Optimierung und technische Validierung vereinfachter, kommerzieller DNA- Extraktionsverfahren für Mycobacterium ulcerans und Mycobacterium leprae für den Einsatz im Feld

Full text

Fazit. Die vereinfachten Methoden Genolyse® sowie zumindest SwiftX™
Protokolle Nr. 7 und 8 sind ihrer Sensitivität nach der Referenzmethode
nahezu gleichwertig. Sie sind sowohl kostengünstiger (ab 1,80 € versus
⌀3 €/Test) als auch zeitlich effizienter (ab 20 min versus 12 h).
Optimierung und technische Validierung vereinfachter, kommerzieller DNA- Extraktionsverfahren
für Mycobacterium ulcerans und Mycobacterium leprae für den Einsatz im Feld
T.Tsulaia1, M. Saar1, A. Wende 2, G. Bretzel 1
1 Abteilung für Infektions- und Tropenmedizin [AITM],
Klinikum der Ludwig-Maximilians-Universität München
³ Xpedite Diagnostics, München, Deutschland
Abteilung für Infektions- und Tropenmedizin
Hintergrund. Für den molekularbiologischen Nachweis von
Mycobacterium ulcerans und Mycobacterium leprae stehen mittlerweile
neben konventionellen (q)PCR-basierten Methoden auch trockenreagenz-
basierte [dry reagent based, DRB] Nukleinsäureamplifikationstechniken
[NAAT] (IS2404 DRB Loop-mediated isothermal amplification [LAMP]
bzw. RLEP DRB LAMP) zur Verfügung, für die gleichermaßen
feldtaugliche DNA-Extraktionsverfahren benötigt werden [1][2][3][4].
Fig 1: Vergleich der Referenzmethode…
▪Gentra® Puregene® (Qiagen, Hilden, Deutschland), verifiziert und
standardmäßig im akkreditierten Labor der AITM verwendet.
… mit 9 vereinfachten DNA-Extraktionsmethoden
▪Genolyse® (Hain Lifescience, Nehren, Deutschland)
▪SwiftX™ DNA und ParaBact (Xpedite Diagnostics, München,
Deutschland) (8 verschiedene Protokolle zur Optimierung)
Nächste Schritte. Nach der weiteren Austestung der
Extraktionsverfahren auch mit niedriger Bakterienlast und ohne
natürliche Probenmatrix, folgt die Auswertung zusätzlich neben der qPCR
auch mit LAMP, um die Extraktionsmethoden bei verschiedenen NAAT
zu vergleichen. Die ausgewählten vereinfachten Extraktionsmethoden
werden mit Bakteriensuspensionen von M. ulcerans und inaktivierten M.
leprae (Bezugsquelle: National Hansen's Disease Program, Baton Rouge,
USA) technisch validiert.
Kooperation der Abteilung für Infektions- und Tropenmedizin, München und Xpedite Diagnostics GmbH, München
Unser herzlicher Dank geht an Kerstin Helfrich für ihre hilfreiche Unterstützung im Labor,
sowie an Dr. rer. nat. Noemi Castelletti für ihre wertvolle Hilfe bei der statistischen Auswertung.
Zielsetzung der Studie ist die Optimierung und technische Validierung
vereinfachter kommerzieller DNA-Extraktionsverfahren für M. ulcerans
und M. leprae im Vergleich zur Referenzmethode.
Literatur:
[1] M. Beissner et al. (2012) Detection of viable Mycobacterium ulcerans in clinical samples by a novel combined 16S rRNA reverse transcriptase/IS2404 real-time qPCR assay. PLoS Negl Trop Dis 6(8): e1756.
[2] M. Beissner et al. (2015) Loop-Mediated Isothermal Amplification for Laboratory Confirmation of Buruli Ulcer Disease-Towards a Point-of-Care Test. PLoS Negl Trop Dis 9(11): e4219.
[3] M. Beissner et al. (2019) Development of a combined RLEP/16S rRNA (RT) qPCR assay for the detection of viable M. leprae from nasal swab samples. BMC Infect Dis 19: 753.
[4] M. Saar et al.(2021) RLEP LAMP for the laboratory confirmation of leprosy: towards a point-of-care test. BMC Infect Dis 21:1186.
[5] Shepard, C. C., & McRae, D. H. (1968). A method for counting acid-fast bacteria. International journal of leprosy and other mycobacterial diseases: official organ of the International Leprosy Association, 36(1),78-82
Für die Optimierung der SwiftX™ Protokolle wurde zunächst mit M.
ulcerans gearbeitet, da dieses im Gegensatz zu M. leprae im Labor relativ
einfach kultiviert werden kann. Von zehn verschiedenen M. ulcerans
Kulturen wurden zehn Bakteriensuspensionen hergestellt und aliquotiert
(variable Bakterienlast 10.000 bis 100.000 pro 200 μl Suspension).
Die Bakteriensuspensionen (n = 200) wurden im Doppelansatz mit
natürlicher Probenmatrix (Nasenabstriche) jeweils gepoolt und extrahiert.
Anschließend wurden die 200 Extrakte per IS2404-qPCR gemessen.
Um die Ct-Werte von verschiedenen qPCR-Läufen statistisch vergleichen
zu können, wurden sie mit Hilfe von Standardkurven in die Starting
Quantity (SQ) umgewandelt. Aus der SQ konnte über die sich, je nach
Methode unterscheidende Extraktmenge sowie die bekannte Anzahl der
IS2404-Kopien (⌀207 pro M. ulcerans Genom [1]), die Bakterienzahl pro
Extrakt (B/E) errechnet werden (somit wurde die unterschiedliche
„Verdünnung“ der DNA im Extrakt ausgeglichen).
Fig. 1 Vergleich von DNA-Extraktionsmethoden
Fig. 2
Vergleich der Extraktions-
methoden nach per qPCR
ermittelter SQ in 2 μl DNA-
Extrakt; Kruskal-Wallis-Test,
χ2 = 42.349, p = 2.837-06
(nur p ≤ 0.05 angegeben)
*p ≤ 0.05, ***p ≤ 0.001
(signifikant); Paarweise
Vergleiche: DunnTest;
Bonferroni-Korrektur
Vergleich der Extraktions-
methoden nach per qPCR
ermittelter Bakterienanzahl
pro DNA-Extrakt; Kruskal-
Wallis-Test, χ2 = 23.206,
p = 0.005751 (signifikant);
Paarweise Vergleiche: Dunn-
Test; Bonferroni-Korrektur
(nur p ≤ 0.05 angegeben)
*p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01
Fig. 3
Ergebnis qPCR. Um Aussagen über die Sensitivität der verschiedenen
Extraktionsmethoden treffen zu können wurden die zum Teil signifikant
voneinander unterschiedlichen SQ- bzw. B/E- Werte verglichen (Fig. 2, 3).
Die Ausgangsmenge der Bakterien wurde nach Resuspendierung der M.
ulcerans Kolonien in RPMI 1640 Medium und anschließender
Hitzeinaktivierung mikroskopisch gezählt (Kinyoun-Färbung und Zählung
nach Shepard, mit eigenen Modifikationen [5]).
Methoden und Ergebnisse.
****
*** *
*
*
**
*
Statistik. Im Kruskal-Wallis-Test wurden statistisch signifikante
Unterschiede zwischen den Methoden sichtbar. Basierend auf dem
DunnTest mit anschließender Bonferroni-Korrektur unterscheiden sich
die im Boxplot mit Asterisken markierten Extraktionsmethoden
signifikant.