工程噬菌体的合成生物学 智造 Merging the frontiers： when synthetic biology meets advanced bacteriophage design

Abstract

Bacteriophages (phages), natural viruses known for infecting and killing bacteria, are the most diverse and abundant organisms on Earth. In the past 100 years of research about phages, breakthroughs in genetics, molecular biology, and synthetic biology have been successfully achieved. The fascinating scientific history of phage therapy has been repeatedly reported as drug-resistant bacteria are becoming increasingly prevalent. Although phages outnumber other species combined in nature (1031 in total), only a small fraction of them have been successfully exploited in fighting infections caused by drug-resistant bacteria. Therefore, there is an urgent need to implement the core thought of synthetic biology,"build to learn, build to use", and to use methods such as high-throughput sequencing and precise genome editing to create enhanced variants with unique features to improve the efficacy and programmability of phage therapy. In the review, we discuss the recent technological advances in phage genome engineering approaches and the potential directions of synthetic biology to fuel phage development, such as modifying phage host range according to practical needs, mining the extensive resources of phages in nature with the help of macro genomes, combining multi-omics technologies to reveal the molecular mechanisms of phage-host interactions, regulating the intestinal phages to maintain intestinal homeostasis for human health and using big data and artificial intelligence to guide rational phage design. Synthetic biology is driving a paradigm shift in traditional experimental research by combining"Design-Build-Test-Learn (DBTL) cycles" to rationally designed phages. The synthetic phage design is promising for both top-down system optimization and bottom-up life-form reconstruction.

Full text

2022 年 第 3 卷 第 XX期 |w ww.synbioj.com
Synthetic Biology Journal 2022，3（XX）：1-18
工程噬菌体的合成生物学“智造”
陈青黎，童贻刚
（北京化工大学生命科学与技术学院 北京 100029）
摘要：噬菌体，以杀菌特性而闻名的天然病毒，是地球上多样性和丰度最高的生物体。在过去一百多年中，噬菌
体的研究极大地推动了遗传学、分子生物学和合成生物学的发展。随着耐药超级细菌的流行，噬菌体疗法引人入
胜的科 学历史也被 广为传颂。 然而，相对 于自然环境 中丰富的噬 菌体数量 （总数为 1031，比所有其他生物的总和
还要多），目前只有少数噬菌体被成功地应用于对抗耐药性细菌感染及其它工程领域。当前，急需践行合成生物
学从“造物致知”到“造物致用”理念，采用高通量测序和基因组精准编辑等先进生物技术来创建具有独特属性
的增强变体，提高噬菌体治疗的疗效和可编程性。本文综述了近年来噬菌体基因工程改造方法的技术进展以及合
成生物学助力噬菌体应用技术发展的研究动态，如按照实际需求改造噬菌体宿主范围、借助宏基因组挖掘自然界
中噬菌体的广泛资源、结合多组学技术揭示噬菌体与宿主互作的分子机制、调控肠道噬菌体组维持肠道稳态以促
进人体健康及利用大数据和新型人工智能指导噬菌体理性设计。总之，合成生物学正在跨时代驱动传统实验研究
范式转变，结合“设计
—
—构建
—
—测试
—
—学习 （DBTL） 循环”理性设计目标噬菌体，无论是自上而下的体
系优化，还是自下而上的生命体重构，工程噬菌体的合成生物体“智造”都大有可为。
关键词：噬菌体；合成生物学；工程噬菌体；可编程基因组；理性设计；噬菌体治疗
中图分类号：Q816 文献标志码：A
Merging the frontiers：when synthetic biology meets advanced
bacteriophage design
CHEN Qingli，TONG Yigang
（College of Life Science and Technology，Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029，China）
Abstract: Bacteriophages (phages), natural viruses known for infecting and killing bacteria, are the most diverse and
abundant organisms on Earth. In the past 100 years of research about phages, breakthroughs in genetics, molecular
biology, and synthetic biology have been successfully achieved. The fascinating scientific history of phage therapy has
been repeatedly reported as drug-resistant bacteria are becoming increasingly prevalent. Although phages outnumber
other species combined in nature (1031 in total), only a small fraction of them have been successfully exploited in
收稿日期：202 2-12-06 修回日 期：XXXX-XX-XX
基金项目：国家 自然科学基金资助（32001834）；国家 重点研究发展 计划（2018Y FA 0903000）；军事生物安全研究计划（20SWAQX27）
引用本文：陈青 黎，童贻 刚 . 工程噬菌体的合成生物学“智造”［J］. 合成生物学，2022，3. DOI：10.12 211/2096-8280.2022-070
Citation： CHEN Qingli，TONG Yigang. Me rging t he fro ntier s：when synthetic b iology meets adva nced b acte riophage design［J］. Sy nthetic Bio logy Journa l，
2022，3. DOI：10 .12211/2096-8280.2022-070
DOI:10.12211/2096-8280.2022-070
特约评述

合成生物学 第 3 卷
fighting infections caused by drug-resistant bacteria. Therefore, there is an urgent need to implement the core thought
of synthetic biology,"build to learn, build to use", and to use methods such as high-throughput sequencing and precise
genome editing to create enhanced variants with unique features to improve the efficacy and programmability of phage
therapy. In the review, we discuss the recent technological advances in phage genome engineering approaches and the
potential directions of synthetic biology to fuel phage development, such as modifying phage host range according to
practical needs, mining the extensive resources of phages in nature with the help of macro genomes, combining multi-
omics technologies to reveal the molecular mechanisms of phage-host interactions, regulating the intestinal phages to
maintain intestinal homeostasis for human health and using big data and artificial intelligence to guide rational phage
design. Synthetic biology is driving a paradigm shift in traditional experimental research by combining"Design-Build-
Test-Learn (DBTL) cycles" to rationally designed phages. The synthetic phage design is promising for both top-down
system optimization and bottom-up life-form reconstruction.
Keywords: phage; synthetic biology; engineered phage; reprogramming genome; rational design; phage therapy
噬菌 体约 100 年前被发现［1-2］
，是 特 异 性 感 染
细菌 和 古 菌 的病毒，结构简单 ， 主 要 由蛋白质外
壳和 遗 传 物 质核酸组成。从噬 菌 体 进 入宿主开始
到引起细菌裂解并释放出子代噬菌体为止，为一
个增 殖周期 ，一般为 15-20 min。根据是 否进入裂
解期，可将噬菌体分为烈性噬菌体和温和噬菌体，
其中烈性噬菌体应用场景更广泛［3］
。烈性噬菌体
的繁 殖 周 期 一般分为吸附、入 侵 、 增 殖、组装和
裂解 5个阶段。噬菌体通过吸附蛋白与宿主细菌表
面的受体特异性结合，将其遗传物质注入宿主细
胞， 并 在 宿 主细胞内进行核酸 复 制 、 蛋白质合成
和子 代 噬 菌 体的组装，实现子 代 增 殖 。噬菌体与
细菌的相互抵抗防御可发生在噬菌体繁殖周期的
不同阶段。
人们对噬 菌 体 的 研 究 更 新 了 生 命 科 学 的 基 础
研究 和 本 质 认知。噬菌体对建 立 信 息 传递方向为
“DNA
—
—
RNA
—
—
蛋白质”的分子生物学中心法
则［4］
、揭示遗传密码的三联子性质［5］至 关重 要 ，
人们基于此建立了基因调控的全新范式；细菌编
码限制性内切酶［6］并通过切割特定的 DNA 序列来
防止噬菌体感染这一现象启发研究人员利用限制
性内切酶与 T4 连接酶实现了 DNA 片段的重组和克
隆构建，标志着重组 DNA 黄金时代的开始［7］
；而
噬菌体 DNA 聚合酶［8］推动了测序技术的发展［9］
；
CRISPR-Cas 系统的发现［10-11］更是引领了一场重大
的基因编 辑技术革命并摘 取 2020年诺贝尔奖。
在过去的几十年里，世界范围内爆发了数次
大型 流 行 病 ，包括寄生虫、真 菌 、 细 菌和病毒感
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染 。 传 染 病 的 出 现 速 度 与 对 抗 它 们 的 新 战 略 的
发 展 速 度 不 成 比 例 ， 急 需 开 发 新 颖 、 特 异 、 灵
敏、 有 效 的 传 染 病诊 断 和 治 疗 方 法［12 ］
。抗 生 素
耐 药 性 危 机 的 出 现 使 得 人 们 对 噬 菌 体 疗 法 重 燃
兴趣 ［13 ］
，已 有 多 个 成 功 的噬 菌 体 治 疗 案 例有 力
论证 了 噬 菌 体 治 疗的 巨 大 潜 力［14 ］
，但使用天然
噬 菌 体 可 能 受 到 诸 如 宿 主 范 围 窄 、 细 菌 产 生 噬
菌 体 耐 受 性 或 噬 菌 体 颗 粒 不 稳 定 等 诸 多 问 题 的
限制 ［15 ］
。此 外 ， 用 于 临 床治 疗 的 噬 菌 体 有着 严
格 的 筛 选 标 准 ［14，16- 17］
， 至 少 要 满 足 如 下 条 件 ：
噬 菌 体 具 备 高 效 裂 解 能 力 和 广 泛 的 宿 主 范 围 ；
不存 在 噬菌 体 基因 组意 外 转移 细 菌 DNA 片段的
风 险 ； 噬 菌 体 不 编 码 任 何 毒 素 、 毒 力 因 子 或 抗
生素 抗 性 基 因 ； 不 会引起人体不良免疫反应等。
合成生物学的进步使科学家们能够设计出用
于预 防 和 治 疗 目 的的 活 体 工 程 微 生物 ［1 8］
。随 着
人 们 在 分 子 水 平 对 病 毒 组 装 过 程 的 理 解 不 断 加
深［19］
，合 成 生 物 学 可 用作 解 锁 不 同 微 生物 生 态
系 统 中 未 知 生 命 规 则 的 关 键 钥 匙 ， 揭 示 病 毒 的
组装 、 多 样 性 、 结构 和 规 模 等 法 则［20 ］
。借 助 合
成 生 物 学 ， 我 们 可 以 开 发 应 用 于 临 床 的 工 程 噬
菌 体 ［21-23 ］
。 首 次 证 实 工 程 噬 菌 体 巨 大 潜 力 的 例
子 是 一 名 青 少 年 在 双 侧 肺 移 植 后 因 脓 肿 分 枝 杆
菌 感 染 接 受 了 三 噬 菌 体 鸡 尾 酒 （ 包 含 两 种 经 过
改 造 后 具 有 有 效 裂 解 活 性 的 温 和 噬 菌 体 ） 治
疗［24］
，在持 续 32 周的静脉注射噬菌体中治疗耐
受 性 好 且 没 有 重 大 副 作 用 及 器 官 损 伤 ， 患 者 成
功出 院 回 家 。
本文总结了近年来噬菌体合成生物学领域内
突破性进展［25］
，将工程噬菌体视为有机整体，
结 合 Biology Technology （BT） 和 Information
Technology （IT） 的 视 角 ，利 用 合成 生 物学 中 的
“设 计
—
—
构 建
—
—
测 试
—
—
学 习 （DBTL） 循
环”，思 考如 何 “ 智造 ” 噬 菌体 以 显 著提 高 其 功
效 和 可 编 程 性 ， 应 用 于 按 需 改 变 宿 主 范 围 ， 利
用 宏 基 因 组 挖 掘 自 然 界 中 丰 富 的 噬 菌 体 资 源 ，
结 合 多 组 学 技 术 揭 示 噬 菌 体 与 宿 主 互 作 机 制 ，
精 准 调 控 肠 道 菌 群 生 态 ， 并 利 用 大 数 据 和 新 型
人 工 智 能 指 导 噬 菌 体 设 计 ， 在 临 床 实 践 中 使 用
噬菌体作为治疗或预防药物［26- 27］
，为落实 “One
Health”降本增效［28- 29］
。
1噬菌体的裂解类型及生物学特性
1.1 温和噬菌体
侵入细菌后，其核酸附着并整合在宿主染色
体上 ， 和 宿 主细菌的核酸同步 复 制 ， 这种不引起
宿主细菌裂解的噬菌体称作温和噬菌体［30］
。
温和噬菌体对细菌有三大进化益处：作为水
平基因转移（Horizontal gene transfer，HGT）的中
介、 作 为 全 新的进化遗传变异 来 源 、 以及作为细
菌竞争的武器［31］
。通常认为温 和噬菌体 通过传递
毒力基因在增加细菌致病性中起重要作用，Chen
等［32］报告了温和噬菌体 vB_BbrS_PHB09
（PHB09）的迅速进化可减轻细菌毒力。Sousa
等［33］通过评估两个噬菌体群体中基因流动频率证
实温 和 噬 菌 体的宿主范围比烈 性 噬 菌 体窄，推测
感染 远 亲 细 菌宿主的温和噬菌 体 之 间 的基因流动
可能 是 通 过 与更广泛的宿主烈 性 噬 菌 体的重组介
导的 ， 并 在 随后工作中确定了 远 亲 噬 菌体之间许
多基因的转移频率、结果和有利转移发生因素［34］
。
温和噬菌体因其高丰度和基因组多样性［35］
，
具 有 广 泛 的 改 造 潜 力 ， 可 用 于 研 究 细 菌 毒 力 机
制［36］
，搭建改造细菌和清除耐药质粒的平台，我
们也 可 以 通 过从温和噬菌体的 基 因 组 中去除溶原
性必 需 的 基 因模块，以及编码 毒 素 、 毒力因子或
抗生 素 抗 性 基因，获得具有安 全 可 靠 的特异性烈
性噬菌体。
1.2 烈性噬菌体
烈性噬菌体，是指侵入宿主细菌后，随即引
起宿 主 细 菌 裂解，是目前解决 耐 药 问 题最常用的
工 程 噬 菌 的 类 型 ， 其 基 因 组 具 有 高 度 可 塑 性 。
Labrie 等［37］证明了烈性乳球菌噬菌体基因组的显
著可塑性，使它们能够快速适应动态的乳腺环境。
常见的工程思路为：选取有潜力的烈性噬菌
体， 如 对 全 耐药和多耐药菌株 表 现 出 很强的裂解
活性的新型 噬菌体 phiLLS［38］
，对多耐药和泛耐药
生物膜形成尿路致病性大肠杆菌具有活性的新型
噬菌体 vB_EcoA_RDN8.1［39］
，分析注释其基因组
学特征［40］
，并通过基因 工程强化 改造得到应用于
临床的新型噬菌体重组体，如 Masuda 等［41］通过基
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合成生物学 第 3 卷
因工 程将 LLB 结构基因引入烈性噬菌体基因组中
得到一种应对耐药问题的新型抗菌剂。Nick 等［42］
成功使用经过工程改造的噬菌体治疗分枝杆菌引
发的难治性肺部感染，他们根据患者肺部的脓肿
分枝 杆 菌 样 本，筛选了几十种 候 选 噬 菌体，最终
确定了两种能有效杀死感染患者体内分枝杆菌的
候选噬菌体，通过对这些噬菌体进行基因工程改
造来 增 强 其 裂解细菌的能力， 为 患 有 囊性纤维化
症的年轻患者接受挽救生命的肺移植手术扫清了
障碍。Jin 等［43］采用基因编辑技术设计了一种可以
特异性靶向肠出血性大肠杆菌的工程噬菌体，该
工程 噬 菌 体 在体外和体内实验 条 件 下 ，显示出对
肠出血性大肠杆菌的高效杀菌作用。
2噬菌体基因工程改造技术
2.1 温和噬菌体改造
温和噬菌 体 具 有 稳 定 存 在 于 宿 主 基 因 组 的 特
点，可以采用编辑宿主细菌基因组的通用方法对
其进行改造［44-46］
。
如Ababi 等［47］使 用 λRed 重组系统促进外源
ssDNA 在宿主基因组复制过程中结合到噬菌体基
因组上，并通过失活错配修复系统蛋白来抑制
DNA 修复。在不 额外引入 筛选标记 的基础上 ，高
重组频率可保证在六个循环后获取超过 40% 的重
组噬菌体。这种基于无痕重组的 方法，可在 4-5 天
内将多点突变引入温和噬菌体的基因组中。
Tridgett 等［48］同样使用 λRed 重组系统来编 辑温和
噬菌 体 的 基 因组，并引入抗生 素 作 为 重组体的筛
选标记， 能够在 3-5 天内完成重组体构建。
本文仅列举部分改造温和噬菌体的代表案例，
此外还可 以采用 CRISPR-Cas 系统等多种方式编辑
温和噬菌体，下文主要着重讨论针对烈性噬菌体
的改造案例。
2.2 烈性噬菌体改造
2.2.1 随机诱变
随机诱变 是 改 变 整 个 代 谢 途 径 或 获 得 具 有 所
需特性的酶、蛋白质甚至整个基因组的强大工具。
该技 术 通 过 施加选择性压力， 结 合 高 通量迭代筛
选目标重组体，可来获得具有所需表型的噬菌体。
常用紫外线［49-50］
、 化学 诱 变剂 （ 例如 烷 基化
剂）提高突变频率，借助全基因组测序确认是否
获取 目 标 突 变体，或采用引入 标 记 基 因方式进行
表型筛选。Favor 等［51］开发了化学加速病毒进化
输入
INPUT
输出
OUTPUT
菌群分析
Microbiota information analysis
噬菌体库的数据挖掘
Data mining in Phage database
计算机智能设计基因组
Computer-designed
phage genomes
下载序列信息
Download
电转化DNA的噬菌体重组
BRED
噬菌体工程改造
Phage genome engineering
噬菌体重启
Genome reboot
随机诱变
Random mutagenesis
经典同源重组系统
Homologous
recombination
CRISPR-Cas编辑
CRISPR-Cas gene editing
U
V
Cas9
tracrRN
A
crRNA
Host cell
图图1“智造”工程噬菌体流程及噬菌体基因工程改造方法
Fig. 1 Advanced bacteriophages design pipeline and the approachesof phage engineering
004

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平 台 （Chemically accelerated viral evolution，
CAVE），成功改造大肠杆菌噬菌体 T3 噬菌体、T7
噬菌体以及肠道沙门氏菌噬菌体 NBSal001 和
NBSal002，证明了 该 平 台 能 显著改善噬菌体的热
稳定性。随机诱变可快速获取多种突变株，操作
简单，但需要注意随机诱变也可能导致噬菌体基
因组中其他部位产生额外的未知突变。
2.2.2 经典同源重组系统
同源重组策略是基因工程最常用的方法之
一［52-53］
，有助于快速获取不同功能 的 新 噬 菌 体 突
变体。
Pouillot 等［54］开发了基于同源重组工程的噬菌
体编 辑 技 术 ，成功实现：同时 修 改 一 个基因编码
序 列中 的 多个 区域 并 保持 基 因的 其余 部 分完 整 ；
可逆性地干扰宿主内特异性噬菌体 T4 噬菌体的裂
解周期；通过同源重组将任意数量的工程基因有
效地插入到 T4 天然噬菌体的失活基因组；通过重
新激活噬菌体产生工程噬菌体的重组子代，构建
了庞 大 的 基 因工程烈性噬菌体 库 ， 理 论上可实现
快速分离具有检测 （即诊断）、感染和破坏革兰氏
阴性菌株 的重组 T4 噬菌体颗粒。
Jensen 等［55］开发了基于 λRed 重组系统实现
T7 噬菌体的体内重组，可 以在 T7 噬菌体基因组上
进行单碱基改变和全基因替换，并将 T7 噬菌体基
因组 DNA 转化细胞的效率提高了 100 倍 ， 同时实
现使另外两种通常在大肠杆菌中不繁殖的 T7 样噬
菌体能够在基因组转化后重启。
基于同源 重 组 策 略 的 局 限 性 是 对 于 许 多 非 模
式菌的宿主（尤其是革兰氏阳性菌），没有有效的
转化方 案；重组效率低 （约 1%）； 而通用筛选标
记（例 如 抗 性基因） 的缺失带来 了 更 多挑战，通
常需 要 对 重 组噬菌体进行劳动 密 集 型 的筛选。目
前常用两种方式设计和选择目标噬菌体基因组，
提高 重 组 体 的收率，即额外引 入 特 异 性选择突变
噬菌 体 的 标 志基因 （如荧光蛋 白） 的 正向选择和
消除天然噬 菌 体 的 反向选择［56］
。 在某 些情 况 下 ，
可以 借 助 表 型选择突变噬菌体 ， 例 如 改变宿主范
围的 工 程 噬 菌体或引入对某种 细 菌 防 御系统抗性
的噬 菌 体 。 重组噬菌体的检测 还 可 以 通过设计特
异性引物， 进行 PCR 扩增反应完成［57］
，并对 PCR
条带 为 阳 性 的产物进一步纯化 和 富 集 。引入正向
筛选标记、表型筛选和基于 PCR 的筛选方案均有
助于得到所需的噬菌体突变体。
2.2.3 BRED 系统
电转化 DNA 的噬菌体重组策略［58-5 9］
（Bacteriophage recombineering of electroporated
DNA，BRED），是一种简单有效的对噬菌体基因
组进 行 直 接 编辑的方法，它是 将 噬 菌 体基因组和
重组模板共同电转化到宿主菌株中来改造噬菌体，
电转化后可通过 PCR 筛选出平板中发生重组的噬
菌斑。
Marinelli 等［58］利 用 BRED 在分枝杆菌噬菌体
Giles 中实现了非必需基因缺失、读码框内缺失、
点突 变 、 无 义突变、基因标签 的 添 加 和外源基因
的精确插入。F ehér 等［60］首次在肠杆菌科噬菌体中
应用 BERD 技术，从肠杆菌基因工程中最常用的转
导载 体 噬菌 体 P1vir 的基因组中去除了移动元件
IS1。不携带 IS 元件的基因工程载体 P1virdeltaIS，
其噬 斑 形 态 、病毒滴度、爆发 量 及 转 导能力均与
野生型噬菌体相当。Marinelli 等［59］总结了 BRED
技术 的 主 要 特征，回顾了首例 应 用 工 程噬菌体疗
法治疗人 类分枝杆菌感染 的案例（即 BRED 技术实
现将治疗性温和噬菌体转化为烈性噬菌体），并指
出用 于 治 疗 目的的工程型噬菌 体 相 较 天然噬菌体
的优势以 及 BRED 进行此类修饰的未来前景。
BRED 技术可做到在噬菌体基因组中进行点突
变等精确突变，重组效率提高到 10-15%， 可用于
删除 、 插 入 和替换基因，能够 以 比 经 典同源重组
更高 的 效 率 精确修饰噬菌体基 因 组 ， 目前已经在
分枝杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌［61］和克雷伯菌噬
菌体［62］的基因组中成功应用，并具有扩展到更多
噬菌 体 种 属 的潜力。但也有局 限 性 ， 即必须获得
转化 效 率 高 的宿主感受态细胞 。 为 了 克服这种限
制，许 多 BRED 的变体逐渐出现，如 Wetzel 等［63］
将BRED 技术 与 CRISPR-Cas9 相结合，以促进高效
和精确的噬菌体基因组工程。
2.2.4 CRISPR- Cas 系统
CRISPR-Cas 是细菌和古细菌在长期的演化过
程中出现的一种对抗噬菌体感染或外源 DNA 入侵
的适应性免 疫防御系 统，CRISPR-Cas 系统的出现
加速 了 基 因 编辑技术的发展， 并 被 广 泛应用于生
命科学。人们 建 立 了 一种将同源 重 组 与 CRISPR-
005

合成生物学 第 3 卷
Cas 结合进行噬菌体基因编辑的技术，可用于编辑
原本 难 以 处 理的烈性噬菌体的 基 因 组 ，并帮助人
们进一步了解噬菌体与宿主相互作用［52-53］
。
Martel 等［64］通过使用嗜热链球菌 CRISPR-Cas
II-A 系统作为提高重组效率的选择性压力在烈性噬
菌体 2972 的基因组中实现特异性点突变和大片段
的删除编辑 。Kiro 等［65］基于 I-E 型CRISPR-Cas 系
统开发将大肠杆菌噬菌体 T7 噬菌体基因工程化的
方法 ， 通过 同 源重 组编 辑 的 T7 噬菌 体 基 因 组 的
DNA 序列两侧会 携带同源 序列，而 未被成功 编辑
的基因组 会被 CRISPR-Cas 系统清除，从而分离所
需的重组 噬菌体，并将使 用的 CRISPR-Cas 类型在
人们原来认知的 II 型基础上扩展，该方法可应用到
任何噬菌体基因工程。
Lemay 等［66-67］成功地将化脓性链球菌 II-A 型
CRISPR-Cas 系统用于编辑乳酸乳球 菌的烈性 噬菌
体P2 的基 因组，实 现了 ORF47 的单碱基突变、插
入及 ORF24、ORF42 和ORF49 的删除。Shen 等［68］
应用化脓 链球菌的 CRISPR-Cas 系统在肺炎克雷伯
氏菌噬菌体 phiKpS2 中 ，仅需 30-60 bp 的同源臂即
可完成点突变、基因缺失和交换，成功删除了 1个
启动 子 和 9个基 因 。 Nayeemul 等［69］使 用 III-A 型
CRISPR- Cas 系统的 CRISPR-Cas1 0 改造金黄色葡萄
球菌噬菌体，以 100% 的效率分离出目标噬菌体突
变体，证 明 CRISPR-Cas10 是一种噬菌体基因工程
的强 大 工 具 。 Tao 等［70］发现 V型CRISPR-Cas12a
系统与 II 型C RISPR-Cas9 系统相比，显示出对葡萄
糖 羟 甲 基 胞 嘧 啶 （Glucosyl hydroxymethyl
cytosine，GhmC） 修 饰基 因 组的 更 高 效切 割 ，可
解决因 T4 噬菌体的 GhmC 基因组对 CR ISPR-Cas 系
统表现出不同程度的抗性带来的编辑难题，并基
于此 开发了使 用 V型CRISPR-Cas12a 系统的 T4 噬
菌体基因组中创建插入和缺失的编辑技术，并应
用此 技术改变 T4 噬菌体衣壳蛋白 Hoc 和Soc 在 体
内将外源肽和蛋 白质连接到 T4 噬菌体衣壳的能力。
Zhang 等［71］设计了基于异源 CRISPR-Cas9 系统的
噬 菌 体 基 因 组 编 辑 平 台 ， 在 宿 主 细 菌 Vibrio
natriegens TT4 体内进行了 Natriegens phage TT4P2
基因组编辑实验，实现了噬菌体基因的缺失和
替换。
Joseph Bondy-Denomy［72］和Jennifer A.
Doudna［73］两个课题组利用新挖掘的 CRISPR-
Cas13a 作为反筛工具，构建表达 Cas13a 和靶向噬
菌体内源基因 crRNA 的反筛菌株和含同源模版质
粒的 编 辑 菌 株，将裂解液滴在 反 筛 菌 株上即可消
除天然噬菌体，实现了高效的噬菌体基因组编辑。
两项工作也有各自的别出心裁之处，即利用的
Cas13a 来源及目标噬菌体不同：Jennifer A. Doudna
等通过生物信息学分析及实验证明筛选出来源于
Leptotrichiabuccalis 的Cas13a 具 有 强 抗 噬 菌 体 能
力，并 对 9个大肠杆菌噬菌体都有效，得到应用于
广 谱 噬 菌 体 编 辑 的 LbuCas13a， 而 Joseph Bondy-
Denomy 等选取生化表征最充分的来源于 Listeria
seeligeri 的Cas13a 靶向噬菌体 ФKZ、OMKO1 和
PaMx41 并 增加 了 正 向筛 选 步骤 ， 在 噬菌 体 ФKZ
ORF120 下游整合 anti-CRISPR 基因 acrVIA1，重组
噬菌体在表达针对其他转录物的 crRNA 的宿主中
也可以高效工作。
基于 CRISPR-Cas 系统的噬菌体工程的局限性
在于仅限 于编码表征的天 然 CRISPR-Cas 系统或能
够进行转 化以表达活性异 源 CRISPR-Cas 系统的细
菌宿主；可能会受到天然噬菌体携带的 Acr 系统的
限制干扰。DNA 靶向和 RNA 靶 向 CRISPR-Cas 系
统都 可 提 供 有效的反选择筛选 重 组 体 ，但它们在
噬菌体工程中的适用性可能会受到宿主基因组上
天然 space r 存在的限制，通常可以通过预先分析宿
主基因 组上的 spacer 序列，筛选出合适的宿主体系
来克 服这一点。此外 ，研究 表明 II 型CRISPR-Cas
系统在 T7 噬菌体中比 I型系统更易于使用且通常更
有效［74］
，这一研究成果为未来更有效的 T7 噬菌体
工程化提供了基础。
Ramirez-Chamorro 等［75］指出依赖于 CRISPR-
Cas 核酸酶靶向消除天然噬菌体的同源重组的策略
在 基因 组 较大 的 烈性 噬菌 体 中往 往 效果 不 稳定 ，
如II-A 型CRISPR- Cas9 系统对 T5 的编辑效率低下 ，
因此设计了基于 Retron 的重组替换方案，不需要
较长 的 同 源 臂，降低了克隆难 度 ， 但 对插入片段
的长度有一定限制。
基于 CRISPR-Cas 系统的噬菌体基因组编辑平
台的 建 设 是 体内体系中最具普 适 性 的 策略，有望
解决 噬 菌 体 基因多样性研究不 足 的 问 题，推动噬
菌体 合 成 生 物学和纳米技术的 发 展 ， 甚至加速发
006

第 3 卷 www.synbioj.com
现新的分子生物学工具。
2.2.5 Genome reboot
合成噬菌体基因组的 DNA，并 在酵母或体 外
组装 后 的 适 当宿主细胞中将其 重 新 组 装激活为完
整的基因组，这个过程称为噬菌体重新启动
（Phage genome reboot）， 可分为 4个步骤 ：（1）通
过从头合成或 PCR 扩增产生大量较短的、重叠的
片段 ；（2）在酵母重组平台或体外将人工噬菌体
基因组片段 组 装 成 完整的人工 噬 菌 体 基因组［76］
；
（3）将组装好的噬菌体基因组转化至大肠杆菌、L
型细 菌 等 天 然宿主或无细胞表 达 体 系 重启为有活
性的 噬 菌体 颗粒 ；（4）使用氯仿等裂解释放重启
的噬 菌 体 ， 使用裂解液重新侵 染 天 然 宿主菌进行
增殖富集，获取大量工程化噬菌体。
噬菌体 DNA 被用作模板来生成覆盖整个噬菌
体基因组的重叠 PCR 产物，或 者 通过直接合 成 的
方式 获 取 较 短的、重叠的片段 。 而 其 基因组的组
装有多种可选方案。
首选是在酵母平台实现噬菌体基因组的高效
重组。在酵母人工染色体重组技术［77］中， 通 过
PCR 扩增噬菌体基因组得到长约 4-12 kb 的多个片
段， 第 一 个 和最后一个片段具 有 与 线 性酵母人工
染色体 （Yeast artificial chromosomes，YAC）重叠
的同 源 臂 。 将所有片段共转化 进 酿 酒 酵母，凭借
天然 酵 母 强 大的重组能力有效 地 组 装 噬菌体基因
组和 YAC 载体［78］
。随后从酵母细胞中提取含有组
装完整的噬菌体基因组的 YAC 载体，将其转 化到
细菌 宿 主 细 胞即可重新启动功 能 性 噬 菌体。对获
得的 噬 菌 体 斑块扩增并测序以 确 认 噬 菌体基因组
改造 是 否 成 功。到目前为止， 基 于 酵 母的噬菌体
工程已成功用于改造大肠杆菌［78］
、克雷伯氏菌［78］
和铜绿假单胞菌［79］对应的噬菌体，重新启动首先
发生 在 大 肠 杆菌中或噬菌体的 天 然 宿 主中，此策
略还适用于工程噬菌体诱导的染色体岛（Phage-
inducible chromosomal islands，PICIs）
［80］
。YAC 辅
助的 基 因 组 组装非常高效，但 噬 菌 体 基因组的重
启仅 依 赖 于 宿主细菌的转化， 这 限 制 了该工程策
略对高度可转化细菌的适用性。
Pryor 等［81］通过优化体外 DNA 组装方法
Golden Gate assembly （GGA）成功组装了多达 52
个部分的 40 kb T7 噬菌体基因组，并且在细胞转化
后重启噬菌体颗粒。也可以通过 Gibson 组装策
略［82］拼接 完 整 噬 菌 体 基 因 组 ， Pulkkinen 等［83］使
用这 种 简 单 有效的体外装配反 应 制 造 出一种携带
荧光素酶 的报告型 T7 噬菌体。
将组装完整的噬菌体基因组转入宿主或其他
合适体系，是决定能否重启成功的关键步骤。
电穿孔已成 为将 DNA 递送到原核细胞和真核
细胞 中 的 成 熟工具，将噬菌体 基 因 组 电转入宿主
细胞 即 可 直 接实现噬菌体重启 。 最 常 见的是在大
肠杆菌中实现电转噬菌体基因组［84］
。Milho 等［85］
使用电穿孔 DNA 的噬菌体重组来评估功能未知的
单个基因缺失对沙门氏菌噬菌体 PVP-SE2 的影响。
但 电 穿 孔 重 启 DNA 的成功率受限于 DNA 转 导
效率。
无 细 胞 转 录 翻 译 系 统 （Transcription and
translation，TXTL）系统是利用细胞提取物（而
不是 细 胞） 进行基因转录和翻 译 的 系 统，最大优
势是 避 开 了 细胞内环境对细胞 表 达 的 影响，可以
人为 控 制 反 应条件和进程，可 用 于 测 试调节元件
和 电 路 、 生 物 制 造 生 物 制 剂 或 构 建 合 成 细 胞 。
Rustad 等［86］展示了在无细胞平台中完整合成基因
组长 达 169kb 的T4 噬菌体。最大 的 大 肠杆菌噬菌
体之 一 的 成 功重启，展示了无 细 胞 体 系对复杂基
因调控、代谢和自组装的整合强大的调控能力，
将生 物 系 统 的自下而上合成提 升 到 了 一个新的水
平。Garenne 等［87］利用无细胞平台成功重启 40kb
的T7 噬 菌 体 并 提 供 了 更 优 化 便 捷 的 系 统 配 方 。
Emslander 等［88］通过将枯草芽孢杆菌的 RNA 聚合
酶Σ-igA 因子 SigA 加入无细胞系统，将无细胞生
产扩 展 到 靶 向革兰氏阳性细菌 的 噬 菌 体，仅几微
升的 体 系 中 即可产生有效剂量 的 对 抗 多耐药大肠
杆菌 、 鼠 疫 耶尔森氏菌和肺炎 克 雷 伯 氏菌的噬菌
体。TXTL 系统已发展到体外可行的、复杂的、自
我组 装 的 核 酸编程生物体的体 外 构 建 ，目前已经
实现重启 MS2［89］
、ΦX174［90］
、T7［91］
、T4［86］
、鼠
疫耶尔森氏菌噬菌体［88］
、肺 炎 克 雷 伯 氏 菌 噬 菌
体［88］和抗酸性分枝杆菌噬菌体［92］
，未来有希望扩
展到 更 多 种 属的噬菌体。无细 胞 系 统 局限性在于
使用突变文库时，在重启期间难以保留基因型-表
型关联，使用微流控液滴模拟单分子系统［93］将是
一个很好的解决方案。
007

合成生物学 第 3 卷
细胞壁缺陷的李斯特菌 L型细菌 （Bacterial L-
forms）
［94-95］代表 了一类用于生产 重 组 蛋 白 和 合 成
生命 体 的 独 特表达系统，同样 可 以 在 转染后重新
启动合成噬菌体基因组，即从裸露的合成 DNA 中
产生病毒 颗粒。Kilcher 等［96］证实 L形细菌不仅支
持天然和合成的李斯特菌噬菌体基因组的重新启
动，还能够跨属重新激活芽孢杆氏菌和葡萄球菌
噬菌体。L型细菌中的噬菌体重启工程不受噬菌体
的生活方式 、形态、 DNA 包装策略以及基因组大
小和 末 端 特 征等因素影响，为 各 种 噬 菌体提供了
工程平台，但目前尚无研究表明是否可以成功为
所有细菌 物种生成 L型细菌。
Cheng 等［97］开发了一种全新的“跳板”宿主
辅 助 的 噬 菌 体 基 因 组 工 程 技 术 （Stepping-stone
host assisted phage engineering，SHAPE）， 使 用
Red 同源重组系统重组天然噬菌体基因组与目的
DNA片段，实现对天然噬菌体基因组的精准编辑。
为提高同 源重组效率，借 助 CRISPR-Cas 系统精准
靶向识别并只切割原始噬菌体基因组的特性，可
从同时存在原始的天然噬菌体与成功改造的噬菌
体基 因 组 的 “跳板”宿主菌中 保 留 筛 选得到目标
突变体，最后利用天然宿主菌的激活系统重启得
有活性的目标 噬菌体。 SHAPE 技术也 属于利用 同
源重组与 CRISPR-Cas 结合进行噬菌体基因改造的
范畴，避免了体内外组装等耗时的工作。
合成重启 噬 菌 体 基 因 组 的 方 式 既 降 低 了 生 物
安全 风 险 ， 又能以简便、经济 的 方 式 实现基因组
组装、编辑和激活，有效地提高产生工程噬菌体
的效 率 。 目 前，体外技术通常 需 要 扩 增或合成随
后组装的 DNA 片段，未来可能合成整个噬菌体基
因组，甚至建立完整噬菌体基因组的文库；重新
启动合成噬菌体基因组需要宿主细胞或 L型细菌的
转化，但重新启动过大的合成基因组仍有难度。L
型细菌可以帮助将较大的基因组转化到遗传上任
意操 作 的 革 兰氏阴性菌株，而 无 细 胞 系统因其消
除了细胞膜的屏障，允许各种任意大小的噬菌体
基因 组 不 受 限制地重新启动， 且 不 依 赖于细菌菌
株的生长，有效缩短了 DBTL 周期，更可能成为首
选方法。虽然无细胞系统目前仍然局限于少数物
种和菌株，未来此策略有望扩展到其他物种。
3合成生物学助力噬菌体疗法的前沿
方向
3.1 改变噬菌体宿主范围
以噬菌体 为 基 础 应 用 的 主 要 限 制 是 其 宿 主 范
围狭窄［101］
。噬菌体的受体结合蛋白（Receptor
binding protein，RBP）是宿主特异性的首要决定
因素 ，对 RBP 进行特异 性 修饰可以改变 或扩展噬
菌体 的 宿 主 范围。此外噬菌体 与 宿 主 之间相互作
用的特异性还取决于宿主受体的类型和结构，受
体的定位以及在细胞表面的数量和密度也会影响
吸附的特异性［102］
。
Yoichi 等［103］通过构建携带 PP01 gp37、gp38
的重组 T2 噬菌体 T2ppD1，证实其可感染异质宿主
细胞大 肠杆菌 O157：H7 和相关物种，改变了噬菌
体感 染的特异性 。Mahichi 等［98］尝试将 T2 噬菌体
长尾 纤维基 因 gp37
、
gp38 特异性同 源重组以产生
嵌合噬菌体，在保持 T2 噬菌体原始裂解活性的同
时获得更广的 IP008 宿主范围。Ando 等［78］通过在
酵母菌体内工程化噬菌体基因组来调节噬菌体宿
主范 围 的 合 成生物学策略，改 造 大 肠 杆菌噬菌体
支架以靶向致病性耶尔森氏菌和克雷伯氏菌，同
样克雷伯氏菌噬菌体支架通过模块化交换噬菌体
尾部件也可以靶向大肠杆菌。Chen 等［99］以宿主菌
DE017 为介导，确定了可能用作同源序列重组序
列区域的区域 ，构建了包含 Q L01 不同 gp37 基因片
段的 WG01 子代嵌合噬菌体，通过对 gp37 基因片
段的 测 序 分 析，确定了导致宿 主 范 围 扩大的两种
不同的机 制：第一代 WG01 形成的没有突变的嵌合
体；由嵌合体形成的第二代 WG01 突变体。部分子
代噬菌体宿主范围的扩大表明，C末端以外的区域
可能通过改变对结合位点的亲和性间接改变受体
特异 性 。 Yosef 等［104］设计了各种噬菌体尾丝蛋白
的杂交颗粒，并将这些模块化的颗粒程序化包装
并转导到限制 T7 噬菌体传播的宿主体内，证明了
杂合颗粒 能将所期望 的 DNA 转导入目标宿主。这
项研究通 过人为选择 能高效转导 DNA 的尾丝蛋白
大大扩展了新的宿主范围。Yehl 等［105］通过对噬菌
体尾 丝 蛋 白 突变改造噬菌体宿 主 范 围 ，实现了对
细菌抗性的抑制。他们确定了 T3 噬菌体尾丝蛋白
008

第 3 卷 www.synbioj.com
中 的 宿 主 范 围 决 定 区 （Host-range-determining
regions，HRDRs），并借助定向诱变发展出一种高
通量基因工程技术。结果显示 HRDRs 突变产生的
噬菌 改 变 其 宿主范围改变，并 在 小 鼠 模型中进行
体内 验 证 。 这种方法可以将对 尾 部 结 构的破坏降
到 最 低 并 产 生 功 能 多 样 性 的 工 程 噬 菌 体 。
Avramucz 等［100］采用基于质粒的同源重组和 BRED
重编程通常 感染共生 K12 大肠杆菌菌株的 T7 噬菌
体，以感 染病原体 相关的表 达 K1 胶囊的菌株实现
两种基因 替换的构 建：一种取代 T7 噬菌体的 gp17
基 因 ； 另 一 种 用 K1F 对应物替换 T7 噬菌体的
gp11、gp12 和gp17。两种方法均成功地将 K1F 序
列整合到 T7 噬菌体基因组中，并应用包括标记基
因trxA、宿主 特异性和 CRISPR-Cas 选择的多种方
法来选择 或 富 集结合 K1F gp17 的嵌合 体 噬 菌 体。
该研究表明 BRED 可作为快速获得新的 RBP 结构
表表1应用基因工程成功改造噬菌体的案例
Tab. 1 Applications of successful modification of engineered phages
策略策略
随机诱变随机诱变
经典同源重组经典同源重组
BRED
CRISPR-Cas
Genome Reboot
菌株菌株
T4 噬菌体
T3、T7、肠道沙门氏菌噬菌体
T2 噬菌体
T4 噬菌体
T7 噬菌体
T7 噬菌体
分枝杆菌噬菌体 Giles
肠杆菌科噬菌体 P1
沙门氏菌噬菌体
克雷伯氏菌噬菌体
分岐杆菌噬菌体 BPs、ZoeJ
链球菌噬菌 体 2972
T7 噬菌体
乳酸乳球菌烈性噬菌体 P2
克雷伯氏菌噬菌体
金黄色葡萄球菌噬菌体
T4 噬菌体
T5 噬菌体
需钠弧菌噬菌体 TT4
大肠杆菌噬菌体
ФKZ、OMKO1 和Pa Mx41 噬菌体
大肠杆菌、克雷伯菌噬菌体
PICIs
铜绿假单胞菌噬菌体
大肠杆菌噬菌体
沙门氏菌噬菌体
MS2 噬菌体
T7 噬菌体
T4 噬菌体
耶尔森氏菌噬菌体
克雷伯氏菌噬菌体
抗酸性分枝杆菌噬菌体
李斯特菌、芽胞杆菌、葡萄球菌噬菌体
具体方法具体方法
紫外线诱变获取突变体
改善噬菌体的热稳定性
改造尾丝蛋白结构
改变或扩大 宿主 T4 样噬菌体宿主范围
T7 噬菌体基因组的单碱基替换和全基因替换
获得新的 RBP 结构
非必需基因缺失、读码框内缺失、点突变 、无义突变、外源基因精确插入
去除 IS 元件
实现溶原和裂解性质转换
建立了克雷伯氏菌噬菌体基因组的重组系统
将治疗性温和噬菌体转化为烈性噬菌体
II-A 型CRISPR-Cas 实现特定点突变和大片段删除
I-E型CRISPR-Cas 系统编辑 T7 基因组
点突变，基因缺失和替换
点突变，基因缺失和替换
III-A型CRISPR-Cas 系统 CRISPR-Cas10
V型CRISPR-Cas12a 系统构建包含缺失和插入的重组 T4
II-A 型CRISPR- Cas9 系统效果不稳 定，提 出基于 Retron 的重组方案
使用 CRISPR- Cas9 基因的缺失和替换
CRISPR-Cas13a
CRISPR-Cas13a+正向选择基因 acrVIA1
YAC
YAC
YAC
电转重启
电转重启
无细胞体系
无细胞体系
无细胞体系
无细胞体系
无细胞体系
无细胞体系
L-forms
年份年份
1966
2020
2009
2017
2020
2021
2008
2011
2017
2017
2019
2014
2014
2017
2018
2019
2021
2021
2022
2022
2022
2015
2020
2021
2019
2022
1996
2012
2018
2022
2022
2022
2018
出处出处
[49]
[51]
[98].
[99]
[55]
[100]
[58]
[60]
[61]
[62]
[24]
[64]
[65]
[66]
[68]
[69]
[70]
[75]
[71]
[72]
[73]
[78]
[80]
[79]
[84]
[85]
[89]
[91]
[86]
[88]
[88]
[92]
[96]
009

合成生物学 第 3 卷
的高效工具，而无需设计可持续复制噬菌体。此
外， 在某些 情况下 ，单纯 的交换 RBP 不足以产生
有活力的嵌合噬菌体。
利用 RBP 协 助 噬 菌 体识别宿主的特性， 同 样
可以 人 工 缩 小噬菌体宿主谱， 开 发 高 特异性噬菌
体 制 剂 杀 灭 特 定 病 原 体 ， 保 障 生 物 安 全 性 。
Holtzman 等［106］通过监测同时存在多个宿主的情况
下T7 噬菌体宿主范围的变化，在 95 小时内进行
100 次噬 菌体传代，发现 T7 噬菌体可以通过尾丝
蛋白基因 gp17 的自发 突变丧失对有完整吸 附受体
（Lipopolysaccharide，LPS） 的 K12 的 有 效 吸 附 。
T7 噬菌体在两种宿主菌 K12ΔtrxA （噬菌体可吸附
但无法 生物合成） 与 K12ΔwaaC （LPS 部分缺失）
中多次传代驯化后，对 K12ΔwaaC 的吸附率增高
而对 K12ΔtrxA 的吸附率降低，也不再识别表面保
留完 整的 LPS 的K12ΔtrxA。这种方式有效缩小噬
菌体 RBP 的 受体识别范围 ， 帮助构建高宿 主特异
性的噬菌体生物制剂，应用于通过噬菌体检测或
消除特定血清型的细菌。
对噬菌体 受 体 的 功 能 和 位 置 的 深 入 了 解 为 改
进和 创 新 的 噬菌体治疗方法打 开 大 门 ，我们可以
设计出智能的噬菌体“鸡尾酒”，发现新的噬菌体
源性抗菌剂，并引导噬菌体抗性进化为临床可利
用的表型。
3.2 宏基因组挖掘自然界噬菌体资源
噬菌体是 地 球 上 丰 度 和 多 样 性 最 高 的 生 物 学
实体，全球宏基因组数据的比对分析揭示了病毒
噬菌 体 的 多 样性和进化规律， 加 深 了 人们对噬菌
体的认知：噬菌体的形态特征以及蛋白结构；噬
菌 体基 因 组的 多样 性 以及 较 低的 基因 组 相似 性 ；
群落水平噬菌体的多样性及其在不同生态系统里
的丰度与群落组成；不同噬菌体的基因交换、基
因组镶嵌性与多样性、噬菌体谱系呈现出的复杂
网络结构［107］
。Chevallereau 等［108］探讨了当前关于
噬菌 体 群 的 组成、进化以及它 们 在 控 制细菌群的
数量 和 进 化 动力学中的作用的 知 识 ， 指出实验室
研究需要更符合现实中自然环境的生态性，以揭
示中繁衍复杂的微生物群落。
Kavagutt i 等［109］在远洋淡水生境进行超深度宏
基因组测序，从宏基因组数据中恢复了超过 2000
个噬菌体的完整基因组并研究了噬菌体在淡水系
统中 的 物 种 分类和时空分布特 征 。 研 究者从人工
系统的 Římov 水库 和自然系统的 Ji řická 池塘分别采
样， 产生共计 23 个样本的宏基因组测序结果，并
进一 步 分 析 病毒的分布、种类 和 功 能 。结果显示
在淡水系统中发现了 775 个未在数据库中发现的基
因组，同 时新发现 553 个海洋噬菌体独特基因组。
Al-Shayeb 等［110］通过搜索从将近 30 种不同的
地 球环 境 （从 早 产 儿和 孕 妇的 肠 道 到西 藏 温泉 、
病房、海 洋、湖泊和 深层地下） 产生的 DNA 数据
库来发现全新的巨型噬菌体（huge phage，也称为
megaphage）， 总共 鉴 定 出 351 种不 同 的巨 大 噬菌
体，它们的基因组比常见噬菌体的平均基因组大 4
倍或 更 多 。 在它们当中，存在 迄 今 为 止发现的一
种最大的噬菌体，其基因组长达 735kb，比噬菌体
的平 均基因组大近 15 倍 ，甚至比 许多细菌 的基因
组大 得 多 。 此外，他们发现一 些 噬 菌 体可能利用
细菌 CRISPR-Cas 系统消除竞争性噬菌体。
由于测序 技 术 和 研 究 方 法 的 限 制 ， 目 前 研 究
最多的 是 DNA噬 菌体，而高 通量 RNA 测序为探索
地球上的 R NA 病毒组提供了广泛的机会。
Neri 等［111］挖掘了 5150 个不同的元转录组，并
发现 了超过 250 万个 RNA 病 毒等位 点。对 超过 33
万 个 依 赖 RNA 的RNA 聚 合 酶 （RNA-dependent
RNA polymerase，RdRP）的分析表明，这一扩展
相当于已知 RNA 病毒多样性的 5倍。基因内 容 分
析揭示了以 前在 RNA 病毒中没有发现的、与病毒
和宿主相互作用有关的多个蛋白质结构域。扩展
的RdRP 系统发育支持五个已建立分类门的单系
性，并揭示了两个假定的新增的噬菌体门和许多
假定 的 新增 的 纲 和 目 。 急 剧扩 张的 Lenarviricota
门， 由细菌和相关的 真核病毒组成 ，现占 据 RNA
病毒群的三分之一。CRISPR 间隔和溶菌蛋白的鉴
定表明，以前 与真核生物有 关的 picobirnavirus es 和
partitiviruses 的亚群可感染原核生物宿主。该研究
结果拓 宽了己知的 R NA 多样性，指出 RNA 病毒在
全球范围内 具有普遍性 并且大多数 RNA 病毒类别
在 不 同 数 据 集 类 型 和 环 境 中 显 示 出 清 晰 的 分 布
模式。
Kauffman 等［112］以海洋噬菌体和沿海海洋异养
010

第 3 卷 www.synbioj.com
弧菌科细菌为模型，针对 2010 年为期 3个月内于
三个时间点（第 222、261 和286 天） 分离的 1440
个菌株研究其噬菌体-宿主互作关系。在 1287 个能
够在诱饵试验中生长且具有 hsp60 基因的菌株 中 ，
285 个（22%）对噬菌体侵染表现敏感性，环境相
互作 用 网 络 中的裂解性互作较 少 ， 大 多数细菌菌
株的噬菌体-捕食者负载较低，而且噬菌体具有宿
主菌 株 的 特 异性。研究通过高 通 量 的 交互侵染及
基因 组 测 序 等分析，揭示表明 重 组 主 要在共同侵
染中 产 生 的 ，且同源重组比突 变 对 序 列变异的贡
献更 高 ， 表 明隐性共侵染中重 组 是 微 生物群落中
噬菌 体 进 化 的一种重要模式， 揭 示 了 基因重组对
全球和局部噬菌体多样性的贡献。
病毒宏基因组学通过阐明环境病毒的遗传潜
力和 群 落 结 构，提供了对病毒 生 态 学 的见解，辅
助挖 掘 自 然 界中的未知噬菌体 ， 揭 示 病毒以全新
方式 操 纵 宿 主的基因，扩展人 们 当 前 对噬菌体与
宿主 相 互 作 用的认知，可以广 泛 推 动 包括进化生
物学、病原体监测和生物技术在内的学科进展。
3.3 多组学技术揭示噬菌体与宿主互作机制
随着高通量测序技术的发展，组学研究也在
不断 深 入 ， 通过对各组学进行 高 通 量 测序并对数
据整 合 研 究 ，可以全面和系统 地 了 解 噬菌体与宿
主之 间 的 互 作机制，如噬菌体 基 因 表 达调控，噬
菌体如何克服细菌免疫防御机制等。
噬菌体通常会劫持宿主细菌的转录机制来调
节自 身 和 宿 主细菌的基因表达 ， 但 尚 不清楚噬菌
体蛋 白 介 导 的转录调控特别是 转 录 抑 制的结构基
础。Yo u 等［113］揭示了噬 菌体蛋白 P7 通读转录终止
信号 ， 开 启 噬菌体后期基因转 录 的 分 子机制，也
解释了噬菌 体蛋白 P7 抑制宿主细菌转 录的分子机
制。Shi 等［114-115］系统地研 究了 T4 噬菌体中 期和晚
期基 因 转 录 激活的分子机制， 揭 示 了 噬菌体蛋白
MotA 和AsiA 劫持细菌 RNA 聚合酶 激 活 中期基因
转录的分子机制，利用冷冻电镜分别解析了 T4 噬
菌体 晚 期 基 因的基础转录复合 物 和 转 录激活复合
物的结构，揭示 T4 噬菌体依赖滑动夹激活晚期基
因转录的机制。噬菌体蛋白 gp55 和细菌 RNA 聚合
酶可 以 共 同 起始晚期基因的基 础 转 录 ，而转录的
激活还需要环状三聚体蛋白滑动夹 gp45 以及辅助
激活 蛋白 gp33 的参与，为了解 σ适配和 转 录 激 活
提供了基础。
TIR 结构域是识别细菌、植物和动物中病原体
入侵 的 免 疫 受体的关键组分， 对 感 染 外源物质的
识别会刺激 TIR 结构域产生一种免疫信号分子，结
合并 激活 Thoeris 免疫效应器并执行免疫功能，但
其分子结构仍不清楚。Le avitt 等［116］确定了一个命
名 为 Thoeris 抗 防 御 系 统 1（Thoeris anti-defence
1，Tad1）的大型噬菌体编码蛋白家族，它可以抑
制Thoeris 免疫。Tad1 蛋白能结合并封存由 TIR 结
构域 蛋 白 产 生的免疫信号分子 ， 从 而 使噬菌体感
应与免 疫效应器激活 脱钩，从而失活 Thoe ris 系统。
Tad1 也能有效地封存来自植物 TIR 结构域蛋白的
分子 ， Tad1 与植物衍生分子结合的高分辨率晶体
结构显示了 1''-2'糖环 ADPR（Glycocyclic ADPR，
gcADPR）的独特化学结构。该研究确定了一个核
心免 疫 信 号 分子的化学结构， 并 揭 示 了噬菌体抑
制宿主免疫的一种全新的模式，即病毒抑制 TIR
gcADPR 信号传递来克服细菌防御。
这些研究通过组学方式从分子层面阐明了噬
菌体 基 因 表 达调控的结构基础 和 分 子 机制，为人
工噬菌体的构建提供了理论基础。
3.4 调节肠道菌群生态
人肠道是已知最密集的微生物群落之
—
—
肠
道菌群 的 宿主环 境 ，肠 道 菌 群包 括 细 菌、 古 菌 、
病毒、真菌和其他微生物真核细胞［117］
。尽管肠道
中的噬菌体有调节细菌群落和人类健康的作用，
但我 们 并 不 清楚具体的作用机 制 。 结 合先进的序
列组 装 方 法 和功能强大的序列 分 析 算 法，近年来
不断涌现针对肠道噬菌体组的优秀研究成果。
Lawley 等［118］通过挖掘全球范围内 28060 个人
类肠 道宏基因组和 可培养 的 2898 个肠道细菌参 考
基因 组数据，建立了 包含 142000 个非冗余病毒基
因组（>10 kb）的肠道噬菌体数据库。宿主分组显
示Fyrmicut es 菌系的病毒多样性最高，约36% 的病
毒簇 不 局 限 于单一菌种。这种 高 质 量 、大规模的
噬菌体 基 因组数 据 库将 推 进 未来 的 肠 道病 毒 组 、
人类肠道噬菌体组的生态学和进化分析相关研究。
011

合成生物学 第 3 卷
Koonin 等［119］通过检索人类肠道中的宏基因组数
据， 并借助 环形 contigs 来推断其为完整的噬菌体
基因组， 鉴定出代表了 451 个假定属的 3738 个明
显完 整 的 噬 菌体基因组，验证 了 人 类 肠道中噬菌
体与 宿 主 相 互作用的多种假设 机 制 。 将这些已分
类 好的 高 多样 性 的噬 菌体 添 加到 公 共数 据 库中 ，
将有力促进对人类肠道病毒分类和功能表征的研
究 。 其 中 两 个 候 选 科 Flandersviridae 和
Quimbyviridae 是包括感染 Bacteroides
、
Parabacteroides 和Prevotella 的最常见和最丰富的
人 类 肠 道 噬 菌 体 成 员 。 第 三 个 提 出 的 新 科
Gratiaviridae 噬 菌 体 成 员 较 少 ， 与
Autographiviridae
、
Drexlerviridae 和Chaseviridae
有远缘关 系。对 CRISPR spacer 的分析表明，所有
三个假定家族的噬菌体都可以感染 Bacteroides。对
三个候选噬菌体家族的比较基因组分析找到了在
噬 菌 体 基 因 组 中 没 有 先 例 的 特 征 。 一 些
Quimbyviridae 噬菌体具有产生多样性的逆转录因
子 （Diversity-generating retroelements，DGRs），
可 产生 嵌 套在 防 御相 关基 因 中的 高 可变 靶 基因 ，
而先前已知的噬菌体编 码 DGR的靶点是结构基因。
该研究首次报道了几种 Flandersviridae 噬菌体编码
参与脂质生物合成中异戊二烯类途径的酶。
Gratiaviridae 噬菌体编码一个 HipA 家 族 蛋 白激酶
和糖 基 转 移 酶，表明这些噬菌 体 可 以 改变宿主的
细胞 壁 ， 防 止其他噬菌体的超 感 染 。 这三个家族
和其他家族的数百个噬菌体被证明编码过氧化氢
酶和 铁 螯 合 酶，预测这可以增 强 细 胞 对活性氧的
耐受性。
Gerber 等［120］研究了噬菌体对模型菌群的动态
影响。已知的人类肠道共生细菌在无菌小鼠中定
植并 受 到 对 应的烈性噬菌体的 侵 染 。 他们发现噬
菌体 侵 染 不 仅直接影响敏感细 菌 ， 还 通过细菌间
的相互作用对其他细菌物种产生级联效应。代谢
组学 分 析 还 显示，噬菌体侵染 引 起 的 菌群变化对
肠道 代 谢 组 产生了直接的影响 。 该 类 研究证明了
噬菌体作为肠道细菌定植调节剂的重要的生态学
意 义， 还 表明 了 肠道 噬菌 体 可以 靶 向调 控 细菌 ，
在哺乳动物治疗方面存在潜在的应用价值。
对肠道细 菌 和 噬 菌 体 群 落 的 前 瞻 性 生 态 学 研
究将帮助我们理解肠道内稳态及这种微生物系统
的功 能 。 例 如，分别在健康和 疾 病 期 间，对肠道
中的细菌、噬菌体和宿主免疫细胞的动态变化研
究可以提供有关疾病发展的关键信息和指导治疗
方法；了解噬菌体复制周期的调节可以帮助利用
肠道 微 生 物 群来改善疾病。我 们 应 当 在使用个性
化治疗时考虑噬菌体在肠道内发挥的影响。
3.5 大数据和新型人工智能指导噬菌体设计
合成生物 学 领 域 正 在 展 望 可 靠 的 设 计 创 新 生
物 功能 的 工程 框 架。 计 算机 辅 助设 计 （Computer
aided design，CAD）应在促进设计方面发挥核心
作 用 ， 但 在 合 成 生 物 学 中 的 应 用 仍 处 于 起 步
阶段［121］
。
Molina 等［122］提出并详细解释了两种根据给定
的噬菌 体 与细菌 感 染网 络 设 计噬 菌 体 “鸡 尾 酒”
的新型计算方法。其中一种方法 Exhaustive Search
总是 产 生 最 好的噬菌体“鸡尾 酒 ” 配 方，另一种
方 法 Network Metrics 总是使用最短的运行时间
（几毫秒）。两 种 方法都包含在可 供 任何用户使用
的应 用 程 序 中。作者还进行了 一 项 完 整的实验性
研究 ， 在 “ 鸡尾酒”中加入其 他 噬 菌 体，评估并
比 较 其 生 物 学 质 量 、 运 行 时 间 和 影 响 。 Rebollo
等［123］通过对 35 个宿主范围矩阵进行了宏基因组
分析，包括最近发表的研究和包含了在乳酪奶制
品中分离的大肠杆菌和从羊粪中分离的大肠杆菌
的新数据集，构建噬菌体与细菌感染网络后分析
由宿主范围矩阵提供的信息，通过使用 Nestedness
Temperature Calculator 和遗传算法 BinMatNest，构
建了自动 设 计 “鸡尾酒 ” 的 新途径 。 Díaz-Galián
等［124］开发了一个名为 PhageCocktail 的R包，可自
动设计出来自噬菌体与细菌感染网络的高效的噬
菌体“ 鸡尾酒”，其原理为通 过 13 种经验性噬菌体
与细菌感染网络，对 ExhaustiveSearch、
ExhaustivePhi、ClusteringSearch 和ClusteringPhi 这
4种方法进行了详细的解释和评估。对运行时间和
预期 成 功 率 （裂解细菌的百分比） 的 分析结果显
示， 四 种 方 法在运行时间和结 果 的 质 量上存在差
异。ExhaustiveSearch 总是提供最好的噬菌体“鸡
尾酒”，但运行时间 可能很长 。ExhaustivePhi 只关
注 一 种 “ 鸡 尾 酒 ”， 它 的 运 行 时 间 小 于
012

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ExhaustiveSearch， 但可以产生“ 鸡 尾 酒 ” 的 噬菌
体较 多 ， 该方 法 是相 对 最好 的 。 ClusteringSearch
和ClusteringPhi 都 非 常 迅 速 （ 一 般 来 说 不 到 1毫
秒）， 能 提供 最 即 时的 结 果 ，但 准 确 性有 一 定 下
降， 产 生 “ 鸡尾酒”的预期成 功 会 更 低。作者同
样进 行 了 完 整的实验研究来评 估 运 行 时间和生物
质量 。 总 之 ，聚类方法很快， 穷 举 方 法具有最高
的精 度 ； 噬 菌体与细菌感染网 络 越 大 ，分析就越
复杂 。 用 户 可以根据速度和结 果 的 准 确性的选择
不同方法辅助设计高质量噬菌体“鸡尾酒”。
此外，合成生物学家开发了合成生物学开放
语 言 （Synthetic biology open language，
SBOL）
［125］
，让科学家能够交换生物组件和系统的
设计 思 路 ， 允许用户定义合成 部 件 和 设计作为服
务的文 库，与合作者 共享 SBOL 数据，并储存局部
生物 系 统 设 计。Voigt 课题组设计出 Cello［126-127］程
序， 用 于 指 导基因回路自动化 设 计 ， 传统生物实
验室 正 在 越 来越多地与计算机 结 合 联 动，加速推
进合成生物学“智造”生物进程。
4总结与展望
尽管噬菌体研究已经延续了一个多世纪，但
针对 噬 菌 体 的高效基因组编辑 技 术 直 到最近才出
现。 噬 菌 体 基因工程技术仍处 于 早 期 阶段，随着
DNA 测序、合成和基因编辑技术的迭代发展以及
我们 对 天 然 噬菌体的多样性、 进 化 模 式和宿主互
作关 系 的 认 知的不断加深，未 来 噬 菌 体疗法将发
挥其巨大潜力［128］
。最重要的是提供可在实验室和
医院 中 实 施 的、简单有效的、 针 对 来 自自然界的
不同 种 类 细 菌的基因编辑技术 方 案 。 笔者认为噬
菌体 基 因 组 从头合成方法将凭 借 其 快 速和便捷性
很快 会 取 代 基于重组的基因编 辑 方 法 ，成为工程
噬菌 体 的 主 流研究技术。从头 合 成 噬 菌体的主要
限制 是 大 基 因组的组装和噬菌 体 重 启 效率，而随
着基 因 合 成 成本的进一步下降 、 廉 价 高保真聚合
酶的 开 发 以 及通用体外重启系 统 的 建 立，这些限
制将很快被突破。
通过对全球 204 个国家和 地 区 2019 年 抗 生 素
耐药相关数据进行分析发现，保守估计 2019 年有
127 万人直接死于抗生素耐药，另有 495 万人的死
亡与 抗生素耐药相 关，意 味着 2019 年抗生素耐 药
直接 导 致 的 死亡人数约等同于 艾 滋 病 和疟疾导致
死亡 的 总 和 ，而抗生素耐药相 关 死 亡 是仅次于缺
血性心脏病和中风的全球第三大死亡病因［129］
。随
着抗 生 素 耐 药性感染的患病率 上 升 ， 对噬菌体的
需求将持续增加。
此外，天然噬菌体分离物因其相对容易分离 ，
不需 要 创 新 步骤，通常不能申 请 专 利 。而具有改
进 的特 定 功能 （ 如 提高 杀 菌效 率 、 扩宽 宿 主谱 、
增强 安 全 性 或新功能） 的基因工 程 噬 菌体可以用
于申 请 专 利 ，有望引导制药公 司 投 资 这一令人振
奋的 新 领 域 。到目前为止，商 业 化 的 工程噬菌体
产品 已 有 用 于检测的噬菌体产 品 和 用 于养殖业的
噬菌 体 制 剂 。全球噬菌体市场 预 计 将 在未来几年
以3.5% 的显著复合年增长率增长。2021 年，全球
噬菌 体市场 价值为 11.7 亿美元，预计到 2028 年将
达到 14.4 亿美元。预计未来几年噬菌体的需求将
大幅增加 ，在 2022 年至 2028 年的预测期内，噬菌
体产业将 为主要行 业参与者 创造价值 2.688 亿美元
的收 入 机 会 。预计亚太地区凭 借 其 对 创造性研发
投资 增 加 、 医疗保健基础设施 的 扩 张 和政府努力
的加强，将成为增长最快的地区［130］
。
未来噬菌体技术的发展趋势，包括围绕常见
的模式细菌不断优化开发精准的基因编辑方式，
借助生信分析手段挖掘高效的 CRISPR 基因编辑系
统， 搭 建 标 准化工程噬菌体改 造 流 程 ，通过模块
化基 因 组 工 程搭建确保安全性 和 通 用 性的噬菌体
“骨架”，在此基础上根据需求引入有效的外源功
能基 因 、 删 除非必需基因或其 它 修 饰 ；通过模块
化工 程 ， 使 噬菌体成为极其通 用 的 生 物制剂；未
来更 加 便 捷 、高效、安全的噬 菌 体 基 因工程技术
会被 开 发 出 来，针对患者的个 性 化 噬 菌体基因组
设计并在体外重启噬菌体可能会变得越来越容易，
结合 计 算 机 辅助技术可以进一 步 优 化 噬菌体“鸡
尾酒 ” 组 成 ，实现高效低成本 设 计 、 合成、制备
和运 用 人 工 噬菌体，噬菌体的 大 规 模 临床应用也
将成为现实［131］
。
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通讯 作 者 ：童 贻 刚（1966—），男 ，
研究员，博士生导师，研究方向 为噬菌
体学 、微 生物学 、高 通量测 序、生物信
息学研究、合成生物学等。
E-mail: tongyigang@mail.buct.edu.cn.
第一 作 者 ：陈 青 黎（2000—），女 ，
硕士研究生。研究方 向为合成生物学
改造工程噬菌体。
E-mail: ql.chen@buct.edu.cn.
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