d’induire une réponse inflammatoire au niveau des cellules vasculaires
et des macrophages (Klouche et al., 2000).
Les Ox-LDL possèdent un effet chimiotactique sur les monocytes, et les lymphocytes T
(Berliner, et al., 1995), par la sécrétion de M-CSF et de MCP-1, et contribuent à l’amplification de
l’infiltration sous endothélial des monocytes et leur différenciation en macrophages. Elles
représentent également un stimulus prolifératif pour les macrophages (Hamilton, 1999;Martens, et
al., 1999)
Par leur cytotoxicité sur les cellules endothéliales, les Ox-LDL participent à l’accumulation
lipidique dans le noyau (Berliner, et al., 1995). Elles sont également responsables de
l’augmentation de l’expression des récepteurs « éboueurs » des macrophages (Yoshida, et al.,
1998).
Elles stimulent l’expression du facteur tissulaire et participent ainsi à la formation du
thrombus (Daugherty and Roselaar, 1995).
Enfin, les LDL oxydées participeraient à la formation des cellules spumeuses en diminuant
l’export du cholestérol (Brown, et al., 2000;Gelissen, et al., 1996;Kritharides, et al., 1993).
27
Des études récentes montrent en outre que l’endocytose et l’accumulation des LDL
oxydées induisent un stress oxydant et une apoptose (Galle, et al., 2006 ; Salvayre, et al., 2002)
Ainsi, les Ox-LDL semblent jouer un rôle très important dans la genèse et le
développement de la plaque d’athérome
III-4-3-2 Les lipoprotéines de haute densité (HDL) :
III-4-3-2-1 Structure des HDL
Les HDL sont de petites lipoprotéines (8-10 nm de diamètre) responsables du transport de
25 à 30% du cholestérol total plasmatique. Elles sont composées de plusieurs apolipoprotéines :
ApoA, ApoC, ApoD et ApoE.
L'origine des HDL est mixte, tissulaire et plasmatique. Le foie sécrète des HDL discoïdales qui
ne contiennent comme apolipoprotéine que l’apoE. Dans la circulation, sous l’action de la
lipoprotéine lipase, des chylomicrons et des VLDL peuvent être transformés en HDL contenant
principalement comme apolipoprotéines apoA-I et apoC.
Grâce à une protéine particulière, l’ATP-binding Cassette A1 (ABCA1), il y a transfert de
phospholipides et de cholestérol des cellules vers les HDL. Ce transfert nécessite une interaction
entre ABCA1 et apoA-I (Knight, 2004 ; Yancey, et al., 2003). Le cholestérol provenant des cellules
est sous forme libre et s’insère sur la surface de la lipoprotéine. Grâce à l’enzyme plasmatique
Lécithine Cholestérol Acyl-Transférase (LCAT), le cholestérol est estérifié et migre au centre de la
lipoprotéine, transformant les HDL discoïdales en HDL3 sphériques.
Les HDL3 à leur tour sont capables de capter des molécules de cholestérol membranaire et
après nouvelle action de la LCAT deviennent de plus en plus riches en esters de cholestérol. Les
HDL2 ainsi obtenues ont une densité plus légère et un diamètre plus grand que les HDL3. La
captation du cholestérol membranaire par les HDL réalise ce que l'on appelle le transport
« réverse » du cholestérol car les HDL2 ainsi formées sont en grande partie reconnues et
dégradées dans les cellules hépatiques par l'intermédiaire de récepteurs qui reconnaissent les
apoA-I présentes dans la structure des HDL. Le cholestérol retourne au foie et est éliminé dans la
bile ou dégradé en acides biliaires.
Acton et al. ont démontré l’implication d’un récepteur particulier dans le transport réverse du
cholestérol : le récepteur d’épuration classe B type 1 (scavenger receptor class B type 1, SR-B1).
Celui-ci se lie aux HDL et en transfère sélectivement les lipides qu’elles contiennent par transfert
28
sélectif du cholestérol estérifié ou par efflux bidirectionnel du cholestérol libre (Stangl, et al.,
1999 ; Gu, et al., 2000 ; Ji, et al., 1997) , ce qui implique que le SR-RB1 serait un acteur majeur
dans le transport réverse du cholestérol. Le mécanisme d’action du SR-B1 est différent de celui
d’endocytose des LDL. Les HDL se lient au SR-B1 et il y a endocytose dans l’endosome primaire,
puis il y a transfert de cholestérol à la cellule et finalement, la HDL dépouillée de lipides est
retournée dans la circulation (Silver and Tall, 2001). Cependant, on ne comprend toujours pas
très bien comment s’effectue ce transfert de cholestérol (Fluiter, et al., 1999 ; de la Llera Moya, et
al., 1999 ; Krieger, 1999 ; Rigotti, et al., 1997 ; Trigatti, et al., 2000).
III-4-3-2-2 Rôle des HDL dans l’athérosclérose
L’ensemble des études menées sur le rôle des HDL tend à montrer que celles-ci
réduiraient le risque athérosclérotique et ce à différents niveaux. Etant responsables du retour du
cholestérol cellulaire, la diminution du taux de HDL plasmatique serait responsable de
l’augmentation de l’apparition de lésions athérosclérotiques (Aiello, et al., 2002). Il semble que le
niveau plasmatique des HDL est inversement corrélé avec le risque d’athérosclérose (Despres,
et al., 2000;Gordon, et al., 1989;Plump, et al., 1994;Rubin, et al., 1991;Tangirala, et al., 1999). et
qu’une baisse d’1% du taux plasmatique de cholestérol HDL entraînerait une augmentation de 2-
3% du facteur de risque cardiovasculaire (Gordon, et al., 1989). Cependant, le mécanisme de
protection des HDL contre l’athérosclérose est assez mal connu. Des études in vitro ont montré
que l’incubation de cellules endothéliales en présence d’HDL diminuaient fortement la production
de VCAM, impliquée dans l’inflammation (Ashby, et al., 1998;Calabresi, et al., 1997;Cockerill, et
al., 1995).
Les HDL semblent augmenter la résistance des cellules endothéliales vis-à-vis de la
cytotoxicité des LDL oxydées, en bloquant la transduction du signal intracellulaire stimulé par les
LDL oxydées et induisant la cytotoxicité (Suc, et al., 1997).
Les HDL protègent les LDL vis-à-vis des modifications (Hessler, et al., 1979;Navab, et al.,
2000a;Navab, et al., 2000b;Parthasarathy, et al., 1990 Ohta, et al., 1989) et en particulier leur
oxydation (Mackness, et al., 1991;Navab, et al., 2000a;Navab, et al., 2000b;Stafforini, et al.,
1990a) grâce à deux enzymes particulières associées aux HDL : la paraxonase et la PAF-
acétylhydrolase, responsables de la dégradation des phospholipides oxydés et de l’inhibition de
l’oxydation des LDL (Aviram, et al., 1998;Stafforini, et al., 1990b).
Bien que l’ensemble des résultats ne soit pas absolument clair, il met en évidence un rôle
antiathérosclérotique des HDL.
29
III-5 Athérosclérose et acides gras poly insaturés (AGPI) :
Dans les années 70, la curiosité des chercheurs (Dyerberg, et al., 1975) fut interpellée par
la faible incidence des maladies coronariennes dans les populations esquimaudes du Groenland.
Après avoir constaté que les populations du Groenland émigrantes présentaient une incidence
cardiovasculaire équivalente à celle des populations d’accueil, les scientifiques ont rapidement
éliminé la possibilité d’un facteur de protection génétique et ont alors associé la bonne santé
coronarienne des esquimaux à leur alimentation. Ils se sont alors intéressés aux propriétés
nutritionnelles des acides gras polyinsaturés de la famille n-3 (ou oméga-3), constituants
majoritaires d’une alimentation à base de poissons gras et de mammifères marins. Depuis, de
nombreuses études ont confirmé l’effet bénéfique des acides gras n-3 à longue chaîne sur le
système cardiovasculaire.
III-5-1 Les AGPI n-3 - généralités
Les principaux AGPI de la série n-3 trouvés dans la chaîne alimentaire sont l’acide α-
linolénique (18:3n-3), l’acide eicosapentaénoïque (EPA, 20:5n-3) et l’acide docosahexaénoïque
(22:6n-3). La caractéristique principale de ces acides gras est la double liaison située à 3
carbones du groupement méthyle, double liaison qui définit la série (figure 6). Cette double liaison
ne peut être réalisée par l’organisme c’est pourquoi, l’acide α-linolénique est dit essentiel et doit
être apporté par l’alimentation. L’EPA et le DHA dérivent du 18:3n-3 par une alternance de
réactions de désaturation et d’élongation. Il est admis que les séries n-3 et n-6 utilisent le même
système enzymatique (Sprecher and Sankarappe, 1981), il y a donc compétition entre ces
familles pour la formation des polyinsaturés longs, à 20 et 22 atomes de carbone, qui sont les
acides gras actifs in vivo. Mais ces réactions sont lentes et limitées, et l’activité de ces enzymes
n’est pas toujours suffisante pour fournir la quantité d’acides gras polyinsaturés à longue chaîne
nécessaire à l’organisme ; les acides gras doivent par conséquent être apportés par
l’alimentation.
III-5-2 Incorporation et distribution
L’acide alpha-linolénique est présent en quantité notable dans les huiles végétales :
principalement dans les huiles de colza et de soja. L’EPA et le DHA sont majoritairement
30
d’origine animale : on trouve très peu d’AGPI n-3 dans la viande, par contre ils sont
particulièrement abondants dans les poissons gras (maquereau, hareng, saumon…).
Figure 6 : Synthèse des acides gras des familles oméga 6 et oméga 3
L’incorporation des AGPI dans les lipides membranaires nécessite leur activation préalable
en acyl-CoA par une acyl-CoA synthétase. L’acyl-CoA ainsi formé sert de précurseur lors de la
synthèse de novo des lipides membranaires. La première étape de cette synthèse est la
conversion du glycérol-3-phosphate en acide phosphatidique (PA) par addition d’un acyl-CoA par
des acyltransférases. Le PA donne naissance au diacylglycérol (DAG) par une phosphatidate
phosphatase. Le DAG est le précurseur des TG, des PC et des PE. Les phospholipides ainsi
formés subissent des modifications dans leur composition en acides gras par des réactions de
remodelage. Dans la voie de déacylation/réacylation, ou voie de Lands (Lands and Merkl, 1963),
les acides gras sont libérés des phospholipides par une phospholipase A1 ou A2, formant des
lysoPL. Les acides gras libres sont convertis en acyl-CoA puis directement transférés sur un
lysoPL à l’aide d’une acyltransférase.
Famille
oméga-6
18:2
Acide linoléique
18:3
20:3
20:4
Acide arachidonique
22:4 24:4
elongase
elo gasen
24:522:5
Βoxydation
partielle
6-désaturase
élongase
5-désaturase
élongase
Famille
oméga-3
18:3
Acide α-linolénique
18:4
20:3
20:4
22:5 24:5
elongase
24:6
elongase
Βoxydation
partielle
22:6
DHA
Famille
oméga-6
18:2
Acide linoléique
18:3
20:3
20:4
Acide arachidonique
22:4 24:4
elongase
n
24:522:5
Βoxydation
partielle
Famille
oméga-3
18:3
Acide α-linolénique
18:4
20:3
20:4
22:5 24:5
elongase
24:6
Βoxydation
partielle
elongase
22:6
DHA
6
-
désaturase
elo gase
Famille
oméga-6
18:2
Acide linoléique
18:3
20:3
20:4
Acide arachidonique
22:4
Famille
oméga-6
18:2
Acide linoléique
18:3
20:3
20:4
Acide arachidonique
22:4 24:4
elongase
nelo gase
24:4
elongase
n
24:522:5
Βoxydation
partielle
24:522:5
Βoxydation
partielle
6-désaturase
élongase
5-désaturase
élongase
elo gase
6
-
désaturas
e
31
III-5-3 Etudes épidémiologiques sur les effets des AGPI n-3
Comme nous l’avons signalé, la très faible incidence des maladies cardiovasculaires des
populations esquimaudes du Groenland (10 à 30% plus faible qu’au Danemark) est à l’origine des
recherches entreprises sur les acides gras oméga 3 (Bjerregaard and Dyerberg, 1988;Kromann
and Green, 1980). En effet, les esquimauds présentent des taux plasmatiques élevés en DHA et
EPA. Cela se traduit par une moindre réactivité des plaquettes sanguines et un allongement du
temps de saignement. Ce profil métabolique a également été observé dans d’autres populations
consommant de grandes quantités de poisson comme le Japon (Kagawa, et al., 1982).
Plusieurs types d’étude ont été réalisés chez l’homme quant à l’impact des AGPI oméga 3
sur les maladies cardiovasculaires.
Tout d’abord, des études d’observations ont été effectuées soit à l’aide de questionnaires
portant sur les habitudes alimentaires (principalement la consommation de poisson) soit basées
sur la mesure de taux plasmatiques ou tissulaires d’acides gras oméga 3. Ces études ont été
menées sur de grands effectifs (parfois jusqu’à 80.000 personnes) et pour des durées maximales
de 30 années. Les deux tiers de ces études montrent une diminution du risque cardiovasculaire
en fonction de la consommation de poisson. Il a été suggéré que la consommation régulière de
poisson pouvait réduire l’incidence des maladies coronariennes et les accidents cardiovasculaires
(Djousse, et al., 2001;Orencia, et al., 1996;Siscovick, et al., 2000) ainsi que le taux de mortalités
cardiovasculaires (Kromhout, et al., 1985;Siscovick, et al., 1995;Tavani, et al., 2001).
L’étude « US Physician’s Health » a mis en évidence que la consommation d’une portion de
poisson par semaine réduisait de 30-45% le taux de mortalité cardiovasculaire et la mortalité
totale (Albert, et al., 1998;Hu, et al., 2002;Kromhout, et al., 1995). De la même façon, il a été
observé que lorsque la diète était appauvrie en acides gras n-3, il y avait apparition de lésions
athérosclérotiques (Newman, et al., 1993).
L’étude cas-témoins réalisée à Seattle de 1988 à 1994, sur des sujets n’ayant jamais eu de
problème cardiovasculaire, a montré une réduction de 50% de l’incidence des arrêts cardiaques
chez des personnes consommant des acides gras n-3 (Siscovick, et al., 1995). Cependant, de
part la nature méthodologique, ces travaux ne permettent pas d’établir assurément que seuls les
acides gras n-3 sont responsables des effets observés.
Des études d’interventions secondaires ont apporté des données très importantes dans
l’établissement d’une relation de causalité entre la consommation d’AGPI n-3 et la diminution du
risque cardiovasculaire. L’étude du groupe von Schacky, réalisée sur des personnes ayant
survécu à un premier accident cardiovasculaire et conduite en parallèle sur un groupe
supplémenté en poisson ou huile de poisson et un groupe placebo, a montré qu’une diète riche
32
en acides gras n-3 semble réduire la progression des maladies coronariennes (von Schacky, et
al., 1999).
L’étude DART (Diet And Reinfarction Trial), effectuée sur 2033 hommes a montré que les
consommateurs de 300g de poisson par semaine pendant 2 ans, présentaient un risque de
mortalité diminué de 29% comparativement à ceux qui n’en consommaient pas (Burr, et al.,
1989).
Ces observations ont été confortées par celles de l’étude GISSI 1999. Cette dernière
portait sur des patients hospitalisés pour un infarctus du myocarde 3 mois, au plus, avant le début
de l’enquête. Après 3.5 ans, le groupe supplémenté avec des n-3, présentait un taux de mortalité
cardiovasculaire inférieur à 30% à celui du groupe placebo. La supplémentation en n-3 a
également entraîné une diminution de 45% des cas de mort subite. Une moindre incidence des
infarctus du myocarde non mortels et des attaques cérébrales a également été constatée
(Marchioli, et al., 2002).
Dans le cas de l’étude Lyon Diet Hart Study et de l’étude indo-méditerrannéenne menée
par l’équipe de Singh (Singh, et al., 2002), l’administration de produits enrichis en acide α-
linolénique semble abaisser la morbidité et la mortalité cardio-vasculaire.
Une étude a également été menée sur des patients en attente d’endarterectomie
supplémentés ou non en huile de poisson. Après l’endarterectomie, les plaques prélevées ont été
analysées. Les patients dont la diète était supplémentée en oméga-3 présentaient des plaques
dont la chape fibreuse était bien formée et plus stable, ainsi qu’une moindre infiltration de
macrophages, suggérant un rôle stabilisateur de la plaque des n-3 (Thies, et al., 2003).
Cependant, il ressort de l’étude organisée par la Food Standards Agency (FSA),
regroupant des experts pour faire le point des recherches actuelles, que le bénéfice attribuable à
l’acide α-linolénique sur le plan des risques cardiovasculaires est limité, y compris en prévention
secondaire comparé aux effets cardiovasculaires de l’EPA et du DHA. Le rapport rédigé par
Sanderson en 2002 semble indiquer que les résultats obtenus avec une supplémentation en
huile de poisson ne seraient pas retrouvés dans le cas d’un enrichissement par l’acide α-
linolénique (Sanderson, et al., 2002).
III-5-4 AGPI n-3 et inflammation
L’inflammation tient une place centrale dans le développement et la progression de
l’athérosclérose. Plusieurs études se sont intéressées aux rôles des acides gras n-3 dans le
processus inflammatoire.
33
Des cellules endothéliales en culture et activées par des cytokines produisent moins
d’interleukines IL-6 et IL-8 après avoir été traitées avec des AGPI n-3 (De Caterina, et al.,
1994;Khalfoun, et al., 1996).
Dans plusieurs modèles de macrophages cultivés en présence d’AGPI n-3, il a été observé une
diminution de la biosynthèse des agents pro-inflammatoires PGE2, et LTB4 (Mitjavila, et al.,
1996;Wallace, et al., 2000;Yaqoob and Calder, 1995), pouvant atteindre jusqu’à 60% (Caughey,
et al., 1996;Endres, et al., 1989;Meydani, et al., 1993) ainsi qu’une réduction de la production des
cytokines IL-1β et TNF α (Baldie, et al., 1993;Chu, et al., 1999).
Des études menées sur des volontaires sains supplémentés ou non en AGPI ont confirmé les
effets des AGPI n-3 sur la réduction de la production de PGE2 (Caughey, et al., 1996;Endres, et
al., 1989;Meydani, et al., 1991).
III-5-5 AGPI n-3 et recrutement des monocytes
Au cours de la formation du centre athéromateux, les monocytes sont les principales
cellules qui s’accumulent. Leur recrutement en masse, sous l’effet d’agents chémoattractants
(MCP-1, LTB4, ICAM-1, VCAM-1…) sécrétés par les cellules endothéliales activées, accélère
l’évolution de la plaque.
Plusieurs études in vitro ont montré que lorsque les cellules endothéliales sont cultivées en
présence d’AGPI n-3, il y a diminution de l’adhésion des monocytes (Prichard, et al., 1995) par
réduction de la production de LTB4 (Lee, et al., 1985;Sperling, et al., 1993), de VCAM1 (De
Caterina, et al., 1994;De Caterina, et al., 2000;Miles, et al., 2000), d’ICAM1 (Hughes, et al.,
1996;Miles, et al., 2000) et de MCP-1 (Baumann, et al., 1999).
Deux études réalisées sur des monocytes issus de sujets sains et stimulés ex vivo, confirment la
réduction de la production d’ICAM-1 (Hughes, et al., 1996;Miles, et al., 2000).
La culture de macrophages murins en présence d’AGPI n-3 entraîne une diminution de leur
adhésion à la boîte de Pétri (Calder, et al., 1990).
Ces résultats suggèrent que les AGPI n-3 peuvent réduire la progression de l’athérosclérose.
III-5-6 AGPI n-3 et prolifération cellulaire
La prolifération des CML est à l’origine de la formation de la chape fibreuse des plaques
d’athérome. L’équipe de Terano a montré que la prolifération des CML était diminuée en
présence d’AGPI n-3 (Terano, et al., 1997).
34
III-5-7 AGPI n-3 et lipides et lipoprotéines plasmatiques
Les effets des AGPI n-3 sur les lipoprotéines restent sujet à controverse. En effet,
plusieurs études montrent une réduction du taux de CST-LDL plasmatique en présence d’AGPI
de la série n-3 que ce soit au niveau de patients normolipidémiques (Grundy and Denke, 1990),
hyperlipidémiques (Harris, 1989;Phillipson, et al., 1985;Smith, et al., 1995) ou encore au niveau
de souris athérosclérotiques (George, et al., 2000), alors que d’autres observent une
augmentation de ce taux (Bruckner, et al., 1987;Vandongen, et al., 1988). La difficulté dans
l’interprétation des résultats de ces études vient du fait de la grande variabilité de certains
paramètres tels que la triglycéridémie, le taux d’acides gras saturés ingérés, etc….
De nombreuses études menées sur des rats ou des hamsters confirment que la
supplémentation alimentaire en acides gras de la série n-3 réduit la cholestérolémie plasmatique.
Il semble que les acides gras de la famille n-3 agissent, entre autre, en limitant l’oxidation des LDL
(Lapointe, et al., 2006).
Les études portant sur le rôle des AGPI n-3 sur la concentration en cholestérol-HDL
plasmatiques apportent des résultats tout autant controversés. En effet, dans de nombreux cas,
la supplémentation en huile de poisson est corrélée à une augmentation du taux plasmatique de
cholestérol-HDL que ce soit chez des sujets normolipidémiques (Fehily, et al., 1983;Grundy and
Denke, 1990;Sanders and Roshanai, 1983) ou des sujets hyperlipidémiques (Green, et al., 1985).
Cependant, plusieurs études menées sur des rats ou des hamsters indiquent qu’un régime
alimentaire supplémenté en acides gras de la famille n-3 pendant 2 semaines entraîne une
réduction du taux de HDL plasmatique (Lin, et al., 2005;Morgado, et al., 2005).
Des macrophages humains de la lignée THP-1 ont été incubés avec des LDL de
composition variable en AGPI n-3. Il a été observé dans les THP-1 incubés avec des LDL riches
en AGPI n-3 une diminution de l’accumulation des TG ainsi que des CE (Lada, et al., 2003).
Apparemment, les AGPI n-3 réduiraient le taux intracellulaire de CE par augmentation de leur
efflux (Dusserre, et al., 1995;Pal and Davis, 1990).
Il semble également que les AGPI n-3 exercent des effets hypotriglycéridémiant. En effet,
des études semblent indiquer que les AGPI n-3 diminuent la concentration de TG circulants en
atténuant la synthèse ou la sécrétion des VLDL. (Davidson, 2006 ; Tran, et al., 2006).
35
CHAPÎTRE II : LES MACROPHAGES
I Origine et morphologie
Le terme macrophage fut employé pour la première fois par Elie Metchnikoff à la fin du 19e
siècle pour qualifier de grosses cellules mononuclées retrouvées dans les tissus et dotées de la
capacité de phagocytose (Karnovsky, 1981). En effet, le terme de macrophages provient de 2
racines grecques : makros qui signifie grand et phagein qui signifie manger ; en d’autres termes,
macrophage pourrait se traduire par « grand mangeur ».
A l’origine les macrophages ont été classés dans le système réticulo-endothélial (Ashoff,
1924) puis Van Furth (van Furth, 1989) a proposé le système mononucléaire de phagocytes, et
monocytes et macrophages sont devenus les cellules de base de ce système. Les macrophages
sont issus de la moelle osseuse dont le précurseur commun à toutes les cellules
hématopoïétiques est le CFU-ML (Colony Forming Unit of Myeloid and Lymphoid cells). Celui-ci
se différencie, en présence de cytokines telles l’IL-3 et l’IL-6, et de GM-CSF (Granulocyte
Macrophage Colony Stimulating Factor) en CFU-GM (pour Granulocyte Macrophage). Ce dernier
est le précurseur des monocytes et des granulocytes. En présence de GM-CSF, de M-CSF
(Macrophage Colony Stimulating Factor), d’IL-3 et d’IL-6, cette cellule souche deviendra d’abord
un monoblaste qui se divisera pour donner deux promonocytes qui eux-même se diviseront pour
former des monocytes (Auger and Ross, 1992).
Ces monocytes pourront alors quitter la moelle osseuse et entrer dans la circulation
sanguine. Ils migreront vers les différents organes où ils se différencieront en macrophages
résidents. Pour quitter les vaisseaux sanguins, les monocytes doivent d’abord adhérer à
l’endothélium vasculaire via des adhésines exprimées à leur surface qui se lieront aux molécules
de surface des cellules endothéliales. Suite à leur attachement à l’endothélium, les monocytes
pourront le traverser et atteindre les tissus. Une fois différenciés, les macrophages peuvent
demeurer plusieurs mois dans les tissus (Bosque, et al., 1997).
Outre leur apparence morphologique, on peut distinguer les monocytes des macrophages par la
grande capacité de phagocytose qu’ont ces derniers. De plus, on peut différencier les
macrophages selon qu’ils sont activés ou non tant au niveau de l’expression de molécules de
surface qu’au niveau de leurs différentes fonctions.
Selon le tissu où ils se trouvent, les macrophages ont différents noms et morphologies. On
en retrouve partout dans l’organisme : dans le foie (cellules de Kupffer), dans la rate et les
différents tissus lymphoïdes, dans les poumons (macrophages alvéolaires), dans les os et tissus
conjonctifs (ostéoclastes et chondroclastes), dans la moelle osseuse, dans les cavités séreuses,
36
dans la peau, dans les tractus urogénital et gastro-intestinal et même dans le système nerveux
central (microglies) (Bosque, et al., 1997). La dispersion des monocytes à travers l’organisme
semble faite au hasard et les macrophages résidents sont modelés selon leur environnement.
Cette dispersion est continue mais, lors d’une infection ou d’un traumatisme, il y a augmentation
de l’expression d’adhésines à la surface des cellules endothéliales des vaisseaux, ce qui conduit
au recrutement de monocytes (Auger, 1992).
Les monocytes sont de grandes cellules de 15 à 20 µm de diamètre. Le noyau est
irrégulier, réniforme parfois lobé mais non segmenté. Le cytoplasme est de forme très irrégulière
et contient de nombreuses et fines granulations. Il est parfois possible de reconnaître dans le
monocyte des fragments cellulaires ou des cellules phagocytées.
Il existe une grande diversité de macrophages, il est par conséquent difficile de présenter un
aspect général. On peut cependant les définir comme de grandes cellules de 20 à 50 µm de
diamètre, à noyau assez grand, arrondi ou ovalaire. Le macrophage résident est plus grand que
le monocyte circulant, a une activité métabolique plus importante et exprime un nombre plus
important de récepteurs membranaires.
Monocytes et macrophages présentent des caractéristiques communes : un système de
Golgi très développé, de nombreuses granules cytoplasmiques, des récepteurs de surface pour
les complexes anticorps ou monomètres IgG, des récepteurs pour IgE, des récepteurs CR1 et
CR3 pour les fractions du complément, les récepteurs pour les cytokines et les facteurs de
croissance et les récepteurs de chimiotactisme
Une des caractéristiques importantes du macrophage est sa transformation d’un état de repos à
un macrophage inflammatoire activé. Les cellules activées sont plus grandes que les cellules
résidentes au repos, contiennent plus de granules lysozomiales et de mitochondries. Elles ont
une capacité plus grande de phagocytose des particules opsonisées, d’attachement à des
surfaces, de former plus de pseudopodes, et contiennent un nombre plus important de vésicules
de pinocytose, une quantité supérieure d’enzymes fibrinolytiques et une capacité supérieure à
générer des anions superoxydes. Le cytosquelette du macrophage, formé de microtubules et de
microfilaments d’actine, est très bien développé et permet sa locomotion de même que la
formation de pseudopodes lors de la phagocytose (Auger, 1992).
37
II Fonctions des macrophages
Les fonctions des monocytes et macrophages sont très nombreuses. Ces cellules jouent
un rôle essentiel dans les réactions de défense, non seulement à cause de leur capacité de
phagocytose mais aussi comme support de la prolifération lymphocytaire et de la présentation
antigénique.
II-1 Phagocytose
La phagocytose permet aux cellules d’ingérer des particules de plus de 0.5µm. Bien que la
majorité des cellules de l’organisme possède la capacité de phagocytose, certaines cellules
comme les monocytes/macrophages sont spécialisées dans ce domaine (Aderem and Underhill,
1999). Les macrophages peuvent phagocyter toutes sortes de particules telles les micro-
organismes, les débris cellulaires et les cellules tumorales. Il y a tout d’abord adhésion de la
particule à éliminer sur le macrophage. Il s’en suit alors la formation de pseudopodes qui
entourent la particule jusqu’à former un phagosome. Le phagosome va fusionner avec les
endosomes précoces, puis avec les endosomes tardifs et enfin avec les lysosomes : on parle
alors de phagolysosomes. Les enzymes lysosomiales vont détruire la particule ingérée, les débris
cellulaires sont ensuite libérés par exocytose.
II-2 Présentation d’antigènes
Les éléments étrangers ingérés par les macrophages peuvent également être fragmentés
en peptides. Ces peptides peuvent se fixer sur les molécules du CMH (Complexe Majeur
d’Histocompatibilité) et se répartir sur toute la surface du macrophage. Il s’en suit l’activation des
lymphocytes T et amplification de la réponse immunitaire.
II-3 Activation cellulaire et chimiotactisme
Les macrophages sont extrêmement importants dans l’orchestration de la réponse
immunitaire et pour cela, sécrètent une grande variété de molécules actives. Les macrophages
sécrètent trois cytokines dites pro-inflammatoires : IL1 α et β, le TNFα et l’IL-6. L’Il-1 et le TNF α
activent l’endothélium vasculaire qui deviendra plus perméable à l’exsudat inflammatoire, et
induisent l’expression des adhésines endothéliales, responsables du recrutement d’autres
leucocytes et leur extravasation. Ils induisent la production de prostaglandines et leucotriènes
(Aggarwal and Natarajan, 1996;Bendtzen, 1988;Durum, et al., 1985). L’IL-6 favorise l’activation
38
des lymphocytes, et particulièrement la production d’anticorps par les plasmocytes (Van Snik,
1993). Le TNF α permet l’activation autocrine des macrophages (Aggarwal and Natarajan, 1996).
Les macrophages produisent également plusieurs facteurs de croissance tels que, PDGF
responsables de la prolifération des précurseurs hématopoïétiques des macrophages et des
granulocytes.
Certaines chimiokines, cytokines aux propriétés chimioattractantes, sont produites par les
macrophages (l’IL-8, les MCP,..) et induisent l’expression d’adhésines à la surface des cellules
endothéliales vasculaires.
Les macrophages sont également responsables de la production de prostaglandines et de
leucotriènes. Leurs actions combinées permettent la régulation du flux sanguin et lymphatique
aux abords du site lésé.
Comme nous l’avons étudié dans le chapitre précédent, les macrophages sont impliqués
dans le développement de l’athérosclérose dès les premiers stades et leur rôle persiste au cours
de l’évolution des lésions, indiquant un rôle central de ces cellules dans le processus
athérosclérotique.
L’un des évènements crucial dans l’apparition de lésions athérosclérotiques est
l’accumulation de macrophages dits spumeux. L’hypercholestérolémie est l’un des principaux
facteurs de risque de la maladie. L’incidence des accidents coronariens semble directement liée
au taux plasmatique de cholestérol-LDL et inversement liée au taux de cholestérol-HDL. Ainsi, le
métabolisme du cholestérol est un élément clé du développement des maladies
cardiovasculaires.
III Trafic intracellulaire du cholestérol
Comme dans les autres types cellulaires, le cholestérol macrophagique a deux origines : la
synthèse de novo dans le réticulum endoplasmique d’une part, responsable des deux tiers des
apports journaliers, et l’endocytose des ligands contenant du cholestérol notamment les
lipoprotéines de faible densité (LDL) d’autre part. Dans les conditions physiologiques, aussi bien
le cholestérol nouvellement synthétisé que le cholestérol exogène (apporté notamment par les
LDL) sont distribués dans la cellule pour enrichir les pools de cholestérol des membranes
cellulaires et principalement la membrane plasmique.
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Les compositions lipidiques précises de la membrane plasmique et des autres membranes
des organites intracellulaires restent sujettes à discussion puisque la détermination de celles-ci
semble dépendre à la fois du type cellulaire et de la méthode de quantification. Toutefois, on
estime qu’à l’état basal, 60 à 80% du cholestérol cellulaire se trouve au niveau de la membrane
plasmique.
Après endocytose, les LDL sont d’abord transportées vers les endosomes précoces et
sont ensuite dirigées vers les endosomes tardifs/lysosomes. Les endosomes tardifs constituent
non seulement une étape obligatoire pour les LDL ou les autres ligands qui ont suivie la voie
endocytique et qui doivent être dégradés, mais fonctionnent aussi comme un compartiment de tri
de protéines. Lorsque la fonction endosomale est altérée comme dans la maladie de Niemann
Pick de type C (NPC) ou après traitement par des drogues mimant cette pathologie, le cholestérol
s’accumule dans les endosomes tardifs et le trafic membranaire est perturbé (Kobayashi, et al.,
1999).
Ce transport intracellulaire du cholestérol à partir des endosomes tardifs est très important
dans l’homéostasie du cholestérol cellulaire : un dérèglement ou un déficit dans l’une des voies
de transport du cholestérol à partir de l’endosome tardif et/ou lysosome est souvent à l’origine de
perturbations graves dans le fonctionnement cellulaire (maladie de Niemann Pick C et syndrome
antiphospholipide). Les mécanismes mis en jeu dans le transport du cholestérol à partir de ces
deux organites ne sont pas complètement caractérisés et demeurent sujet à controverses.
Cependant, des développements récents montrent qu’un phospholipide, exclusivement localisé
dans les endosomes tardifs paraît clairement impliqué dans la mobilisation du cholestérol à partir
de ces organites : le BMP (voir le chapitre 3). Ce phospholipide pourrait en ce sens jouer un rôle
dans l’accumulation de cholestérol observée dans la maladie de Niemann Pick C et dans le
syndrome anti-phospholipide voire même de manière plus générale dans les processus qui
conduisent à l’accumulation de quantités importantes de cholestérol dans les macrophages au
cours de l’athérogénèse.
III-1 Capture des LDL
III-1-1 Endocytose des LDL par récepteur interposé
L’endocytose par récepteur interposé offre la possibilité d’une capture sélective de
protéines et de particules extracellulaires. Des protéines réceptrices présentes à la surface
cellulaire fixent fortement le ligand approprié, avec un degré élevé de spécificité. L’endocytose de
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ces complexes particuliers s’opère couramment au niveau de puits tapissés, dépressions
spéciales de la surface cellulaire.
Le type particulier le mieux étudié d’endocytose par récepteur interposé est le système qui
permet aux cellules d’accumuler le cholestérol. Celui-ci est insoluble dans les liquides de
l’organisme ; qu’il soit d’origine alimentaire ou qu’il soit synthétisé par la cellule hépatique, il est
toujours véhiculé par un transporteur. Le type de complexe prenant en charge le cholestérol
sanguin n’est autre que la lipoprotéine de faible densité ou LDL (low density lipoprotein). Les
particules LDL sériques sont une source non négligeable de cholestérol pour toutes les cellules,
bien que toutes puissent en faire la synthèse de novo à partir de l’acétate (Alberts, 1994).
Dès que la particule LDL est fixée au récepteur LDL de la membrane plasmique, le
complexe récepteur-ligand est endocyté au niveau d’un puit tapissé de clathrine, qui s’invagine en
profondeur, s’étrangle et se détache de la membrane pour devenir une vésicule tapissée
indépendante. Puis, le tapis de clathrine se dépolymérise en triskélions, laissant subsister une
vésicule lisse appelée endosome. Celui-ci fusionne alors avec une vésicule de découplage
(CURL : Compartment of Uncoupling of Recepteur and Ligand) dont le pH intérieur peu élevé (
5) va pousser les particules de LDL à se dissocier des récepteurs LDL. Une zone enrichie en
récepteurs bourgeonne ensuite de la vésicule pour former une vésicule distincte qui va recycler
les récepteurs LDL et les ramener à la membrane plasmique (l’ensemble des étapes est
représenté dans la figure 7).
Membrane plasmique
Récepteur aux LDL
Endosome précoce
lysosome
Cholestérol
libre
Enzymes
hydrolytiques
endocytose
Retour des récepteurs
aux LDL à la
membrane plasmique
Fusion avec les
endosomes
LDL Membrane plasmique
Récepteur aux LDL
Endosome précoce
lysosome
Cholestérol
libre
Enzymes
hydrolytiques
endocytose
Retour des récepteurs
aux LDL à la
membrane plasmique
Fusion avec les
endosomes
LDL
Figure 7 : Endocytose des LDL par l’intermédiaire de récepteurs (Alberts,
1994).
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La vésicule chargée d’une particule de LDL se soude avec un autre endosome (endosome
tardif) ou à un lysosome : c’est là que la protéine apo-B de la particule LDL est dégradée en
acides aminés et que les esters de cholestérol sont hydrolysés en acides gras et cholestérol libre
qui est ainsi mis à la disposition de la cellule pour une nouvelle synthèse membranaire.
Des observations en microscopie électronique montrent que le compartiment endosomal
se présente sous la forme d’un ensemble complexe de tubes et de vésicules hétérogènes limités
par une membrane, s’étendant de la périphérie de la cellule à la région périnucléaire, où il est
souvent proche mais séparé de l’appareil de Golgi. Dans de telles expériences de marquage, on
peut facilement distinguer deux groupes d’endosomes : les molécules de traceur apparaissent en
une minute environ dans les endosomes précoces, situés juste en dessous de la membrane
plasmique, et après 5 à 15 minutes dans les endosomes tardifs, proches de l’appareil de Golgi et
près du noyau.
On ne sait pas encore comment les molécules endocytées passent d’un compartiment
endosomal à l’autre et finissent (pour certaines) dans les lysosomes. Une hypothèse est que les
endosomes précoces progressent lentement vers l’intérieur pour devenir des endosomes tardifs
qui après fusion avec des vésicules transportant des hydrolases à partir du réseau trans- golgien
(TGN), récupération croissante de membrane et acidification croissante, seraient convertis en
lysosomes. Un autre point de vue est que les endosomes précoces et tardifs sont des
compartiments stationnaires distincts, et que le transport entre eux se produirait via un
compartiment de transport intermédiaire soit par un réseau dynamique de tubes, soit par le
détachement de fragments de l’endosome précoce qui seraient transportés vers l’intérieur de la
cellule, où ils finissent par fusionner avec les endosomes tardifs. Le transport des endosomes
précoces vers les endosomes tardifs est alors assuré par de grosses vésicules de transport
endosomales, qui contiennent de grandes quantités de membranes invaginées et sont pour cette
raison appelées corps multivésiculaires : ce transport se produit le long des microtubules et peut
être bloqué de façon expérimentale par des substances chimiques dépolymérisant les
microtubules. Les endosomes précoces et tardifs diffèrent réellement par leur composition
protéique : en particulier, ils sont associés avec différentes protéines rabaptin (rab7-GTP pour
l’endosome tardif, rab5-GDP pour l’endosome précoce) qui jouent un rôle important en orientant
le transport vésiculaire. Par ailleurs, lorsque l’endosome tardif fusionne avec les vésicules du
TGN, il acquiert le marqueur du récepteur au mannose 6-phosphate (étant donné que les
lysosomes ne possèdent pas de récepteur MPR, on peut donc distinguer les endosomes tardifs
des lysosomes sur la base d’un marquage de MPR). Les récepteurs M6PR ont pour principal rôle
d’acheminer les hydrolases acides nouvellement synthétisée vers la voie endocytique (Luzio, et
al., 2000).
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Dans les endosomes tardifs/lysosomes, la principale réaction qui intéresse le métabolisme
du cholestérol est l’hydrolyse des esters de cholestérol (coupure de la liaison ester) contenus
dans les LDL pour produire des molécules de cholestérol libre : cette réaction est catalysée par
une cholesterylester hydrolase acide (encore appelée lipase acide). Celle-ci se distingue de la
cholesterylester hydrolase neutre présente dans le cytoplasme de la cellule.
Cholesterylester cholestérol libre + acide gras
Cholesterylester hydrolase acide
III-1-2 Phagocytose des LDL
Dans le sous-endothélium, les LDL subissent des modifications et principalement sont
oxydées. Des études in vitro ont montré que les LDLox ont la propriété de s'agréger (Hoff and
O'Neil, 1991). De telles agrégations de particules ont également été observées dans l'espace
sous-endothélial de certaines lésions (Frank and Fogelman, 1989;Guyton and Klemp, 1992).
Certains récepteurs aux LDL référencés comme « récepteurs phagocytaires » sont tout
particulièrement impliqués dans le processus de phagocytose. Ainsi, il apparaît que les LDL
agrégées peuvent être incorporées par les macrophages par le biais de récepteur médiant la
phagocytose (Suits, et al., 1989). Ainsi, une alternative aux récepteurs des LDL est la capture de
ces lipoprotéines agrégées par phagocytose (Daugherty and Roselaar, 1995). Les facteurs de
reconnaissance et de capture de ces lipoprotéines n'ont, pour l'instant, pas été établis.
La phagocytose de lipoprotéines semble aboutir à des dépôts de cholestérol
intracellulaires aberrants. Il a été montré que la phagocytose stimulait l'apparition de cholestérol
non estérifié et de cristaux de cholestérol au sein des lysosomes. De tels dépôts de cholestérol
intracellulaire, semblent ne pas pouvoir être recyclés en cholestérol estérifié.
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III-2 Transport du cholestérol à partir des endosomes tardifs et/ou
lysosomes
Après endocytose des LDL, le cholestérol libre est donc retrouvé au niveau des
endosomes tardifs et/ou lysosomes. Les mécanismes mis en jeu dans le transport à partir de ces
deux organites ne sont pas complètement caractérisés et demeurent sujet à controverses.
Cependant, les résultats donnés par la littérature montrent l’existence de deux destinations du
cholestérol libre à partir des endosomes tardifs/lysosomes : après sa sortie des endosomes tardifs
et/ou lysosomes, le cholestérol libre peut être acheminé soit vers la membrane plasmique, soit
vers le réticulum endoplasmique (RE).
Une grande part du cholestérol libre des endosomes tardifs/lysosomes est rapidement
transporté à la membrane plasmique pour y enrichir le pool de cholestérol. Il apparaît que plus de
70% du cholestérol endocyté est transporté au niveau de régions spécialisées caractérisées par
leur richesse en cholestérol et sphingolipide de la membrane plasmique : les radeaux lipidiques
ou rafts. Lorsque des macrophages en culture sont incubés avec les LDL natives ou modifiées, la
majorité du cholestérol est ainsi retrouvé dans la membrane plasmique et plus particulièrement au
niveau des rafts (Gaus, et al., 2004).
Ces microdomaines lipidiques sont appelés cavéoles lorsqu’ils contiennent aussi une
pro