REVIEW SU METODI ANALITICI PER LA CARATTERIZZAZIONE DI STRUTTURE GRAFENICHE E PROFILI DI TOSSICITA’

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1
PRE-PRINT Aprile 2023
REVIEW SU METODI ANALITICI PER LA CARATTERIZZAZIONE DI
STRUTTURE GRAFENICHE E PROFILI DI TOSSICITA’
Amedeo Cinosi 1, Loretta Bolgan 2 e Carlo Martelli 3
1 Sr. Specialist X-Ray & OES Spectroscopy analytical methods
2 Consulente scientifico PhD in scienze farmaceutiche
3 Docente universitario, PhD in Matematica
ABSTRACT
Nella seguente revisione si passeranno in rassegna dapprima alcune delle più interessanti metodiche di analisi in relazione alla loro
applicabilità nell’identificazione della presenza di composti del grafene in varie matrici; successivamente ci si focalizzerà sulle matrici
organiche al fine di fornire la corretta interpretazione qualitativa e quantitativa degli esiti analitici di campioni contenenti tali
composti e, per concludere, si affronterà il tema della presenza di composti del grafene all’interno dei preparati iniettabili anti SARS-
Cov2, in relazione a eventuali profili di tossicità correlati ai possibili dati osservazionali, individuati dalla disamina delle metodiche
analitiche considerate e alla letteratura attualmente disponibile in merito.
INTRODUZIONE
I primi studi sulle strutture 2D del carbonio risalgono agli anni ’50, ma solo dopo vari decenni i fisici Andrei
Geim e Kostantin Novoselov riuscirono a isolare un piano di grafene e a misurarne le proprietà chimico-fisiche,
scoperta che è valsa loro il premio Nobel per la Fisica nel 2010. In tempi via via più recenti il grafene è diventato
uno dei materiali più studiati al mondo, in particolar modo negli ultimi anni e, grazie alle sue proprietà uniche, è
stato definito un “materiale del futuro”
1
. Le rare proprietà del grafene lo rendono un materiale molto
promettente per un'ampia varietà di applicazioni, inclusi transistor ad effetto di campo (FET), setacci molecolari
per la rimozione di gas tossici e metalli pesanti dalle acque, membrane semipermeabili, sensori di gas, pellicole
conduttive trasparenti (TCF), batterie al grafene e nella medicina
2
,
3
,
4
,
5
,
6
,
7
,
8
.
1
Rümmeli MH, Rocha CG, Ortmann F, Ibrahim I, Sevincli H, Börrnert F, Kunstmann J, Bachmatiuk A, Pötschke M, Shiraishi M,
Meyyappan M, Büchner B, Roche S, Cuniberti G. Graphene: Piecing it together. Adv Mater. 2011 Oct 18;23(39):4471-90. doi:
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2
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doi: 10.1080/14686996.2018.1494493. PMID: 30181789; PMCID: PMC6116708.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6116708/
3
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https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18989330/
4
Robinson JT, Perkins FK, Snow ES, Wei Z, Sheehan PE. Reduced graphene oxide molecular sensors. Nano Lett. 2008 Oct;8(10):3137-
40. doi: 10.1021/nl8013007. Epub 2008 Sep 3. PMID: 18763832. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18763832/
5
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https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19367973/
6
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https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19206571/
7
Wang H, Yang Y, Liang Y, Robinson JT, Li Y, Jackson A, Cui Y, Dai H. Graphene-wrapped sulfur particles as a rechargeable lithium-
sulfur battery cathode material with high capacity and cycling stability. Nano Lett. 2011 Jul 13;11(7):2644-7. doi: 10.1021/nl200658a. Epub
2011 Jun 28. PMID: 21699259. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21699259/
8
Jiříčková A, Jankovský O, Sofer Z, Sedmidubský D. Synthesis and Applications of Graphene Oxide. Materials (Basel). 2022 Jan
25;15(3):920. doi: 10.3390/ma15030920. PMID: 35160865; PMCID: PMC8839209.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8839209/

2
IL GRAFENE E I SUOI DERIVATI
Il carbonio può essere strutturato in varie fasi cristalline (Fig 1) e classificate in funzione della dimensione spaziale
(D).
Fig. 1 - Rappresentazione grafica della struttura atomica delle forme allotropiche del carbonio. Da sinistra a destra: “0D”
Fullerene, “1D” Nanotubo di Carbonio a strato singolo (Single Walled Carbon Nano-Tube), “2D” Grafene e “3D”
Diamante e Grafite.
Il grafene, l’ossido di grafene (GO) e gli altri derivati si ottengono dalla grafite per esfogliazione e ossidazione
(Fig. 2) 8. Le proprietà chimico-fisiche variano in funzione dei processi di sintesi e dal rapporto atomico tra
carbonio e ossigeno (C/O) di cui bisogna tenere conto nella caratterizzazione chimico-fisica 2.
Fig. 2. Schema di processo per ottenere l’ossido di grafene
Il grafene, il GO e le strutture derivate sono costituiti da un singolo strato (monostrato) di atomi di carbonio,
con struttura cristallina a nido d’ape (Fig.3), dove ogni atomo di carbonio condivide tre orbitali sp2 con gli atomi
adiacenti, attraverso legami  a 120° e con lunghezza del legame “C-C” di 0,142 nm. Il quarto orbitale p è
ortogonale al piano ed è responsabile della sovrapposizione dei piani adiacenti 2D con legami Van der Waals a

3
basse energie (L=0,335 nm), da cui la semplice esfoliazione del grafene dalla grafite e l’eccezionale conduttività.
Fig. 3 – Struttura a nido d’ape dell’ossido di grafene. Tale struttura è comune al A) grafene, B) all’ossido di grafene e C)
all’ossido di grafene ridotto (rGO) https://doi.org/10.1016/B978-0-12-813182-4.00001-5
Il grafene esiste in diverse forme come nanonastri, nanofogli, nanopiastrine (GNP Nanoplatelets) e grafene 3D,
ciascuna delle quali fa intravedere applicazioni molto interessanti, ma le sue proprietà elettroniche e quantistiche
sono ancora materia di studi fondamentali.
A causa della presenza di gruppi funzionali dell'ossigeno sulla superficie del GO, il GO può essere utilizzato
come materiale di partenza per la sintesi di derivati innovativi del grafene come fluorografene, bromografene e
grafano.
L'ossido di grafene trova impiego in svariati campi di applicazione (Fig.4), le strutture hanno uno spessore tipico
1-2 nm e diametro variabile da 100 a 3000 nm
9
,
10
,
11
in funzione delle applicazioni e del processo di sintesi.
Le strutture di grafeniche inferiore a 1 m (Fig. 5) sono state oggetto di numerosi recenti lavori al fine di valutarne
9
Derakhshi M, Daemi S, Shahini P, Habibzadeh A, Mostafavi E, Ashkarran AA. Two-Dimensional Nanomaterials beyond Graphene for
Biomedical Applications. J Funct Biomater. 2022 Mar 9;13(1):27. doi: 10.3390/jfb13010027. PMID: 35323227; PMCID: PMC8953174.
https://www.mdpi.com/2079-4983/13/1/27
10
Lin J, Li P, Liu Y, Wang Z, Wang Y, Ming X, Gao C, Xu Z. The Origin of the Sheet Size Predicament in Graphene Macroscopic Papers.
ACS Nano. 2021 Mar 23;15(3):4824-4832. doi: 10.1021/acsnano.0c09503. Epub 2021 Mar 8. PMID: 33682415.
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33682415/
11
Vannozzi L, Catalano E, Telkhozhayeva M, Teblum E, Yarmolenko A, Avraham ES, Konar R, Nessim GD, Ricotti L. Graphene Oxide
and Reduced Graphene Oxide Nanoflakes Coated with Glycol Chitosan, Propylene Glycol Alginate, and Polydopamine: Characterization
and Cytotoxicity in Human Chondrocytes. Nanomaterials (Basel). 2021 Aug 19;11(8):2105. doi: 10.3390/nano11082105. PMID:
34443935; PMCID: PMC8399274. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8399274/

4
la biocompatibilità, la citotossicità per l’impiego in ambito clinico farmaceutico
12
,
13
,
14
,
15
,
16
(trattamento
fototermico del cancro, somministrazione di farmaci, terapia antibatterica e diagnostica per immagini).
Fig. 4 – Principali campi di applicazione del GO [57]
12
Liao C, Li Y, Tjong SC. Graphene Nanomaterials: Synthesis, Biocompatibility, and Cytotoxicity. Int J Mol Sci. 2018 Nov 12;19(11):3564.
doi: 10.3390/ijms19113564. PMID: 30424535; PMCID: PMC6274822. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6274822/
13
Cellot G, Franceschi Biagioni A, Ballerini L. Nanomedicine and graphene-based materials: advanced technologies for potential
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Sep 3. PMID: 34480086; PMCID: PMC9411050. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9411050/
14
Zare P, Aleemardani M, Seifalian A, Bagher Z, Seifalian AM. Graphene Oxide: Opportunities and Challenges in Biomedicine.
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https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8143506/
15
Han XM, Zheng KW, Wang RL, Yue SF, Chen J, Zhao ZW, Song F, Su Y, Ma Q. Functionalization and optimization-strategy of graphene
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PMC7270027. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7270027/
16
Derakhshi M, Daemi S, Shahini P, Habibzadeh A, Mostafavi E, Ashkarran AA. Two-Dimensional Nanomaterials beyond Graphene for
Biomedical Applications. J Funct Biomater. 2022 Mar 9;13(1):27. doi: 10.3390/jfb13010027. PMID: 35323227; PMCID: PMC8953174.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8953174/
57 S. Yadav et al An Update on Graphene Oxide: Applications and Toxicity. ACS Omega 2022 7 (40), 35387-35445 DOI:
10.1021/acsomega.2c03171 https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/acsomega.2c03171

5
Fig. 5 Contributo dei lavori sul grafene e sulle strutture derivate nelle applicazioni biomediche
Recenti studi di laboratorio hanno valutato le potenzialità del GO come adiuvante per la somministrazione di
vaccini.
17
Il GO appare promettente nel caricamento e nel rilascio dell'antigene e nell’attivare il sistema
immunitario, tuttavia la sua bassa solubilità, la scarsa stabilità, la citotossicità e in particolare i rischi a carico del
DNA ne hanno limitato l'applicazione nel corpo umano
18
,
19
.
Tao Jiang et al.
20
hanno studiato gli effetti sulla tossicità in funzione della dimensione, della composizione
elementare e dello stato di ossidazione.
Gli effetti sulla tossicità del GO sono correlati alla composizione elementare e alle dimensioni, mentre il livello
di ossidazione non ha mostrato effetti significativi. I livelli di tossicità e i modelli di espressione dei marcatori
proteici sono simili nel GO tra superfici da 5,31 ± 1,41 µm2 (L=2.2 ± 1.2 µm) a 0,70 ± 0,05 µm2 (0.8±0.2 µm).
Tuttavia, al diminuire delle dimensioni del GO e fino a 0,14 ± 0,007 µm2 (0.37nm± 0,08) è stato osservato che i
livelli di tossicità dei GO sono risultati significativamente più alti e indipendentemente dai tipi di GO esaminati.
Attualmente non sono disponibili nuovi metodi di sintesi di GO per una produzione su larga scala, a basso costo
o rispettosa dell'ambiente.
17
Xu L, Xiang J, Liu Y, Xu J, Luo Y, Feng L, Liu Z, Peng R. Functionalized graphene oxide serves as a novel vaccine nano-adjuvant for
robust stimulation of cellular immunity. Nanoscale. 2016 Feb 14;8(6):3785-95. doi: 10.1039/c5nr09208f. Epub 2016 Jan 27. PMID:
26814441. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26814441/
18
Cao W, He L, Cao W, Huang X, Jia K, Dai J. Recent progress of graphene oxide as a potential vaccine carrier and adjuvant. Acta
Biomater. 2020 Aug;112:14-28. doi: 10.1016/j.actbio.2020.06.009. Epub 2020 Jun 10. PMID: 32531395.
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32531395/
19
Jia PP, Sun T, Junaid M, Yang L, Ma YB, Cui ZS, Wei DP, Shi HF, Pei DS. Nanotoxicity of different sizes of graphene (G) and graphene
oxide (GO) in vitro and in vivo. Environ Pollut. 2019 Apr;247:595-606. doi: 10.1016/j.envpol.2019.01.072. Epub 2019 Jan 24. PMID:
30708322. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30708322/
20
Jiang T, Amadei CA, Lin Y, Gou N, Rahman SM, Lan J, Vecitis CD, Gu AZ. Dependence of Graphene Oxide (GO) Toxicity on
Oxidation Level, Elemental Composition, and Size. Int J Mol Sci. 2021 Sep 30;22(19):10578. doi: 10.3390/ijms221910578. PMID:
34638921; PMCID: PMC8508828. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8508828/

6
METODI ANALITICI PER IDENTIFICARE LE STRUTTURE DEL GRAFENE
Esistono diverse tecniche analitiche utilizzate su fasi per la caratterizzazione delle proprietà fisico-chimiche di
nanopolveri di grafene o di strutture derivate in fase solida, sospensione, in acqua o in solvente, ma non su matrici
complesse associate con altri composti e in cui le strutture grafeniche sono presenti in concentrazioni minori o
come tracce.
Le principali tecniche di indagine sono la microscopia elettronica a scansione (SEM), la microscopia elettronica
a trasmissione (TEM), la spettroscopia Raman e micro Raman, la microscopia a forza atomica (AFM), la
risonanza magnetica nucleare allo stato solido (Ss-NMR), la spettroscopia infrarossa in trasformata di Fourier
(FT-IR), la spettroscopia fotoelettronica indotta da raggi X (XPS), la diffrazione di raggi X (XRD) e l’analisi
termogravimetrica (TGA).
21
(Fig.6). In taluni casi è citata la microscopia ottica.
Fig. 6 Principali tecniche analitiche per la caratterizzazione chimico, fisica e morfologica delle strutture grafeniche
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9558614/)
Microscopia elettronica
La microscopia elettronica è una tecnica che, attraverso l’interazione tra un fascio di elettroni focalizzato e gli
atomi del campione, consente di generare immagini con una risoluzione di alcuni nanometri, quindi con un potere
risolutivo circa tre ordini di grandezza maggiore di quello della microscopia ottica; conseguentemente le
metodiche SEM e TEM hanno un potere risolutivo nell’ordine dei nanometri. Il SEM fornisce immagini in bianco
e nero a elevata risoluzione, con caratteristiche simili a quelle di una normale immagine fotografica e, grazie alla
grande profondità di campo, consente di apprezzare l’eventuale tridimensionalità delle strutture morfologiche
presenti.
L’identificazione di una struttura, quale il grafene, all’interno di una matrice in cui coesistono più fasi può risultare
complessa o impossibile, a meno che alcune fasi non siano state già identificate con altre tecniche o note dalla
letteratura, o dalle informazioni del produttore. Ciò in particolare può essere problematico nel caso di matrici
biologiche, quindi con presenza di carbonio, per cui eventuali strutture grafeniche presenti in tali condizioni
sperimentali potrebbero non essere distinguibili in modo univoco. In presenza di un campione monofasico, quale
il grafene o dei suoi derivati, invece l’analisi al microscopio elettronico è una tecnica diagnostica per descrivere la
morfologia, le dimensioni e le caratteristiche fisiche e chimiche.
21
Yadav S, Singh Raman AP, Meena H, Goswami AG, Bhawna, Kumar V, Jain P, Kumar G, Sagar M, Rana DK, Bahadur I, Singh P. An
Update on Graphene Oxide: Applications and Toxicity. ACS Omega. 2022 Sep 28;7(40):35387-35445. doi: 10.1021/acsomega.2c03171.
PMID: 36249372; PMCID: PMC9558614. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9558614/

7
Fig. 7 - Immagini al microscopio elettronico a scansione SEM di ossido di grafene.[22, 23]
Il TEM consente inoltre di esaminare dettagli sulle strutture micrometriche dei materiali e allo stesso tempo di
ottenere informazioni chimiche.
Fig. 8- Immagini al microscopio elettronico a scansione TEM di ossido di grafene [24, 25]

8
Le strutture di grafene ottenute al SEM o al TEM in Fig. 7 e Fig. 8 sono riferite a campioni costituiti da sole fasi
grafeniche, ottenute partendo da dispersioni di nanopolveri in matrice acquosa
22
,
23
,
24
,
25
, il che consente di avere
uno standard visivo delle strutture.
Altro fenomeno correlato alla produzione di immagini con microscopio elettronico è la generazione di Raggi-X
di fluorescenza (XRF), derivanti dall’eccitazione del fascio di elettroni incidente sugli atomi del campione.
I fotoni XRF prodotti hanno un’energia caratteristica e permettono di identificare gli elementi nel campione sia
da un punto di vista qualitativo, che semi-quantitativo. Le sonde EDS (Energy Dispersive X-ray Spectroscopy)
consentono di discriminare l’energia dei raggi-X degli atomi e attraverso uno spettro di fluorescenza X di
individuare gli elementi presenti e la composizione chimica della struttura osservata.
I raggi X di fluorescenza sono prodotti dall’eccitazione degli elementi fino a una profondità di 2-3 m o più,
26
in funzione della densità del campione. L’intensità dei segnali FRX negli spettri è quindi la somma dei contributi
di tutti gli elementi presenti fino alla profondità massima bagnata dal fascio degli elettroni incidente dal raggio
primario (Fig 11, Fig 12).
Fig. 11 Effetti associati all’interazione degli elettroni del raggio primario con la distanza dalla superficie del campione
22
Rhazouani A, Gamrani H, El Achaby M, Aziz K, Gebrati L, Uddin MS, Aziz F. Synthesis and Toxicity of Graphene Oxide
Nanoparticles: A Literature Review of In Vitro and In Vivo Studies. Biomed Res Int. 2021 Jun 10;2021:5518999. doi:
10.1155/2021/5518999. PMID: 34222470; PMCID: PMC8213470. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8213470/
23
Gurunathan S, Han JW, Eppakayala V, Kim JH. Green synthesis of graphene and its cytotoxic effects in human breast cancer cells. Int
J Nanomedicine. 2013;8:1015-27. doi: 10.2147/IJN.S42047. Epub 2013 Mar 10. PMID: 23687445; PMCID: PMC3655623.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3655623/
24
Aziz, M., Abdul Halim, F.S. and Jaafar, J. 2014. Preparation and Characterization of Graphene Membrane Electrode Assembly. Jurnal
Teknologi. 69, 9 (Aug. 2014). DOI:https://doi.org/10.11113/jt.v69.3388.
25
P. W. Albers et al - The characterization of commercial 2D carbons: graphene, graphene oxide and reduced graphene oxide -Mater.
Adv., 2022, 3, 2810–2826 DOI: 10.1039/d1ma01023a http://eprints.gla.ac.uk/266521/1/266521.pdf
26
Jongbo Park et al. Non-destructive electron microscopy imaging and analysis of biological samples with graphene coating, 2D Materials.
July 2014 http://dx.doi.org/10.1088/2053-1583/3/4/045004
https://iopscience.iop.org/article/10.1088/2053-1583/3/4/045004/pdf

9
Fig 12 Modello ottenuto con metodo Monte Carlo da Jongbo Park et al. 26 di mappatura dell’attenuazione dell'energia degli
elettroni del fascio primario con la profondità in matrice organica e l’emissione dei segnali RX per l’analisi EDS 30
Spettroscopia Raman
Il metodo Raman applicato a un campione (es. soluzione, sospensione, polvere policristallina) fornisce uno
spettro pari alla somma degli spettri generati dalle singole fasi presenti.
La spettroscopia Raman ha consentito a vari autori la caratterizzazione delle strutture grafeniche e delle relative
proprietà (GNP: grafene nanoplatelets, GO e rGO), sia prodotti ottenuti in laboratorio per ricerca che destinato
alla vendita
27
,
28
,
29
. Le fasi del grafene (GNP, GO, rGO) e della grafite (Fig. 13 e Fig. 14) hanno un’impronta
spettrale caratterizzate da tre bande, con energia simile e rapporti specifici di intensità.
La tabella 1 mostra le energie medie (cm-1) delle bande Raman G, D e 2D e le relative intensità per il GNP, il
GO e il rGO riportati da Albers et al. 37 su campioni commerciali relativamente puri.
La prima banda G a circa 1580 cm-1 è attribuita alle vibrazioni di fase della struttura cristallina ordinata, mentre
la banda D (∼1350 cm-1) è attribuita alla struttura amorfa.
Tab. 1 Frequenze e intensità dei picchi Raman del grafene, dell’ossido di grafene e del grafene ridotto
Variazioni strutturali generano dispersioni energetiche nella posizione della banda G nel GO di circa 20 cm-1 o
alla comparsa di segnali secondari D prossimi a 1600 cm-1.
30
27
Ferrari AC, Basko DM. Raman spectroscopy as a versatile tool for studying the properties of graphene. Nat Nanotechnol. 2013
Apr;8(4):235-46. doi: 10.1038/nnano.2013.46. PMID: 23552117. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23552117/
28
Ferrari AC, Meyer JC, Scardaci V, Casiraghi C, Lazzeri M, Mauri F, Piscanec S, Jiang D, Novoselov KS, Roth S, Geim AK. Raman
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Oct 30. PMID: 17155573. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17155573/
29
P. W. Albers et al. , The characterisation of commercial 2D carbons: graphene, graphene oxide and reduced graphene oxide, Mater. Adv.,
2022, 3, 2810 https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2022/ma/d1ma01023a
30
King AA, Davies BR, Noorbehesht N, Newman P, Church TL, Harris AT, Razal JM, Minett AI. A New Raman Metric for the
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PMC4726011. https://www.nature.com/articles/srep19491

10
La spettroscopia Raman risulta pertanto essere un supporto di rilievo per la caratterizzazione chimica, fisica o
strutturale di singole fasi (GO, rGo GNP), specialmente se associata a diffrazione X, microscopia elettronica,
spettroscopia IR o altre tecniche.
Fig. 13 Spettri Raman di grafite, ossido di grafene e ossido di Fig. 14 Spettri Raman di grafene 22
grafene ridotto
31
ANALISI DEI METODI PER L’IDENTIFICAZIONE DI GRAFENE IN CAMPIONI
ORGANICI E PREPARATI INIETTABILI ANTI SARS-COV2
Microscopia ottica
La microscopia ottica è stata impiegata da Campra36 per la determinazione di strutture attribuite a GO sulla base
di un lavoro di Xu et al.
32
. L’autore36 osserva al microscopio dei corpuscoli neri sia nei preparati Pfizer che negli
Astrazeneca e li attribuisce alla presenza di ossido di grafene (fig. 15).
Fig. 15- Immagini al microscopio ottico di corpuscoli nel vaccino anti- SARS-Cov2 Pfizer e Astrazeneca attribuiti a
grafene (b)
31
M. Strankowski et al. Polyurethane Nanocomposites Containing Reduced Graphene Oxide, FTIR, Raman, and XRD Studies. Journ. of
Spectroscopy, 2016, ID 7520741, 6p http://dx.doi.org/10.1155/2016/7520741
32
Xu H, Qi Z, Jin H, Wang J, Qu Y, Zhu Y, Ji H. Identification of graphene oxide and its structural features in solvents by optical
microscopy. RSC Adv. 2019 Jun 17;9(32):18559-18564. doi: 10.1039/c9ra02076d. PMID: 35515238; PMCID: PMC9064764.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9064764/

11
L’impiego di tale metodo di indagine nella determinazione del GO nei preparati lascia spazio a una serie di dubbi:
1. La microscopia ottica ha una risoluzione massima di circa 10µm, che in campo oscuro scende 0.2 µm (1000x).
In particolare i fogli di GO in sospensione acquosa determinati da Xu et al. 34 hanno dimensioni laterali da
pochi micrometri a centinaia di micrometri e possono pertanto essere identificati in microscopia ottica.
Le fasi di grafene (Gr, GO, rGO…) attese nei preparati destinati al campo bio-medicale e clinico e pertanto
nei vaccini, sono di nanocomposti 12-16, 27-29, con dimensioni tipiche inferiori ai 1µm, ovvero minori del limite
di rilevabilità della microscopia ottica, eccetto nell’ipotesi della presenza di fogli di grafene con dimensioni
laterali da pochi micrometri a centinaia di micrometri, tali da essere identificati nelle immagini al microscopio
ottico (in tal caso è necessaria un’interpretazione);
2. La presenza di particolato solido sospeso in un liquido incolore (acqua o solvente organico), per la legge di
Lambert-Beer conferisce a questo una colorazione tipica (es. per il ferro è rossa), la cui intensità è
proporzionale alla concentrazione e al percorso della luce nel mezzo.
La presenza già di poche parti per milione (ppm=µg/ml) di nanoparticelle di grafene nei preparati dovrebbe
conferire una colorazione giallo paglierino, che non si riscontra nelle dosi dei sieri analizzati, in quanto sono
incolori o bianco-lattiginosi;
3. le immagini al microscopio ottico (MO) delle sospensioni acquose di ossido di grafene in Fig. 16 tratte da Xu
et al. 34 mostrano come con l'aumento della concentrazione di GO, il colore della sospensione GO cambia da
giallo (100 µg/ml, Fig. 14a ) a marrone scuro (2000 µg/ml, Fig. 14e). Quando la concentrazione di GO è di
100 µg/ml, l'immagine al microscopio (Fig. 14a) mostra un contrasto uniforme quasi uguale a quello dell'acqua
pura con sporadici corpuscoli neri, fogli di GO, contrassegnati dalle linee tratteggiate.
Le immagini al microscopio ottico associate da ricercatori indipendenti al grafene in fig. 15 sono comparabili
alla fig. 16c, ovvero con una dispersione almeno di 500 µg/ml di grafene. La presenza di tale concentrazione
di grafene disperso conferisce una colorazione giallo bruna alla soluzione, mentre nella realtà le fiale di siero
a vettore adenovirale o Pfizer sono rispettivamente incolori limpide o debolmente bianche opalescenti;
4. la soglia di concentrazione per la stima del limite di rilevabilità dei nanocomposti di GO dispersi in acqua è di
100 µg/ml ( Fig. 14a ); per concentrazioni inferiori il contrasto è uniforme e pari a una soluzione acquosa
priva di corpuscoli.
Fig. 16 Immagini al microscopio ottico di sospensioni acquose di ossido di grafene a varie concentrazioni. Quando la
concentrazione di GO viene aumentata, il colore delle immagini al microscopio cambia da verde chiaro ( Fig 16a) a giallo
scuro (Fig. 16e), come risultato dell'aumento della quantità di luce assorbita dal GO, secondo la legge di Lambert-Beer. In
particolare, i fogli di GO in sospensione acquosa con dimensioni laterali da pochi micrometri a centinaia di micrometri
possono essere identificati nelle immagini MO, mentre l’intensità del colore potrebbe essere attribuito alle frazioni
nanometriche non rilevate in microscopia ottica.

12
Microscopia elettronica
Le analisi di un campione di ComirnatyTM al microscopio elettronico TEM mostrano strutture sub-sferoidali (Fig.
17) attribuite da Delgado
33
e da The Scientists’ Club 2021
34
a GO, e da R. O. Young
35
a ossido di grafene ridotto
(rOX).
I campioni costituiti da sospensioni in acqua di nanoparticelle per essere analizzate mediante microscopia TEM
sono depositati su griglie micrometriche e disidratate.
Le strutture sub-sferoidali attribuite dagli autori 33-36 non mostrano caratteri morfologici affini ai campioni di
grafene di GO e rOX riportati in letteratura e la loro morfologia potrebbe essere compatibile con l’impronta della
griglia portacampione 35a per la preparazione dei campioni al TEM. (Fig.17a)
Occorre inoltre osservare che i preparati anti SARS-Cov2 sono matrici complesse, in cui oltre al principio attivo
sono presenti eccipienti organici (PEG2000, ALC 0315, fosfolipide) ed inorganici (NaCl, KCl, KH2PO4,
NaHPO4.
Strutture cristalline di sali misti di cloruri, di fosfati, piuttosto che strutture organiche saranno pertanto attese
nelle immagini acquisite in microscopia elettronica, invece nei lavori dove sono state individuate le strutture
grafeniche nei preparati anti SARS-Cov2. 27, 28,
36
non risultano evidenti strutture cristalline riconducibili alla
presenza degli eccipienti. Le strutture osservate al TEM nel vaccino Pfizer (Fig. 18) sono descritte da Young
come cluster/aggregati di grafene,19 ma sia i caratteri morfologici che le dimensioni (50 m) non sono correlabili
alle fasi grafeniche note dalla letteratura 12-20 o studiate in ambito clinico.
Fig 17a Esempio di griglia portacampioni per analisi di campioni in TEM 35a
33
M. Delgado e P. Campra. Muestra RD1, La Quinta Columna Report, June 28, 2021; Graphene Oxide Detection in Aqueous Suspension;
Madrid https://emlct.com/wp-content/uploads/2021/10/NS-PfizerVaccines-Graphene-Prof.P.C.Madrid.pdf
34
Scientist Club. nanotecnological investigation on covid-19 vaccines: Detection of toxic nanoparticles of graphene oxide and heavy
metals 2021 https://herowndestiny.com/wp-content/uploads/2021/10/INFORME-THE-SCIENTIFIC-CLUB-CORREGIDO-POR-
DR.-CAMPRA.pdf
35
Robert O Young. Scanning & Transmission Electron Microscopy Reveals Graphene Oxide in CoV-19 Vaccines 2021
https://usercontent.one/wp/vaxx.free2shine.net/wp-content/uploads/2021/09/ElectronMicroscopyVaccinesAnalysis-
DrRobertYoung.pdf
35a Cho, HJ., Hyun, JK., Kim, JG. et al. Measurement of ice thickness on vitreous ice embedded cryo-EM grids: investigation of optimizing
condition for visualizing macromolecules. J Anal Sci Technol 4, 7 (2013). https://doi.org/10.1186/2093-3371-4-7
36. Campra. Detectión de oxido de grafeno en suspensión acuosa (Comirnatytm (RD1) Estudio observacional en microscopia óptica y
electrónica informe provisional (I). August 2021. DOI: 10.13140/RG.2.2.36808.65280

13
Fig. 17- Strutture 3D sub-sferoidali al TEM associata al grafene nei preparati anti SARS-Cov2 da Campra Delgado e
Young 33-35
Fig. 18-Particolato solido micrometrico nel Pfizer 27 attribuito a cluster/aggregati di grafene
Le analisi mediante sonda EDS consentono di acquisire lo spettro di fluorescenza e la composizione di una
struttura osservata in microscopia elettronica.
Alte concentrazioni di un elemento all’interno del volume eccitato dal fascio primario (Fig. 11 e 12), quali il
carbonio nelle matrici biologiche/organiche, potrebbero interferire sulla rilevabilità di segnali a bassa intensità
degli elementi con numero atomico minore (Boro) o maggiore (Azoto)
37
,
38
,
39
.
L’intensità del segnale di fluorescenza X del carbonio è la somma dei contributi di tutte le strutture organiche
eccitate dal fascio elettronico fino a 2-3m, e pertanto i possibili contributi spettrali da parte di nanostrutture
immersi nella matrice, ovvero dei fogli grafenici (10-2 10-3 m), risultano mascherati dagli altri composti della
matrice.
Eventuali strutture grafeniche presenti in tali condizioni sperimentali potrebbero non essere distinguibili in modo
univoco in EDS.
37
A. C. Thompson et al. (2001) - Lawrence Berkeley National Laboratory, X-Ray Data Booklet http://xdb.lbl.gov/
38
Kirandeep Kaur & Kiran Jeet (2017) Electrical conductivity of water- based nanofluids prepared with graphene – carbon nanotube
hybrid, Fullerenes, Nanotubes and Carbon Nanostructures, 25:12, 726-734, DOI: 10.1080/1536383X.2017.1389906
https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/1536383X.2017.1389906
39
Massardier, V., Voron, L., Esnouf, C. et al. Identification of the nitrides formed during the annealing of a low-carbon low-aluminium
steel. Journal of Materials Science 36, 1363–1371 (2001). https://doi.org/10.1023/A:1017547318732
https://link.springer.com/article/10.1023/A:1017547318732

14
Spettroscopia Raman
I preparati iniettabili anti SARS-Cov2 sono soluzioni in cui sono dichiarati i seguenti composti:
o eccipienti organici: PEG_2000: polietilenglicole
40
,
41
;
o ALC0315: lipide sintetico;
o DSPC: fosfolipide
42
o eccipienti inorganici: NaCl, KCl, Diidrogenofosfato di potassio KH2PO4, Idrogenofosfato di disodio
Na2HPO4
43
o principio attivo Tozinameran-RNA messaggero
Una matrice complessa analizzata in spettroscopia Raman genera uno spettro pari alla somma dei contributi dei
singoli composti, pertanto anche i preparati iniettabili anti SARS-Cov2 dovranno restituire uno spettro formato
dalla somma delle impronte spettrali degli ingredienti dichiarati, ovvero del PEG2000
44
,
45
; (Fig. 19), dei liposomi
42 (Fig. 20) e dei sali presenti 43(Fig. 21), con intensità proporzionali alle concentrazioni relative.
La presenza di composti non dichiarati nei preparati è ipotizzabile dopo aver identificato nello spettro segnali
non riconducibili ai composti attesi.
Questa è una condizione necessaria, ma non sufficiente per identificare fasi non dichiarate tra gli ingredienti a
causa di interferenze spettrali, elevati segnali di background che potrebbero interferire e obliterare impronte
spettrali diagnostiche. Il riconoscimento di grafene o altro in una matrice complessa potrebbe essere possibile se
applicabili metodi separativi, di arricchimento o di estrazione per limitare gli effetti degli interferenti.
Il riconoscimento sarà validato incrociando i risultati in Raman, ove possibile con ulteriori metodi di indagini. La
Raman può essere applicata anche su scala microscopica. La tecnica micro Raman è stata impiegata
46
per eseguire
screening su strutture micrometriche rilevate al microscopio ottico nei preparati Pfizer, Astrazeneca e Janssen, e
attribuite ad ossido di grafene.
La risoluzione spettrale della micro Raman è dell'ordine di 1 µm, mentre le strutture grafeniche già impiegate
negli studi in vivo e in vitro hanno dimensioni inferiori al micron 22 ovvero inferiori alla risoluzione della micro
Raman. La determinazione con micro Raman di dette strutture, essendo inferiori alla risoluzione, potrebbe
risultare “sporca” dalle impronte spettrali degli eccipienti organici ed inorganici dichiarati nei preparati.
40
V.V.Kuzminaet al. Raman spectra of polyethylene glycols: Comparative experimental and DFT study. Journal of Molecular Structure,
Vol. 1217, 5 October 2020, 128331 https://doi.org/10.1016/j.molstruc.2020.128331
41
E A Sagitova et al. Raman analysis of polyethylene glycols and polyethylene oxides2018 J. Phys.: Conf. Ser. 999 012002
DOI 10.1088/1742-6596/999/1/012002 https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1742-6596/999/1/012002/pdf
42
E. Kocisova, et al. DCDR Spectroscopy as Efficient Tool for Liposome Studies: Aspect of Preparation Procedure Parameters. Hin Publ
Corp Spectroscopy: An International Journal, Vol 27 (2012), Issue 5-6, Pages 349–353 doi:10.1155/2012/182720
https://www.hindawi.com/journals/jspec/2012/182720/
43
T.H. Kauffmann et al. Raman probe for the simultaneous measurement of anion concentration in mixtures of salt solutions. Conference:
IEEE Sensors 2013. Baltimore Vol: 978-1-4673-4642-9 671-674. DOI: 10.1109/ICSENS.2013.6688293
https://www.researchgate.net/publication/259072866_Raman_probe_for_the_simultaneous_measurement_of_anion_concentration_in
_mixtures_of_salt_solutions
44
V.V.Kuzminaet al. Raman spectra of polyethylene glycols: Comparative experimental and DFT study. Journal of Molecular Structure,
Vol. 1217, 5 October 2020, 128331 https://doi.org/10.1016/j.molstruc.2020.128331
45
E A Sagitova et al. Raman analysis of polyethylene glycols and polyethylene oxides2018 J. Phys.: Conf. Ser. 999 012002
DOI 10.1088/1742-6596/999/1/012002 https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1742-6596/999/1/012002/pdf
46
P. Campra Detection of graphene in Covid19 vaccines. Technical Report · November 2021.
https://www.researchgate.net/publication/355979001
22 Rhazouani A, Gamrani H, El Achaby M, Aziz K, Gebrati L, Uddin MS, Aziz F. Synthesis and Toxicity of Graphene Oxide
Nanoparticles: A Literature Review of In Vitro and In Vivo Studies. Biomed Res Int. 2021 Jun 10;2021:5518999. doi:
10.1155/2021/5518999. PMID: 34222470; PMCID: PMC8213470. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8213470/

15
(SEM, DRX, FTIR, UV, TGA).
Fig. 19 Spettri Raman di polietilenglicole a diverso peso molecolare. Il PEG2000 ha bande Raman interferenti le D e G del
grafene
Fig. 20 Confronto degli spettri Raman di una sospensione acquosa di liposomi
Fig. 21 Spettri Raman di soluzioni saline. Si osservano le linee caratteristiche degli anioni NO3 -, SO4 2- e HPO42- prossime
a 1000 cm-1 e l'ampia banda di stiramento OH dell'acqua a 3500 cm-1 e interessata dall'anione Cl. Il fondo spettrale cresce
per energie inferiori a 800 cm-1
Indagini in micro raman nei preparati anti SARS-Cov2 46 nel range spettrale tra 1200-1800 cm-1 hanno evidenziato
solo i segnali D, G e 2D diagnostici per l’identificazione del grafene, tuttavia nel range spettrale indagato non c’è
alcuna evidenza dei segnali riconducibili alla presenza degli eccipienti o segnali interferenti con le righe D e G del
grafene (KH2PO4 a 1600cm-1
47
, PEG2000 a 1391cm-1 40)
47
J. F. Jurado et al. Raman and structural studies on the high-temperature regime of the KH2PO4-NH4H2PO4 system. 2012 Revista
Mexicana de Fisica 58(5):411-416 https://www.scielo.org.mx/pdf/rmf/v58n5/v58n5a7.pdf
Fig. 20
Fig. 21

16
VALUTAZIONI QUANTITATIVE SUI PROFILI DI TOSSICITÀ DI COMPOSTI DEL
GRAFENE IN PREPARATI INIETTABILI ANTI SARS-COV2
Le sospensioni di nanoparticelle disperse in soluzioni acquose o in solventi assorbono frazioni di luce incidente
e conferiscono a queste colorazioni caratteristiche. D. Wencheng et al.
48
hanno osservato che, aumentando la
concentrazione del GO da 100 g/ml a 10.000 g/ml, le dispersioni risultavano stabili e con colorazione
progressiva sul rosso (Fig. 20).
Le osservazioni sulle correlazioni tra intensità di colore e concentrazione, sia in acqua che solvente, hanno
consentito di sviluppare un metodo per determinare le concentrazioni del grafene sospeso (100-200 nm)
mediante spettroscopia UV-Vis
49
,
50
,
51
attraverso la stima della quantità di radiazioni assorbite (assorbanza) in
funzione della lunghezza d’onda.
Fig. 20 Dispersioni di GO con concentrazioni nel range da 100 g /ml a 10.000 g /ml 38
48
Du W, Wu M, Zhang M, Xu G, Gao T, Qian L, Yu X, Chi F, Li C, Shi G. Organic dispersions of graphene oxide with arbitrary
concentrations and improved chemical stability. Chem Commun (Camb). 2017 Oct 5;53(80):11005-11007. doi: 10.1039/c7cc04584k.
PMID: 28766592. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28766592/
49
Weifeng Zhao, Furong Wu, Hang Wu, Guohua Chen, "Preparation of Colloidal Dispersions of Graphene Sheets in Organic Solvents
by Using Ball Milling", Journal of Nanomaterials, vol. 2010, Article ID 528235, 5 pages, 2010. https://doi.org/10.1155/2010/528235
50
Wang Y, Zhang X, Liu H, Zhang X. SMA-Assisted Exfoliation of Graphite by Microfluidization for Efficient and Large-Scale
Production of High-Quality Graphene. Nanomaterials (Basel). 2019 Nov 21;9(12):1653. doi: 10.3390/nano9121653. PMID: 31766336;
PMCID: PMC6955778. https://www.mdpi.com/2079-4991/9/12/1653
51
Tseng, Kuo-Hsiung, Ku, Hsueh-Chien, Tien, Der-Chi and Stobinski, Leszek. "Parameter control and concentration analysis of graphene
colloids prepared by electric spark discharge method" Nanotechnology Reviews, vol. 8, no. 1, 2019, pp. 201-209.
https://doi.org/10.1515/ntrev-2019-0018

17
Fig. 21. Spettri di assorbimento UV-vis su sospensioni con concentrazioni crescenti di GO 48 e correlazione lineare tra
assorbimento a 660nm con la concentrazione 47
Le analisi di sospensioni con concentrazioni crescenti di GO (5, 10, 15, 20 e 25 g /ml) registrano spettri UV-
vis in cui l’assorbanza in tutto lo spettro cresce in funzione della concentrazione, con un massimo relativo a 232
nm (Fig. 21). Si osserva inoltre una correlazione lineare (R =0,999) tra gli assorbimenti a 660 nm (rosso) con le
concentrazioni crescenti sia di grafene 47 che di GO 48 dispersi nelle fasi liquide.
I valori di assorbanza ottenuti dalle equazioni di correlazione sia lineari e che polinomiali 47-49 tendono a zero per
valori di concentrazione di GO e grafene inferiori a 5-7 g /ml, ovvero a concentrazioni inferiori non si ha
assorbimento UV-Vis e le sospensioni risultano essere limpide e incolori.
I preparati anti SARS-Cov2 sono limpidi, incolori, trasparenti od opalescenti e pertanto, non essendoci
assorbimento di luce UV-Vis, il grafene se presente è inferiore a 5-7 g /ml, ovvero alla concentrazione minima
che assorbe luce e a partire della quale i preparati assumono una debole colorazione rilevabile con metodi
spettroscopici.
Le dosi di preparato iniettabile sono di 0.3ml. Un'ipotetica concentrazione di grafene o GO di 10 g /ml equivale
ad una massa di 3 g /dose. Un adulto sano ha una quantità di sangue pari a circa l’8% del proprio peso ovvero
da 4.5 a 5.5 litri, e ipotizzando che le nanoparticelle iniettate siano ripartite solo nel sangue, la concentrazione di
grafene o GO attesa sarà di 0.5-0.6 ng/ml.
Studi clinici hanno dimostrato che dopo l'iniezione intraperitoneale, il GO è rimasto principalmente accumulato
vicino al sito di iniezione.
Contemporaneamente, piccoli agglomerati possono essere trovati nel fegato e nella membrana sierosa della
milza.
52
Rhazouani et al. 22 evidenziano che la tossicità del GO nelle cellule è dovuta a diversi fattori, tra cui la dose, le
dimensioni laterali e la carica superficiale. Gli studi effettuati sulla citotossicità del GO sono contraddittori.
Alcuni studi hanno dimostrato che il GO non ha effetti tossici sul comportamento cellulare, evidenziando anzi
una significativa biocompatibilità, con la promozione della crescita cellulare e il potenziamento della
52
Ou, L., Song, B., Liang, H. et al. Toxicity of graphene-family nanoparticles: a general review of the origins and mechanisms. Part Fibre
Toxicol 13, 57 (2016). https://doi.org/10.1186/s12989-016-0168-y

18
proliferazione delle cellule dei mammiferi
53
,
54
. Le interazioni positive sono state ricondotte alla presenza di gruppi
funzionali ossigenati
55
,
56
.
Al contrario, esistono diversi studi sugli effetti tossici del GO sulle cellule, dove la citotossicità di questo
nanomateriale in vitro è strettamente correlata alle condizioni di incubazione, inclusa la dose di esposizione, il
tempo di coltura, la temperatura di incubazione e il tipo di cellule
57
. È stata inoltre osservata una riduzione della
vitalità delle cellule di cancro al seno umano MDA-MB-231 legata alla dose di esposizione al GO 54 (Tabella 2 e
3); inoltre, le proprietà fisico-chimiche del GO, come la forma, la dimensione delle particelle, il numero di strati
e la funzionalizzazione della superficie, influenzano il comportamento del GO sulle cellule.
Tutti questi fattori possono determinare una varietà di risposte biologiche. Ad esempio, il GO con una dose
inferiore a 20 μg/mL non ha mostrato tossicità per le cellule dei fibroblasti umani e la dose superiore a 50 μg/mL
mostra citotossicità come la diminuzione dell'adesione cellulare, l'induzione dell'apoptosi cellulare e l'ingresso nei
lisosomi, mitocondri, endoplasma e nucleo cellulare 55,
58
.
53
Ruiz ON, Fernando KA, Wang B, Brown NA, Luo PG, McNamara ND, Vangsness M, Sun YP, Bunker CE. Graphene oxide: a
nonspecific enhancer of cellular growth. ACS Nano. 2011 Oct 25;5(10):8100-7. doi: 10.1021/nn202699t. Epub 2011 Sep 29. PMID:
21932790.
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21932790/
54
Chen GY, Pang DW, Hwang SM, Tuan HY, Hu YC. A graphene-based platform for induced pluripotent stem cells culture and
differentiation. Biomaterials. 2012 Jan;33(2):418-27. doi: 10.1016/j.biomaterials.2011.09.071. Epub 2011 Oct 19. PMID: 22014460.
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22014460/
55
Yoon H. H., Bhang S. H., Kim T., Yu T., Hyeon T., Kim B. S. Dual roles of graphene oxide in chondrogenic differentiation of adult
stem cells: cell-adhesion substrate and growth factor-delivery carrier. Advanced Functional Materials. 2014;24(41):6455–6464. doi:
10.1002/adfm.201400793. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.201400793
56
Liu Y, Luo Y, Wu J, Wang Y, Yang X, Yang R, Wang B, Yang J, Zhang N. Graphene oxide can induce in vitro and in vivo mutagenesis.
Sci Rep. 2013 Dec 11;3:3469. doi: 10.1038/srep03469. PMID: 24326739; PMCID: PMC6506447.
https://www.nature.com/articles/srep03469
57
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58
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Toxicol Lett. 2011 Feb 5;200(3):201-10. doi: 10.1016/j.toxlet.2010.11.016. Epub 2010 Dec 2. PMID: 21130147.
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21130147/

19
Tabella 2. Citotossicità in vitro di GO.
Dose di OB ( μg /mL)
Linea cellulare
Diametro (nm)
Tempo (ore)
Effetto tossico
3.125-200
Eritrociti umani
342-765
24
Attività emolitica,
generazione di ROS, rilascio
di LDH, diminuzione della
vitalità cellulare
Fibroblasti cutanei umani CRL-
2522
5-100
Cellule di fibroblasti umani
1 (altezza)
24
Citotossicità dose-
dipendente, apoptosi
50–100
Cellula di carcinoma del colon
di topo CT26
Spessore: <2
18
Autofagia innescata,
aumenta la morte cellulare
Dimensione laterale:
450
100-500
MDA-MB-231
156,4
48
Citotossicità dose-
dipendente; Danno al DNA,
arresto del ciclo cellulare,
apoptosi
0–80
Cellule HeLa
Distribuzione
dimensionale: in
PBS, in FBS
24
Rilascio di LDH, aumento
della generazione di MDA e
ROS, diminuzione della SOD,
riduzione della vitalità
cellulare
20
Cellula macrofagica J774A.1
GO di taglia più
piccola: 50-350
1-24
Induzione M1 dipendente
dalla dimensione dei
macrofagi, risposte
proinfiammatorie
Cellule THP-1 Cellule
GO di taglia
intermedia: 350-750
HEK293 Cellule
GO di taglia più
grande: 750-1300
MEL Cellule
HUT102
10-200
Cellule A549 epiteliali
polmonari umane
Spessore di 0,9
24
Stress ossidativo dose-
dipendente, vitalità cellulare
diminuita ad alta
concentrazione
Dimensioni laterali: s-
GO, m-GO, l-GO,
7.8, 15.6, 31.2, 62.5 e
125
Celle MCF-7, HUVEC, KMBC/71
100
4-24 ore
Alterazioni significative nel
livello di espressione dei
geni miR-21, miR-29a, Bax,
Bcl2 e PTEN dopo il
trattamento in tutte e tre le
cellule
Alterazione dell'attività
mitocondriale a livello
cellulare
50
Cellule derivate da cellule
staminali embrionali (ESC-)
Spessore 1.3
24 ore
Nessuna differenza
significativa tra il livello di
apoptosi delle cellule hRPE
trattate con GO e i controlli
hRPE non trattati

20
Tabella 3. Citotossicità in vitro di GO.
Dose di GO
Animali
Diametro (nm)
Tempo di incubazione
Effetto tossico
1,0mg/kg
Topi ICR maschi
Spessore di 0,9
Iniezione endovenosa, 24 h
Accumulato principalmente
nel fegato e nei polmoni
Dimensione di l-GO: 1-
5 μ m
Dimensione di s-GO:
100-500
24mg/kg
Topi ceppi ICR maschi e
femmine
Spessore di <4
Vena caudale iniettata, 5 giorni
Nessun effetto sul numero di
cuccioli, rapporto tra i sessi,
peso, sopravvivenza o
crescita dei cuccioli e bassa
tossicità riproduttiva
maschile
Dimensione di l-
GO: Dimensione di s-
GO:
Concentrazioni
in serie
Topi maschi C57BL/6
Spessore di 3,9 e 4,05
nm, dimensione di 350
nm e 2 μ m
Iniezione sottocutanea 21 giorni
La microdimensione del GO
ha indotto risposte
infiammatorie molto più forti
rispetto alla nanodimensione
del GO
0,5 o 4 mg/ m3
Ratti Sprague-Dawley
Spessore di 0,93 nm
Esposizione per inalazione,
singola 6
La singola esposizione per
inalazione alla GO induce
risposte tossiche minime nei
polmoni del ratto
Dimensioni di 150–250
nm
0, 1, 5, 10
mg/kg
topi C57BL/6
—
Instillazione intratracheale 0
ore, 24 ore, 48 ore, 72 ore e 1
settimana
Porta a lesioni polmonari
acute e fibrosi polmonare
cronica
4mg/kg
Topi Balb/c
Spessore di 0,94, 1,22,
4,43 e 5,66; dimensioni
di 450, 25, 50 e 27
Iniezione intraperitoneale 1, 7 e
30 giorni
Accumulato nel sistema
reticoloendoteliale (RES),
inclusi fegato e milza, per
lungo tempo
5, 10, 20 e 30 g
kg -1
Lombrichi ( Eisenia fetida )
Spessore di GO 2,1 nm
Per 7, 14, 21 e 28 giorni
Stress ossidativo e
genotossicità, con
conseguente perossidazione
lipidica, ridotta stabilità della
membrana lisosomiale e
danno al DNA
5, 10, 50 e 100
mg/kg
Ratti maschi Sprague-
Dawley
—
Iniezione nella vena della coda
una volta al giorno per 7 giorni
consecutivi
Lesioni polmonari in modo
dose-dipendente inducendo
l'autofagia
10, 50 e 100
mg/L
Embrioni di pesce zebra
Diametro 50-200 nm
Gli embrioni sono stati esposti
da 6 hpf a 144 hpf in piastre da
6 pozzetti (20 embrioni per
pozzetto)
Anomalie dello sviluppo
neurologico e tendenza
alterata dell'apparato
locomotore nei pesci larvali
Aumento delle attività AchE
e ATPasi e sovraregolazione
dello stress ossidativo e
interruzione dell'espressione
dei geni coinvolti nel
neurosviluppo e nella via dei
neurotrasmettitori
Un altro interessante studio sulla tossicità dei GOs da parte di T. Jiang et al. 20 mette in correlazione lo stress a
micro e nanoscala che determinate concentrazioni di detti materiali inducono, in base a studi su linee cellulari e
in funzione di un trattamento preattivante dei GOs (Fig. 22).

21
Fig. 22 Tossicità e stress cellulare espressa dall’indice di PELI indotto da forme di GO
Tale studio introduce l’indicatore “PELI” (Protein Expression Level Index) come misura di cinque tipi di stress
cellulare. Senza entrare nel dettaglio di tale indicatore, ciò che si riscontra è che la soglia di stress si rileva
superando concentrazioni di 0,125-8 mg/L di GOs (dipendentemente dal trattamento di attivazione usato), cioè
da 0,125 ppm nel caso di trattamento del GO sonicato con ultrasuoni a 8 ppm per gli altri casi.
I lavori di T. Jiang et al. 20 e di A Rhazouani 22 evidenziano che i composti grafenici inducono stress cellulare e
tossicità a partire da concentrazioni comunque almeno due ordini di grandezza superiori a quelle attese
conseguentemente alla somministrazione dei preparati se si ammettesse la sua presenza in essi.

22
CONCLUSIONI
Il grafene è un prodotto derivato dalla grafite oggetto di molte ricerche e potenziali applicazioni anche nell’ambito
farmaceutico, tra cui come adiuvante vaccinale. La presenza di grafene e del suo derivato, ossido di grafene, è
stata indagata anche nei preparati anti SARS-CoV-2 da alcuni gruppi di ricerca.
Dalla revisione di tali studi sono emerse varie criticità in funzione dei metodi impiegati e le relative conclusioni.
Le strutture osservate in microscopia elettronica, sia per l’aspetto morfologico che dimensionale, non sono
compatibili con le strutture grafeniche riportate in letteratura da vari autori, come non risultano evidenti strutture
cristalline riconducibili alla presenza di cloruri o alle altre fasi presenti nei preparati anti SARS-CoV-2.
Le analisi EDS per la ricerca di grafene, in basse concentrazioni, sui preparati anti SARS-CoV-2, sul sangue o su
matrici biologiche attraverso l’impronta di carbonio, presentano criticità a causa dei massivi contributi da parte
delle altre strutture carboniose presenti e che emettono fluorescenza X.
Gli effetti matrice, nella ricerca delle strutture grafeniche, sono presenti anche in spettroscopia Raman. Gli spettri
Raman riportati in letteratura sui preparati SARS-CoV-2 non mostrano la presenza delle impronte spettrali degli
altri ingredienti presenti in tali formulati, ovvero gli spettri riportati sono coerenti con campioni formati
prevalentemente di solo grafene.
Una soluzione assume colorazione già in presenza di sospensioni diluite di strutture grafeniche maggiori di
5-7g/g, tuttavia i preparati iniettabili SARS-CoV-2 sono incolori e pertanto la correlazione degli spettri Raman
a concentrazioni massive di dette strutture risulta incongruente con quanto riportato in letteratura.
Ipotizzando inoltre una concentrazione massima di grafene nei preparati iniettabili pari a 10 g/g, ovvero tale
da non conferire alcun colore alla soluzione, eseguendo un bilancio di massa, la concentrazione attesa nel sangue
sarà di 0.5-0.6 ng/ml cioè 2-3 ordini di grandezza inferiore alle quantità minime che possano indurre in vivo, in
vitro e su linee cellulari alcun effetto di tossicità. Tali livelli di concentrazione sono inferiori ai limiti di rilevabilità
delle strutture grafeniche nel sangue sia in microscopia (in acqua 100 µg/ml) che con altre tecniche
spettroscopiche.
La presente rassegna sui metodi di indagine, per la caratterizzazione chimico fisica delle strutture grafeniche e
sulla loro specificità, applicati ai preparati SARS-CoV-2 e ai fluidi biologici non consente di acquisire evidenze
sulla presenza di grafene, ossido di grafene e grafene ridotto in dette matrici. Inoltre la potenziale presenza di
dette strutture in concentrazioni inferiore ai limiti di rilevabilità dei metodi analitici in letteratura non è correlabile
ad effetti tossici.