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FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y AMBIENTALES. UNIVERSIDAD DE LEÓN
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SIGUIENDO LA PISTA
Aplicación de la herramienta de edición genética
CRISPR-Cas9 para la generación de grandes deleciones en
el genoma de Streptomyces rimosus
Carmen Díez Acedo1 ; Alen Pšeničnik2 ; Hrvoje Petković3
Facultad de C.C. Biológicas y Ambientales. Universidad de León. Graduada de
Biotecnología (promoción 2018-2022). Departamento de “Food biotechnology”,
Universidad de Ljubljana (Eslovenia).
1. cdieza03@estudiantes.unileon.es ; 2. alen.psenicnik@bf.uni-lj.si;
3. hrvoje.petkovic@bf.uni-lj.si
Resumen
Mediante la aplicación de la técnica de CRISPR-Cas9 se ha conseguido la dele-
ción de fragmentos de ADN de 245 kpb a 450 kpb del cromosoma de la cepa pro-
ductora de oxitetraciclina, Streptomyces rimosus ATCC 10970. Estas deleciones
afectaron a la misma región de un extremo del cromosoma que, según el análi-
sis bioinformático, contiene varios agrupamientos genéticos que codican para
enzimas implicadas en la biosíntesis de metabolitos secundarios. La generación
de grandes deleciones en esta parte del cromosoma de S. rimosus probablemen-
te hará que las cepas modicadas sean más robustas, reduciendo de esta forma
la inestabilidad morfológica y genética. Para ello, mediante diferentes procedi-
mientos de clonación se ensamblaron 3 construcciones en Escherichia coli de
plásmidos que contenían la maquinaria CRISPR-Cas9, para posteriormente ser
introducidas independientemente en S. rimosus usando técnicas de conjugación,
para conseguir las deleciones correspondientes. A pesar de las grandes deleciones
generadas, los clones modicados de S. rimosus seguían manteniendo la morfo-
logía de la cepa original de referencia, pudiendo representar atractivas factorías
de células microbianas para la producción de diferentes metabolitos.
Palabras clave
Antibióticos, CRISPR-Cas9, grandes deleciones, Streptomyces.
Introducción
Género Streptomyces
El género Streptomyces pertenece a la familia Streptomycetaceae. Esta
familia pertenece al lo Actinobacteria y en el orden recientemente renombrado
Streptomycetales (Kämpfer, 2015). El género Streptomyces es el único miembro
de la familia Streptomycetaceae (Hasani et al., 2014), con bacterias Gram-posi-
tivas con un alto valor de G+C en genoma (aproximadamente 70 %) y capaces de
crecer en ambientes aeróbicos. Las especies de Streptomyces son bacterias qui-
mioorganotrócas y lamentosas que se encuentran en los mismos hábitats que
un amplio rango de hongos, y presentan una similitud morfológica macroscópica
con estos últimos (Hasani et al., 2014).
Los representantes de Streptomyces son los principales productores de
metabolitos secundarios, actuando estos en muchos casos como agentes antibac-
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terianos, antifúngicos, antivirales, antiparasitarios, antitumorales o inmunosu-
presores (Bekiesch et al., 2016); sus miembros se caracterizan por poseer un gran
cromosoma lineal de un tamaño aproximado entre 8-10 mega-pares de bases
(Mpb), y parte de su información genética está codicada en plásmidos lineales o
circulares (Gravius et al., 1994).
Streptomyces rimosus
Streptomyces rimosus ATCC 10970 es una actinobacteria lamentosa uti-
lizada para la producción del antibiótico oxitetraciclina. S. rimosus tiene un gran
cromosoma lineal con numerosos agrupamientos genéticos largos repetidos, y un
único plásmido lineal gigante. El cromosoma de S. rimosus tiene una organiza-
ción genética compleja con una región central de genes conservados anqueada
por brazos cromosómicos variables. El cromosoma de S. rimosus ATCC 10970
tiene un tamaño aproximado de 8,6 Mpb, y un 72 % de G+C en su DNA (Petković
et al., 2006).
Grandes deleciones del genoma
Las deleciones del genoma de ciertas bacterias pueden incidir en la reduc-
ción de la carga metabólica bacteriana, incrementándose de esta forma la produc-
ción de metabolitos secundarios, como se ha descrito en el caso de S. rimosus y el
antibiótico oxitetraciclina (Bu et al., 2020). El cromosoma de S. rimosus presenta
una región central (core), donde se encuentran los genes esenciales para las fun-
ciones básicas para la viabilidad bacteriana y los brazos izquierdo y derecho don-
de se encuentran, entre otros, los agrupamientos genéticos prescindibles (Bu et
al., 2019). En los extremos de los brazos se pueden encontrar los agrupamientos
(clusters) genéticos de biosíntesis (BGCs), encargados de la síntesis de antibióti-
cos u otros metabolitos secundarios.
CRISPR-Cas9
Las bacterias presentan en muchos casos sistemas de inmunidad innato
(enzimas de restricción) descrito hace medio siglo, y adaptativo basado en el re-
cientemente descrito sistema CRISPR-Cas9. Este último protege a las bacterias/
arqueas del acceso de ácidos nucleicos extraños, que pudiera recombinar con el
propio (Zhang, 2019). El proceso de actuación de este sistema se divide en 3 pa-
sos:
• Adaptación: se produce la infección del virus, que introduce su mate-
rial genético. Este material es detectado y algunas proteínas del siste-
ma CRISPR lo integran en el genoma del procariota.
• Expresión: cuando se produce una nueva infección, la secuencia CRIS-
PR se expresa.
• Interferencia: si se detecta material genético extraño, es eliminado y
cortado por las nucleasas Cas9.
CRISPR-Cas9 como técnica de edición genética
Lo que realmente nos interesa del sistema CRISPR-Cas9 es su capacidad
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de edición; para ello es necesaria la nucleasa Cas9, que escinde las dos cadenas
de DNA, y el RNA guía, que dirige a la enzima al punto de corte deseado. Modi-
cando la secuencia del RNA guía, y haciéndola complementaria al del genoma del
procariota, se pueden realizar diferentes procesos de edición (Thurtle-Schmidt y
Lo, 2018).
Una vez realizado el corte en la doble hebra, se lleva a cabo el proceso de
reparación, que puede ser mediante (i) una recombinación homóloga, en la cual
se incluyen las regiones de homología UP y DOWN en el plásmido, para que el
DNA se repare de forma correcta, o (ii) por recombinación no homóloga, que no
usa molde y, por tanto, se repara al azar produciendo inserciones y deleciones.
Este trabajo fue desarrollado durante mi estancia en la Universidad de
Ljubljana (Eslovenia), bajo la supervisión y dirección del Profesor Hrvoje Petko-
vić, director del Departamento de biotecnología alimentaria (food Biotechnolo-
gy) en colaboración con el Dr. Alen Pšeničnik.
Hipótesis y objetivo
La hipótesis de este trabajo arma que es posible la deleción de grandes
fragmentos (de más de 100 kpb) en S. rimosus mediante la aplicación del sistema
CRISPR-Cas9. Para ello, se elimina una parte importante del brazo cromosómico
izquierdo que contiene los BGCs.
En este caso, se propone realizar 3 deleciones de tamaños diferentes, don-
de la deleción avanza hacia el extremo 5’ del brazo izquierdo. De esta forma, la re-
gión de aguas abajo (3’-DOWN) de homología es siempre la misma, y las regiones
aguas arriba (5’-UP) cambian en función del tamaño. El tamaño de las deleciones
propuestas sería de 245, 350 y 450 kpb.
Material y métodos
Para llevar a cabo las deleciones del genoma se construyeron 3 plásmidos
recombinantes diferentes, con idéntica región de homología 3’-DOWN, siendo
variables las regiones 5’-UP y la secuencia de RNA guía en cada plásmido.
Las 3 construcciones plasmídicas fueron usadas para transformar las ce-
pas de Escherichia coli, seleccionando los clones recombinantes y transriendo
los plásmidos de forma individual a la cepa de S. rimosus mediante sistemas con-
jugativos. Como último paso, se conrma la deleción en las cepas de S. rimosus
mediante reacciones de PCR (Fig. 1).
Resultados
Clonación y construcción de los plásmidos
El primer paso fue la construcción y ensamblaje de los plásmidos recom-
binantes (Fig. 2).
Para ello, se llevó a cabo la amplicación por PCR de las diferentes regio-
nes de homología UP, así como las secuencias de RNA guía especícas (Fig. 3).
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Figura 1. Esquema general del experimento.
Figura 2. A. Ensamblaje de la región de homología UP, y las
correspondientes guías RNAs (de arriba a abajo: Δ245kbp,
Δ350kbp y Δ450kbp). B. Plásmido pRep_P1_cas9_ΔDOWN di-
gerido con las enzimas DraI y SpeI. C. Los plásmidos ensambla-
dos para las diferentes deleciones (de izquierda a derecha: 245,
350 y 450 kpb).
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Figura 3. Esquema de la amplicación de las regiones UP (parte
derecha) y regiones de RNA guía (parte izquierda), para cada uno
de los plásmidos (de arriba hacia abajo: 245 kpb, 350 kpb y 450
kpb).
El siguiente paso consistió en la unión de los fragmentos amplicados
para UP y para el RNA guía, para cada uno de los 3 plásmidos. Para esto, se llevó
a cabo una PCR de fusión, donde los primers de los extremos (FW de la guía y RW
de secuencia UP) se añadieron una vez iniciada la reacción (Fig. 4).
Figura 4. Esquema de los fragmentos obtenidos de la PCR de
fusión (de arriba hacia abajo: 245 kpb, 350 kpb y 450 kpb).
Una vez obtenidos los fragmentos obtenidos en la PCR de fusión, se lle-
vó a cabo una reacción “SliCE” para provocar la recombinación con el plásmido
base, idéntico en los tres casos, que posee la región de homología DOWN. Este
plásmido base procede de un plásmido recombinante que fue previamente dige-
rido con las enzimas de restricción DraI y SpeI.
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La mezcla de la reacción se usó individualmente (3 ensayos) para trans-
formar las cepas de E. coli DH10B, para posteriormente seleccionar y vericar el
correcto ensamblaje de los plásmidos recombinantes.
Vericación y ensamblaje de los plásmidos.
La vericación/ensamblaje de los plásmidos se llevó a cabo mediante la
digestión con la enzima de restricción PstI. 8 plásmidos procedentes de otros
tantos clones en el ensayo de 245-kpb fueron aislados y digeridos con la enzima
PstI, (Fig. 5A), de forma que únicamente los 4 primeros fueron ensamblados
de manera correcta. Por otro lado, los 6 plásmidos para la deleción de 350-kpb
fueron satisfactoriamente ensamblados (Fig. 5B), mientras que en el caso de los
plásmidos para la deleción 450-kpb únicamente 2 de ellos fueron correctos.
Figura 5. Patrón de restricción previsto de los plásmidos tras la
reacción de restricción PstI (carril 1); MW (marcador de tama-
ño de peso molecular). A. Electroforesis en gel de agarosa para
plásmidos de deleción 245-kpb, aislados de transformantes indi-
viduales (de 1 a 8), digeridos con PstI. B. Ensayo con plásmidos
para deleciones de 350-kpb (del 1 al 6), y 450-kpb (del 7 al 9),
digeridos con PstI.
Transferencia del plásmido por conjugación
Los plásmidos que fueron correctamente ensamblados aislados de E. coli
DH10B, se usaron para transformar la cepa E. coli ET12567-pUB307 por electro-
poración; esta última es capaz de transferir los plásmidos indicados con anterio-
ridad a cepas de S. rimosus por electroporación.
En la conjugación, S. rimosus (actuando como receptora) acepta el plás-
mido y lo integra en su genoma para proceder a la deleción de los diferentes frag-
mentos. La selección de los transconjugantes correctos se realiza por selección
con tioestreptona y ácido nalidíxico para eliminar las colonias donadoras de E.
coli (Fig. 6).
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Figura 6. Selección en medio SM + MgCl2/CaCl2 de transcon-
jugantes con el plásmido para la deleción 450-kpb. A. Extensión
de 100 μL de la mezcla de conjugación; B. Con 200 μL de la mez-
cla de conjugación.
Proceso de subcultivo
La eliminación del plásmido se llevó a cabo mediante sistemas de sub-
cultivo. Para ello, se realizaron dos pases (subcultivos) en medio TSB líquido sin
antibiótico. Tras esos pases, el último cultivo se sembró en medios SM y SM+Tio
(Fig. 7). El último paso del proceso de subcultivo se basa en la técnica de replica
plating, donde se siembra la misma colonia en un medio sin- y con- antibiótico
(Fig. 8). En el ensayo las colonias que crecieron en el medio con antibiótico fue-
ron descartadas (el plásmido usado en deleción seguía integrado: gen para Tior,
sin ser eliminado).
Figura 7. Cultivos diluidos de los transconjugantes de S. rimo-
sus + el plásmido de la deleción 350-kpb, después del proceso de
subcultivo. Dilución 10-6 de los subcultivos crecidos en: A. Medio
SM+Tio. B. Medio SM.
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Figura 8. Técnica de replica plating de transconjugantes de S.
rimosus. Fila superior: medio SM+Tio; Fila inferior: medio SM.
A. Clones con plásmido para la deleción 245-kpb. B. Clones con
plásmido para 350-kpb. C. Clones con plásmido para 450-kpb.
Conrmación de la deleción
Para conrmar las deleciones existentes en los diferentes clones, se llevó a
cabo el aislamiento de las colonias que habían eliminado correctamente los plás-
midos, y posteriormente se llevó a cabo una reacción de amplicación por PCR.
Respecto a la deleción de 245-kpb, todos los amplicones, menos el terce-
ro, habían delecionado correctamente la región deseada, debido a que presentan
una banda de 2334-pb esperada después de la deleción. Sin embargo, la muestra
3 presenta una apariencia similar a los controles (Fig. 9).
Figura 9. Electroforesis en gel de agarosa de la conrmación
por PCR de la deleción de 245-kbp. Del 1 al 7 se cargaron las dife-
rentes muestras de genoma de las cepas S. rimosus ATCC 10970.
C1, C2 y C3 son los controles correspondientes al genoma no edi-
tado de la bacteria (silvestre: Wild Type).
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Por otra parte, en el caso de la deleción de 350-kpb, únicamente dos de las
muestras consiguieron eliminar correctamente la región, al presentar una banda
de 2356-pb esperada para esa deleción (Fig. 10).
Figura 10. Electroforesis en gel de la conrmación por PCR de
la deleción de 350-kpb. Del 1 al 9, se cargaron las diferentes re-
acciones de PCR de las cepas S. rimosus ATCC 10970. C1, C2 y
C3 son los controles correspondientes al genoma no editado de
la bacteria (WT).
Con respecto a la deleción de 450-kpb en los clones transconjugantes ob-
tenidos, únicamente los dos últimos amplicones han sido exitosos al eliminar la
región esperada del genoma, al presentar una banda de 2042-pb (Fig. 11).
Figura 11. Electroforesis en gel de la conrmación por PCR de la
deleción de 450 kbp. Del 1 al 7, se cargaron las diferentes reaccio-
nes de PCR de las cepas S. rimosus ATCC 10970. C1, C2 y C3 son
los controles para clones con genoma no editado.
Discusión y conclusiones
El sistema CRISPR-Cas9 fue descubierto en un elevado número de proca-
riotas (bacterias y arqueas) frente a los desafíos virales (fagos), usando un sistema
equivalente a la inmunidad adquirida en los sistemas animales. La aplicación de
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esta herramienta en el campo de la biología molecular está siendo determinante
en diferentes ámbitos como la sanidad (terapia génica, ensayos preclínicos, etc.),
en diagnóstico, con técnicas para la identicación de agentes patógenos (e.g. de
coronavirus), o en otras aplicaciones biotecnológicas como la generación de fár-
macos nuevos o en el incremento en la producción de antibióticos ya presentes en
cepas bacterianas. El enfoque de esta última aplicación ha llevado a la utilización
de CRISPR-Cas9 en los procesos de biología sintética, integrando la biología mo-
lecular con la biología de sistemas. Un abordaje sencillo de esto último consiste
en la modicación de la dotación genética de representantes de Streptomyces, el
principal productor de antibióticos bacteriano; uno de los abordajes basado en la
deleción de fragmentos cromosómicos de gran tamaño de agrupamientos gené-
ticos (no esenciales) implicados en el metabolismo secundario y no directamente
vinculado a la producción del antibiótico diana, está resultando prometedor en
S. rimosus. Su aplicación en este trabajo nos permite generar las siguientes con-
clusiones:
CRISPR-Cas9 es un método ecaz para crear deleciones a gran escala y
con ello reducir el genoma en Streptomyces rimosus.
La ecacia del método depende del tamaño de la región del genoma elimi-
nada, siendo más difícil la eliminación de segmentos más grandes.
La nucleasa Cas9 parece tener cierta toxicidad en S. rimosus, lo cual se
relaciona con el bajo número de transconjugantes obtenidos y la rápida pérdida
del plásmido de las cepas, cuando carecían de presión selectiva.
Agradecimientos
Quiero expresar mi agradecimiento al profesor Luis Mariano Mateos Del-
gado (Universidad de León) que revisó la última versión de mi Trabajo Fin de
Grado. A Marata, Miki, Sara, Belén, Elena, Pechu y Roberto (<3), y a todas las
personas que he conocido durante mi estancia Erasmus que han hecho que esta
experiencia sea inolvidable, y han hecho que todo sea mucho más fácil. Y, por
último, a mi familia que siempre me apoya.
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