ArticlePDF Available

Primjena Allium-testa u nastavi biologijeAllium test application in biology teaching

Authors:

Abstract

Allium-test je jednostavni biotest za određivanje ukupne toksičnosti i genotoksičnosti kojeg učenici uz pomoć nastavnika ili samostalno mogu provesti u školi te njime testirati učinak različitih otopina na modelni organizam Allium cepa L. (obični luk). Allium-test je dobar primjer projekta u nastavi jer se svojim opsegom može prilagoditi dobi učenika, a potiče njihovu kreativnost i samostalnost u provedbi i prezentiranju samog projekta. Sam projekt i rezultati istog potiču učenike na razvijanje svijesti o vodenom okolišu i učinku onečišćenja na svim njegovim razinama.
Stručni rad
Zaprimljeno 13.10.2019.
Prihvaćeno za objavljivanje 24.10.2019.
Objavljeno 28.12.2019.
Kokotović, I., Radić Brkanac, S. (2019). Primjena Allium-testa u nastavi biologije. Educ. biol., 5:87-91.
87
Primjena Allium-testa u nastavi biologije
Iva Kokotović, Sandra Radić Brkanac
Sveučilište u Zagrebu, Prirodoslovno-matematički fakultet, Biološki odsjek, Zagreb, Hrvatska
ikokotovic1@gmail.com
SAŽETAK
Allium-test je jednostavni biotest za određivanje ukupne toksičnosti i genotoksičnosti kojeg učenici uz pomoć
nastavnika ili samostalno mogu provesti u školi te njime testirati učinak različitih otopina na modelni organizam
Allium cepa L. (obični luk). Allium-test je dobar primjer projekta u nastavi jer se svojim opsegom može prilagoditi
dobi učenika, a potiče njihovu kreativnost i samostalnost u provedbi i prezentiranju samog projekta. Sam projekt
i rezultati istog potiču učenike na razvijanje svijesti o vodenom okolišu i učinku onečišćenja na svim njegovim
razinama.
Ključne riječi: Allium-test; vodeni okoliš; projekt u nastavi
UVOD
Problemska nastava je model nastave u kojem je učenje najčešće organizirano oko projekta. Projekti
su kompleksni zadatci bazirani na izazovnim pitanjima ili problemima koji uključuju učenike u
osmišljavanje samog projekta te njegovu provedbu donošenjem odluka, provjerom činjeničnog znanja
i rješavanjem problema. Stoga je projektna nastava često ujedno i problemski orijentirana nastava.
Projektna nastava daje učenicima mogućnost da rade samostalno kroz dulji vremenski period (Lou i
sur., 2012).
Primjer projekta u nastavi može biti procjena kvalitete vode i njezinog utjecaja na biljne organizme
primjenom Allium-testa. Taj je dobro poznat i jednostavan biotest pogodan za izvedbu u laboratorijima
u kojima se rutinski testira učinak različitih otopina, a njime se može odrediti ukupna toksičnost,
citotoskičnost i genotoksičnost (Fiskesjö, 1985). Uzorci vode rijeke Save sakupljeni na lokacijama
Lukavec, Rugvica, Jesenice i Hrušćica koju su bili testirani ovim testom nisu inhibirali rast korjenčića
luka, no pokazali su se genotoksičnim, a uzorak s lokacije Jesenice i citotoksičnim (Kokotović, 2019).
Allium cepa L. (obični luk) je zeljasta trajnica iz porodice Alliaceae, a njegov podzemni organ je
karakteristična lukovica (Nikolić, 2013). Kao pokazatelji toksičnosti prate se:
1) makroskopske promjene kao što su rast i oblik korijena te pojava listova na lukovici
2) mikroskopske promjene kao što su mitotska aktivnost (određivanje mitotskog indeksa tj. broj
stanica u diobi) te pojava kromosomskih i mitotičkih nepravilnosti (Fiskesjö, 1988).
Allium-test ima mnoge prednosti poput niske cijene, jednostavne izvedbe i dostupnosti lukovica
tijekom cijele godine, malog broj dugačkih kromosoma (2n = 16) i raspoloživosti velikog broja stanica
na jednom mikroskopskom preparatu što doprinosi pouzdanosti dobivenih rezultata (Leme i Marin-
Morales, 2009; Radić i sur., 2014). Učenici mogu testirati kako na modelni organizam utječe voda iz
bunara, potoka, jezera, rijeke koja se nalazi u blizini škole ili njihovog mjesta stanovanja. Različiti
onečišćivači će uzrokovati promjene u rastu i obliku korjenčića te dovesti do kromosomskih i mitotičkih
nepravilnosti. Na temelju teorijskog znanja i opažanja tijekom uzorkovanja učenici mogu postaviti
hipotezu o utjecaju testne vode na modelni organizam. Ako znamo koji je zagađivač prisutan u testnim
vodama enici ih mogu povezati sa svojim rezultatima. Projekt učenici mogu provesti uz pomoć
nastavnika u školi, a rezultati mogu biti obrađeni statistički ili samo opisani ovisno o dobi učenika. Iako
Broj 5, prosinac 2019.
88
projekt traje nekoliko dana unutar samog dana oduzima relativno malo vremena, što ostavlja
učenicima dovoljno vremena za izvršavanje ostalih obaveza.
PRILAGODBA METODA RADA ZA UČENIKE
S obzirom da se ovim testom provjerava toksičnost treba paziti pri odabiru postaje istraživanja da one
nisu izričito opterećena onečišćenjem, već da su to dostupna područja na lokalnim tekućicama.
Uzorkovanje bi posebno u osnovnoj školi trebao provesti nastavnik, a u srednjoj školi to mogu biti i
učenici, ali pod njegovim strogim nadzorom nastavnika biologije. Sam postupak i primjena ove metode
na uzorcima vode tekućica nije opasna za zdravlje učenika, ali je poželjno da se učenike zaštiti od dodira
s vodom uzorka. Pri uzorkovanju i kasnije u radu s uzorcima treba poštivati sve mjere opreza i koristiti
zaštitne rukavice.
Materijali i metode prilagođeni za osnovnu školu
Učenici uz pomoć nastavnika prikupljaju uzorke vode koju žele testirati. Uzorci vode se ne filtriraju.
Baza lukovica (smeđi prsten korijena) se očisti pomoću skalpela ili noža, a da se pritom ne ošteti sama
lukovica. Lukovice se stave na vrh staklene posude odgovarajućeg promjera te se bazom urone u
destiliranu vodu (može se koristiti i odstajala vodovodna voda) dok korjenčići ne postignu duljinu od
otprilike 2 cm. Nakon toga lukovice se premjeste na uzorke testnih voda odnosno destilirane vode
(kontrolne lukovice). Inhibicija rasta korjenčića i promjene u morfologiji korjenčića se bilježe nakon 72
h izlaganja testnim vodama i destiliranoj vodi. Duljina korjenčića izmjeri se ravnalom i bilježi u mm.
Promjene u morfologiji korjenčića, kao što su promjena boje korjenčića, kuke na vršku korjenčića ili c-
tumori, mogu se promatrati golim okom. Inhibicija rasta korjenčića luka kao i promjene u morfologiji
samih korjenčića koriste se kao pokazatelji ukupne toksičnosti uzoraka površinskih voda. Učenici
rezultate istraživanja mogu bilježiti u tablice u koje će upisivati koliko su narasli korjenčići te potom
napraviti dijagrame kako bi se bolje vidio utjecaj testnih voda na modelni organizam. Svaki učenik može
testirati različiti uzorak, a prilikom izlaganja rezultata može se raspravljati zašto se neki rezultati
podudaraju, zašto neki uzorci ne odstupaju značajno od kontrole, može li se testna voda koristiti za
zalijevanje vrta u kojem uzgajamo povrće i kakve bi posljedice imala za biljku.
Materijali i metode prilagođeni za srednju školu
Postupak je isti kao i za osnovnu školu, no uz makroskopske promjene mogu se promatrati i
mikroskopske tj. može se utvrditi citotoksični (broj stanica u diobi odnosno mitotski indeks)
genotoksični učinak (pojava kromosomskih i mitotičkih nepravilnosti). Nakon što su korjenčići postigli
duljinu od 2 cm, učenici označuju 3-5 korjenčića vodootpornim markerom; ti korjenčići služe za
određivanje inhibicije rasta korijena i morfoloških promjena. Nakon toga se lukovice premjeste na
uzorke testnih voda i destiliranu vodu (kontrola). Preporučaju se tri lukovice za svaki uzorak testne
vode i kontrolu. Nakon 24 h izlaganja testnim vodama i običnoj destiliranoj vodi (kontrola) korjenčići
se fiksiraju u mješavini 96% etanola i ledene octene kiseline u omjeru 3:1 (30 min do 24h). Fiksiranjem
se zaustavlja dioba stanica. Ukoliko se promatraju mikroskopske promjene, a projekt se radi u školi,
bilo bi poželjno da se radi nakon nastave s obzirom da je bitno da vrijeme fiksiranja korjenčića bude
točno nakon 24h, a učenici nemaju svaki dan sat biologije u isto vrijeme. Učenici uzorke mogu fiksirati
doma, a u školu ih donijeti samo na analizu pod uvjetom da su napravili fiksativ. Prije same analize
korjenčići se prvo omekšaju zagrijavanjem u 1M HCl te zatim oboje 1%-tnom otopinom aceto-karmina.
Pri izradi preparata, otkine se vršni dio korjenčića (intezivno obojana zona primarnog meristema), stavi
na predmetno stakalce u kap aceto-karmina te macerira staklenim štapićem. Macerirani korjenčići se
pokriju pokrovnicom i laganim pritiskom zgnječe ("squash") (Sharma i Sharma, 1972). Predmetna i
Broj 5, prosinac 2019.
89
pokrovna stakalca prethodno se očiste u etanolu. Mikroskopiranje i fotografiranje se vrši pomoću
svjetlosnog mikroskopa. Za analizu mitotske aktivnosti poželjno je pregledati najmanje 3000 stanica
(1000 stanica u svakoj od tri replike) po svakom uzorku voda, a za analizu kromosomskih aberacija
najmanje 100 diobenih stanica vrškova korjenčića luka po uzorku (kontrola, uzorci testnih voda).
Ukoliko više učenika radi na projektu treba paziti da isti učenik broji sve tri replike jednog uzorka kako
bi došlo do što manjih pogrešaka. Mitotski indeks se računa kao omjer broja stanica u diobi i ukupnog
broja stanica uzorka i izrazi u postocima. Tipovi mitotičkih i kromosomskih nepravilnosti koje se mogu
promatrati uključuju: lomove, anafazne mostove i sljepljivanje, c-mitozu, zaostale kromosome i
anafaze s multipolarnim vretenom (slika 1).
Slika 1 Primjeri citogenetičkih učinaka uzoraka vode rijeke Save u meristemskim stanicama vrškova korijena luka: (A) c-
metafaza, (B) anafazni most s multipolarnim diobenim vretenom, (C) anafaza sa zaostalim kromosomom (D)
sljepljivanje u anafazi, (E) metafaza s lomovima, (F) anafaza s multipolarnim diobenim vretenom
Prilikom izrade mikroskopskih preparata "squash" tehnikom može doći do pucanja i razvlačenja stanica
na što učenicima treba skrenuti pažnju, ukoliko vrškovi korjenčića nisu dovoljno macerirani pod
mikroskopom možemo vidjeti nakupinu stanica koju prilikom brojanja stanica preskačemo (slika 2).
Slika 2 Primjer meristemskih stanica vrškova korijena luka: (A) puknuće, (B) razvučena stanica, (C) nakupina
A
B
Broj 5, prosinac 2019.
90
Učenici dobivene rezultate statistički obrađuju i međusobno uspoređuju. Dobivene rezultate mogu
povezati s literaturnim izvorima te procijeniti koji zagađivači bi uzrokovali koje mitotičke i
kromosomske nepravilnosti.
ZAKLJUČAK I METODIČKI ZNAČAJ
Onečišćenje voda aktualna je tema našeg doba i okruženja u kojem živimo te može biti zanimljiva za
istraživanje i poticajna učenicima različite dobi. Učenici mogu procijeniti kvalitetu vode i povezati ju s
učinkom koji ostavlja na biljku. Zbog sve većeg onečišćenja vodenog okoliša javlja se potreba za
njegovim redovitim monitoringom. Allium-test je dovoljno osjetljiv test za ispitivanje toksičnosti vode,
dok je luk modelni organizam pristupačan i nastavnicima i učenicima. Učenici provedbom Allium-testa
mogu steći praktična znanja i izgraditi pozitivan stav prema očuvanju okoliša. Sam projekt može
doprinijeti njihovoj samostalnosti, snalažljivosti i interpretaciji dobivenih rezultata na temelju
istraživanja i prezentaciji istih kao i poboljšanju komunikacijskih vještina.
NAPOMENA
Ovaj članak pripremljen je prema diplomskom radu: Procjena toksičnosti vode rijeke Save upotrebom običnog
luka (Allium cepa L.) kao modelnog organizma izrađenom na Biološkom odsjeku, Prirodoslovno-matematičkog
fakulteta, Sveučilišta u Zagrebu pod voditeljstvom izv. prof. dr. sc. Sandre Radić Brkanac.
LITERATURA
Fiskesjö G. (1985). The Allium test as a standard in environmental monitoring. Hereditas 102: 99-112
Fiskesjö G. (1988). The Allium test - an alternative in environmental studies: the relative toxicity of metal ions. Mutation
Research 197: 241-260
Kokotović I. (2019). Procjena toksičnosti vode rijeke Save upotrebom običnog luka (Allium cepa L.) kao modelnog
organizma. Diplomski rad, PMF, Sveučilište u Zagrebu, Zagreb
Leme D.M., Marin-Morales M.A. (2009). Allium cepa test in environmental monitoring: a review on its application. Mutation
Research 682: 71–81
Lou S., Chung C., Dzan W., Shih R. (2012). Construction of a Creative Instructional Design Model Using Blended, Project-
Based Learning for College Students. Creative Education 3: 1281-1290
Nikolić T. (2013): Sistematska botanika. Alfa, Zagreb.
Radić S., Vujčić V., Cvetković Ž., Cvjetko P., Oreščanin V. (2014). The efficiency of combined CaO/electrochemical treatment
in removal of acid mine drainage induced toxicity and genotoxicity. Science of the Total Environment 466–467:
84–89
Sharma A.K., Sharma A. (1972). Chromosome techniques: Theory and practice. Buterworths and Co. Ltd, London, str. 97-
111.
Broj 5, prosinac 2019.
91
Allium test application in biology teaching
Iva Kokotović
1
, Sandra Radić Brkanac
1
1
University of Zagreb, Faculty of science, Department of biology, Zagreb, Croatia
ikokotovic1@gmail.com
ABSTRACT
Allium-test is a simple biotest for determining toxicity and genotoxicity which students can perform at school,
with the help of teachers or independently, to test the effects of different solutions on the model organism Allium
cepa L. (the common onion). The Allium test is a good example of project-based learning because it can be
adapted to the age of the students, and it enforces their creativity and independence in the implementation and
presentation of the project itself. The project itself and its results encourages students to develop awareness of
the aquatic environment and the impact of pollution at all its levels.
Keywords: Allium-test; aquatic environment; project-based learning
ResearchGate has not been able to resolve any citations for this publication.
Article
Higher plants are recognized as excellent genetic models to detect environmental mutagens and are frequently used in monitoring studies. Among the plant species, Alium cepa has been used to evaluate DNA damages, such as chromosome aberrations and disturbances in the mitotic cycle. Employing the A. cepa as a test system to detect mutagens dates back to the 40s. It has been used to this day to assess a great number of chemical agents, which contributes to its increasing application in environmental monitoring. The A. cepa is characterized as a low cost test. It is easily handled and has advantages over other short-term tests that require previous preparations of tested samples, as well as the addition of exogenous metabolic system. Higher plants, even showing low concentrations of oxidase enzymes and a limitation in the substrate specification in relation to other organism groups, present consistent results that may serve as a warning to other biological systems, since the target is DNA, common to all organisms. The A. cepa test also enables the evaluation of different endpoints. Among the endpoints, chromosome aberrations have been the most used one to detect genotoxicity along the years. The mitotic index and some nuclear abnormalities are used to evaluate citotoxicity and analyze micronucleus to verify mutagenicity of different chemicals. Moreover, the A. cepa test system provides important information to evaluate action mechanisms of an agent about its effects on the genetic material (clastogenic and/or aneugenic effects). In the face of all the advantages that the A. cepa test system offers, it has been widely used to assess the impacts caused by xenobiotics, characterizing an important tool for environmental monitoring studies, where satisfactory results have been reported.
Article
Among the test systems suitable for toxicity monitoring, the Allium test (A. cepa) is well known and commonly used in many laboratories, The onions are easy to store and to handle, and the root tip cells constitute a convenient system for macroscopic (growth, EC50 values) as well as for microscopic parameters (c-mitosis, stickiness, chromosome breaks). Since the cells possess important plant activation enzymes, the Allium test has a wide area of application. Furthermore, results from the Allium test have shown good agreement with results from other test systems, eukaryotic as well as prokaryotic.
Article
The Allium test is suggested as a standard in environmental monitoring, e. g. as a part of a test battery. Background, the method including suggested parameters for standard use, results from various application areas and comparisons with a number of other test systems are presented. The Allium test is a short-term test with many advantages: low cost, ease to handle, good chromosome conditions for the study of chromosome damage or disturbance of cell division including the evaluation of risks of aneuploidy. The ability of the root cells to activate promutagens (the MFO-system) further widens the application areas of the Allium test. The use of series of onions for each concentration of the test chemical allows statistical considerations, and from growth curves Effect-Concentration values are obtained. The Allium test is, lastly, a sensitive test showing good correlation to other test systems. Thus, positive results in the Allium test should be considered as a warning and also an indication that the tested chemical may be a risk to human health and to our environment.
Procjena toksičnosti vode rijeke Save upotrebom običnog luka (Allium cepa L.) kao modelnog organizma. Diplomski rad, PMF
  • I Kokotović
Kokotović I. (2019). Procjena toksičnosti vode rijeke Save upotrebom običnog luka (Allium cepa L.) kao modelnog organizma. Diplomski rad, PMF, Sveučilište u Zagrebu, Zagreb