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1
Protocolos de
Microalgas de la Red
RENUWAL (I)
2
Las microalgas pueden ser utilizadas para la recuperación de nutrientes contenidos en
diversos efluentes, contribuyendo de esta forma a la mejora de la sostenibilidad de
multitud de procesos. Sin embargo, para poder conseguir procesos eficientes es
necesario evaluar con detalle cada aplicación en función de los efluentes que se van a
procesar. Dependiendo del proceso, la biomasa algal obtenida puede tener interés
para su aplicación en distintos sectores y productos finales con diferente valor
añadido, i.e., farmacéutico, cosmético, agroalimentario-ganadero-acuícola, ambiental,
químico o incluso energético.
3
En el año 2019, varios grupos de investigación pertenecientes a diferentes países
iberoamericanos junto con 6 empresas que trabajan con microalgas se unieron para
solicitar al programa de Redes de la CYTED (Programa Iberoamericano de Ciencia y
Tecnología para el Desarrollo; https://www.cyted.org/es/cyted) la creación de una red
temática para el tratamiento de efluentes con microalgas. Las Redes Temáticas que
subvenciona este organismo, son asociaciones de grupos de investigación y desarrollo
(I+D) de entidades públicas o privadas y empresas de los países miembros del
Programa CYTED, cuyas actividades científicas o tecnológicas están relacionadas
dentro de un ámbito común de interés y enmarcadas en una de las Áreas del
Programa. En nuestro caso, la red se solicitó por el área industrial. La red RENUWAL
320RT0005 fue concedida en esta convocatoria del 2019 para iniciarse en el año 2020
durante un periodo de 4 años que, con motivo de la Pandemia, se ha extendido hasta
el 2024 (https://www.cyted.org/es/renuwal).
Las redes CYTED tienen como objetivo general el intercambio de conocimientos entre
grupos de I+D y la potenciación de la cooperación como método de trabajo. El objetivo
principal de la Red RENUWAL, es disponer de una Red multi- e interdisciplinar que
permita la sinergia necesaria para impulsar las aplicaciones potenciales de las
microalgas como agentes de reciclaje para la industria y el medioambiente en el marco
de la Economía Circular. Para ello se analizan e implementan los procedimientos
disponibles basados en microalgas que permitan el desarrollo de nuevas estrategias
sostenibles de valorización de la biomasa algal. Como objetivos específicos de la
propuesta, la Red trabaja en tres ejes distintos: a) Gestión del conocimiento; b)
Gestión de la comunicación y c) Gestión educacional.
Dentro de la gestión de comunicación, queremos ofrecer parte de nuestro know-how
mediante la publicación de procedimientos que puedan ser de interés para todos
aquellos relacionados con el mundo de las microalgas. Es por eso, que en esta primera
publicación se recopilan algunos de los protocolos utilizados para el trabajo con
microalgas en diferentes disciplinas. Es nuestra intención seguir recopilando más
protocolos de los centros que componen la red RENUWAL y ponerlos al servicio de
aquellos interesados.
Agradecemos la ayuda que la Cyted nos ha brindado para que este proyecto pueda
hacerse realidad, tanto por la concesión de la red como por ayudarnos durante todo el
proceso de publicación. Para cualquier sugerencia, pregunta o aclaración pueden
ustedes dirigirse por mail a las editoras. Esperemos que les guste esta iniciativa y la
encuentren de utilidad.
Editoras:
JUANA MARÍA NAVARRO LLORENS (UCM) jmnavarr@ucm.es
LUISA GOUVEIA (LNEG) luisa.gouveia@lneg.pt
4
Contenido
Protocolo de cultivo de la microalga Botryococcus braunii .......................... 5
Andrés Alonso Arbeláez Pérez, Néstor David Giraldo Calderón, Lucía Atehortúa Garcés
Inmovilización de microalgas en perlas de alginato para su uso en
procesos de biorremediación .................................................................... 12
Patricia Laura Marconi, Myriam Zawoznik, María Daniela Groppa, Laura I. de Cabo
Flow cytometry-assisted method for cell disruption of microalgae ............ 18
Daniel Figueiredo, Teresa Lopes da Silva, Alice Ferreira, Alberto Reis, Luisa Gouveia1,2
Conjugación triparental en cianobacterias ................................................. 29
Sara Baldanta Callejo, Govinda Guevara, Juana María Navarro Llorens
Determinación de fosfato disuelto e intracelular en cultivos de la
diatomea marina Halamphora coffeaeformis orientados a la producción
de lípidos neutros para biodiesel ............................................................... 37
Ana M. Martínez, Lucas A. Martín, Cecilia A. Damiani, Paolo M. Díaz Godoy, Patricia I.
Leonardi, Cecilia A. Popovich
Identificación y cuantificación de clorofila a y fucoxantina en cultivos de
la diatomea marina Halamphora coffeaeformis, aislada del estuario de
Bahía Blanca (Pcia. de Buenos Aires, Argentina). ....................................... 47
M. Alejandra Sequeira, M. Belén Faraoni, Ana M. Martínez, M. Cecilia Damiani, Patricia
Leonardi, Cecilia A. Popovich
Analysis of microalgae lipids from adapted Bligh Dyer followed by
derivatization and GC-MS analysis ............................................................. 56
Gisele Alves, Maiara Priscilla de Souza, Liange Reck, Carlucio Roberto Alves, Rosana de
Cassia de Souza Schneider
Determinación de carbohidratos totales por fenol-sulfúrico (DuBois-
Gilles-Hamilton) ........................................................................................ 62
Enrique Romero Frasca, Germán Buitrón
Protocolo de Preparación y Evaluación de Pilas de Combustible de Óxido
Sólido ........................................................................................................ 69
Araceli Fuerte, Rita X. Valenzuela, Paloma Ferreira-Aparicio, Beata Bochentyn
Método de cálculo del potencial bioquímico de metano (BMP), mediante
el equipo AMPTS II, para la investigación en digestión anaeróbica. ........... 84
Juan Luis Ramos, Nely Carreras
5
Protocolo de cultivo de la microalga Botryococcus braunii
Andrés Alonso Arbeláez Pérez1, Néstor David Giraldo Calderón1, Lucía Atehortúa
Garcés1
1Universidad de Antioquia, Grupo de Biotecnología, Calle 70 No 52-21, AA 1226,
Medellín, Colombia.
Correspondencia: latehor@gmail.com
RESUMEN
Este protocolo describe una guía para el cultivo de Botryococcus braunii a escala de
matraz, lo que es una herramienta útil para mantener cultivos de iniciación (inóculos)
en óptimas condiciones antes de su escalado. Es una etapa clave del proceso de
producción a gran escala en todo sistema biotecnológico.
La especie de microalga descrita en este documento es ampliamente estudiada a nivel
mundial como una potencial fuente de energía renovable, gracias a su gran
particularidad de producir hidrocarburos y excretarlos al medio [1]. Debido a esto es
de gran importancia conocer y establecer los protocolos adecuados para los inicios de
cultivo, teniendo en cuenta la demanda nutricional de la especie, así como sus tiempos
de crecimiento, lo que resulta en el diseño de un flujograma de proceso que incluya las
fases críticas y los pasos a seguir para lograr el objetivo de cultivar esta especie a nivel
de laboratorio. Los resultados obtenidos han demostrado que el protocolo establecido
es apto para el cultivo axénico de Botryococcus braunii, mostrando buena velocidad de
crecimiento y un periodo constante de mantenimiento que permita obtener células en
perfectas condiciones para iniciar cultivos de producción para su posterior escalado.
INTRODUCCIÓN
El desarrollo de tecnologías para la obtención de múltiples productos de valor
agregado a partir de diferentes fuentes renovables, es una etapa clave en la transición
de procesos hacia modelo más diversos y ambientalmente responsables [2]. Las
microalgas han ganado interés en los últimos años debido a su potencial de crear
biorrefinerías que acoplen procesos que produzcan diferentes tipos de productos,
dentro de los cuales están los derivados del petróleo [3]. La evaluación de diversos
medios de cultivos aptos para el cultivo de Botryococcus braunii ha sido motivo de
estudio por largo tiempo [4] donde los nutrientes que presentan principales
variaciones son el nitrógeno y el fosforo.
Las concentraciones adecuadas de los nutrientes que componen mayoritariamente el
medio, así como las concentraciones celulares iniciales, son vitales para las
producciones a gran escala de las microalgas [5]. Debido a esto, la evaluac1ión de una
concentración inicial adecuada fue evaluada y el periodo de tiempo de los
mantenimientos fue establecido para el cultivo de Botryococcus braunii en escala de
matraz.
6
PROTOCOLO
1. Preparación del medio de cultivo
Para el cultivo de Botryococcus braunii, se utilizó el siguiente medio de cultivo. La
composición se basa en macronutrientes que son utilizados durante el crecimiento
celular, trazas de elementos que son coadyuvantes en el metabolismo y una solución
de hierro.
Tabla 1. Medio de cultivo
Elementos
g/L
***
Macronutrientes
NaNO
3
1
1,5
K
2
HPO
4
0,093
0,042
MgSO
4
.7H
2
O
0,075
CaCl
2
.2H
2
O
0,036
Trazas
H3BO3
0,00286
MnSO
4
.H
2
O
0,00188
ZnSO4.7H2O
0,00022
Na
2
MoO
4
.2H
2
O
0,00039
CuSO4.7H2O
0,00008
CoCl
2
.6H
2
O
0,00004
Fe
Citrato Férrico de
NH4
0,006
Ácido Cítrico
0,006
Na
2
EDTA.2H
2
O
0,001
***Medio de cultivo solido: agar - agar (13 g/L)
2. Material Inicio
2.1 Para cada cepa de agua dulce se requieren 5 matraces de 500 ml con 200
ml de medio BG11 con entrada y salida de gases. En total 1L de medio por
cada cepa de agua dulce para cada lote
2.2 10 erlenmeyers de 100 ml estériles
2.3 10 tubos falcon de 50 ml estériles
2.4 1 Gradilla estéril para poner los falcon
2.5 N Acrodiscos medianos (50mm) – Siendo N = (# cepas * 5 + 5)
2.6 K Erlenmeyer de 1.0L estériles – Siendo K = (# cepas + 1)
2.7 Mechero
2.8 Fósforos
2.9 Aspersor con etanol al 70%
2.10 Plástico para envolver la boca de los envases luego de inoculados
2.11 Toallas o papel absorbente para secar y limpiar
3. Material mantenimiento
7
3.1 P litros de medio BG11 – siendo P = (# cepas agua dulce * 5 * 0,1L + 0,5L)
(se agregan 100 ml en cada envase)
3.2 P litros de medio salino – siendo P = (# cepas salinas* 5 * 0,1L + 0,5L) (se
agregan 100ml en cada envase)
3.3 10 erlenmeyers de 100ml estériles
3.4 10 tubos falcon de 50ml estériles
3.5 Gradilla para poner los falcon
3.6 K Erlenmeyer de 1.0L estériles – Siendo K = (# cepas + 1) para depositar
sobrantes de cada cepa
3.7 Mechero
3.8 Fósforos
3.9 Aspersor con etanol al 70%
3.10 Plástico para envolver la boca de los envases luego de inoculados
3.11 Toallas o papel absorbente para secar y limpiar
4. Descripción mantenimiento
4.1 Inicio lote
4.1.1 Luego de esterilizados y enfriados todos los materiales hasta
temperatura ambiente, llevar los envases a la cabina de flujo de
laminar junto con el cultivo que será usado como inóculo y los demás
materiales.
4.1.2 Dejar en exposición a la luz UV durante 20 minutos.
4.1.3 Luego de pasado el tiempo de exposición a la luz UV, poner los
acrodiscos en la salida de gases a los envases.
4.1.4 Encender el mechero y flamear la boca de todos los envases sin
células y el envase que tiene el inóculo.
4.1.5 Pasar 20ml de suspensión celular de cultivo de origen a cada uno de
los matraces de cultivo de forma aséptica.
4.1.6 Flamear nuevamente la boca de todos los envases buscando eliminar
cualquier residuo de humedad que puede favorecer la proliferación
de contaminantes.
4.1.7 Forrar la boca de los envases con plástico para sellado.
4.1.8 Retirar todo el material y limpiar la cabina con etanol al 70%.
4.1.9 Llevar todos los envases a un agitador orbital iluminado con luz
blanca a 25 µE/m2/s.
4.1.10 Instalar las redes de suministro de gases a cada uno de los envases.
4.1.11 Incubar a 110 rpm.
4.1.12 Agregar dióxido de carbono a todos los envases cada 48h a través del
sistema de distribución de gases durante 10 segundos hasta el
siguiente mantenimiento.
4.2 Consideraciones adicionales
4.2.1 Se recomienda iniciar el trabajo en la cabina de flujo laminar en
orden ascendente en rapidez de crecimiento para no favorecer las
contaminaciones cruzadas
8
4.2.2 Los cultivos establecidos deben ser renovados mensualmente.
4.2.3 Todos los envases deben ser marcados con su respectivo número y
fecha de establecimiento y renovación.
4.2.4 Los cultivos tomados de estos lotes para ser usados como inóculo
para otros experimentos se deben reponer en cada renovación de
medio para evitar futuras limitaciones de células activas.
4.2.5 Luego de la inoculación, y pasados varios días de incubación se debe
realizar un chequeo permanente para identificar envases que
muestren colores o características físicas diferentes del resto. En caso
de tratarse de una contaminación, se recomienda retirar el envase
inmediatamente de agitador y reponerlo con uno nuevo en el
siguiente evento de renovación.
4.3 Renovación de un lote
4.3.1 Luego de esterilizados y enfriados todos los materiales hasta
temperatura ambiente, llevar todos los materiales esterilizados junto
con los cultivos a renovar a la cabina de flujo laminar
4.3.2 Dejar en exposición a la luz UV durante 20 minutos.
4.3.3 Luego de la exposición a la luz UV, quitar el plástico protector de la
boca de todos los envases y flamear con el mechero.
4.3.4 Retirar 100 ml de suspensión celular de cada envase con el matraz de
este mismo volumen y depositarla en los envases de 1,0L.
4.3.5 Agregar 100 ml de medio de cultivo fresco a cada uno de los envases
a los que se retiró la suspensión con un matraz de 100 ml estéril.
4.3.6 Flamear el cuello de todos los envases y luego de enfría, sellar con
plástico.
4.3.7 Llevar nuevamente todos los envases al agitador orbital, instalar las
redes de distribución de gases y renovar la agitación.
4.3.8 Suministrar dióxido de carbono gaseoso a todos los envases durante
10 segundos para proporcional la carga inicial de fuente de carbono.
4.3.9 Cada lote debe renovarse cada 4 semanas y se debe suministrar CO2
gaseosos cada dos días.
4.4 Consideraciones adicionales
4.4.1 El protocolo aquí descrito está diseñado para hacer la renovación de
un lote completo de Botryococcus braunii. En el caso de que alguno
de los lotes se haya descompletado, bien sea por contaminación o
por requerimientos de inóculo, dentro de la preparación de los
materiales se debe incluir la cantidad de medio de cultivo y matraces
acondicionados suficientes para reponer los envases faltantes. El
inóculo para estos envases a reponer será la suspensión sobrante del
cambio del mismo lote de mantenimiento.
4.4.2 Se recomienda toma muestras al azar de algunos de los cultivos de
las cepas para posteriormente revisarla en el microscopio y así poder
identificar a integridad de las células y posibles contaminaciones.
4.5 Notas importantes
9
4.5.1 Debido a que es posible que se use alguno de esos envases como
inóculo para determinados ensayos, es importante hacer un
inventario semanal para saber cuántos envases se deben reponer y
así evitar escases de envases de mantenimiento.
4.5.2 Se recomienda tener por lo menos dos lotes de cultivos de
mantenimiento para cada cepa separados por un tiempo de dos
semanas uno del otro. Al tener dos lotes, en caso de haber algún
problema que provoque la pérdida de un lote entero, se cuenta con
uno adicional como respaldo. Esto evitaría tener que iniciar cultivos
nuevamente partiendo de cultivos sólidos ante cualquier problema
que pudiera presentarse.
4.6 Condiciones de cultivo
4.6.1 Botryococcus braunii es cultivado en periodos de 25 días (ajuste de
nutrientes) para cada lote de mantenimiento.
4.6.2 El volumen de trabajo es de 400 ml en matraces de 1L mantenidos en
agitación constante de 100 rpm con una iluminación de 0.258
µE/m2/s.
4.6.3 La temperatura del cuarto es de 22°C.
4.6.4 Los cultivos son gasificados 1 vez al día con un pulso de CO2 durante
20 segundos.
4.6.5 El ajuste de los nutrientes se realiza con un reemplazo del 60% del
volumen del cultivo con medio fresco.
4.6.6 Los cultivos se mantienen aproximadamente a una concentración de
3 g/L al final de su ciclo de mantenimiento
RESULTADOS
Siguiendo el protocolo, se evaluó el consumo de nutrientes por lote de recambio lo
que indicaría el tiempo de mantenimiento adecuado para que la microalga no sufra un
déficit nutricional que comprometa su viabilidad. Durante la cinética (Figura 1), se
pudo observar que el consumo total de fosfato (PO4) ocurría en unos pocos días
después de iniciar la cinética, lo cual puede ser debido a que la abundancia de este
nutriente estimula su propia acumulación, y la célula puede usarlo gradualmente a
medida que lo vaya necesitando [6]. El fosforo tiene un papel estructural fundamental
en muchas estructuras moleculares y celulares, como en el caso de los enlaces diéster
presentes en los ácidos nucleicos y fosfolípidos, los cuales son indispensables en las
estructuras membranosas [7]. En los ensayos presentados con el fosfato, se identificó
que sin importar la concentración de fosfato en el medio (< 60 mg L-1), la
concentración de este llegaba a cero a más tardar el día 5, por lo que se optó por
descartar el uso de un modelo para este, además de variar su concentración en el
medio dependiendo del nitrógeno, estableciendo una relación molar N:P de 10:1 la
cual es establecida en la basándose en la composición molecular de B. braunii [8]. Caso
distante ocurre con el nitrato, cuyo uso y acumulación parece no tener relación con la
disponibilidad de fosfato [6].
10
Figura 1. Cinética de crecimiento y consumo de la microalga Botryococcus braunii.
El nitrógeno está implicado en múltiples funciones celulares, es un componente
necesario para la síntesis de pigmentos como la clorofila y por lo tanto posee un papel
fundamental en el proceso de obtención de energía a través de la fotosíntesis.
Además, es el principal componente de los aminoácidos, en donde su limitación influye
en la traducción de mARN y a su vez en la síntesis de proteínas; hace parte de la
estructura de vitaminas y forma parte de coenzimas y enzimas [9].
El principal uso de nitrato por la célula es la síntesis de proteínas asociadas a la
replicación del ADN, por lo que es un nutriente que favorece la multiplicación celular y
por lo tanto afecta directamente las tasas de crecimiento de las algas [9–11]. Por esta
razón su consumo es gradual y proporcional al crecimiento logrado, como puede
evidenciarse en la Figura 1. Es sabido que el nitrógeno junto con el fósforo son los
nutrientes responsables de los conocidos “Bloom” de microalgas en cuerpos de agua
provenientes de actividades antropogénicas [12].
DISCUSIÓN
El actual protocolo establece un proceso adecuado para el crecimiento celular de
Botryococcus braunii en escala de laboratorio seguido de un protocolo de
mantenimiento que permite su replicación indefinida en el tiempo. Las etapas críticas
que permiten llevar a cabo el procedimiento son aquellas donde se compromete la
inocuidad del cultivo, debido a que una temprana contaminación con otro
microrganismo afectaría su replicación en las siguientes etapas. Por consiguiente, el
método está limitado en el volumen de trabajo evaluado y la especie estudiada. Por lo
cual, el método establecido tiene un gran potencial para ser implementado en
sistemas microalgales a escala de matraz.
AGRADECIMIENTOS:
Los autores agradecen a la agencia nacional de hidrocarburos por la financiación
presentada para la realización de este estudio. Así mismo, al grupo de biotecnología de
la Universidad de Antioquia por las instalaciones utilizadas.
0
2
4
6
8
10
12
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
0 5 10 15 20 25
NO3
PO4
Biomasa g / L
Dias
g/L Biomasa
NO3 g/L x 10
PO4 mg/L
11
CONFLICTO DE INTERESES:
Los autores declaran no tener conflicto de intereses
REFERENCIAS
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braunii for Efficient Hydrocarbon Extraction. PLoS One. 8(6), e66483.
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0066483.
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gasification through chemical looping in the presence of steam. Int. J. Hydrogen
Energy. 42 (36), 22730–22742. https://doi.org/10.1016/j.ijhydene.2017.07.173.
[3] Barbosa MJ, Wijffels RH (2013). Biofuels from Microalgae, In: Handbook of Microalgal
Culture: Applied Phycology and Biotechnology, Second Edition.
https://doi.org/10.1002/9781118567166.ch29.
[4] Dayananda C, Sarada R, Vinod Kumar, Ravishankar GA (2007). Isolation and
characterization of hydrocarbon producing green alga Botryococcus braunii from
Indian freshwater bodies, Electron. J. Biotechnol. 10(1), 79-91.
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[5] Arbelaez AA (2019). Analysis, modeling and improvement of production process of the
microalga Botryococcus braunii for energy purposes. M.Sc. Thesis. Faculty of Engineer,
Universidad of Antioquia-Colombia.
[6] Beuckels A, Erik S, Koenraad M (2015). Nitrogen availability influences phosphorus
removal in microalgae-based wastewater treatment. Water Res. 77, 98-106
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[7] Azcón-Bieto J, Talón M (2008). Fundamentos de fisiología vegetal (No. 581.1). McGraw-
Hill Interamericana, New York.
[8] Grobbelaar JU (2012). Microalgae mass culture: The constraints of scaling-up. J. Appl.
Phycol. 24, 315–318. https://doi.org/10.1007/s10811-011-9728-6.
[9] Barsanti L, Gualtieri P (2006). Algae: anatomy, biochemistry and biotechnology. Second
edition. eBook. Published March 5, 2014 by CRC Press.
[10] Peccia J, Haznedaroglu B, Gutierrez J, Zimmerman JB (2013). Nitrogen supply is an
important driver of sustainable microalgae biofuel production. Trends Biotechnol.
31,134–138. https://doi.org/http://dx.doi.org/10.1016/j.tibtech.2013.01.010.
[11] Turpin DH, Elrifi IR, Birch DG, Weger HG, Holmes JJ (1988). Interactions between
photosynthesis, respiration, and nitrogen assimilation in microalgae. Can. J. Bot. 66,
2083–2097. https://doi.org/10.1016/j.jembe.2006.05.002.
[12] Andersen R (2005). Algal Culturing Techniques. Elsevier Academic Press, New York, 578
pp.
12
Inmovilización de microalgas en perlas de alginato para su uso
en procesos de biorremediación
Patricia Laura Marconi1, Myriam Zawoznik2, María Daniela Groppa3, Laura I. de
Cabo4
1CONICET, CEBBAD-Univ. Maimónides, Hidalgo 775, Buenos Aires, Argentina;
2FFyB, Universidad de Buenos Aires, Junín 956, Buenos Aires, Argentina
3IQUIFIB-CONICET, FFyB, Universidad de Buenos Aires, Junín 956, Buenos Aires,
Argentina
4Museo Argentino de Ciencias Naturales “B. Rivadavia”-CONICET, Buenos Aires,
Argentina
Correspondencia: marconi.patricialaura@maimonides.edu
RESUMEN
Se detalla el protocolo para obtener microalgas inmovilizadas en alginato de sodio. El
cultivo de microalgas inmovilizadas en alginato de sodio ha mostrado ser eficiente para
obtener mayores rendimientos en los procesos de biorremediación. El presente
protocolo describe la obtención de perlas de alginato con concentraciones conocidas
de Chlorella vulgaris inmovilizada.
INTRODUCCIÓN
La inmovilización de la biomasa microalgal en diversos soportes tales como el alginato,
agar-agar, celulosa y sílica-gel, entre los más utilizados [1-5] protege las microalgas de
los efectos tóxicos de los contaminantes presentes en el agua, manteniendo el pH y
evitando temperaturas extremas, permitiendo una mayor eficiencia en la producción
de biomasa y sobrevida [6]. En particular, el alginato es una matriz de polisacáridos
especialmente útil para la elaboración de cápsulas esféricas, comúnmente
denominadas “perlas”. Además, las células entrampadas en la matriz ocupan un
volumen pequeño y definido -las perlas tienen un tamaño de 1 a 1,5 cm de diámetro- y
son fáciles de manipular confiriendo una estabilidad operacional al sistema (Figura 1A).
Otra ventaja, es mantener una comunicación célula-célula generalmente obtenida por
moléculas señal disueltas en la matriz que las contiene. En nuestro caso, la principal
ventaja de la inmovilización de las microalgas en alginato fue obtener mayor biomasa y
facilitar su recuperación (Figura 1B). Las perlas no sólo contribuyen a la resolución de
aspectos estrictamente técnicos relacionados con la ingeniería del proceso (“scalling-
up”), sino que evitan la liberación de células al medio y, por ende, los potenciales
peligros de eutrofización del sistema e introducción de especies exóticas. Además, el
uso de las perlas contribuye con la cosecha de la biomasa, haciendo este proceso
menos costoso.
13
A B
Figura 1. Cultivos de microalgas de C. vulgaris alimentados con agua del Lago Lugano.
A) perlas de alginato conteniendo células al 2% (P:V); B( comparación del crecimiento
obtenido por cultivos en suspensión (Chlsusp) o inmovilizados (Chlinm) en perlas de
alginato. Biomasa, estimación por peso seco (mg/L); concentración de clorofila
(μg/mL). Obtenido de Groppa et al. (2019) [7].
El presente protocolo describe la obtención de perlas de alginato conteniendo una
concentración conocida de microalgas. Además, se describe el protocolo para liberar
las algas del alginato.
Protocolo de inmovilización de Chlorella vulgaris
1. Disolver alginato de sodio en agua estéril al 10%. Utilizar un mixer o procesadora
hogareña para tal fin. La solución debe quedar traslúcida. Autoclavar la solución a 0,10
MPa por 15 min.
2. Preparar una suspensión de algas creciendo en fase exponencial. La concentración
puede variar entre 1 a 6 x 106 células/ml en medio de cultivo sintético. Se puede
obtener esta suspensión filtrando con papel de filtro estéril o centrifugar en
condiciones de esterilidad (menor a 5000 g por 10 min) y resuspender en medio hasta
obtener la densidad deseada.
Nota: Cultivo suspensión de C. vulgaris: medio MS, con el agregado de sacarosa (3 %) y
suplementado con el regulador de crecimiento AIA (ácido indol acético, 1 mg/L) [8].
Los medios de cultivo se dispensan en Erlenmeyers de 250 mL (50 mL en cada uno) y se
mantienen en agitación constante (100 rpm) para su oxigenación. Las incubaciones se
realizan a 24±2 ºC, con fotoperíodo de 16:8 luz:oscuridad con una intensidad PAR de
400 µmol.m-2s-1. El crecimiento se evalúa mediante peso fresco de biomasa, densidad
óptica a 600 nm de longitud de onda y recuento en cámara de Neubauer.
3. Mezclar la solución de C. vulgaris obtenida en el ítem 2 con alginato de sodio 2% estéril
en relación 20:80 (V:V).
Nota: se almacena el alginato al 10 % estéril. La dilución correspondiente se realiza
según la siguiente fórmula.
Ci x Vi = Cf x Vf
4. Mezclar durante 15 minutos sobre un agitador electromagnético (“magnetic stirrer”).
14
5. Gotear la mezcla con una aguja de 2.0 mm de diámetro de salida sobre una solución
2% de CaCl2 estéril en agitación suave (medio de gelificación) sobre un agitador
electromagnético. Alternativa para grandes volúmenes a preparar: utilizar una bomba
peristáltica con una vía estéril.
6. Incubar las bolillas formadas en CaCl2 2% estéril en agitación rotatoria (60-100 rpm)
durante 1 h a 22 °C.
7. Descartar el medio y lavar las bolillas tres veces con 10 vol. de solución salina estéril
(0.85% NaCl) en las mismas condiciones de agitación y temperatura durante 20
minutos cada uno cambiando el medio durante cada lavado.
Recuperación de la biomasa inmovilizada: una vez finalizado el proceso de
biorremediación, se cosechan las perlas con la microalga inmovilizada y se recupera la
biomasa por dos mecanismos posibles.
1. Por redisolución de la matriz:
a. Triturar en forma mecánica y suavemente las bolillas en un pequeño volumen de
buffer fosfato KH2PO4/Na2HPO4, 1 M y pH 6,5 (relación aproximada de 1 bolilla:1ml).
Se puede utilizar Eppendorf y un pilón o pestle (Bel-Art®) para una muestra de 10
bolillas
b. Centrifugar las suspensiones a 2500 rpm durante 10 minutos.
2. Por disgregación mecánica de la matriz
a. Triturar mecánicamente las bolillas en un pequeño volumen de medio
b. Diluir la suspensión en medio de trabajo.
c. Centrifugar la suspensión a 2500 rpm durante 10 minutos.
RESULTADOS
Entre los contaminantes que más impactan en el medio ambiente se describe el exceso
de las especies químicas nitrogenadas y fosforadas responsables de causar la
eutrofización de las aguas trayendo aparejado un desbalance en el ecosistema. Para
probar la eficiencia del cultivo de las microalgas inmovilizadas se llevaron a cabo
cultivos utilizando biorreactores tipo tanque agitado (Minifors, Infors HT®, Switzerland)
con un vaso de 2 L y agitación por paleta marina (100 rpm), con sistema de control de
pH y aireación por burbujeo (“sparger”) con una bomba a 0,5 vvm. El biorreactor fue
alimentado con agua del lago Lugano (sector correspondiente a las coordenadas
34°40′50.80″S y 58°26′44.10″O) o medio sintético (MS suplementado con AIA 1 mg/L,
sacarosa 3 %) [9].
La cinética de crecimiento se basó en muestreos diarios de 10 perlas de alginato a lo
largo de 14 días, donde se cuantificó el número de células inmovilizadas en cada
bioproceso (Tabla 1).
El medio de cultivo MS con 3% de sacarosa fue el más adecuado para generar biomasa
con un tiempo de duplicación de 3 días.
Además, se observa una disminución significativa del contenido de amonio y fósforo
en los mismos ensayos respecto al control (perlas de alginato sin microalgas) (Figura
2). Cabe destacar que se obtuvieron mejores resultados en los sistemas con algas
inmovilizadas respecto a los cultivos de las mismas algas en suspensión [9]. A los 11
días de cultivo, se consume casi el total del amonio y más del 80% del fósforo total en
los tratamientos con microalgas inmovilizadas.
15
Tabla 1. Parámetros de crecimiento de Chlorella vulgaris inmovilizada en perlas de
alginato, en biorreactores alimentados con agua del lago Lugano. Los asteriscos
señalan diferencias significativas (p ≤ 0,05). RGR: Tasa específica de crecimiento (peso
final-peso inicial/peso inicial), μ: velocidad de crecimiento (peso final-peso inicial/días
en cultivo), dt: tiempo de duplicación. MS, medio sintético MS; ALL: agua del Lago
Lugano. Los cálculos cinéticos se realizaron con “FermenterTool software 2018”
(www.fermentertool.com/en/).
MS
ALL
RGR
73,3*
9,7*
µ (d
-1
)
0,214*
0,090*
dt (d)
3
8
A
B
Figura 2. Consumo de nitrógeno amoniacal (A) y fósforo total, (B) en agua del Lago
Lugano luego de cultivar C. vulgaris en suspensión (Chl.) o inmovilizadas en perlas de
alginato (Chl. Inm) respecto al control de perlas de alginato sin células (Alginato).
Obtenido de Trentini et al. (2017), [9].
El pH inicial en las muestras de agua del lago Lugano fue de 9, lo cual puede traer como
consecuencia la formación de amoníaco y el desacople de la cadena de electrones en
el fotosistema II ([10], Tabla 2). El valor de pH disminuye al finalizar el bioproceso, lo
16
cual reduce los riesgos de toxicidad por presencia de amoniaco.
Finalmente, también se pudo observar que en presencia de C. vulgaris inmovilizada
hubo una reducción de la concentración de plomo (90%); cadmio (65%); cobalto (más
de 50%) y cromo (50%) en el agua. De esta manera, el contenido de metales en el agua
queda dentro de los valores admisibles propuestos por la “American Public Health
Association” (APHA, 2005) (Tabla 2). Algunas microalgas tienen la capacidad de
acumular en su interior metales pesados y de degradar algunos compuestos orgánicos.
Está descrito que los metales pueden adsorberse a la pared celular de la microalga C.
vulgaris. Los grupos químicos funcionales como amino, hidroxilo, ácidos, entre otros,
de la pared celular atraen por diferencia de cargas a los metales inmovilizándolos en la
superficie celular [12-15]. El proceso de inmovilización en alginato no impidió la
remoción de metales de las muestras de agua.
Tabla 2. Evaluación del efecto biorremediador de Chlorella vulgaris sobre el agua del
lago Lugano en biorreactores. Valores de referencia de APHA (2005) [11].
Valores
iniciales
bioproceso
Valores de
referencia
pH
9
8,4
6,5/9
Hierro (ppm)
0,30
0,3
0,3
Cobalto (ppm)
0,08
ND
ND
Plomo
(ppm)
165,00
6,0
50,0
Cadmio
(ppm)
4,00
<2
10,0
CONCLUSIONES
● Nuestro modelo de contaminación ambiental fue el agua proveniente del lago Lugano,
CABA. El conjunto de trabajos publicados permitió demostrar que microalgas
inmovilizadas en perlas de alginato permite biorremediar estas aguas en el término de
5 días en sistemas confinados como son los Erlenmeyers y los biorreactores.
● Las ventajas de trabajar con perlas de alginato fueron facilitar la manipulación y
aislamiento de las células, permitiendo su crecimiento en forma simultánea con la
remoción de los elementos contaminantes medidos, en especial nutrientes inorgánicos
y metales pesados.
● La tecnología se presenta como una alternativa potencialmente aplicable a espacios
abiertos para su biorremediación y posterior remoción, evitando la eutrofización del
sistema.
AGRADECIMIENTOS: a los estudiantes Lic. Andrea Trentini, Lic. Daniel Orozco, Ing.
Juan Sanchez Novoa
CONFLICTO DE INTERESES:
Los autores declaran no tener conflicto de intereses
17
REFERENCIAS
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lipid content, lipid variety, and cell and population size of the microalgae Chlorella spp.
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Environ Chem Eng 7, 103169.
18
Flow cytometry-assisted method for cell disruption of
microalgae
Daniel Figueiredo1, Teresa Lopes da Silva2, Alice Ferreira2, Alberto Reis2, Luisa
Gouveia1,2
1GreenCoLab - Green Ocean Technologies and Products Collaborative Laboratory,
CCMAR, University of Algarve, Campus de Gambelas, 8005-139 Faro, Portugal
2LNEG_UBB - Laboratório Nacional de Energia e Geologia IP. - Unidade de Bioenergia e
Biorrefinarias, Estrada do Paço do Lumiar, 22, 1649-038, Lisboa, Portugal
Correspondence: luisa.gouveia@lneg.pt
SUMMARY
The effect of cell disruption by high-pressure homogenization can be accessed in a fast
and comprehensive way by using flow cytometry, which distinguishes and quantifies
disrupted, permeabilized and intact cell populations.
ABSTRACT
Cell disruption is a mandatory process to extract intracellular components of
microalgae, which are useful for food, feed, agriculture, biomedical or pharmaceutical
applications. A wide variety of cell disruption technologies is available, but
optimization of operation parameters is required. Flow cytometry (FC) combined with
viability staining dyes is a valuable tool to quickly analyze cell disruption. In this
protocol, samples of Tetradesmus obliquus that are subjected to multiple disruption
conditions (e.g., high-pressure homogenization pressures and cycles) are analyzed
using a flow cytometer equipped with a 488 nm argon laser. Samples are stained with
the viability dye SYTOX-Green, which stains DNA of membrane-compromised cells.
Staining optimization is the most critical step in this protocol, since it depends heavily
on species, cultivation media and cell concentration. Fluorescence data collected with
Forward and Side Scatter detectors as well as the FITC (green) fluorescence detector
allows the distinction of intact, membrane-permeabilized and disrupted cell
populations. The distinction of cells with compromised membranes can be useful when
mild-disruption applications are necessary. In conclusion, by having a faster and more
reliable evaluation of cell disruption, rupturing technologies can be optimized quicker,
resulting in a more efficient and cost-reduced downstream process.
INTRODUCTION
Microalgae are a sustainable alternative to produce foods, feeds, fertilizers,
pharmaceuticals, or fuels, due to their potential in sequestering CO2 and uptake of
wastewater pollutants [1]. The rich biochemical composition of microalgae can be used
in a biorefinery concept, where lipids, proteins, pigments, or other molecules can be
separated for different applications [2]. These intracellular components are only
accessible after breaking the cell wall, which in some species or growth conditions is a
challenging step, often associated to high operation costs [3]. Analyzing cell disruption
is then crucial to compare and optimize the available disruption technologies.
19
Flow cytometry (FC), a technology invented in the 1950s, is currently used to count
and analyze cell functions and compartments, therefore exploring their characteristics,
such as morphology, composition, metabolic activity or viability [4,5]. In a flow
cytometer, samples are acquired and drained into the flow cell, where a narrow
stream transports the sample into a physiological buffer called sheath fluid [6]. Cells
are then directed to pass individually in the interrogation point, where each cells
intercepts the lasers and emits light that is captured by the detectors (Figure 1). FC
detectors measure the light scattered by the cells, such as the forward scatter (FSC),
often indicated as a measure of the relative cell size and the side scatter (SCC),
associated to the inner cell complexity. The flow cytometer is also equipped with
fluorescence detectors, which collect the emission of a fluorescence at a specific
wavelength range, by filtering unwanted wavelengths with a bandpass filter [7]. The
scattered and fluorescence light is then converted to an electric signal with a specific
voltage, and the data allows the multiparametric analyses of all cells. These signals,
which represent events (e.g. cell, debris particle, or salts) can be gated based on two-
dimensional plots, allowing the selection of subpopulations that share the same
properties under the same multidimensional parameter space [6].
Figure 1. Schematic representation of flow cytometry with Tetradesmus obliquus. Cells
in the flow cell are suspended in a liquid sheath fluid (represented in blue) which is
constrained in a narrow tube. Light from the optical filters is directed to the forward
scatter (FSC), side scatter (SSC), and the green (FITC), yellow (PE) and red (PC5.5)
fluorescence detectors.
Flow cytometry is commonly used with staining of fluorescent dyes, which can detect
and unravel cellular components or enzymatic activities [8]. Furthermore, without the
addition of dyes, it is possible to detect microalgae cell features, such as chlorophyll,
which is a fluorescent compound mainly responsible for the cell-based fluorescence,
commonly designated autofluorescence [5,9]. Microalgae are easily distinguished
using FC due to their large size and wide diversity, especially when compared to
unicellular prokaryotes, which are smaller and less complex, therefore having lower
20
FSC and SSC signals. However, analyzing microalgae with FC is more challenging than
the analysis of animal tissues due to their wide variety of pigments and secondary
metabolites that can interfere with fluorescent staining [10]. Flow cytometry scattered
light is also influenced by cell orientation, organelles, cell refractive indices, DNA
content, or cultivation media6. Sample preparation also differs widely, as the
extraction of organelles, chemical fixation or the buffer solution is often species
dependent [10].
A broad list of methods including different dyes exist for microalgae applications, such
as the determination of lipid content, reactive oxygen species or cell viability [7,10–
13]. The detection of fluorescence-stained nuclei, where membrane-impermeable
fluorochromes (e.g., SYTOX-Green, PICO Green) determine cell viability in terms of
membrane integrity are the most common [10]. SYTOX-Green is an impermeable dye
that only enters in cells with damaged plasma membranes, staining cell nucleic acids
[14]. Cells stained with SYTOX-Green and excited with a blue laser (488 nm) emit green
fluorescence colour, whereas intact cell membranes (not stained with SYTOX-Green)
can be visualized as red-coloured cells, as a result of chlorophyll autofluorescence [13].
In this protocol, flow cytometry coupled with SYTOX-Green was used to analyze
Tetradesmus obliquus membrane integrity, after the microalgal culture has been
subjected to disruption with a high-pressure homogenizer.
PROTOCOL
A. MICROALGAE CULTIVATION AND CELULAR DISRUPTION
Tetradesmus obliquus, formerly known as Scenedesmus obliquus (ACOI 204/07, ACOI
Culture Collection, Coimbra University, Portugal), was cultivated in piggery wastewater
diluted 1:20 in a 5L bubble-column photobioreactor with a working volume of 4L for 16
days. The culture was kept at room temperature (23-25°C), under continuous artificial
light conditions using fluorescent lamps (Philips TL-D). A constant light intensity of 67.6
μE/(m2s) was provided to the culture, which was agitated with an air flowrate of 0.7
vvm.
B. FLOW CYTOMETRY PREPARATION AND ANALYSES
1. Collect a sample from a viable microalgae culture, preferably at exponential phase to
1-5 mL tubes/Eppendorf’s.
2. Incubate 1 tube of the microalga culture in a water-bath at 100 °C, for 30 min. This
heat-treatment will permeabilize the microalga cell cytoplasmic membrane and is the
positive control of the experiment. The negative control is the culture without any
treatment.
3. Run the non-stained negative control in the flow cytometer to adjust the number of
events/s, by diluting the microalgal culture with phosphate buffer saline (PBS). Flow
cytometry readings of 100-150 events/s should be used.
4. Define the layout in the flow cytometer software by creating a FSC/SSC and a FITC/FSC
2-dimension dot plots.
5. Adjust the flow cytometer detector gains to both microalga culture and staining dye so
that cell events appear visible within the tested fluorescence range (detector gains are
not transversal to other flow cytometers). The microalga cells autofluorescence should
be adjusted to the first logarithmic decade in FITC/FSC plot, so that the stained cells
fluorescence can be visualised within the fluorescence range detectors.
21
6. If necessary, create a detection threshold below the microalga FSC or SSC plots, to
disregard smaller events (e.g., bacteria or debris).
7. Prepare a 30 µM working stock solution of SYTOX-Green by dissolving it in pure
dimethyl sulfoxide (DMSO).
8. Optimize the staining procedure, by testing different incubation times and stain
concentrations using the positive control (heat-treated cells).
a. Start by studying increasing stain concentrations (e.g., 0.1-3.0 µM) at a fixed
incubation time (e.g., 30 min). The optimal stain concentration should be the one that
produces the highest stain FITC fluorescence.
b. Optimize the incubation time by incubating cells at increasing times (e.g., 1-30 min).
The optimal incubation time should be the one that produces the highest stain FITC
fluorescence.
9. Run both positive (heat-treated cells) and negative controls (exponential growing cells)
after incubating with SYTOX-Green, using the optimized staining procedure. Run also
unstained both positive and negative control samples.
10. Create the gates comprising the different T. obliquus sub-populations:
a. Select T. obliquus cell events from the negative control unstained, using the FSC/SSC
plot to create gate 0 (G0; Figure 2a). These are the untreated cell events which
typically appear as an elliptic broad spot.
b. Select T. obliquus cell events from the positive control (heat-treated cells) unstained
using the FSC/SSC plot to create gate 1 (G1; Figure 2b). This gate should be at the same
position as G0 and is related to cells that kept their size and internal content after
sample heat-treatment. Debris from cells that lost their size and internal content due
to disruption treatments will appear below this gate.
c. In FITC/FSC plot using the positive control stained, select the subpopulation (with all
G1 backgated) that exhibits higher Sytox Green florescence, creating the gate 2 (G2;
Figure 2c). These cells have their membrane compromised due to heat-treatment.
d. Compare the FITC/FSC fluorescence for both stained positive and negative controls and
create gate 3 (G3), by selecting events with lower FITC fluorescence (Figure 2d). These
are events that appear below G2, which relate to cells not stained with SYTOX-Green,
therefore with intact cell membranes.
e. These controls were then used for further comparison with data obtained from HPH
disruption treatment on T. obliquus.
22
Figure 2. Flow cytometry gates for Tetradesmus obliquus using the detectors FSC/SSC
and FITC/FSC dot plots. Untreated (exponential grown) cells are used as a negative
control (a, d) and heat-treated (dead) cells are used a positive control (b, c).
11. Proceed to the cell disruption treatment. Collect samples immediately before the FC
analysis, to prevent sample degradation.
12. Apply non-destructive ultrasonication to the sample tubes for 10 s to disperse
microalgae aggregates, before FC analyses.
13. Dilute samples with PBS and use the already optimized staining procedure.
14. Run both stained and unstained samples to determine all cell populations.
C. DATA ANALYSES
1. Export FC data in .FSC files and run it with a compatible software.
2. Create the same population gates as in Figure 2 (G0-G3 gates). These gates are used to
quantify the following microalgae cell subpopulations:
a. Disrupted cells, which have changed their structure, size, and internal content due to
harsh HPH treatment (obtained by subtraction of G1 from G0).
b. Permeabilized cells, which have a compromised cytoplasmic membrane, but maintain
their structure, size, and internal complexity after the HPH treatment (G2).
23
c. Intact cells, which have an intact cytoplasmic membrane (G3).
3. Calculate the percentage of disrupted cells by subtracting the number of events in G1
(cells that kept their size and internal content after treatment) by the G0 events
(untreated cells) and dividing it by the G0 events (Equation 1).
Disrupted cells (%)=
100 (Equation 1)
4. Calculate the percentage of permeabilized cells by dividing the number of events in G2
(permeabilized cells), by the number of events in G0 (Equation 2).
Permeabilized cells (%) =
100 (Equation 2)
5. Calculate the percentage of intact cells by dividing the number of events in G3 (intact
cells), by the number of events in G0 (Equation 3).
Intact cells (%)=
100 (Equation 3)
TABLE OF MATERIALS
Table 1. Table of materials and equipment used for the protocol, which include the
company name, catalog number and description/comments.
Name of Material/
Equipment
Company
Catalog
Number
Comments/Description
Cytoflex
Beckman Coulter
-
Flow cytometer
PandaPLUS 2000
GEA
-
High-Pressure Homogenizer
SYTOX-Green
Thermo Fisher
Scientific
S7020 Fluorescent dye
Dimethyl Sulfoxide
(DMSO)
Honeywell D5879-1L
For preparation of SYTOX-
Green solution
Phosphate-
buffered saline
(PBS) tablets
Oxoid BR0014 Dulbecco `A’ Tablets
Falcon tubes VWR 734-0451
To collect disruption
samples
Microtubes
Fisher scientific
11926955
1.5 mL Eppendorf tubes
RESULTS
By subjecting T. obliquus to high-pressure homogenization at different pressures (100,
350 and 600 bar) and cycles (1, 2 and 3), there is a clear impact on cell size, internal
content, and membrane integrity (Table 2). The increase in pressure and cycle number
decreases the number of intact cells (83.4% without HPH to 55.3-8.4% with HPH
treatments), while increasing the disrupted cells (0% without HPH to 3.4-74.8% with
HPH treatments). As for permeabilized cells, there is strong increase with 1 cycle
(16.6% without HPH to 44.7-55.0%), followed by a decrease with 2 or 3 cycles (44.7-
55.0% to 16.8-46.2%, respectively). This suggests permeabilized cells with 1 cycle are
24
more prone to suffer cell lysis due to the already compromised membrane. Indeed,
this population decrease was accompanied with an increase in the disrupted
population, especially at 350 and 600 bar (1 cycle= 3.4-28.9%; 2 and 3 cycles= 36.5-
74.8%). Permeabilized cells in the untreated sample (16.6%) are a result of already
membrane compromised cells, which is also evident in Figure 2c. These results confirm
that the present FC protocol to evaluate cell disruption and membrane integrity of T.
obliquus was successfully implemented.
Table 2. Cell disruption results of Tetradesmus obliquus subject to different pressure
and cycles of high-pressure homogenization. Intact, permeabilized and disrupted
populations were determined using FSC, SSC, and FITC fluorescence channels. Data are
shown as mean ± standard deviation (n=2).
Sample
Intact cells
(%)
Permeabilized cells
(%)
Disrupted cells
(%)
Total
(%)
Untreated
83.4±0.5
16.6±0.7
0.0±0.0
100
100 bar 1 cycle
55.3±1.2
44.7±1.6
0.0±0.0
100
100 bar 2 cycle
53.8±0.4
46.2±0.5
0.0±0.0
100
100 bar 3 cycle
34.7±0.3
36.1±0.4
29.3±18.9
100
350 bar 1 cycle
41.7±0.9
55.0±1.3
3.4±9.4
100
350 bar 2 cycle
23.9±0.1
39.5±0.1
36.5±5.4
100
350 bar 3 cycle
16.5±0.6
30.8±0.9
52.7±5.1
100
600 bar 1 cycle
25.8±0.7
45.3±1.0
28.9±3.4
100
600 bar 2 cycle
12.8±0.6
25.7±0.8
61.6±1.6
100
600 bar 3 cycle
8.4±0.1
16.8±0.1
74.8±0.8
100
There are constrains that may compromise the accuracy of the method, such as not
using optimal staining conditions (Figure 3). The inability to stain compromised
membranes makes the intact and permeabilized gates undistinguishable. This often
leads to underestimation on the proportion of permeabilized cells which compromises
the method. To overcome this, staining optimization can be performed with a heat-
treated microalga sample, by increasing dye concentrations to the point no increase in
FITC fluorescence is observed. This concentration should be compatible with all
samples, including all cell concentrations and media types. If using different media
composition and cell concentrations, it might be relevant to check interferences on
staining by boiling samples and using them as positive controls. If equal FITC
fluorescence among samples is observed, then the staining is not impaired.
25
Figure 3. Flow cytometry histogram for staining optimization showing different
concentrations of SYTOX tested on Tetradesmus obliquus dead cultures (positive
control), using the FITC channel.
Another concern is the cultivation media and cell suspension (broths) affecting FC
analyses due to organic contamination (e.g., bacteria or debris) or salt precipitates
overlapping with the microalga populations. Wastewater such as piggery wastewater
(PWW) contains events with similar FSC fluorescence to T. obliquus untreated cells.
This media contamination still overlaps with the untreated T. obliquus gate (G0
contains 1.4% PWW media) and is highly visible below this gate in both media (Figure
4a), and T. obliquus untreated and treated samples (Figure 4b and Figure 4c,
respectively).
Figure 4. Flow cytometry populations gates present in (a) piggery wastewater (PWW)
media, (b) untreated cells in PWW media, and (c) disrupted cells in PWW media using
FSC/SSC dot plots.
Running only media without cells previously to the cell analysis is a recommendable
practise to check if particles contamination overlaps with any of the microalga
population gates. If so, the overlapping media events can be subtracted using cell
concentration events ([events]), as exemplified for a disrupted population (Equation
4). The same subtraction logic applies for intact and permeabilized cell populations.
26
Disrupted cells (%) = [] [] []
[]100 (Equation 4)
Other concerns can occur, such as cell toxicity caused by high concentrations of the
staining dye solvent (e.g., acetone or DMSO). Nevertheless, unexpected changes in
FSC/SSC or FITC fluorescence can be detected when optimizing dye concentration. Also
changes in the microalga autofluorescence can occur while keeping samples waiting
for analyses. Immediate FC analyses after sample treatment can prevent this.
DISCUSSION
Evaluating cellular disruption is usually performed using microscopic manual count,
gravimetric analyses or flow cytometry [15]. While manual count and gravimetric
analyses are time-consuming and often lead to underestimations, flow cytometry is
recognized as a powerful tool to analyze the cell disruption yield in a quick and
accurate manner [16]. Different FC protocols have been conducted, either using non-
staining options [15] or combining the use of viability dyes, such as SYTOX-Green or
propidium iodide [17,18]. While the first are an easy and safe procedure to evaluate
cell disruption, a closer view at the membrane permeability is only achieved using
viability dyes.
Optimizing the dye staining parameters and its working stock solution are the most
critical steps of this procedure, as fluorescence deviations can compromise results. The
dye staining time, concentration and solvent for the working stock solution require
careful validation and should be adjusted to the microalga, cell concentration and
cultivation media. A common concern in this protocol are the overlapping events
caused by media composition or contamination. While these could be avoided with
appropriate subtraction in the data analysis, biological contamination already in the
culture with equal microalgae FSS and FSC signal, require other selecting procedures.
For example, if this contamination is from non-autotrophs (e.g., fungi or bacteria), the
red fluorescence detector can be used to select only microalga cells, as chlorophyll
fluorescence set events to higher red fluorescence levels.
SYTOX-Green gives information about cell membrane integrity, by differentiating
between intact and permeabilized cells but adds no more information about cell
viability (e.g., metabolic activity). Nevertheless, SYTOX-Green analyses can be
complemented with the use of carboxyfluorescein diacetate (CFDA) which gives a
gradient on cellular metabolic activity, or with 3,3-dihexylocarbocyanine iodide
(DiOC6(3)), which gives information on the cell membrane electric potential [19].
Another limitation of this method could be FC associated costs, which are high for
equipment and consumables [20]. Nevertheless, simpler and cheaper cytometers can
be found in the market with cell viability evaluation capabilities [21].
In summary, this method represents a robust platform to rapidly analyze microalgae
membrane integrity and disruption. This information is useful to optimize the
disruption efficiency of different rupture mechanisms towards the desired disruption
outcome. Ultimately, optimizing disruption parameters and understanding cell lysis is
important to achieve a more efficient and less costly bioprocess, while being
particularly important to food, feed, or agricultural applications.
ACKNOWLEDGMENTS:
27
This work was financially supported by: (i) project ALGAVALOR - Lisboa-01-0247-
FEDER-035234, funded by national funds (supported by COMPETE2020, Lisboa 2020,
and Algarve 2020), through the European Regional Development Fund (ERDF); (ii)
Biomass and Bioenergy Research Infrastructure (BBRI)- LISBOA-01-0145-FEDER-
022059, funded by national funds (PORTUGAL2020, Lisboa 2020, and Norte 2020)
through ERDF; (iii) PERFORMALGAE - ALG-01-0247-FEDER-069961 supported by
national funds (COMPETE2020, CRESC Algarve 2020) through ERDF; (iv) and Red CYTED
P319RT0025 - RENUWAL - Red Iberoamericana para el Tratamiento de Efluentes con
Microalgas. Alice Ferreira is pleased to acknowledge her PhD grant no.
SFRH/BD/144122/2019 awarded by Fundação para a Ciência e Tecnologia. The authors
express their gratitude to Graça Gomes and Natércia Sousa (LNEG) for laboratorial
assistance.
DISCLOSURES:
The authors declare they have no conflicts of interest.
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29
Conjugación triparental en cianobacterias
Sara Baldanta Callejo1, Govinda Guevara1, Juana María Navarro Llorens1
1Grupo de Ingeniería metabólica Departamento de Bioquímica y Biología Molecular,
Universidad Complutense de Madrid, 28040 Madrid, España
Correspondencia: joana@bio.ucm.es
RESUMEN
En este capítulo se presenta un protocolo de conjugación en gotas o “spots” basado en
el desarrollado por Elhai, J., & Wolk, C. P. (1988) [1] con modificaciones.
En la conjugación triparental, un plásmido al que llamamos cargo, se moviliza de una
primera bacteria a una tercera a través de una cepa auxiliar que porta un plásmido
conjugativo y que ayuda a la transferencia. Este protocolo de conjugación triparental,
se ha probado con éxito en Synechocystis sp. PCC 6803, Anabaena sp. PCC 7120
Synechococcus elongatus PCC 7942 y Chroococcidiopsis sp.
INTRODUCCIÓN
Las cianobacterias son organismos procariotas que comparten características con las
bacterias gram-negativas (como la pared celular) y con algas eucariotas como la
capacidad de realizar la fotosíntesis. La aplicación biotecnológica de las cianobacterias
es un campo de reciente interés, pero es necesario contar con herramientas de
manipulación genética [2-4]. El siguiente protocolo de conjugación triparental es uno
de los métodos de transferencia de material genético, junto a la electroporación y la
transformación natural, que más se utilizan en las cianobacterias [5].
En este proceso, se distingue a la cepa donante (“donor”) que es la E. coli que porta el
plásmido de amplio rango de huésped (cargo) que se desea transferir a la
cianobacteria y a la cepa auxiliar (“helper”) que es la cepa de E. coli que porta el
plásmido conjugativo (pRL443 / pRK2013 / pRK600) que va a promover la transferencia
del cargo a otras bacterias. Este plásmido conjugativo no debe ser capaz de replicarse
en la cianobacteria. La cepa receptora ("Recipient") es la cianobacteria a la que se
quiere transferir el cargo.
La selección, tanto en E. coli como en la cianobacteria receptora, requiere del uso de
diferentes antibióticos o marcadores. El cargo debe contener un gen de resistencia que
permita seleccionar las cepas de E. coli y, tras la conjugación, de las cianobacterias que
lo portan; por otra parte, aunque se use el mismo antibiótico para ambas, la E. coli no
crece en BG11 (el medio de cultivo de la cianobacteria) porque es un medio pobre y no
tiene una fuente de carbono
MATERIALES
Los materiales se muestran en la Figura 1, y son:
• Placas de BG11 con agar al 1,5-2% (p/v) y el antibiótico de interés para la
cianobacteria.
• Placas de BG11 con agar al 1,5-2% (p/v) con LB al 5% (v/v).
• Filtros para transferencia de Immobilon-NC HATF de 85 mm, poro de 0,45 µm
30
autoclavados.
• E. coli HB101 (preferentemente, también sirve DH10B) con el plásmido
conjugativo (pRL443 / pRK2013 / pRK600).
• E. coli HB101 (preferentemente, también sirve DH10B) con el plásmido cargo de
interés. Opcional: además del cargo, puede contener el plásmido helper
pRL623, que contiene tres metilasas de Anabaena sp. PCC 7120 y los genes
mob. El helper pRL623 es estrictamente necesario cuando se conjuga
Anabaena.
• Los plásmidos cargo deben llevar un oriT o bien los genes mob en el caso de no
usar el plásmido pRL623.
• Pinzas y tijeras de acero inoxidable estériles.
• Incubadora a 30°C con 100 μmol foton • m-2 • s-1 de luz blanca continua.
• Centrífuga de mesa.
• Micropipeta p20, p200 y p100.
• Puntas estériles de micropipeta.
Figura 1. Materiales empleados en la conjugación triparental. Cepas de E. coli cargo (A)
y conjugativa (B); cianobacteria a conjugar y medio BG11 (C); placas de agar en BG11
con LB al 5% y placas de agar en BG11 con el antibiótico de selección del cargo (D);
Membranas para la conjugación (E).
PROCEDIMIENTO
NOTAS
Teniendo en cuenta el número de conjugaciones que se vayan a realizar, se debe
calcular la cantidad necesaria de E. coli que se va a necesitar: 1 mL de cargo y 0.75 mL
de conjugativo permiten realizar 6 gotas o spots de 10µL de la mezcla.
La preparación de las E. coli debe realizarse en esterilidad al mechero o en campana,
extremando la precaución para evitar contaminaciones. Todo el trabajo con
cianobacterias, tanto la preparación como la conjugación, debe realizarse en
condiciones estériles en una campana de flujo laminar.
En cuanto a la fase de crecimiento de la cianobacteria, es preferible emplear cultivos
en fase exponencial temprana. Por otro lado, para las cianobacterias filamentosas se
recomienda sonicar el cultivo antes de realizar la conjugación.
A
C
CIA NO BA CTE RIA
Chroococcidiopsis sp.
(cian ob act eria ext remó fi la)
CARG O
Esc h eric h ia coli HB101 + Plásmido pSEVA341
(Res istenc ia a clo ranf enicol )
B
CO NJU G A TIVO
Esc h eric h ia coli HB101 + Plásmido pRK2013
(Res istenc ia a kan amicina)
PLACA S D E BG11 A GAR +
AN TIB IÓTICO
(E n n u est ro caso : k anami cina)
PLACA S D E BG11 A GAR +
LB 5%
C
D E
F
31
1. Preparación de E. coli (Figura 2)
1.1. Poner a crecer los cultivos de la E. coli cargo y la E. coli conjugativa con LB
más el respectivo antibiótico en un matraz y dejar crecer O/N. El volumen
dependerá del número de conjugaciones que se desee hacer.
1.2. Al día siguiente, pasar a un eppendorf y centrifugar a 15000 rpm durante
1 min. Para mantener las proporciones óptimas entre la cepa cargo y la
conjugativa, se centrifugan 2 mL para las E. coli con el cargo y 1.5 mL para
las E. coli que llevan el plásmido conjugativo.
1.3. Resuspender con una pipeta cada pellet en LB sin antibióticos con
cuidado y sin usar vórtex.
1.4. Lavar cada pellet dos veces con LB sin antibiótico, centrifugando en las
mismas condiciones mencionadas anteriormente.
1.5. Resuspender cada pellet en 500 µL de LB.
1.6. Mezclar en un eppendorf estéril 250 µL de la cepa cargo más 250 µL de la
cepa conjugativa.
1.7. Centrifugar la mezcla 15000 rpm durante 1 min.
1.8. Quitar el sobrenadante con pipeta con cuidado y resuspender el pellet
despacio con pipeta en LB, sin usar vórtex.
1.9. Hacer un último lavado con 500 µL de LB sin antibiótico.
1.10. Resuspender el pellet en 60 µL de LB sin antibiótico.
1.11. Mantener a 37°C al menos 1 hora, mientras se preparan las
cianobacterias.
Figura 2. Preparación de los cultivos de E. coli para el proceso de conjugación.
2. Preparación de las cianobacterias
Protocolo empleado con Synechocystis sp. y Synechococcus elongatus.
2.1. Tras crecer la cianobacteria en el medio BG11, medir la OD750nm del
cultivo.
No utilizar vortex.
1 mL hacer 2 lavados
con LB líqu ido
resuspenderen
250 µL LB
60 µL de LB
En estático a 37°C
dura nte 1 hora.
15000 rpm
1 mi n
CARGO
Es che rich ia co li H B101 + Plásm ido pSE VA341
(Resistencia a cloranfenicol)
0,75 mL hacer 2 lavados
con LB líqu ido
resuspenderen
250 µL LB
15000 rpm
1 mi n
CONJUGA TIVO
Es che rich ia co li H B101 + Plásm ido pRK2013
(Resistencia a kanam ic ina )
No utilizar vortex.
32
2.2. Centrifugar a 5000 rpm durante 15 min a 15°C.
2.3. Resuspender el cultivo en un volumen mínimo de BG11 (unas 10 veces
menos que el volumen inicial).
2.4. Medir la DO750nm del pellet (es necesario diluir antes de medir). Si no se
alcanza al menos una DO de 16, volver a centrifugar más cultivo de
cianobacteria para incrementar biomasa.
2.5. Preparar las diluciones necesarias para la conjugación. Cada dilución se
prepara en un Eppendorf estéril diferente. Preparar DO750 16, 8, 0’8, 0’08,
0’008 preparadas en medio BG11. Si no se quieren hacer tantas pruebas,
con tener diluciones a partir de 0’8 podría ser suficiente.
Protocolo empleado con Anabaena sp.
2.1. Medir la DO750nm del cultivo (opcional, no es necesario que esté a una DO
concreta).
2.2. Revisar al microscopio la longitud de los filamentos
2.3. Sonicar en ciclos de 30 segundos en el baño (30 segundos en hielo y
reduciendo la luz sobre el matraz).
2.4. Tras considerar filamentos cortos adecuados para la conjugación, dejar 4
horas en estático con luz reducida.
2.5. Centrifugar a 5000 rpm durante 15 min a 15ºC.
2.6. Resuspender en el mismo volumen de BG11.
2.7. Centrifugar a 5000 rpm durante 15 min a 15ºC.
2.8. Resuspender el cultivo en un volumen mínimo (10 veces menos).
2.9. Medir la DO750nm del pellet (es necesario diluir antes de medir). Si no se
alcanza al menos una DO de 16, volver a centrifugar más cultivo de
cianobacteria para incrementar la biomasa.
2.10. Preparar las diluciones necesarias para la conjugación. Cada dilución se
prepara en un Eppendorf estéril diferente. Preparar DO750nm 16, 8, 0’8,
0’08, 0’008 preparadas en medio BG11. Si no se quieren hacer tantas
pruebas, con tener diluciones a partir de 0’8 podría ser suficiente.
3. Conjugación triparental (Figura 3)
Todo este proceso se debe hacer en una campana de esterilidad.
3.1. Poner la membrana, previamente esterilizada p.e en un vaso, sobre el
medio BG11 agar con 5% LB (v/v) en placa. Dejar que la membrana esté
totalmente empapada y pegada al medio. Revisar que no queden
burbujas de aire entre el medio y la membrana.
3.2. En una placa estéril vacía depositar 10 µL de la mezcla de E. coli
(preparadas en la parte uno del protocolo) y 10 µL de la cianobacteria por
cada dilución (preparadas en la parte dos del protocolo).
3.3. Mezclar despacio con pipeteo suave.
3.4. Coger 10 µL y depositarlos en forma de gotas (spots) en la membrana.
33
3.5. Colocar la placa en la incubadora a 30°C con 100 μmol foton • m-2 • s-1 de
luz blanca continua.
3.6. A las 24/48 horas se cambia el filtro por medio del uso de pinzas estériles
a una placa de BG11 con antibióticos.
3.7. Para Synechocystis sp. PCC 6803, Choroococcidiopsis sp. y Anabaena sp.
PCC 7120 se debe esperar 48 horas antes de pasarlas a la placa de BG11
con antibióticos, mientras que para Synechococcus elongatus PCC 7942
bastan 24horas.
3.8. Usar pinzas estériles. Si se desean mezclar plásmidos con distintas
resistencias, cortar la membrana con tijeras estériles.
3.9. Dependiendo del éxito de la conjugación, se tarda más de 1 semana en
ver transformantes.
3.10. Cambiar cada 7-10 días el filtro a una nueva placa con antibióticos.
Figura 3. Esquema del proceso de conjugación.
RESULTADOS
pSL2773 (Figura 4) es un plásmido que permite la edición genética de cianobacterias
[6]. Como ejemplo representativo de la conjugación triple, se va a proceder a la
conjugación de la cepa modelo de Synechocystis sp. PCC 6803 (donado por el Dr. Luis
López-Maury del IBVF-CSIC, Sevilla, España) con el plásmido pSL2773 (obtenido en el
laboratorio a partir del vector pSL2680 procedente de Himadri Pakrasi (Addgene
plasmid # 85581; http://n2t.net/addgene:85581; RRID:Addgene_85581). Synechocystis
6803 se cultivó en medio BG11 a pH 7.5 y 10 mM de Hepes a 30°C y a 100 μmol
fotones • m-2 • s-1 de luz blanca.
Cianobacteria
Cepa cargo
E. coli HB101 + cargo Cepa conjugativa
E. coli HB101 + pRK2013 (Km
R
)
E. coli HB101 + cargo + pRK2013
Cianobacteria + cargo
34
Figura 4. Esquema del plásmido pSL2773.
El proceso de conjugación se llevó a cabo como ya se ha detallado anteriormente. La
cepa de E. coli HB101 que porta al plásmido conjugativo pRK2013 se utilizó como cepa
conjugativa; por otra parte, la cepa HB101 que porta al plásmido pSL2773 se utilizó
como cepa cargo. Se dejaron crecer O/N y se mezclaron la cepa cargo y la conjugativa
en una proporción 2:1.5 respectivamente. Después de los lavados de la mezcla, se
resuspendió el pellet en un volumen pequeño (unas 16 veces más reducido que el
volumen inicial de cultivo, de 2 mL a 120 µL de LB sin antibióticos) y se dejó reposar
una hora a 37°C.
Por otra parte, cuando la cianobacteria ha alcanzado una densidad de crecimiento
visible (en torno a una DO750nm de 1-3), se preparó una serie de diluciones para la
conjugación, desde 14 (DO tras centrifugar y concentrar el cultivo) hasta 0’008 en
medio BG11 estéril. Seguidamente, se mezclaron 10 µL de la mezcla de E. coli y otros
10 µL de la cianobacteria, y 10 µL de la mezcla se depositaron en la membrana de
conjugación previamente colocada en el medio de las placas de BG11 con 5% LB y sin
antibióticos. Las membranas con los spots se dejaron 48 horas incubando a 30°C bajo
una luz continua de 100 μmol fotones • m-2 • s-1. Seguidamente, se transfirió la
membrana a una placa de BG11 agar suplementada con 50 μg/mL de kanamicina. Las
colonias aparecieron tras unos 8 días de incubación (Figura 5 A).
La comprobación del proceso de conjugación se realiza mediante una PCR (Figura 5 B)
para lo cual se usaron los oligos AL034 (5’-GGTAGCGTTGCCAATGATGT) y AL035
(GGCAAGATCCTGGTATCGGT).
35
Figura 5. Resultados de la conjugación triparental de Synechocystis con el plásmido
pSL2773. A. Colonias obtenidas tras la conjugación triparental. Se testaron diferentes
densidades ópticas a 750nm en BG11 agar con Kanamicina a 50 μg/mL. B.
Confirmación por PCR de transformantes con el plásmido pSL2773. La detección del
vector se realizó con los Oligos AL034 y AL035 que amplifican la resistencia a
kanamicina. Muestras C+: control positivo (plásmido); T: DNA de un clon positivo; WT:
cianobacteria sin transformar; C-: control negativo de PCR (sin DNA).
Tabla 1. Plásmidos y E. coli de interés para la conjugación.
Antibiótico
Cepa
Plásmido
Interés
KmR
E. coli HB101
pRK2013
Contiene los genes tra permitiendo la
transferencia de plásmidos mediante conjugación.
supE44, Δ(mcrC-mrr), recA13, ara-
14, proA2,
lacY1, galK2, rpsL20, xyl-5, mtl-1, leuB6, thi-1
KmR
E. coli HB101
pSL2773
Cepa HB101 de E. coli con el plásmido pSL2773.
AGRADECIMIENTOS:
Agradecemos a la red iberoamericana Cyted Renuwal, al Proyecto ALGATEC-CM
(P2018/BAA-4532) cofinanciado por los Fondos Sociales europeos y al Proyecto SETH
(RTI2018-RTI2018-094399-A-I00). S.B. ha participado con una beca predoctoral de la
UCM, “Universidad Complutense de Madrid”.
CONFLICTO DE INTERESES:
Los autores declaran no tener conflicto de intereses
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28000776; PMCID: PMC5175191.
37
Determinación de fosfato disuelto e intracelular en cultivos de
la diatomea marina Halamphora coffeaeformis orientados a la
producción de lípidos neutros para biodiesel
Ana M. Martínez1, Lucas A. Martín2,3, Cecilia A. Damiani2,3, Paolo M. Díaz Godoy2,
Patricia I. Leonardi2,3, Cecilia A. Popovich2,3,4*
1Departamento de Química - Instituto de Química del Sur (UNS-CONICET). Universidad
Nacional del Sur. Alem 1253. B 8000, Bahía Blanca, Argentina.
2Laboratorio de Estudios Básicos y Biotecnológicos en Algas (LEBBA). Centro de
Recursos Naturales Renovables de la Zona Semiárida (CERZOS) CONICET-UNS, Camino
La Carrindanga, Km
3Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia. UNS, San Juan 670, B 8000, Bahía
Blanca, Argentina.
4Centro de Emprendedorismo y Desarrollo Territorial Sostenible (CEDETS) Comisión de
Investigaciones Científicas de la Provincia de Bs. As (CIC-UPSO) Ciudad de Cali 320,
B8000, Bahía Blanca, Argentina.
Correspondencia: bmpopovi@criba.edu.ar (Cecilia A. Popovich)
RESUMEN
Este protocolo describe el procedimiento para determinar el contenido intracelular de
fosfato en una diatomea marina y fosfato disuelto en el medio de cultivo.
El tratamiento de aguas residuales es una necesidad emergente ante el aumento de la
población humana y la actividad industrial. Un problema para resolver en los actuales
sistemas de tratamiento es la captación de nitrógeno y fósforo. Algunas especies de
diatomeas acumulan altas concentraciones de nutrientes intracelularmente. La rápida
incorporación de fosfato y su almacenamiento en vacuolas resulta en una potencial
aplicación del cultivo en medios de aguas residuales, como biotratamiento terciario. En
este trabajo, el cultivo de la diatomea marina Halamphora coffeaeformis está
orientado a promover la acumulación de lípidos neutros para la obtención de
biodiesel, sin embargo, el procedimiento analítico descripto para el seguimiento de la
concentración de fosfato es aplicable a otros fines del cultivo. Determinar la
concentración intracelular presenta varios puntos críticos. Se propone la estimación
experimental de la concentración de fósforo, de la concentración microalgal y del
biovolumen. Se obtuvieron resultados satisfactorios y adecuados para la comparación
entre las distintas fases del cultivo.
INTRODUCCION
El aumento de la población humana y de la actividad industrial genera cada vez más
cantidad de efluentes residuales que necesitan ser tratados. Por otro lado, la escasez
de los recursos hídricos incentiva la necesidad de recuperar las aguas residuales para
distintos usos. La eliminación de la materia orgánica es uno de los aspectos más
controlados en el proceso de depuración. No ocurre lo mismo con la eliminación del
nitrógeno (N), fósforo (P) y otras sales disueltas que involucra metodologías más
complejas. Las aguas residuales con altas concentraciones de N y P son una causa
38
importante de eutrofización en los cuerpos de agua naturales donde son vertidas, y
representan un recurso inadecuado para su reutilización. En general, los tratamientos
terciarios convencionales eliminan estos nutrientes, pero a expensas de un alto
consumo de energía y baja eficiencia, a lo que debe sumarse la pérdida de estos
elementos para el sistema productivo comercial. En contraposición, la utilización de
microalgas se presenta como un bio-tratamiento terciario alternativo de gran interés a
nivel mundial [1,2] debido a su alta eficiencia de remoción de nitrógeno y fósforo
(entre un 80% y 100%). Además, estos microorganismos tienen la capacidad de
transformar estos nutrientes en biomasa con potenciales aplicaciones industriales. En
particular, algunas especies de diatomeas sometidas a altas concentraciones de
nutrientes tienen la capacidad de acumular nitrato, fosfato y silicatos en vacuolas
como una forma de reserva [3]. Muchas especies también pueden sintetizar lípidos,
péptidos, aminoácidos, pigmentos antioxidantes y fitoesteroles [4]. Así, la biomasa
producida a partir de efluentes residuales y bajo un concepto de biorrefinería puede
representar una fuente de materia prima de interés para industrias de biofertilizantes,
biocombustibles y alimento para animales, entre otros. Además, la depuración de los
efluentes representa una ventaja ambiental y económica al permitir la reutilización del
agua para otros fines comerciales de una manera sustentable.
En particular, en el presente trabajo se describe el protocolo de determinación de
fosfatos disuelto e intracelular de la diatomea Halamphora coffeaeformis cultivada en
agua de mar con fines bioenergéticos. Esta metodología puede ser de utilidad en
cultivos de diatomeas en aguas residuales con altas concentraciones de fosfatos, para
evaluar tanto la remoción del fosfato disuelto como también para analizar el
almacenamiento del fosfato intracelular.
PROTOCOLO
DETERMINACION DE FOSFATO
La estimación de la concentración de fosfato se realiza según Murphy y Riley [5], sobre
alícuotas previamente filtradas por filtros de fibra de vidrio de 0,7 μm de poro (GF/F).
El método empleado se basa en reacciones específicas para el ión ortofosfato, que
reacciona en medio ácido con el molibdato de amonio y el tartrato de antimonil
potasio para formar ácido fosfomolíbdico. Este heteropoliácido es reducido por ácido
ascórbico a azul de molibdeno, detectado a λ=885 nm en un espectrofotómetro UV-Vis
Agilent Cary 60 empleando celdas de 1 cm. El segmento de calibración empleado es de
0,3 – 10 µM.
1. Preparación del material
1.1 Preparar una disolución de ácido clorhídrico (HCl) al 10% agregando 100 mL de
HCl al 32-36% a 900 mL de agua ultrapura para lograr un volumen final de 1 L.
Guarde en recipiente de polietileno de alta densidad (HDPE). PRECAUCIÓN:
disponga de los elementos de seguridad personal para manipulación de corrosivos.
Evite que los vapores se liberen en el área de trabajo. Adicione lentamente el ácido
al agua para evitar salpicaduras y aumento de la temperatura.
1.2 Lave todo el material a emplear en el laboratorio y en el muestreo con
detergente libre de fosfato, enjuague con abundante agua y deje en remojo en HCl
10% durante 2 horas. Enjuague con agua ultrapura y mantenga el material
reservado. Asegúrese que no queden restos ácidos en el material. PRECAUCIÓN:
39
disponga de los elementos de seguridad personal para corrosivos. Use guantes y
evite las salpicaduras en la piel, use protección de ojos y rostro.
1.3 Coloque los filtros de fibra de vidrio en sobres de papel aluminio individuales y
coloque en la mufla los sobres abiertos. Combustione a 450°C durante 4 horas.
Cierre los sobres para almacenar en lugar seco hasta su uso.
1.4 Emplee pinzas y guantes libres de polvo para manipular los filtros y el material.
1.5 Disponga de agua de mar artificial. Ajuste la salinidad a la salinidad del cultivo
en caso de ser necesario.
2. Toma de muestras y filtrado
2.1. Defina si empleará muestra única, duplicados o más y tome muestras
independientes y representativas en los frascos de muestreo.
2.2. Traslade los frascos con las muestras cerrados, al abrigo de la luz y en lugar
fresco hasta el laboratorio.
2.3. Coloque un filtro de fibra de vidrio de 0,7 µm de tamaño de poro previamente
acondicionado en el portafiltro y enjuague con agua de mar artificial.
2.4. Coloque un tubo para colectar el filtrado o cambie el kitasato por uno limpio.
2.5. Filtre, a presión reducida (1/8 atm), un volumen exactamente medido de la
alícuota de muestra. En general 10,00 mL puede ser suficiente, dependiendo de la
densidad del cultivo. Descarte como lavado los primeros mL del filtrado colectados
en el tubo.
2.6. Retire el tubo con el filtrado y reserve para la cuantificación de fosfato en el
medio de cultivo. Guarde a -20 °C hasta su análisis.
2.7. Enjuague el filtro con el material retenido antes de retirarlo del portafiltro,
haciendo pasar 3 fracciones de 3 a 5 mL de agua de mar artificial para eliminar
restos de medio de cultivo.
2.8. Retire el filtro y colóquelo en el tubo para la extracción de fosfato intracelular.
2.9. En este punto, puede almacenar a -20 °C hasta continuar el procedimiento de
extracción.
3. Extraccion de fosfato intracelular
3.1. Adicione 5 mL de agua ultrapura al tubo de extracción conteniendo el filtro con el
material microalgal. Incorpore un “blanco” a partir de este punto, colocando un
filtro limpio del lote que está empleando en un tubo e incorpore al procedimiento.
3.2. Realice el procedimiento de disrupción celular con una sonda ultrasónica en el
tubo de extracción. PRECAUCIÓN: emplee la protección auditiva en este
procedimiento.
3.3. Someta a 70°C durante 3 minutos como tratamiento adicional de disrupción y
liberación del contenido intracelular.
3.4. Filtre a través de un filtro de fibra de vidrio de 0,7 µm (previamente acondicionado
según el punto 1.3) recolectando el filtrado en tubos limpios. Enjuague el filtro
haciendo pasar 2 porciones de 2 mL de agua de mar artificial colectando el lavado
en el mismo tubo. Deje enfriar.
3.5. En este punto se puede interrumpir el procedimiento y conservar a -20 °C hasta su
cuantificación.
40
3.6. Lleve a volumen de 10,00 mL con agua de mar artificial empleando material
volumétrico.
4. Cuantificación de ortofosfato
4.1. Reactivos (grado reactivo analítico)
PRECAUCIÓN: Use guantes, ropa y equipo de protección para los ojos y la cara.
4.1.1. Ácido sulfúrico (H2SO4) 5N: en una botella de vidrio agregue 50 mL de agua
ultrapura, luego mientras agita continuamente agregue lentamente 7 mL de H2SO4
concentrado (δ=1.84 g.mL-1 a 25 °C). Se puede almacenar indefinidamente.
PRECAUCIÓN: evite el contacto con piel y ojos, produce lesiones muy graves. Evite
liberar vapores al lugar de trabajo.
4.1.2. Tartrato de Antimonio y Potasio K(SbO)C4H4O6.½H2O: disolver 0,136 g de
K(SbO)C4H4O6. ½H2O (M=334 g.mol-1) en agua ultrapura y llevar a 50 mL. Puede
almacenarse refrigerado en botella de vidrio o plástica hasta 2 meses.
PRECAUCIÓN: Evitar respirar el polvo/ el humo/ el gas/ la niebla/ los vapores/ el
aerosol. Evite dispersar en el ambiente de trabajo.
4.1.3. Molibdato de Amonio (NH4)6Mo7O24.4H2O: en una botella de polietileno de
alta densidad (HDPE) disolver 1,5 g de (NH4)6Mo7O24.4H2O (M = 1236 g mol–1) en
agua ultrapura y llevar a 50 mL. Se puede almacenar varias semanas a temperatura
ambiente en oscuridad; se debe reemplazar si aparece precipitado.
4.1.4. Ácido Ascórbico (C6H8O6): disolver 1,35 g de C6H8O6 (M = 176 g mol–1) en 25
mL de agua ultrapura. Preparar diariamente o mantener a -20 °C en recipiente
plástico.
4.1.5. Disponga de solución estándar de fosfato: 1000 mg en 1000 mL (± 0,4 %)
4.1.6. Solución de trabajo: diluya el estándar (1:200) tomando 150 µL y llevando a
25,00 mL en un matraz aforado clase A.
4.1.7. Reactivo Color: a 5 mL de H2SO4 5N agregue 1 mL de tartrato de antimonio y
potasio, 2 mL de molibdato de amonio y 2 mL de ácido ascórbico. Es suficiente para
20 muestras. Descarte después de usar, no se conserva.
4.2 Calibración y registo de señales
4.2.1. Encienda el espectrofotómetro para estabilizar y seleccione 885 nm como
longitud de onda.
4.2.2. Prepare la curva de calibrado con testigos entre 0,3 µM y 8 µM de PO43-
llevando por ejemplo 60 uL, 200 uL, 400 uL, 600 uL, 800 uL y 1000 uL de la solución
de trabajo a un volumen final de 10,00 mL con agua de mar artificial.
4.2.3. Coloque 5,00 mL de cada muestra y blanco de procedimiento en tubos
limpios y etiquetados.
4.2.4. Adicione a los testigos, muestras y blancos 500 µL de Reactivo Color, tape y
agite.
4.2.5. Espere el desarrollo de color a temperatura ambiente (<30°C) [6].
4.2.6. Realice la lectura de la Absorbancia entre los 15 min. y las 2 h.
4.2.7. Ajuste mediante regresión lineal y evalúe la calibración.
PRECAUCIÓN: disponga los residuos adecuadamente. El tartrato de antimonio y
potasio es tóxico para los organismos acuáticos, con efectos nocivos duraderos.
41
5. Concentración celular y biovolumen
5.1. Agite suavemente la muestra para extraer 1 mL de cultivo y colocar en la cámara
de Sedgwick-Rafter.
5.2. Cuente N campos y estime el número de células por mL.
5.3. Agite suavemente la muestra para extraer 2 mL de cultivo.
5.4. Halamphora coffeaeformis presenta frústulos elíptico-lanceolados con ápices
truncados. A partir de esta forma y de acuerdo con [7] estime el biovolumen en µm3
6. Estimación del contenido intracelular
6.1. Calcular el contenido de PO43- intracelular (C1± S1) en mM como sigue:
C1 ± S1 = P1 ± DE P1*(1/ N1 ± DE N1)* (1/ B1 ± DE B1)
C1 = P1 *(1/ N1)* (1/ B1)
C1: VALOR MEDIO DE LA CONCENTRACIÓN INTRACELULAR
S1: INCERTIDUMBRE DEL VALOR DE CONCENTRACIÓN INTRACELULAR
P1 ± DE P1: concentración de fosfato (µmol mL-1) ± desviación estandar
N1 ± DE N1: concentración celular (Numero de células.mL-1) ± desviación estandar
B1 ± DE B1: biovolumen (mL) ± desviación estandar
Si se tomaran dos o más muestras independientes en el punto 1, se expresaría como C
± ES donde C es el valor promedio de las concentraciones de las réplicas C1, C2… Cn y la
incertidumbre sería el error estándar de del valor medio expresado como ES= S/
con n: número de muestras independientes.
7. INCERTIDUMBRE Y ESTIMACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN EN EL MEDIO DE CULTIVO
De la curva de calibrado se obtiene la concentración por duplicado CD1 y CD2
expresándose el resultado como la media ± el desvío estándar.
RESULTADOS
La Figura 1 presenta el proceso completo, incluyendo el muestreo y se indican las
principales fuentes de incertidumbre en el procedimiento. Los componentes son
agrupados en tres: a) estimación de la concentración de fósforo (P), b) estimación de la
concentración microalgal (N) y c) estimación del biovolumen (B), las cuales son
valoradas experimentalmente como la dispersión de medidas repetidas, expresándose
como una desviación estándar según Ramsey et al. [8].
42
Figura 1. Representación esquemática general del protocolo, marcando las principales
fuentes de incertidumbre. (1) Incertidumbre debida a la heterogeneidad del cultivo. (2)
Incertidumbre sobre la retención de las células sin perder contenido intracelular. (3)
Incertidumbre en la eficiencia en la disrupción celular. (4) Incertidumbre en el proceso
de calibración. (5) Incertidumbre en la distribución al azar de las células en la cámara
de recuento. (6) Incertidumbre en la medición micrométrica de las dimensiones
celulares.
La Figura 2 muestra la variación de la densidad celular (células.mL-1) y la biomasa (peso
seco libre de cenizas, PSLC, g.L-1) de H. coffeaeformis creciendo en pileta tipo raceway.
Las células presentaron una fase lag corta, seguida de una fase de crecimiento
exponencial de seis días, durante la cual los valores de PSLC aumentaron casi tres
veces. La fase de crecimiento estacionaria ocurrió entre los días 10 y 22 y se
caracterizó por valores relativamente estables de PSLC y densidad celular. Desde el día
22 en adelante, los valores de biomasa mostraron una tendencia decreciente, lo que
indica una fase de declinación del crecimiento.
La Figura 3 muestra la variación del fosfato disuelto e intracelular en el cultivo de H.
coffeaeformis, a partir del cual se puede evaluar el efecto del estado nutricional celular
sobre la acumulación de lípidos. Se indica el fosfato disuelto limitante para el
crecimiento de diatomeas, de acuerdo con Sarthou et al. [9]. El P disuelto disminuyó
exponencialmente y alcanzó sus valores límite en los primeros días de cultivo (P <8,9
μM en el día 7), con una tasa de remoción de 3,62 µM.día-1. En cultivos discontinuos
de diatomeas, la acumulación de lípidos neutros (triacilglicéridos: TAG) en respuesta a
la limitación de P es variable [10].
43
Figura 2. Variación de la densidad celular y la biomasa de un cultivo de H.
coffeaeformis en pileta tipo raceway. DC: densidad celular; PSLC: peso seco libre de
cenizas.
Esto puede deberse a que las diatomeas tienen la capacidad de absorber fosfato
cuando sus concentraciones en el medio son elevadas y almacenarlo en grandes
depósitos intracelulares que generan una reserva adicional [10, 11]. En el presente
estudio, cabe destacar que, aunque el P disuelto alcanzó valores límite rápidamente
(Figura 3), la concentración de lípidos neutros alcanzó su punto máximo en el día 32
(Figura 4). Además, la reserva de fosfato al comienzo del cultivo fue 8,71 mM P, más
de 200 veces mayor que el fosfato disuelto (Figura. 2). Esta reserva de P se utilizó a lo
largo de todo el cultivo y alcanzó valores mínimos durante la fase de declinación del
crecimiento, cuando la acumulación de TAG fue máxima. Por lo tanto, en esta especie
ambas fuentes de P (disuelto más interno) tuvieron que agotarse para inducir la
máxima acumulación de lípidos neutros. Por lo tanto, la acumulación de fosfato en H.
coffeaeformis puede explicar el retraso observado en la acumulación de TAG, que
alcanzó un valor máximo el día 32. Además, esta reserva interna de P podría ayudar a
comprender el efecto variable del P disuelto sobre la acumulación de TAG en las
diatomeas.
Figura 3. Cinética del fosfato disuelto e intracelular en un cultivo de H. coffeaeformis
en pileta tipo raceway (modificado de [3].
44
La Figura 4 muestra la cinética de acumulación de lípidos en el cultivo de H.
coffeaeformis. En la fase de crecimiento estacionario (días 10 a 22), el contenido de
lípidos totales osciló entre el 10 y el 17% (PSLC), con un valor máximo de lípidos
neutros de 9,89% (PSLC). El contenido de lípidos totales aumentó en la fase de
declinación de crecimiento hasta 33,41% (PSLC) debido a un aumento de los lípidos
neutros, los cuales alcanzaron un 29,15% (PSLC) o un 87% con respecto a los lípidos
totales. En las fotomicrografías se puede apreciar el aumento en el tamaño de las
gotas lipídicas, las cuales en el día 32 de cultivo ocupan una gran parte del citoplasma
de la célula (Figura 4).
Figura 4. Variación de la cantidad y composición de lípidos en Halamphora
coffeaeformis (modificado de [3]).
DISCUSION
**El protocolo descrito representa una herramienta confiable para medir la cinética
del fosfato disuelto e intracelular en diatomeas.
**Cuando la especie microalgal es cultivada en aguas residuales, la cinética del P
disuelto es clave para evaluar la capacidad de la especie de biorremediar las aguas
residuales, dado que la metodología permite determinar rangos de P desde 0,3 µM.
Por su parte, la cinética de P intracelular es una herramienta muy útil para evaluar la
capacidad de la especie de almacenar P. Esta última información es relevante para
evaluar el uso de la biomasa como biofertilizante fosfatado.
**En biorrefinerías microalgales destinadas a bioenergía, como es el caso de los
45
resultados mostrados en este trabajo, el protocolo descripto es adecuado para poder
definir el estado nutricional de la especie estudiada y por ende para estimar el tiempo
de acumulación de los lípidos neutros aptos para biodiesel. Dicha información permite
tomar decisiones en relación con el tiempo de cosecha de la biomasa. El uso de la
deprivación de los nutrientes disueltos como un indicador de estrés en diatomeas no
es una herramienta confiable, debido a la capacidad que tienen algunas especies de
acumular altas concentraciones de nutrientes intracelulares.
AGRADECIMIENTOS:
Los autores agradecen a la Comisión de Investigaciones Científicas de la Provincia de
Buenos Aires (CIC) (Resolución N° 801/18), a la Agencia Nacional de Promoción
Científica y Tecnológica (PICT 2019-00348), al Consejo Nacional de Investigaciones
Científicas y Técnicas de la República Argentina (CONICET, PIP 11220200100696CO) y a
la Universidad Nacional del Sur (UNS) (PGI 24/B246 y 24/Q105) por la financiación
otorgada para la realización de este estudio. CAP es investigadora de la CIC. LAM y PIL
son investigadores CONICET.
CONFLICTO DE INTERESES:
Los autores declaran no tener conflicto de intereses
REFERENCIAS
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Treatment and Value Recovery. In: Leal Filho W, Surroop D (eds.). The Nexus: Energy,
Environment and Climate Change. Green Energy and Technology. Springer, Cham. 289-
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CITAC/Nordtest/AMC Guide: Measurement uncertainty arising from sampling: a guide
46
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Available from http://www.eurachem.org
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future, Trends in Biotechnology 32, 117-124.
[11] Griffiths MJ, Harrison ST (2009). Lipid productivity as a key characteristic for choosing
algal species for biodiesel production. Journal of Applied Phycology 21, 493-507.
MATERIALES
Materia l o Equipo Casa comercial Referencia Descripción
Agua MilliQ
Millipore, Billerica, MA Resistividad de ~ 18,5 MΩ y ausencia de impurezas con actividad superficial
HCl
ACS CAS: 7647-01-0 32-36%
detergente libre de fosfatos
Biopak NC 3402.20.90 diluido según indicaciones del fabricante
Balanza
OHAUS Cor p. USA PA 214 Legibilidad 0,0001 g
Espectrofotómetro UV–Vis Agilent Cary 60
celdas de lectura de cuarzo o vidrio de 1cm de paso optico
Mufla hasta 800°C
Disruptor celular ultrasó nico OMNI con tip o OR-T-156 (250 ul-10 m L), potencia límite: 50%
bomba de vacio Milipore con regulador para filtrado a baja presion
portafiltro d e virio de 25mm milipore adaptado para agregar tubo de recoleccion de filtrado
kitasa to Gassco de vidrio
termoreactor HACH temperatura regulada a 70°C
filtros de fib ra de vidrio Munktell 0.7 µm de tamaño de poro
Vortex VELP Scientifica
Papel alumin io
Matraces volumetricos de 5,
Gassco Clase A
Pipeta automática de 100-
Eppendorf
Pipeta auto mática de 40 - 200
Eppendorf
puntas para micropipetas
Microscopio campo claro Leica
Cámara de recuento
tubos de vidrio calidad optica
HACH
Acido Sulfur ico Biopa ck CAS: 7664-93-9
Heptamolibdato de amonio
Merck CAS: 12054-85-2
Tartr ato de antimonio y
Sigma-Aldrich CAS:28300-74-5
L-Acido Ascorbico Sigma-Aldrich CAS: 50-81-7
Freezer -20°C
Standard de fosfato M erck 119898 trazable a SRM de NIST KH₂PO₄ en H₂O 1000 mg/l PO₄ Certipur®
agua de mar artificial
conservadora de frio portátil
47
Identificación y cuantificación de clorofila a y fucoxantina en
cultivos de la diatomea marina Halamphora coffeaeformis,
aislada del estuario de Bahía Blanca (Pcia. de Buenos Aires,
Argentina).
M. Alejandra Sequeira1, M. Belén Faraoni1*, Ana M. Martínez1, M. Cecilia
Damiani2, Patricia Leonardi2, Cecilia A. Popovich2,3*
1Instituto de Química del Sur (INQUISUR). Universidad Nacional del Sur (UNS). B 8000,
Bahía Blanca, Argentina.
2Laboratorio de Estudios Básicos y Biotecnológicos en Algas (LEBBA). Centro de
Recursos Naturales Renovables de la Zona Semiárida (CERZOS) CONICET-UNS, Camino
La Carrindanga, Km 7. Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia (UNS), San
Juan 670, B 8000, Bahía Blanca, Argentina.
3Centro de Emprendedorismo y Desarrollo Territorial Sostenible (CEDETS) Comisión de
Investigaciones Científicas de la Provincia de Bs. As (CIC-UPSO) Ciudad de Cali 320,
B8000, Bahía Blanca, Argentina.
Correspondencia: bmpopovi@criba.edu.ar (Cecilia A. Popovich);
bfaraoni@criba.edu.ar (María Belén Faraoni)
RESUMEN
El presente protocolo describe la técnica de extracción optimizada de pigmentos
provenientes de la biomasa de la diatomea marina Halamphora coffeaeformis, aislada
del estuario de Bahía Blanca (Argentina) y cultivada en piletas tipo raceways. En
particular, se describe la identificación y cuantificación de fucoxantina y clorofila a
utilizando Cromatografía Líquida de Alta Performance en fase reversa y Espectroscopía
UV-Vis.
Las diatomeas (Clase Bacillaripophyceae), son microalgas unicelulares que contribuyen
a un 25% de la productividad primaria anual terrestre y a un 40% de la productividad
primaria total de los océanos, convirtiéndose así en un grupo de organismos
fotosintéticos relevantes en la captación de CO2 de la atmósfera y en la generación de
biomasa en los ambientes naturales. Además, la capacidad de estas microalgas de
producir varios metabolitos de interés industrial las ha transformado en materias
primas ideales para el desarrollo de distintos tipos de biorrefinerías. En particular,
estudios realizados en la diatomea marina Halamphora coffeaeformis, aislada del
estuario de Bahía Blanca (Argentina) y cultivada en piletas raceways, han demostrado
que esta especie presenta la capacidad de producir cantidades significativas de
fucoxantina (Fx). La Fx es considerada un metabolito de alto valor agregado, con
potencial aplicación en las industrias de nutracéuticos, cosmética, alimentación
humana y animal; así como en la salud. Sin embargo, su disponibilidad se limita
actualmente a fuentes no sustentables como el aceite de pescado y ciertas especies de
algas pardas. Bajo este contexto, en este trabajo se describe el protocolo usado para la
extracción, identificación y cuantificación de clorofila a (Cl a) y Fx de H. coffeaformis,
utilizando Cromatografía Líquida de Alta Performance (HPLC) y Espectroscopía UV-Vis
(UV-VIS). Los tiempos de retención y máximos de absorción, utilizando estándares de
referencia, se emplearon como criterios de identificación de estos pigmentos.
48
INTRODUCCIÓN
Los cultivos microalgales de alcance comercial, en general, están orientados a la
producción de biomasa rica en proteínas con fines nutracéuticos o alimenticios. Sin
embargo, la diversidad de microalgas que existe en nuestro planeta representa un gran
abanico de metabolitos como son los pigmentos (carotenoides y clorofilas), además de
lípidos, hidratos de carbono, vitaminas, minerales, entre otros, con un gran potencial
de mercado [1-3]. En particular, la Fx es una xantofila que presenta una amplia gama
de propiedades bioactivas como antioxidante, anti-cancerígeno, hipoglucemiante, anti-
obesidad, anti-envejecimiento, anti-angiogénico y anti-metastásico en animales; así
también por sus propiedades beneficiosas en el hígado, vasos sanguíneos del cerebro,
huesos, piel y ojos [4]. Por lo cual, representa un metabolito que podría competir en
las industrias nutracéuticas, alimenticias y de la salud. Si bien la síntesis química de
este pigmento es posible, es un proceso muy costoso y por lo tanto su extracción a
nivel industrial se realiza a partir de macroalgas pardas, como por ejemplo, Laminaria
japonica, Eisenia bicyclis y Undaria pinnatifida [5]. Sin embargo, esta producción no es
sustentable debido al bajo contenido de Fx que presentan estas algas y a la cosecha
indiscriminada de las poblaciones naturales. Por otro lado, la Fx es mucho más
abundante en algunas especies de diatomeas. En particular, estudios realizados con
cultivos de la diatomea marina Halamphora coffeaeformis, aislada del estuario de
Bahía Blanca (Argentina), en piletas raceways han demostrado una producción
significativa de Fx [6].
Los carotenos y xantofilas han sido estudiados a partir de la utilización de
Cromatografía Líquida de Alta Performance (HPLC), la cual permite realizar análisis
cuali/cuantitativos con resultados de gran exactitud y sensibilidad [7]. El detector de
UV con arreglo de diodos acoplado al HPLC posibilita la identificación selectiva de cada
pigmento presente en la muestra algal, por medio del barrido del pico, haciendo uso
de las propiedades espectrales de este tipo de compuestos. Asimismo, para
determinar la concentración de los pigmentos de forma rápida, sencilla y confiable,
resulta de gran utilidad la Espectroscopía UV-VIS (UV-Vis) [8], método basado en la
aplicación de las leyes fotométricas, que correlaciona la absorción de luz de un
compuesto a una determinada longitud de onda con la concentración del mismo en
una muestra. Haciendo uso de este método es posible trazar una curva de calibrado
estándar que permita relacionar en forma directamente proporcional la medición de
absorbancia con la concentración del pigmento de interés, para cuantificar su
rendimiento en la biomasa algal por simple medición de su absorción UV-Vis.
Bajo este contexto, en el presente trabajo se detalla la optimización del protocolo de
extracción, así como las metodologías de identificación y cuantificación usadas para la
determinación de Fx y Cl a en diferentes etapas de un cultivo de H. coffeaformis en
piletas de tipo raceways [6]. Se espera que esta metodología represente una
herramienta útil para evaluar la identificación y cuantificación de Fx y Cl a en cultivos
de diatomeas con potenciales aplicaciones industriales.
PROTOCOLO
1. Optimización de la extracción de pigmentos a partir de biomasa seca de H.
coffeaeformis
49
Consideraciones generales
Inicialmente se llevó a cabo la optimización de la técnica de extracción con disolventes
a partir de la biomasa seca de un cutivo de H. coffeaeformis. Las muestras fueron
lavadas con H2O bidestilada, posteriormente liofilizadas y conservadas en freezer a -
80°C.
1.1. Pesar 50mg de biomasa seca.
1.2. Pulverizar en mortero.
1.3. Adicionar 1 mL del medio de cultivo f/2 (20:1 volumen/peso) usado para
el crecimiento de la especie y colocar en tubo de centrifuga de vidrio
envuelto en aluminio.
1.4. Agitar en vortex por 10min, repitiendo 3 veces.
1.5. Determinar la absorbancia en el espectrofotómetro a 750nm (rango de
barrido: 400 a 800nm).
1.6. Utilizar como blanco medio de cultivo f/2.
1.7. Centrifugar a 1000 x g durante 30 min y retirar el sobrenadante con
pipeta Pasteur.
1.8. Agregar 1 mL de etanol absoluto al pellet (20:1 volumen/peso) y
homogenizar en vortex por 3min.
1.9. Colocar en cristalizador en un baño de glicerina controlado a 40 °C
durante 2 h. con agitación magnética y manteniendo en oscuridad.
1.10. Centrifugar a 1000 x g durante 30 min.
1.11. Retirar el extracto obtenido con pipeta Pasteur
1.12. Colocar en frasco caramelo y mantener a -20 °C hasta su análisis
espectroscópico y cromatográfico.
Notas importantes
El presente protocolo nos permitió predecir una cuantificación comparable por
bibliografía [8], de la concentración de fucoxantina en la muestra algal utilizando
Espectroscopía UV-Vis (18,99 mg.L − 1) y HPLC (21,4 mg.L − 1).
2. Extracción, identificación y cuantificación de pigmentos a partir de células en
diferentes etapas de cultivo
Consideraciones generales
Para la determinación de Fx y Cl a en las diferentes fases de crecimiento, se
seleccionaron muestras conteniendo 20 mL de cultivo de H. coffeaeformis en
diferentes etapas de cultivo: 0, 2, 5, 6, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 21 y 22 días. Cada muestra
se filtró utilizando filtros Whatman GF/C (1.2 μm) y se almacenó a -80 °C. Se adaptó el
protocolo optimizado de extracción anteriormente descripto.
2.1. Colocar cada filtro conteniendo las células de H. coffeaeformis en un
frasco caramelo conteniendo un imán.
2.2. Agregar 2 mL de etanol absoluto a cada frasco.
2.3. Agitar en vortex 1 min, repitiendo 3 veces.
50
2.4. Colocar los frascos en cristalizador en un baño de glicerina controlado a
40 °C durante 2 h. con agitación magnética y manteniendo en oscuridad.
2.5. Centrifugar a 1000 x g durante 30 min.
2.6. Retirar cada extracto obtenido con pipeta Pasteur.
2.7. Filtrar utilizando jeringa de 2 mL y un filtro de jeringa de PTFE de 0,2 μm
directamente sobre viales caramelo de inyección automática de HPLC.
2.8. Mantener a -8 °C hasta su análisis cromatográfico.
2.9. Utilice las condiciones de la tabla 1 para el análisis cromatográfico por
HPLC.
Tabla 1 Condiciones para el análisis cromatográfico por HPLC.
Columna AcclaimTM fase inversa 120 - C18
(2,1 mm × 150 mm; 3 μm, Dionex Bonded Silica Products)
Fase Móvil ACN: H2O (83:17)
Tiempo de inyección: 15 min.
Flujo: 0,5 mL.min-1
Temperatura: 25 °C
Detector UV-Vis 445 nm
2.10. Inyectar una disolución madre etanólica del estándar de Fx para
determinar el tiempo de retención (tR) del compuesto.
2.11. Inyectar concentraciones decrecientes obtenidas por dilución de la
disolución madre etanólica del estándard de Fx, para elaborar una curva
de calibrado externa.
2.12. Determinar las absorbancias de cada estándar en el espectrofotómetro
UV-Vis a 449 nm y calcular su concentración usando un valor de
coeficiente de extinción molar (0,1%, 1 cm) de 160 L/g/cm a 449 nm.
2.13. Inyectar los extractos e identificar la Fx del resto de los componentes al
comparar los tR obtenidos con el tR del estándar.
2.14. Obtener la concentración volumétrica de Fx (mg.L-1) en cada extracto a
partir de la curva de calibrado.
2.15. Determinar las absorbancias de cada extracto en el espectrofotómetro
UV-Vis a 663 nm (absorción de Cl a + Fx) sustrayendo el “scattter” al valor
obtenido.
2.16. Determinar las absorbancias a 663 nm de distintas diluciones de la
disolución madre del estándar de Cl a en acetona, y calcular su
concentración usando un valor de coeficiente de extinción molar de Cl a
de 82 L/g/cm.
2.17. Elaborar con los datos obtenidos una curva de calibrado externa Abs663 vs
concentración de Cl a.
2.18. Obtener la concentración de Cl a + Fx en cada extracto a partir de entrar
en la curva de calibrado con los valores de absorbancia a 663 nm, previa
resta del “scatter”.
51
2.19. Obtener la concentración volumétrica de clorofila a (mg.L-1) en cada
extracto por sustracción de los valores de concentración de Fx
previamente calculados para cada extracto.
RESULTADOS
La Fx junto con la Cl a, la clorofila c y una apoproteína constituyen el principal
complejo captador de luz de algas feófitas, haptófitas y diatomeas. Este complejo
transfiere la energía absorbida al centro de reacción que es la Cl a, la cual participa
directamente en la fotosíntesis [9]. La Fx constituye el carotenoide más importante
producido por las diatomeas y ha sido informado como un metabolito con importante
actividad antioxidante [9]. A partir del presente protocolo, se aisló la fracción de
pigmentos enriquecida en carotenoides y clorofilas; se identificó la Fx y Cl a; y se
cuantificó la concentración volumétrica de ambos metabolitos (mg.L-1) en H.
coffeaeformis utilizando HPLC y UV-Vis.
Los picos de Fx en los extractos algales obtenidos por HPLC se asignaron comparando
su tiempo de retención con el del estándar puro. En la Figura 1a se observa el
cromatograma HPLC del estándar de Fx, mostrando un tR de 4,566 min; en la Figura 1b
se observa el cromatograma HPLC de un extracto etanólico mostrando el pico de Fx
con un tR de 4,566 min. La curva de calibrado elaborada a partir de los estándares de Fx
por HPLC es mostrada en la Figura 1c. La determinación de las concentraciones
volumétricas o producción de cada estándar en el rango de 4–100 mg.mL−1 fue
realizada por espectroscopía UV-Vis (Figura 1d).
Siguiendo el protocolo, la concentración volumétrica o producción de Cl a (mg.L-1) en
los mismos extractos crudos de H. coffeaeformis fue cuantificada mediante
espectroscopía UV-Vis. A partir de los datos de producción (mg.L − 1) obtenidos por
HPLC y UV-Vis de ambos metabolitos, se calculó la cinética del rendimiento (mg.g − 1
PS) de Fx y Cl a en los cultivos de H. coffeaeformis, que sigue el perfil mostrado en la
Figura 2.
52
Figura 1. Cuantificación de fucoxatina (Fx). (a) Cromatograma HPLC del estándar de Fx;
(b) Cromatograma HPLC del extracto obtenido en el día 7 de cultivo [6]. (c) Curva de
calibrado obtenida por HPLC. (d) Espectro UV-Vis de los estándares de Fx en el rango
de concentración 4–100 mg.mL−1.
Durante la cinética, se pudo observar que la producción de Cl a y Fx aumentó a lo largo
de la experiencia hasta 15,4 mg.L − 1 y 15,6 mg.L − 1 en el día 22, respectivamente;
mientras que las concentraciones (expresadas en peso seco -PS-) más altas de Cl a (~
26-38 mg.g − 1 PS) y Fx (~ 30-38 mg.g − 1 PS) se encontraron desde el día 13 al día 22,
respectivamente. La producción y el rendimiento de Cl a y Fx mostraron un aumento
significativo entre el día 0 y el día 22 (p <0,05). El aumento simultáneo de Cl a y Fx en
diferentes etapas de cultivo podría estar relacionado con su respuesta fisiológica
similar frente a las condiciones de luz y nutrientes.
El rendimiento de Fx de H. coffeaeformis fue mayor que el reportado para el género
relacionado Amphora sp. (1,21 ± 0,18 mg.g − 1 PS) [10], coincidió favorablemente con el
rendimiento de Fx de Odontella aurita, una diatomea de alto rendimiento (> 20 mg.g −
1 de PS) [9], y fue al menos treinta veces más alto que en las macroalgas pardas (0,87
mg.g− 1 PS), la principal fuente comercial de este pigmento [11].
El contenido de Fx varía según las especies y cepas de la misma especie, y se ve
afectado por múltiples factores relacionados con las condiciones de cultivo [10]. Su
valor de rendimiento máximo, junto al de la Cl a, se correlacionan en sincronía con la
producción máxima de biomasa, resultando muy valiosa la determinación de estas
biomoléculas como índices de la productividad de biomasa en los cultivos de H.
coffeaeformis.
53
Figura 2. Producción (mg.L − 1) y cinética de la producción (mg.g − 1 PS) de Fx y Chl a. Los
datos se expresan como media ± desviación estándar relativa (RSD), n = 3. RSD fue
2,1% según el análisis de HPLC [6].
DISCUSSIÓN
El estudio de metabolitos de alto valor agregado como la Fx, ha desarrollado un gran
interés debido a sus posibles aplicaciones industriales [12]; sin embargo, su
disponibilidad se limita actualmente a fuentes no sustentables. Aunque algunas
especies de diatomeas también son una fuente natural de estos metabolitos, es
necesario avanzar en la reducción de las barreras de costos involucrados en su
producción a gran escala. A tal fin, en el presente trabajo se desarrolló un protocolo
con alta especificidad, sensibilidad y reproducibilidad de trabajo para la identificación y
cuantificación de Fx y Cl a en distintas etapas de cultivo, que posibilita la evaluación
del rendimiento potencial de metabolitos de interés biológico presentes en la
diatomea marina H. coffeaeformis.
El protocolo de extracción fue optimizado en una primera etapa a partir de la
disposición de biomasa liofilizada que permitió obtener la máxima concentración de
pigmentos. Asimismo, el protocolo de identificación y cuantificación de la Fx y la Cl a se
implementó a partir de un exhaustivo análisis de las condiciones de corrida
cromatográficas de HPLC.
La etapa crítica en el protocolo es la realización de todos los procesos de extracción,
identificación y cuantificación en ausencia de luz para evitar la descomposición de los
pigmentos.
El método está limitado respecto al tipo de columna cromatográfica especificada para
realizar la cuantificación por HPLC.
Los resultados obtenidos contribuyen a la promoción del aprovechamiento rentable y
seguro de H. coffeaeformis con fines biotecnológicos innovadores en las áreas de:
nutracéutica, cosmética y acuicultura; considerando además la escasez mundial de
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
02567911 13 15 17 21 22
Contenido de Fx y Cl a
(mg.g-1 PS)
Producción de Fx y Cl a
(mg.L-1)
Días
Contenido Fx
Contenido Cl a
Producción Fx
Producción Cl a
54
agua dulce y materias primas convencionales de alto valor, que justifica la búsqueda
de fuentes alternativas, en particular las de origen marino.
AGRADECIMIENTOS:
Los autores agradecen a la Comisión de Investigaciones Científicas de la Provincia de
Buenos Aires (CIC) (Resolución N° 801/18), a la Agencia Nacional de Promoción
Científica y Tecnológica (PICT 2019-00348), al Consejo Nacional de Investigaciones
Científicas y Técnicas de la República Argentina (CONICET, PIP 11220200100696CO) y a
la Universidad Nacional del Sur (UNS) (PGI 24/B246) por la financiación otorgada para
la realización de este estudio. CAP y MBF son investigadoras de la CIC. PIL es
investigadora del CONICET.
CONFLICTO DE INTERESES:
Los autores declaran no tener conflicto de intereses
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11, 9338-9358. https://doi.org/10.1039/D0FO02176H
MATERIALES
Material o Equipo Casa Comercial Referencia Descripción
Acetona Supelco Grado HPLC
Acetonitrilo Supelco Grado HPLC
Agua MilliQ
Millipore, Billerica, MA Resistividad de ~ 18,5 MΩ y ausencia de impurezas con actividad superficial
Balanza
OHAUS Co rp. USA PA 214 Legib ilidad 0,0001 g
Centrífuga
GELEC GL 40 N° 4205 CA 0,9 A 3500 rpm
Cristalizador
PYREX
Cromatógrafo HPLC LS-MS Thermo Scientific UltiMate 3000 –MSQ PLUS Con detector UV- Vis de longitud de onda fija: 445nm.
Espectrofotómetro UV–Vis Agilent Cary 60
Estándar de clorofila a SigmaAldrich, St. Louis, MO, USA La clorofila a fue purificada y disuelto en acetona grado HPLC
Estándar analítico de fucoxantina Supelco USA
Etanol absoluto 100% Supelco Grado HPL C
Filtro de PTFE 2,0 µm
Frasco caramelo
Glicerina
Imán
Jeringa RYMCO 2,0 mL
Medio de cultivo f/2 Usado para el crecimiento de la especie
Mortero
Pipetas Pasteur Normax 230 mm
Papel aluminio
Placa de calefacción y agitación ma
IKA IKA RET Basic Control de temperatura y agitación
Termómetro L uft Germany
Tubos de centrífuga I.V.A.
Vortex VELP Scientifica
56
Analysis of microalgae lipids from adapted Bligh Dyer followed
by derivatization and GC-MS analysis
Gisele Alves1, Maiara Priscilla de Souza1, Liange Reck2, Carlucio Roberto Alves2,
Rosana de Cassia de Souza Schneider1*
1Environmental Technology Postgraduate Program and Center of Excellence in
Oilchemistry and Biotechnology University of Santa Cruz do Sul, Av. Independência
2293, Bloco 53, CEP 96815-900 Rio Grande do Sul, Brazil.
2Northeast Biotechnology Network Postgraduate Program and Natural Sciences
Postgraduate Program (from State University of Ceara), Av. Dr, Silas Munguba, 1.700,
CEP 60.714-903 Fortaleza, Brazil.
Correspondence: Rosana de Cassia de Souza Schneider at rosana@unisc.br
SUMMARY
This protocol allows to determine the content and lipid profile of microalgae biomass
using modified Bligh Dyer method, derivatization, and analysis by GC / MS.
The increasing demand for lipids production in human and animal food, biofuels,
drugs, and cosmetics has intensified the search for alternatives to produce renewable
resources to obtain high lipid yields. Microalgae can be extremely relevant in these
sectors due to the possibility to produce compounds with high added value. However,
the lipid extraction from these microorganisms still requires high costs considering the
high energy demand as well as the environmental impacts from the use of harmful
solvents. Considering these aspects, the aim of this study was to develop a protocol to
disrupt microalgae cell wall using an adapted Bligh and Dyer method followed by
derivatization an GC-MS analysis. In this protocol, the Bligh and Dyer method, which
uses methanol and chloroform as solvents and ultrasound for cell disruption was
adapted. The new method present favorable conditions in terms of time reduction and
solvents. Derivatization and GC-MS analysis present great results for fatty acid profile
determination and could be applied for different types of microalgae.
INTRODUCTION
Microalgae are a promising source of high added lipids, especially for the functional
food ingredients industry due to the amounts of omega-3 polyunsaturated fatty acid
(PUFAs), such as docosahexaenoic acid (DHA), eicosapentanoic acid (EPA) and other
compounds. One of the main advantages is the broad range applicability considering
the possibility to acting as human health metabolites and producing disease
suppressive compounds [1]. The costs associated with oil extraction, biodiesel
processing and the variability of algal biomass production should focus on methods of
the oil-rich algae itself [2].
The lipid extraction from microalgal cell differs from traditional food cultures since
57
microalgae cell wall must be disrupted to release lipids before the extraction.
However, the robust cell wall structure of microalgae can be affected using
conventional mechanical methods, since the lipids dissolution is inhibited [3]. Thus, the
rupture of microalgae cell wall becomes the key step in the extraction and recovery of
lipids. The selection of the appropriate solvents becomes fundamental for the
extraction process, since it compromises the structure of this cell wall ensuring its
rupture and, therefore, the extraction of lipids [4]. Ultrasound treatment alters
microbial cell structures by two main mechanisms: cavitation, followed by the
propagation of shock waves. The latter phenomenon forms jet streams in the
surrounding environment, thus causing cell disruption by high-strength shear forces
[5,6]. In this context, the use of the Bligh and Dyer (1959) method [7] appears as a
suitable alternative, however, some conditions were optimized in order to reduce
environmental impacts and costs.
PROTOCOL
1. Lipids extraction
1.1. To weight 300 mg of microalgae biomass in glass centrifuge tubes and 6 mL of
chloroform (CHCl3) and 3 mL of methanol (MeOH) were added.
1.2. The tubes passed to a cell disruption process by ultrasound, with an ice bath,
for 45 min, remaining subsequently at rest for 4 h on freezer.
1.3. Subsequently, the sonication process for 30 min was repeated, followed by a
centrifugation step at 3600 rpm for 10 minutes.
1.4. The lipid phase was separated into another in glass centrifuge tubes, with
residual biomass and 1 mL of CHCl3 and 2 mL of MeOH.
1.5. The tube containing the residual biomass passed through sonication and
centrifugation processes, respectively, both for 15 min.
1.6. The lipid phase was separated and the previously removed organic phase was
incorporated. To this tube containing the sum of the lipid phases, 4 mL of
ultrapure H2O and 2 mL of CHCl3 were added followed by a centrifugation step
of 10 min.
1.7. After the centrifugation process, the lipid phase was transferred another flask,
which was subsequently dried in an oven at 70 °C until constant weight.
1.8. Afterwards, the lipid fraction was weighed, and the amount of total lipids was
determined in lipid yield % (LY) of dry biomass (oil content) and in milligrams of
lipid per liter of microalgal culture (LC) according to the equations:
= (2 1) × 100
= ( × )
100
TL = total lipids (in% of freeze-dried biomass);
58
TLC = total lipids (in mg L-1 of microalgal culture);
F1 = mass of the empty glass flask (mg);
F2 = mass of the glass flask + total lipids (mg);
m = mass of the lyophilized biomass sample (mg);
FDB = amount of dry (freeze-dried) biomass per liter of microalgal culture (mg
L-1).
2. Derivatization
2.1. To determine fatty acids, 6 mL of methanolic solution with NaOH was added to
a volumetric flask and refluxed for 20 min (saponification).
2.2. Then, 7 mL of a 14% (w/v) boron trifluoride solution in methanol (derivatizing)
was added through the reflux condenser by dripping, then refluxed for 4 min.
2.3. Likewise, 5 mL of heptane was added to the reaction medium, remaining at
reflux for 2 min.
2.4. After reaching room temperature, 2 mL of saturated aqueous NaCl solution was
added.
2.5. Finally, the upper heptane phase was separated and dried with anhydrous
sodium sulfate (before injection).
3. GC-MS analysis
3.1. Chromatographic analyses were performed using the MS system equipped with
GC 2010 gas chromatography and MS-QP 2010 Plus detector.
3.2. The GC–MS system was operated with a 30 m capillary column ZB-WAX
(polyethylene glycol, Phenomenex, USA with an internal diameter of 0.25 mm
and 0.25 µm of thickness.
3.3. The column oven temperature program was 70 °C (4 °C min−1) to 240 °C for 5
min and elevated to 250 °C (35 min). The injector temperature was 250 °C with
an injection volume of 1 μL, and injection mode was split (1:10).
3.4. Transfer line temperature was set at 260 °C; ion source was electron ionization
(EI) at 70 eV and the temperature was set at 270 °C. Helium was used as a
carrier gas with a flow of 1 mL min−1.
3.5. The methyl ester of fatty acids was identified and quantified by comparison
with spectra library and with the reference standard of the Fatty Acid Methyl
Esters (Unsaturated Kit and Saturated Straight Chains Kit; Sigma-Aldrich, USA).
RESULTS
The total lipid content in microalgae can range between 15-77%, and the composition
of this bioproduct can differ considerably with different species. The adapted Bligh and
Dyer method can be a suitable alternative considering the low solvent content and
short extraction time if compared to the traditional method. The derivatization
method can convert the extracts into methyl esters for further GC-MS
chromatographic analysis. Considering the routine analysis of several types of
59
microalgae, the fatty acid profile of microalgae biomass is commonly the palmitic
(C16:0), palmitoleic (C16:1), linoleic (C18:2), linolenic (C18:3) and eicosapentaenoic
(C20:5) acids, as shown in Figure 1 and Table 1 from periphytic sample, rich in
microalgae. The results are obtained in Fatty acids methyl ester (FAME) after
derivatization with BF3/methanol.
Figure 1. Chromatogram of the main fatty acids found in microalgae biomass obtained
by adapted Bligh and Dyer method, derivatized and followed by GC-MS analysis.
Table 1. FAMEs found in microalgae biomass derivatized by GC-MS with the retention
time (min), equation with r2.
Retention time
(min)
Fatty acids
determined
by FAME
Equation r2
21.77
C14:0
y = 1E+07x + 1E+06
0.9908
26.62
C16:0
y = 1E+07x + 2E+06
0.9916
27.09
C16:1
y = 7E+06x + 666418
0.9876
31.06
C18:0
y = 1E+07x + 2E+06
0.9839
31.38
C18:1
y = 1E+07x + 2E+06
0.9861
32.29
C18:2
y = 8E+06x + 795091
0.9870
33.58
C18:3
y = 7E+06x + 739008
0.9800
As shown in Table 1, palmitic acid (C16:0) was the predominant fatty acid in the
periphytic samples. It is important to highlight that other compounds can be separated
by gas chromatography that have not been identified since the lipid fraction extracted
by the Bligh-Dyer method can contains pigments that are in the lipid phase. As an
alternative, if there are too many pigments in microalgae biomass can be purified with
ethanol washing. After fatty acid analysis, it was found that C16:0 represented a
predominance (> 80%) of the detected fatty acids.
If we have biomass with low yields of lipids, some alternatives must be observed, such
60
as the high levels of ash and the ratio between carbon and nitrogen (C/N) since higher
C/N ratios can increase the lipid content [8]. In unfavorable environmental conditions
or stress, many microalgae alter their biosynthetic pathways to form and accumulate
lipids. It is possible to increase lipid productivity by stress conditions such as by
nitrogen inhibition, higher temperatures, changes in pH and high salt concentrations
[9].
DISCUSSION
The protocol for microalgae cell disruption with adapted Bligh and Dyer using
ultrasonic disruption reduced extraction time and solvent volume. The fatty acid
profile was successfully performed for different microalgae.
The use of different ultrasonication equipment should be optimized. As for
derivatization, there are several concentrations of BF3 in methanol on the market, here
we used it with 14%. Likewise, the glassware used can be selected to avoid solvent
evaporation.
In the chromatographic analysis, the lipid profile (%) can be performed in relation to
the total area or the corrected total area. The total corrected area considers the
response factor for each FAME separated in the chromatogram.
ACKNOWLEDGMENTS:
This study was financed in part by the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Nível Superior – Brasil (CAPES) – Finance Code 001. The authors would also like to
thank the University of Santa Cruz do Sul (UNISC), TecnoUNISC, through the Center for
Research in Oleochemical and Biotechnological Processes and Products for MCTIC
(01.0144.00/2010), CNPq (310228/2019-0), Red Iberoamericana para el Tratamiento
de Efluentes con Microalgas (RENUWAL) and Programa Iberoamericano de Ciencia y
Tecnología para el Desarrollo (CYTED).
DISCLOSURES:
Authors have nothing to disclose.
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62
Determinación de carbohidratos totales por fenol-sulfúrico
(DuBois-Gilles-Hamilton)
Enrique Romero Frasca1, Germán Buitrón1*
1Unidad Académica Juriquilla, Instituto de Ingeniería, Universidad Nacional Autónoma
de México, Blvd. Juriquilla 3001, 76230 Querétaro, México
*Correspondencia: gbuitronm@iingen.unam.mx
RESUMEN
Este protocolo describe la cuantificación de azúcares totales en muestras homogéneas
por medio de la formación de complejos fenólicos, de coloración estable, procedentes
de la hidrólisis ácida de polisacáridos y oligosacáridos en monosacáridos y posterior
deshidratación en compuestos furfurales.
El ensayo de colorimetría para la determinación de azúcares totales en muestras
homogéneas por fenol-sulfúrico se basa en una conversión catalítica de todos los
sacáridos de cadena media (oligosacáridos) y de cadena larga (polisacáridos), así como
sus derivados, en subunidades monoméricas por acción de un ácido fuerte
concentrado (por ejemplo, ácido sulfúrico, H2SO4). La exposición prolongada a este
tipo de ácido promueve la pérdida moléculas de agua en los monómeros, en un
proceso conocido como deshidratación, y hace que se produzcan compuestos
furfurales y hexosas a 5-hidroxifurfural. La interacción
del fenol con el 5-hidroxifurfural facilita la formación de complejos químicos de una
coloración amarillo-naranja que absorben la luz en el espectro visible, obteniendo una
máxima absorbancia a una longitud de onda de 490 nm (para hexosas) y 480 nm (para
pentosas y ácidos urónicos). La gran ventaja de este método se basa en los bajos
costos, estabilidad colorimétrica y pronta disponibilidad de los reactivos, así como su
facilidad de procesamiento.
INTRODUCCIÓN
El uso de microalgas como materia prima para el desarrollo de biorrefinerías se ha
estudiado en los últimos años por su alto y variado contenido de macromoléculas
(carbohidratos, lípidos y proteínas) capaces de convertirse en biocombustibles y
bioproductos [1]. A pesar de ello, aún se tienen diversos cuellos de botella en
diferentes escalas que deben ser superados. Uno de estos, es emplear métodos de
cuantificación rápidos, económicos y simples que permitan una caracterización de las
macromoléculas sin comprometer el funcionamiento de los reactores de cultivo.
Los carbohidratos son biomoléculas con una gran importancia en el campo de
investigación relacionado con las ciencias de la vida e industrias derivadas de ello [2,3].
En la literatura se han reportado diferentes métodos analíticos para la determinación
de carbohidratos, basados tanto en espectrofotometría, como en cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC), refractometría, entre otras [4] (Parc et al., 2014).
63
Existe una amplia variedad de métodos colorimétricos basados en espectrofotometría
que emplean reactivos como antrona, fenol, orcinol o resorcinol [2]. El método
colorimétrico para la determinación de la concentración de carbohidratos más
ampliamente utilizado es el desarrollado por DuBois et al. (1956) [5] y conocido como
método de DuBois debido a la facilidad del procedimiento, sensibilidad, rapidez de los
resultados y por ser apropiado para cuantificar diferentes azúcares como
monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos. En síntesis, los carbohidratos presentes
en las muestras, tanto oligosacáridos como polisacáridos, pueden ser determinados
bajo una reacción de degradación (hidrólisis ácida) donde se generan monosacáridos.
La adición de ácidos minerales, como ácido sulfúrico, provoca la deshidratación de los
carbohidratos con la eliminación de tres moles de agua [6,7]. Con esta reacción se
forman derivados del furfural [8], y el 5-hidroximetilfurfural (HMF) [2]. En el caso de
pentosas, se produce una deshidratación a furfural y en las hexosas a HMF. La
presencia del fenol y su interacción con el HMF facilita la formación de complejos
químicos de una coloración amarillo-naranja que absorben la luz en el espectro visible,
obteniendo una máxima absorbancia a una longitud de onda de 490 nm (hexosas) y
480 nm (pentosas y ácidos urónicos) y en consecuencia facilitan la cuantificación de los
carbohidratos a través de la espectrofotometría [5,9]. En este sentido, el método de
DuBois ha demostrado ser estable y reproducible, logrando acortar el tiempo
necesario para la determinación de carbohidratos comparado con otros métodos
colorimétricos [10].
PROTOCOLO
1. Elaboración de disolución estándar de Glucosa para obtener la curva padrón
1.1. Preparar un estándar de Glucosa a una concentración de 1,000 mg L-1
agregando 250.0 mg de D-(+) Glucosa grado analítico estándar a un matraz
volumétrico de vidrio (Clase A) de 250 mL y aforando con agua destilada hasta
la marca.
1.1.1. Agitar el matraz hasta observarse una completa solubilización de la
glucosa.
ATENCIÓN: Opcionalmente, la disolución puede someterse a un ligero
aumento de temperatura (30 - 50 oC) en una placa de calentamiento
para acelerar la solubilización
1.2. A partir de la disolución 1,000 mg Glucosa L-1 se preparan, al menos, cuatro
diluciones patrones transfiriendo un volumen conocido a matraces
volumétricos de vidrio (Clase A) de 50 mL y aforando con agua destilada hasta
la marca.
ATENCIÓN: se sugiere emplear patrones de glucosa con una concentración de
20 a 100 mg L-1 y repetir, por lo menos, tres veces la preparación de diluciones
con la finalidad de confirmar la confiabilidad del método
Hecho esto, las diluciones patrones son sometidas al procesamiento fenol-
sulfúrico descrito en el siguiente paso
64
2. Procesamiento de muestras líquidas y determinación de absorbancia por
espectrofotometría
2.1. En primer lugar, preparar una solución Fenol 5.0% (m/V) añadiendo 50.0 g de
Fenol ≥99% grado A.C.S. a un matraz volumétrico de 1,000 mL y aforar con
agua destilada hasta la marca.
ATENCIÓN: Almacenar la solución de Fenol 5.0% (m/V) a una temperatura de ±
2.0 oC.
2.2. A continuación, añadir 1.0 mL de muestra líquida o dilución patrón dentro de
un tubo de ensayo con tapón de rosca, fondo redondo de 10 mL; si no se
dispone de suficiente volumen de muestras líquidas, se sugiere realizar una
dilución (no más de 1:2) con agua destilada hasta alcanzar el volumen de
trabajo
ATENCIÓN: El blanco experimental se prepara sustituyendo la muestra líquida
con agua destilada.
2.3. Luego, añadir 1.0 mL de la solución de Fenol 5.0% (m/V) recién preparada a
cada uno de los tubos de ensayo y 5.0 mL de H2SO4 36N (concentrado) grado
A.C.S.
ATENCIÓN: Se sugiere añadir el ácido sulfúrico por las paredes del tubo de
ensayo (de manera inclinada) para evitar una fuerte reacción exotérmica y/o
generación de vapores. Trabajar en campana de seguridad y utilizando careta
protectora.
2.4. Homogeneizar vigorosamente de 5 a 10 s empleando un mezclador de vórtice
e incubar a temperatura ambiente por 10 min.
ATENCIÓN: El tubo de ensayo se calienta rápidamente durante la agitación
2.5. Con cuidado, resuspender el contenido de los tubos de ensayo y transferirlos a
un baño de agua a temperatura ambiente (25 a 30 oC) por 15 min.
2.6. Transcurrido este tiempo, retirar del baño de agua.
2.7. Transferir una pequeña alícuota de la muestra líquida a una celda
espectrofotométrica limpia. Hacer lo mismo con el blanco experimental.
2.8. Introducir el blanco experimental en el espectrofotómetro y establecer como
referencia en el espectrofotómetro a una longitud de onda visible de 490nm.
2.9. Leer y registrar la absorbancia de las muestras líquidas bajo la misma longitud
de onda visible (490nm)
RESULTADOS
En la Figura 1 se observa la curva de calibración generada a partir de D-(+) Glucosa
grado analítico. Resulta importante destacar el alto grado de correlación entre las
concentraciones propuestas y una regresión lineal.
65
Figura 1. Curva de calibración para determinar la concentración de glucosa a una
absorbancia de 490nm empleando el método fenol-sulfúrico.
Considerando entonces la ecuación de la correlación lineal en un rango de 10 a 100 mg
L-1 de Glucosa con una regresión ajustada de 0.99, se presenta entonces el cálculo de la
concentración de carbohidratos en microalgas empleando la siguiente ecuación:
= 0.0098
(1)
Donde y representa el valor de absorbancia obtenido en un rango de luz visible de 490
nm y x representa la concentración de glucosa en mg L-1 bajo dicho rango de luz visible.
Los valores de absorbancia a 490 nm obtenidos para las muestras de consorcio nativo
de microalgas corresponden a 0.673, lo cual sustituyendo en la Ec. 1 se obtiene:
0.673 = 0.0098
(2)
Despejando la variable incógnita x, para encontrar la concentración de carbohidratos
degradados en glucosa en mg L-1, se obtiene lo siguiente:
=0.673
0.0098 =68.7
(3)
Finalmente, se obtiene que la concentración promedio de carbohidratos en el
consorcio nativo de microalgas empleado es de 68.7 mg L-1. En caso de obtenerse una
concentración de carbohidratos fuera del rango de concentración empleado para
realizar la curva de calibración, se sugiere ampliar el rango hasta abarcar la
concentración obtenida preliminarmente.
66
DISCUSIÓN
El método desarrollado por DuBois ha demostrado ser simple, estable y reproducible.
En comparación con otros métodos colorimétricos, p. ej. el método con antrona,
donde la reacción se ha reportado como limitada e inestable dado a la rápida
degradación y consecuente oscurecimiento de la antrona, y en consecuencia, del
analito. Lo anterior altera su lectura colorimétrica, además de poseer una menor
capacidad en el análisis de polisacáridos conformados por mezclas de azúcares [2, 11].
Por otra parte, el método Monsigny emplea resorcinol, el que propone procedimientos
de mucha mayor complejidad y duración, si bien presenta menores sensibilidades
durante la lectura de las absorbancias de soluciones acuosas de carbohidratos [12].
AGRADECIMIENTOS:
Se agradece el apoyo de CYTED a través del proyecto de Red RENUWAL P319RT002. E.
Romero Frasca agradece el financiamiento otorgado por el Programa de Becas
CONACYT-OEA-AMEXCID (no. 855766). Se agradede a la Dra. Virginia Montiel Corona
por el apoyo técnico proporcionado.
CONFLICTO DE INTERESES:
Los autores declaran no tener conflicto de intereses
REFERENCIAS:
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77992017000100007
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determinación de azúcares totales. Revista Cubana de Química 29, 180–198.
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https://doi.org/10.1016/0003-2697(88)90578-7
68
MATERIALES Y REACTIVOS:
Nombre del Material/Equipo Compañía Número de
catálogo Comentarios/Descripción
Ácido Sulfúrico, A.C.S., ≥95.0%
Herschi
Trading
A1590
Balanza analítica Ohaus Explorer
Cole-Parmer
EW-11011-43
Celdas de absorción de cubeta
macro Hellma™
Fisher
Scientific
10518691
Charola de plástico
PROLAB
PRO1002675
Medidas 57 x 14 mm
D-(+)-Glucosa, estándar analítico
Supelco
47829
Espátula Bochem™ con cuchara
estándar de acero inoxidable
Fisher
Scientific
10045070
Espectrofotómetro UV/VIS
Lambda™ 25
PerkinElmer
Inc.
-
Fenol, ACS, ≥99.0%
Sigma-Aldrich
242322
Gradilla para tubo de ensayo
Matraz volumétrico, Clase A, 250
mL
Matraz volumétrico, Clase A, 50 mL
Micropipeta 1,000 μL
Pipeta volumétrica, Clase A, 1 mL
Pipeta volumétrica, Clase A, 10 mL
Pipeta volumétrica, Clase A, 2 mL
Pipeta volumétrica, Clase A, 5 mL
Propipeta o pipeteador
Puntas para micropipeta
Para 1,000 μL
Vaso de precipitado, 50 mL
PYREX®
CLS100050
Viales con tapón de rosca, 10 mL
HACH
2415925
69
Protocolo de Preparación y Evaluación de Pilas de Combustible
de Óxido Sólido
Araceli Fuerte1*, Rita X. Valenzuela1, Paloma Ferreira-Aparicio1, Beata
Bochentyn2
1Centro de Investigaciones Energéticas, Medioambientales y Tecnológicas (CIEMAT).
Departamento de Energía, Madrid, Spain
2Universidad Tecnológica de Gdańsk. Facultad de Física Aplicada y Matemáticas.
Poland
*Correspondencia: araceli.fuerte@ciemat.es
RESUMEN
Este protocolo describe la metodología para la preparación de celdas de óxido sólido y
su evaluación como pila de combustible (SOFC). Es fruto del estudio realizado en el
marco de los proyectos FCTESTNET [1] y SOFCNET [2] del V Programa Marco, en el
Comité IEC/TC105 [3] e investigaciones llevadas a cabo en el laboratorio.
Las pilas de combustible son dispositivos capaces de transformar la energía química de
un combustible en energía eléctrica, con alta eficiencia y baja o nula emisión de
contaminantes a la atmósfera. En el marco energético y medioambiental actual resulta
imprescindible el desarrollo de sistemas de conversión de energía más eficientes,
viables económicamente y no contaminantes. La definición de protocolos
estandarizados de preparación y evaluación de este tipo de dispositivos ayudará al
rápido desarrollo y comercialización de los mismos y con ello a la necesaria transición
energética.
De entre las posibles configuraciones, en el presente trabajo se define el protocolo
para la preparación de celdas de óxido sólido soportadas sobre el electrolito. Además,
se detalla el protocolo para la evaluación de pilas de combustible SOFC alimentadas
con diferentes combustibles y bajo diferentes condiciones de operación, así como para
el análisis post-operacional a fin de evaluar las posibles causas de degradación de estos
dispositivos.
Los resultados obtenidos con la aplicación de estos protocolos han demostrado que
son aptos para la preparación y evaluación de las prestaciones de las pilas de
combustible de óxido sólido SOFC, permitiendo la evaluación de prestaciones de
nuevos materiales y de diferentes celdas, así como identificar mecanismos de
degradación en función de los materiales utilizados o de las condiciones de operación.
De este modo, se pueden buscar soluciones que subsanen estas limitaciones y con ello
ayudar al posterior escalado y comercialización de estos dispositivos.
INTRODUCCIÓN
Actualmente existe un creciente interés en el desarrollo de nuevas tecnologías para la
generación de energía sostenible basada en el uso de las denominadas energías
renovables, debido principalmente a los graves problemas asociados al cambio
70
climático, al incremento de la demanda energética en la sociedad actual, al aumento
de emisiones contaminantes que afectan a los ecosistemas y a la vida humana, así
como a la necesidad de reducir la dependencia de la importación de combustibles
fósiles [4,5,6]. Resulta evidente que el desarrollo de sistemas de conversión de energía
más eficientes, viables económicamente y no contaminantes es una necesidad y un
reto tecnológico al que se enfrenta actualmente la sociedad [7]. En este contexto es
dónde las pilas de combustible, especialmente las de óxido sólido (SOFCs) juegan un
papel importante debido a su alta eficiencia en la conversión de energía y alta
flexibilidad en la selección de combustibles, en comparación con otros tipos de pilas de
combustible [8].
Una pila de combustible es un dispositivo electroquímico que convierte directamente
la energía química de un combustible (generalmente hidrógeno) y un oxidante
(generalmente oxígeno) en electricidad y calor, sin la necesidad de una combustión,
con alta eficiencia y baja emisión de sustancias contaminantes. En caso de utilizar
hidrógeno como combustible los únicos productos de la reacción son electricidad y
agua. Los elementos básicos de una pila de combustible son el ánodo, en el que se
produce el proceso de oxidación del combustible y se liberan electrones a un circuito
externo, el cátodo, donde tiene lugar la reducción del oxidante, y el electrolito, que se
encuentra separando físicamente al ánodo del cátodo y que es el responsable del
transporte de las especies iónicas necesarias para que la reacción global tenga lugar.
En el caso de las pilas de combustible de óxido sólido, debido a las altas temperaturas
de operación, se puede alimentar directamente una gran variedad de combustibles,
como los hidrocarbonados o biogénicos, biogás, gas natural, bioetanol, etc., los cuales
son transformados internamente en hidrógeno [9]. Cabe destacar que aunque la
utilización de combustibles de origen biogénico conlleva la inevitable formación de CO2
en el ánodo de la SOFC, con su utilización se minimiza la huella de carbono del proceso
y el impacto medioambiental [10]. Por otra parte, estos combustibles pueden contener
una gran variedad de impurezas, tales como H2S, VOCs, siloxanos, cloruros, etc. Su
acumulación gradual y/o interacción en la interfase ánodo/electrolito pueden causar la
desactivación del ánodo por bloqueo de los sitios catalíticamente activos y provocar la
degradación de la celda y consecuente pérdida de prestaciones [11]. Por ello, desde un
punto de vista científico y pensando en la futura comercialización de estos dispositivos,
la búsqueda de nuevos materiales más tolerantes a las impurezas y eficientes para la
conversión electroquímica resulta estratégica para la conversión directa de
biocombustibles en electricidad con alta eficiencia y versatilidad.
En cuanto a los materiales que conforman las pilas de combustible de óxido sólido sus
diferentes componentes, electrodos y electrolito, han de cumplir una serie de
requisitos. En cuanto a sus propiedades eléctricas ambos electrodos, ánodo y cátodo,
han de presentar elevada conductividad electrónica con el fin de minimizar las
pérdidas óhmicas. Además, es recomendable que pueda conducir tanto electrones
como iones de modo que se aumente la superficie activa, la denominada fase de triple
frontera donde gas, electrodo y electrolito entran en contacto y se produce la reacción
electroquímica. Por su parte, el electrolito debe presentar una elevada conductividad
iónica para permitir el paso del ion óxido y una conductividad electrónica mínima o
despreciable para evitar las pérdidas de voltaje.
Los electrodos han de ser porosos para permitir el transporte de las moléculas de
71
combustible y de oxidante a los sitios de reacción. El límite inferior de porosidad
vendría dado por consideraciones de transporte de masa mientras que el superior por
la resistencia mecánica de los componentes y la existencia de suficientes caminos de
conducción. El diseño de la microestructura puede llegar a ser tan importante como
unas buenas propiedades intrínsecas del material. El electrolito ha de ser denso ya que
actúa como separador físico de los electrodos evitando el contacto entre los gases y ha
de ser estable en ambas atmósferas.
Existen una serie de características comunes a todos los componentes, como que su
microestructura no puede variar con el tiempo ya que se produciría una variación en la
respuesta del sistema. Los componentes no deben reaccionar entre ellos para evitar la
formación de fases secundarias en la interfase, que pueden producir la caída del
rendimiento. Deben presentar coeficientes de expansión térmica bajos y similares para
minimizar roturas durante los procesos de arranque y parada. Y es deseable que sean
baratos para que su procesado sea sencillo de cara a una producción a gran escala.
La temperatura de operación de estos sistemas viene determinada fundamentalmente
por las propiedades conductoras de los materiales.
Los materiales comúnmente utilizados en SOFC son de tipo cerámico. Como electrolito
se utiliza el óxido de zirconio estabilizado con ytrio (YSZ), con alta conductividad iónica
a elevada temperatura (> 800 °C), denso, aislante electrónico y estable en un amplio
rango de presiones parciales de oxígeno. El cermet Ni-YSZ constituye frecuentemente
el ánodo, siendo un material cerámico que presenta compatibilidad química y
coeficiente de expansión térmica adecuado al electrolito, además de aportar
conductividad iónica al sistema y un alto contenido en metal (30 %) que cataliza la
oxidación del combustible le confiere mayor conductividad electrónica favoreciendo la
extracción de corriente hacia el colector. Y, por último, como cátodo se emplea
manganita de lantano dopada con estroncio por presentar alta conductividad eléctrica
en condiciones oxidantes, adecuada compatibilidad química con la YSZ y semejanza en
los coeficientes de expansión térmica. Sin embargo, aunque estos componentes
comerciales han resultado los más óptimos para operar este tipo de pilas con
hidrógeno, el ánodo de Ni/YSZ no es apto para trabajar con hidrocarburos: el níquel
cataliza la descomposición de los hidrocarburos en carbón e hidrógeno, forma
depósitos de carbono sobre el catalizador que deterioran su microestructura y alteran
sus propiedades electrocatalíticas, y además presenta baja tolerancia al azufre
presente en los combustibles hidrocarbonados e inestabilidad en ciclos de oxidación
reducción. Como solución se están investigando diferentes materiales anódicos,
basados en óxidos mixtos de cerio, cerámicas conductoras electrónicas, titanatos,
entre otros. En cuanto al electrolito, también se han estudiado otros materiales, como
los óxidos de cerio dopados con gadolinio o samario, que presentan mayor
conductividad iónica que la 8YSZ a menor temperatura, lo que permite disminuir la
temperatura de operación de la celda. Y en lo referente a los cátodos se están
estudiando una gran variedad de perovskitas, estructura K2NiF4, etc. con mayor
actividad catalítica en la reducción de oxígeno a temperaturas moderadas (500-600
°C).
Una vez descritas las características principales de una pila de combustible, en este
caso de óxido sólido (SOFC), y de sus componentes fundamentales, cabe destacar que
el establecimiento de protocolos tanto para su preparación, como de evaluación de
72
sus prestaciones y su normalización y estandarización aplicada al desarrollo e
implantación de las pilas de combustible, resulta necesario e interesante debido a
principalmente a dos factores. En primer lugar, es una tecnología multidisciplinar, con
diferentes materiales, procesos de fabricación, diversidad de condiciones de operación
y una gran variedad de aplicaciones y requerimientos de potencia. Y en segundo lugar,
la normalización de los procesos de preparación y evaluación puede facilitar
economías de escala y curvas de aprendizaje que reduzcan costes de desarrollo e
implantación de estos dispositivos como una buena opción tecnológica para la
conversión y aprovechamiento de la energía de modo limpio, eficiente y
económicamente viable, frente a otras opciones de almacenamiento y gestión de
energía.
La normativa referente a la tecnología de las pilas de combustible es desarrollada a
nivel internacional por el comité IEC/TC105 de la Comisión Electrotécnica Internacional
(IEC) y a nivel nacional por el subcomité técnico: CTN 206/SC105. Hasta el momento, el
protocolo para la evaluación de las pilas de combustible de óxido sólido se define en la
Especificación Técnica IEC TS 62282-7-2: Fuel cell technologies – Part 7-2: Test methods
– Single cell and stack performance [12], que actualmente está siendo adaptada para
su transformación en norma internacional (IS).
PROTOCOLO
1. Preparación de celda de óxido sólido soportada en el electrolito
A continuación, se muestra un esquema de los pasos a seguir y los materiales
requeridos (Figura 1 y Tabla 1):
Figura 1. Diagrama del método de preparación de celdas SOFC soportadas en el
electrolito.
73
Tabla 1. Listado de Materiales
1.1. Preparación de electrolito denso y poroso
1.1.1. Preparación de electrolito denso mediante prensado uniaxial (0,5 Kg/15
s) de los polvos del material cerámico seleccionado como electrolito (0,6 g):
Sinterización a alta temperatura (1300-1500 °C, dependiendo del material
utilizado) durante 10 h a una velocidad de calentamiento de 5 °C/min y
posterior pulido de la lámina a fin de reducir el espesor por debajo de 200 µm.
1.1.2. Preparación de electrolito poroso por deposición mediante la técnica de
tape casting sobre la lámina delgada de electrolito denso: Para ello se prepara
una tinta mezclando los polvos del material cerámico seleccionado como
electrolito, con un formador de poro y un ligante, en relación 1:1:1 en peso.
Tras depositar la tinta sobre el electrolito denso se lleva a cabo un tratamiento
térmico a alta temperatura, en el que se elimina el formador de poro,
calentando a una velocidad de 0,5 °C/min y manteniéndose durante 1 h a 400
°C y 2 h a 1400 °C; la velocidad de enfriamiento en todos los casos es de 5
°C/min.
1.2. Preparación de tintas de electrodo y su deposición sobre el electrolito
1.2.1. Preparación de tintas de electrodo: Para la deposición de los electrodos
sobre ambos lados del electrolito se preparan tintas con los materiales
seleccionados como ánodo y cátodo, mezclando los polvos del material para
electrodo con un dispersante (2 % peso) y acetona y se introducen en un
molino de rodillos durante 24 h. Tras la molienda, la suspensión resultante se
mezcla en un vaso de precipitados con la denominada “ink vehicle” (30 %
peso), compuesta por un ligante y un dispersante (Butvar B98 y α-terpineol,
relación 5:95 en peso). Se mantiene en agitación a temperatura ambiente
Nombre del Material/ Equipo Marca Comentarios/Descripción
Acetona Panreac disolvente
Ceramabond 552 Aremco cemento refractario
Decoflux WB40 Zschimmer-Schwarz ligante
Hilos de oro y platino Platecxis colector de corriente
Manganita o ferrita de lantano (LSM o LSCF) Praxair cátodo
Óxido de cerio dopado (Ni, Cu, etc.) Precursores Panreac ánodo
Óxido de cerio dopado con gadolinio (GDC) Praxair electrolito
Óxido de cerio dopado con samario (SDC) Praxair electrolito
Óxido de circonio dopado con itrio (8YSZ) Pi-Kem electrolito
Pasta de oro Heraeus colector de corriente
Pasta de platino Engelhard colector de corriente
Polímero poliéster/poliamida (KD-1) Croda dispersante
Polimetilmetacrilato (PMMA) Sigma-Aldrich formador de poro
Polivinilbutiral (Butvar B98) Sigma-Aldrich ligante
α-terpineol Fluka dispersante
74
durante 6 días para la correcta eliminación de los disolventes.
1.2.2. Deposición de electrodo sobre electrolito: La tinta resultante de los
respectivos electrodos, ánodo y cátodo, son depositadas mediante la técnica de
screen-printing sobre el electrolito. En primer lugar, se deposita la tinta de
cátodo, sobre la lámina densa de electrolito, y se somete a tratamiento
térmico, calentando a 1 °C/min y manteniendo a 850 °C/min durante 2h, en el
caso de usar las perovskitas listadas en la tabla 1 como cátodo. Posteriormente
se deposita la tinta del ánodo sobre la lámina porosa de electrolito y se somete
de nuevo a tratamiento térmico a 750 °C, calentando a 1 °C/min y manteniendo
dicha temperatura durante 2h, para el caso de ánodos basados en óxido de
cerio.
1.3. Pegado de colectores de corriente
Una vez ensamblados electrodos y electrolito se pintan las superficies de los
electrodos con platino (cátodo) y oro (ánodo), usando para ello pastas
comerciales, y se adhiere un hilo del mismo material que actuará como colector
de corriente (ver Tabla 1). Se someten al tratamiento térmico especificado por
el fabricante.
2. Evaluación en celda
A continuación, se muestra un esquema de los pasos a seguir (Figura 2):
Figura 2. Diagrama del método de evaluación de celdas SOFC.
2.1. Ensamblaje de la celda de óxido sólido a la celda de medida e instalación en la
estación de ensayo
2.1.1. Ensamblaje de la celda: La celda SOFC se sella al tubo cerámico de la
celda de evaluación electroquímica, conformada por dos tubos de alúmina, uno
exterior al que se sella la celda y uno interior por el que se alimenta el
combustible (Figura 3). El cátodo queda expuesto al exterior (lo que se
denomina cátodo abierto) y se utiliza el oxígeno del aire para llevar a cabo la
reacción. Para el sellado se utiliza un cemento cerámico (Tabla 1) y se aplica el
tratamiento térmico especificado por el fabricante.
75
Figura 3. Celda para la caracterización electroquímica de una SOFC.
2.1.2. Instalación de la SOFC en la estación de ensayo: La estación de ensayos
para pilas de combustible SOFC incluye un horno tubular, sistemas de
alimentación de gases e impurezas mediante controladores del flujo másico,
humidificadores de gases previos a la entrada de la celda, una carga electrónica
(proporcionada por un potenciostato-galvanostato), las correspondientes
unidades de control de los distintos sistemas periféricos y un cromatógrafo de
gases conectado a la pila (Figura 4).
Figura 4. Esquema de la estación de ensayos SOFC.
La celda electroquímíca se coloca en la estación de ensayos SOFC, en el horno
tubular y para confirmar el correcto sellado de la celda se alimenta hidrógeno y
76
se comprueba el caudal de gas tanto a la entrada como a la salida de la celda y
se descartan posibles fugas (por mal sellado o fractura de la celda) mediante la
utilización de un detector de hidrógeno. Se conectan los colectores de corriente
a la celda de evaluación, asegurando un contacto eléctrico óptimo y se conecta
el potenciostato-galvanostático que se utilizará para realizar la caracterización
electroquímica de la celda.
2.2. Puesta en marcha de la estación SOFC y activación de electrodos
Tanto para el arranque, como para la activación de los electrodos y el análisis
inicial de la celda el combustible utilizado es el hidrógeno. Como oxidante se
utiliza el oxígeno del aire, como ya hemos comentado anteriormente. El rango
de temperatura habitualmente estudiado es de 400 a los 950 °C. El voltaje de la
celda (OCV) es registrado desde el inicio del calentamiento.
2.2.1. Alimentación del combustible: Se alimenta hidrógeno, con un caudal
total de 50 mL/min (calculado para para una celda de aproximadamente 0,3
cm2), controlado mediante controladores de flujo másico. Por lo general, el
combustible se hace pasar por un humidificador antes de su entrada a la
cámara anódica, a temperatura ambiente para alcanzar una humedad del 3 %.
2.2.2. Calentamiento de la celda: La velocidad de calentamiento es de 1 °C/min,
controlada por un termopar situado en el interior del horno junto a la celda. La
celda se mantiene indefinidamente a la temperatura seleccionada para su
evaluación. Una vez alcanzada la temperatura de operación se mide de nuevo
el caudal de entrada y de salida de gases de la celda a fin de descartar posibles
fugas.
2.2.3. Activación de electrodos: Una vez estabilizada la temperatura de
operación, la celda se mantiene durante 12 horas con alimentación de
hidrógeno en el ánodo para asegurar la completa reducción del mismo.
Transcurrido este tiempo, se realiza la caracterización electroquímica de la
celda, mediante voltametría lineal, determinando la máxima densidad de
potencia (MDP) alcanzada en estas condiciones. Se calcula la densidad de
corriente que se debe aplicar para que la celda opere al 95 % de su máxima
potencia y se mantiene dicha demanda de carga durante 24 h como mínimo,
para lograr así la activación del electrodo, lo que se corrobora mediante una
nueva voltametría lineal.
2.3. Evaluación de las prestaciones de la SOFC
Las prestaciones de la celda se evalúan de modo continuo tanto a circuito
abierto como en modo galvanostático, bajo demanda de carga, ajustándose
ésta al valor que permite la operación continua de la celda al 95 % de su
máxima potencia. La evaluación de la celda SOFC puede llevarse a cabo
utilizando una gran variedad de combustibles, H2, biogás, etc. pudiendo
evaluarse el efecto de las diferentes impurezas presentes en los mismos,
diferentes temperaturas, así como diferentes demandas de carga. Para realizar
77
cualquier cambio en los parámetros bajo estudio, la celda se mantiene a
circuito abierto (OCV). Las condiciones utilizadas para los ensayos son las
siguientes:
2.3.1. Efecto de la temperatura de operación: se evalúa la celda en intervalos
de 50 °C. Los cambios en la temperatura se realizan a una velocidad de 1 °C/min
y se espera 1 h para su estabilización.
2.3.2. Efecto de la demanda de corriente: se va variando la misma a una
velocidad de 10 mV/s y registrando el voltaje resultante, intentando en lo
posible que el voltaje de la celda no sea inferior a 0,5 V a fin de minimizar su
degradación.
2.3.3. Efecto del combustible alimentado: se modifica la alimentación anódica
sustituyendo el hidrógeno por otro combustible, como metano, biogás, etc. y se
espera 1 h para la homogeneización de la composición de los gases
alimentados.
2.3.4. Ensayos de durabilidad: durante periodos de tiempo superiores a las
1000 h bajo demanda de corriente operando al 95 % de la máxima densidad de
potencia.
2.3.5. Ensayos de enfriamiento y posterior reinicio de la operación: a una
velocidad de enfriamiento y calentamiento de 1 °C/min, a circuito abierto y
alimentación de hidrógeno en el ánodo.
2.4. Caracterización electroquímica
Una vez estabilizadas las condiciones del ensayo a realizar, se mantiene la celda
operando 1 h a OCV y 1 h bajo demanda de corriente, al 95 % de la máxima
densidad de potencia. Antes y después de cada ensayo se realiza la
caracterización electroquímica mediante voltametría lineal y espectroscopía de
impedancia, utilizando para ello los siguientes parámetros:
2.4.1. Voltametría lineal: se selecciona como voltaje inicial para la medida el
valor del OCV + 0,2 V y la velocidad de barrido es de 10 mV/s.
2.4.2. Espectroscopía de impedancia: se lleva a cabo a circuito abierto, en modo
galvanostático, en un rango de frecuencias de 60KHz a 10 mHz y mediante la
aplicación de una intensidad eléctrica de 5 mA.
2.5. Caracterización post-operacional de la celda
A fin de poder evaluar la degradación de la celda tras su operación, se llevará a
cabo su desmontaje utilizando para ello una herramienta rotativa o
miniamoladora para trabajos delicados con accesorios de corte para cerámicos
78
(tipo Dremel). La celda es caracterizada mediante diferentes técnicas.
2.5.1. Microscopía electrónica de barrido y análisis EDX: permite identificar la
posible migración de cationes entre los electrodos y el electrolito, así como la
formación de capas intermedias en la interfase que pudieran ser aislantes y
mermar las prestaciones de la pila de combustible. Mediante la espectrometría
por dispersión de energías de rayos X (EDX) en diferentes puntos del ánodo
podemos identificar y estimar cuantitativamente la acumulación de diferentes
impurezas presentes en el combustible, que pueden bloquear los sitios
catalíticamente activos para la reacción electroquímica y envenenar el ánodo,
provocando en ocasiones un deterioro irreversible de la pila de combustible.
2.5.2. Termogravimetría: para evaluar la posible formación de depósitos de
carbono sobre el ánodo, cuando se utilizan combustibles hidrocarbonados. Se
realizan ensayos de oxidación a temperatura programada (TPO), utilizando una
corriente gaseosa de 10 % O2 en inerte (Ar), con un caudal de 25 mL/min y
variando la temperatura de 30 a 750 ºC a una velocidad de 5 °C/min.
RESULTADOS
Siguiendo los protocolos descritos se prepararon diferentes celdas de óxido sólido
soportadas en el electrolito y se evaluaron bajo las diferentes condiciones descritas en
el protocolo. El registro continuo del voltaje, la caracterización propuesta, así como la
aplicación de los diferentes pasos definidos en el protocolo permiten, de modo
efectivo, la preparación y evaluación de las prestaciones de celdas de óxido sólido
operando como pilas de combustible, pudiendo valorar comparativamente diferentes
materiales, así como diferentes condiciones de operación. A continuación, se muestran
los resultados obtenidos con una celda de óxido sólido basada en óxidos de cerio
dopados (electrolito y ánodo) y utilizando como cátodo la perovskita ferrita de cobalto,
estroncio y lantano (LSCF). En la Figura 5 se muestra el registro continuo del voltaje
durante toda la operación de la celda con diferentes combustibles y bajo diferentes
demandas de carga [13]. En la Figura 6 se muestra comparativamente la potencia
desarrollada por la celda alimentada con diferentes combustibles.
79
Figura 5. Prestaciones de una SOFC bajo diferentes combustibles y demandas de
corriente.
Figura 6. Representación comparativa de las prestaciones de la SOFC alimentada con
diferentes combustibles.
La caracterización electroquímica propuesta permite identificar pequeñas variaciones
de las prestaciones de la pila en función de las diferentes variables estudiadas, como
por ejemplo el efecto de las impurezas (Figura 7) o la recuperación de las prestaciones
tras eliminar las impurezas del combustible (Figura 8) [14].
80
Figura 7. Representación gráfica de las voltametrías lineales (curvas I-V e I-P).
Figura 8. Representación gráfica de los espectros de impedancia (Diagrama de
Nyquist).
Finalmente, la caracterización de la celda tras la operación permite evaluar su
degradación debido a la posible migración de cationes en la interfase formando capas
aislantes [15], por envenenamiento del electrodo debido a las impurezas del
combustible, o por la formación de depósitos de carbono que taponan los centros
catalíticos activos del ánodo y merman las prestaciones finales de la pila de
combustible (Figuras 9-11) [14].
Mediante los ensayos de oxidación a temperatura programada (TPO) podemos
cuantificar comparativamente los depósitos de carbono que se forman con los
diferentes materiales anódicos, al operar la pila con un combustible hidrocarbonado
(gas natural, biogás, etc.) Además, según la temperatura a la que se produce su
oxidación y volatilización en forma de CO2, se obtiene información del tipo de depósito
de carbono formado y su labilidad.
81
Figura 9. Evaluación de la posible segregación de cationes por espectroscopía
electrónica de barrido y “mapping”.
Figura 10. Acumulación de impurezas en la superficie del ánodo, análisis mediante
SEM-EDX.
82
Figura 11. Evaluación de la formación de depósitos de carbono mediante
termogravimetría (ensayos TPO) y espectroscopía de masas.
DISCUSIÓN
El presente protocolo describe una metodología adecuada para la preparación de pilas
de combustible de óxido sólido soportadas en el electrolito, así como para la
evaluación de sus prestaciones. Permite la comparación de diferentes materiales
propuestos como electrodos o electrolito de este tipo de pilas de combustible y el
estudio de diferentes variables de operación a fin de optimizar el desarrollo de este
tipo de dispositivos y facilitar su comercialización e implantación como sistemas de
conversión de energía limpios, eficientes y fiables.
A fin de poder evaluar la posible degradación de estos dispositivos, debido a las
condiciones de operación requeridas según su aplicación, se ha implementado el
protocolo con una caracterización exhaustiva post-operacional de la celda. Los
resultados de esta caracterización permiten proponer nuevas alternativas que
subsanen las posibles causas de degradación.
Aunque en él se describe exclusivamente el método de preparación de pilas de
combustible de óxido sólido (SOFC) depositadas sobre el electrolito, de entre las
configuraciones posibles, el protocolo de evaluación de celdas definido es aplicable a
cualquier tipo de configuración de celdas SOFC.
AGRADECIMIENTOS:
Los autores agradecen el apoyo de la Red RENUWAL- P320RT0025 CYTED, así como a la
Unidad de Pilas de Combustible del CIEMAT por las instalaciones utilizadas. El presente
trabajo no ha recibido ninguna financiación específica del sector público o privado.
83
CONFLICTO DE INTERESES:
Los autores declaran no tener conflicto de intereses
REFERENCIAS
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https://cordis.europa.eu/project/id/ENG2-CT-2002-20657/es.
[2] SOFCNET: Thematic network on solid oxide fuel cell technology. ENG2-CT-2002-20652.
https://cordis.europa.eu/project/id/ENG2-CT-2002-20652/es.
[3] IEC/TC105: Fuel cell technologies.
https://www.iec.ch/ords/f?p=103:7:4616648204935: FSP_ORG_ID:1309.
[4] Sims REH (2004). Renewable energy: a response to climate change. Solar Energy. 76, 9-17.
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Overview of different approaches. Renewable and Sustainable Energy Reviews 16,
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Elsevier Science, Amsterdam 333-361.
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Systems-Climate Change: A Bioenergy Driver and Constraint in: Greenhouse Gas
Balances of Bioenergy Systems, Thornley P. and Adams P. (Eds.), Academic Press 1-10.
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fuel impurities. Solid State Ionics 179, 1427-1431.
[12] Technical Specification: IEC TS 62282-7-2: Fuel cell technologies – Part 7-2: Test methods
– Single cell and stack performance tests for solid oxide fuel cells (SOFC). International
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microalgae for sustainable energy production. J. of Energy Chemistry. Submitted 2022.
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Cu-Co-ceria anode directly fuelled with simulated biogás mixtures. International
Journal of Hydrogen Energy 39, 4060-4066.
84
Método de cálculo del potencial bioquímico de metano (BMP),
mediante el equipo AMPTS II, para la investigación en digestión
anaeróbica.
Juan Luis Ramos1, Nely Carreras2*
1Departamento de Ingeniería Agraria y del Medio Natural, Universidad de La Laguna
(ULL), Camino San Miguel de Geneto, 2, 38296, San Cristóbal de La Laguna, España.
2CIEMAT. Avda. Complutense 40. 28040 Madrid.
Correspondencia: nely.carreras@ciemat.es
RESUMEN
El potencial bioquímico de metano (BMP) proporciona una medida de la digestibilidad
anaeróbica de un sustrato dado. La información proporcionada por esta prueba es por
tanto valiosa para determinar la cantidad de carbono orgánico de un sustrato que se
puede convertir anaeróbicamente en metano, es decir para evaluar potenciales
sustratos anaeróbicos y optimizar el diseño y el funcionamiento de un digestor
anaeróbico. Asimismo, esta prueba proporciona un método repetible para hacer
comparaciones relativas de la digestibilidad anaeróbica y la producción potencial de
biogás entre varios sustratos de forma individual y/o en codigestión. El conocimiento
de esta prueba es por tanto importante para la investigación y gestión de las plantas
de biogás. Este documento describe el procedimiento de la prueba BMP utilizado en el
Laboratorio de Digestión Anaerobia del CIEMAT para cuantificar la producción de
biogás. Se siguen las indicaciones de la norma alemana VDI 4630 de la Verein
Deutscher Ingenieur (Asociación Alemana de Ingenieros), norma de amplia aceptación
en el sector de la investigación en digestión anaerobia, con el fin de establecer una
metodología clara que permita que pruebas realizadas en diferentes centros de
investigación, llevadas a cabo por diferentes técnicos y realizadas con diferentes
sustratos sean comparables entre sí en cuanto a los resultados obtenidos. Para ello, se
utiliza el Analizador Automático de Medición de Metano (AMPTS II). Este equipo ha ido
ganando popularidad en los estudios de biodegradabilidad anaeróbica por su
capacidad para proporcionar mediciones, registros e informes automáticos y en
tiempo real de la producción de biogás.
INTRODUCCIÓN
La digestión anaerobia (DA) es un proceso biológico mediante el cual una serie de
bacterias en condiciones anaerobias son capaces de degradar la materia orgánica
generando una serie de productos gaseosos conocidos como biogás, con un alto valor
energético por su contenido en metano (50-70%), y un subproducto rico en nutrientes
conocido como digerido o digestato. Este proceso se produce a través de una serie de
complejos procesos microbiológicos, en los cuales diversos tipos de bacterias trabajan
en sinergia [1]. A medida que crece la protección ambiental y la demanda de energía
85
renovable, hay una creciente atención de la comunidad científica por la DA [2] debido
al beneficio tanto energético como medioambiental que aporta en el tratamiento de
residuos orgánicos [3-6].
La idea de la prueba BMP, que fue descrita por primera vez por Owen et al, en 1979, se
ha ido desarrollando y perfeccionando a lo largo de los años [3,7-11]. Los distintos
protocolos propuestos aportan información más o menos detallada de cómo diseñar y
realizar las pruebas de BMP. Las pruebas de biodegradabilidad tienen como objetivo
principal determinar la idoneidad de un sustrato o mezcla de sustratos para su empleo
en DA. Su idoneidad se determina analizando la biodegradabilidad máxima, así como la
máxima producción de biogás y metano. El BMP es un parámetro que indica la máxima
cantidad de metano que se puede recuperar de un sustrato. Se suele expresar bien por
unidad de masa de sólidos volátiles (VS) o demanda química de oxígeno (DQO). De
igual manera, las pruebas de BMP son una opción para medir el impacto de un
pretratamiento en la degradabilidad del sustrato. Por ello, se vienen realizando
numerosos estudios e investigaciones que tratan de determinar el BMP de diversos
tipos de sustratos orgánicos [3], tales como residuos orgánicos y lodos de depuradora,
y también de cultivos energéticos [12]. La medida del BMP de sustratos orgánicos es
una herramienta poderosa y útil para la investigación [11,13-16] y, a efectos prácticos
de la DA, para el diseño y gestión de las plantas de biogás [11,17-19].
Proporcionar condiciones óptimas para el proceso de DA es clave para lograr el mayor
grado posible de degradación. Por lo tanto, las condiciones aplicadas en una prueba de
BMP han de ser las del mejor ambiente posible para el crecimiento microbiano. Para
ello, la materia prima a estudiar se sitúa en las condiciones óptimas en los reactores
anaerobios durante un periodo de tiempo a lo largo del cual no se realiza ningún tipo
de acción sobre ellos salvo la agitación y el mantenimiento de una temperatura
constante.
En la práctica, las pruebas BMP son ensayos en discontinuo en los que una cantidad
conocida de material objeto de estudio se mezcla con una cantidad suficientemente
alta de inóculo procedente de un digestor en operación [20], que contiene una
población microbiana mixta capaz de llevar a cabo el proceso de DA [21]. La elección
de la relación inóculo-sustrato ha de ser adecuada para evitar tanto el exceso como la
insuficiencia de carga del proceso [22]. El espacio de cabeza del reactor se purga antes
del inicio de la prueba para eliminar el oxígeno por el paso de un gas inerte. Después,
el reactor se mantiene a una temperatura adecuada, que puede ser mesófila o
termófila, dependiendo de la procedencia del inóculo y/o del proceso considerado, y
se mezcla de forma suave. Se controla la cantidad producida de biogás y el propio
biogás se libera de forma continua o intermitente. De esta manera, se puede
determinar una curva cinética para la producción de biogás a lo largo del tiempo. La
composición del biogás generalmente se analiza mediante cromatografía de gases (GC)
o analizador de infrarrojos para determinar los porcentajes de metano y dióxido de
carbono. Como alternativa, la fracción de CO2 puede eliminarse haciendo reaccionar,
por ejemplo, el biogás con hidróxido de sodio para retener el CO2 y medir solo metano;
en este caso el contenido de CO2 se puede determinar mediante valoración por
retroceso o titulación. El ensayo ha de continuar hasta que la tasa de producción de
metano sea muy baja para dar tiempo a la degradación de los sustratos más lentos [9].
La prueba BMP generalmente termina cuando cesa la producción de biogás es decir,
86
cuando la curva de producción acumulativa de biogás se aplana o cuando la
producción de biogás de la muestra de ensayo sea la misma que la del inóculo. Este
tiempo puede ser de 30 a 45 días o puede llegar a 50 días para sustancias como la
celulosa [3], o incluso a 100 días o más para algunos materiales con contenido
lignocelulósico [23]. Con el fin de estandarizar las pruebas de BMP, es recomendable
que la prueba finalice cuando la producción neta diaria de metano sea inferior al 1%
del metano acumulado durante tres días consecutivos [9,24]. El inóculo debe ser
digerido por separado (en las mismas condiciones) para obtener un valor de control
(cantidad de metano producida por el inóculo únicamente); este valor de control debe
deducirse de los resultados de los reactores para obtener el rendimiento atribuido al
sustrato real de la prueba. Dividiendo el rendimiento de metano atribuido al sustrato
del ensayo por la cantidad de sustrato añadido, se obtiene el rendimiento de metano
específico; éste puede expresarse en unidades de m3 kg-1 SV añadido o m3 kg-1 ST
añadido, u otra unidad, según corresponda.
La biodegradabilidad anaeróbica de un sustrato está relacionada con el BMP 25, se
obtiene dividiendo el valor del BMP experimental por el valor teórico correspondiente
[2,20]. Este valor teórico se suele calcular en base a la estequiometría del proceso de
DA según la composición elemental del sustrato [26]. Ésta puede medirse
directamente o a partir del análisis macromolecular (p. ej., carbohidratos, proteínas,
lípidos) o incluso mediante un análisis detallado [27], ya que permite distinguir mejor
entre los componentes del sustrato que se degradan con facilidad, con dificultad y los
que no se degradan [7]. Para muestras de líquidos y lodos, el valor teórico se puede
calcular en base a la DQO y el rendimiento teórico de metano de DQO, es decir 0,35
L CH4 / g DQO [28]. Determinar la DQO de materia orgánica particulada también es
posible, pero entraña mayor dificultad [29].
Existe una falta de estandarización en unidades y técnicas en la determinación del
BMP, lo que limita la confianza en la información que se genera al obtener resultados
no comparables ya que tos métodos se utilizan de manera diferente y, a menudo, los
investigadores los modifican para definir la biodegradabilidad anaeróbica de los
compuestos orgánicos [22]. Actualmente, el problema central con las pruebas de BMP
es la falta de procedimientos estandarizados y la falta de información que se aporta en
los informes [11,30].
No obstante, para la realización de las pruebas de biodegradabilidad se emplea
ampliamente la norma VDI 4630 de la Verein Deutscher Ingenieur (Asociación Alemana
de Ingenieros) [10]. Esta norma, de amplia aceptación en el sector de la investigación
en DA, pretende unificar metodologías. Como se ha comentado, uno de los principales
inconvenientes de la investigación en este campo es la dificultad de comparar
resultados de experimentaciones realizadas por diferentes grupos de trabajo debido a
la diversidad de metodologías empleadas. Esta norma pretende establecer una
metodología clara que permita que pruebas realizadas en diferentes centros de
investigación, llevadas a cabo por diferentes técnicos y realizadas con diferentes
sustratos sean comparables entre sí en cuanto a resultados obtenidos. La norma
incluye pautas sobre cómo debe realizarse la toma de muestras, su conservación y
transporte, así como otras consideraciones.
El procedimiento de la prueba BMP utilizado en el Laboratorio de Digestión Anaerobia
del CIEMAT para cuantificar la producción de biogás ha seguido las indicaciones de la
87
norma alemana VDI 4630, con el fin de que los resultados obtenidos sean ampliamente
compatibles y comparables a los obtenidos por otros investigadores. En este protocolo
se especificarán las indicaciones que tienen un efecto directo en los resultados
obtenidos. Para llevar a cabo la prueba BMP se utiliza el Analizador Automático de
Medición de Metano (AMPTS II, Bioprocess Control, Suecia). Este equipo ha ido
ganando popularidad en los estudios de biodegradabilidad anaeróbica por su
capacidad para proporcionar mediciones, registros e informes automáticos y en
tiempo real de la producción de biogás.
PROTOCOLO
1. Condiciones de la prueba
1.1. Realización de las pruebas de biodegradabilidad como mínimo por duplicado,
aunque preferentemente se realizarán por triplicado.
1.2. Reducción del tamaño de partícula del sustrato o mezcla de sustratos a
emplear antes del comienzo de la prueba de biodegradabilidad.
1.3. Utilización de un inóculo apropiado: se recomienda la utilización de un inóculo
procedente del tratamiento de sustratos con el mismo origen que el sustrato
en estudio. Si esto no es posible, es preferible utilizar un inóculo procedente
del tratamiento de lodos de EDAR ya que, debido a su naturaleza, este inóculo
entra en contacto con todo tipo de materia orgánica y por tanto cuenta con
una rica diversidad microbiana.
1.4. Uno de los indicadores de calidad que debe cumplir dicho inóculo es que el
contenido en materia volátil o sólidos volátiles (SV) sea igual o superior al 50%
del contenido de materia seca o sólitos totales (ST). La materia volátil se
corresponde con microorganismos en un inóculo bien digerido y, por tanto,
este porcentaje indica que existe una gran proporción de microorganismos en
el medio.
1.5. El inóculo debe mantenerse durante un mínimo de 3-4 días en condiciones
anaerobias a la temperatura a la que operará el ensayo de biodegradabilidad
con el objetivo de disminuir al mínimo su producción endógena de biogás.
Esto puede realizarse dejando el inóculo en los propios reactores del equipo
AMPTS II.
1.6. La prueba de biodegradabilidad debe contener entre un 1,5 y un 2% en peso
de materia orgánica procedente del inóculo con el objetivo de asegurar una
concentración de biomasa microbiana suficiente.
1.7. La cantidad de materia orgánica del sustrato o mezcla de sustratos a
introducir en los ensayos se calcula en base a:
o SVsustrato/SVinóculo ≤ 0.5
o La producción de biogás a partir del sustrato debe ser mayor del 80% de la
producción de biogás total.
o La concentración de sólidos totales en la prueba debe ser menor del 10% para
asegurar un buen contacto entre biomasa microbiana y biomasa del sustrato a
degradar.
88
1.8. Se debe realizar una purga con gas nitrógeno (N2) del gas de cabecera de los
reactores antes de su sellado para asegurar condiciones anaerobias desde el
principio de la experimentación, lo que permitirá reducir o eliminar
completamente las fases de degradación aerobias que conducirían a una
disminución de la producción de biogás.
1.9. Se debe incluir reactores de referencia o blancos en el ensayo mediante los
que se determinará la producción endógena de biogás del inóculo para
después ser restada de la producción total de biogás de los reactores con
sustrato.
1.10. La agitación de los reactores anaerobios debe ser constante o al menos una
agitación intensa una vez al día.
2. Descripción del Analizador automático de medición de metano (AMPTS II)
Este equipo ha sido desarrollado por la empresa Bioprocess Control1 (Lund, Suecia)
con el objetivo de simplificar la realización de los ensayos de biodegradabilidad. Consta
de los siguientes elementos:
1. Baño termostático
2. 15 reactores anaerobios de 500 mL de capacidad con motor de agitación
individual.
3. 15 botellas de fijación de CO2 de 80 mL de capacidad.
4. Unidad de celdas de medida por desplazamiento de volumen con 15 canales.
5. Conexión online a ordenador por medio del software propio.
Los reactores anaerobios constan con una salida de gas en la parte superior, que se
conecta a las botellas de fijación de CO2 mediante tubos flexibles de 1/8”. En estas
botellas de fijación de CO2 una solución básica absorberá el CO2 contenido en el
biogás, permitiendo que continúe fluyendo el metano desde estas botellas a las celdas
de medida de volumen por desplazamiento.
Se recomienda la lectura completa del manual de operación y mantenimiento del
AMPTS II antes de comenzar a utilizarlo.
3. Procedimiento experimental
En esta sección se detallará el procedimiento experimental empleado en el ensayo de
biodegradabilidad. Durante el procedimiento experimental se seguirán las indicaciones
de la norma VDI 4630.
3.1. Selección y caracterización del inóculo
3.1.1. Obtener un inóculo apropiado
3.1.2. Antes de cada ensayo el inóculo se mantiene en predigestión durante
3-4 días para reducir la producción endógena de biogás.
3.1.3. Cuando ésta finaliza, se realiza el análisis de ST y SV sobre el inóculo
para, de acuerdo a las indicaciones de la norma VDI 4630, calcular la
proporción de inóculo y sustrato/s a emplear en cada ensayo.
3.1.4. Sobre el inóculo también se realizan análisis de NTK, NTA, DQOt,
DQOs, alcalinidad parcial y total (AP y AT), ácidos volátiles (AV) y pH.5.
89
3.2. Caracterización del sustrato o sustratos a emplear.
3.2.1. En el caso de que se realicen ensayos de codigestión de varios sustratos
conviene conocer la composición elemental de cada cosustrato para
determinar la proporción (en base a SV) de cada uno de ellos en las
mezclas a estudiar, obteniendo mezclas con una relación C/N
determinada. Por lo tanto, además de realizar dicho análisis elemental
es necesario caracterizar los sustratos en base a su contenido en sólidos
volátiles (SV). A su vez, se realiza la caracterización en sólidos totales
(ST), nitrógeno total Kjeldahl (NTK), demanda química de oxígeno total y
soluble (DQOt y DQOs) y nitrógeno total amoniacal (NTA).
3.2.2. Posteriormente, se procede a la homogeneización de los sustratos por
separado. En el caso de sustratos sólidos se realiza una molienda de
éstos, en el caso de sustratos semisólidos se recomienda una trituración
y para los sustratos líquidos una correcta homogeneización mediante
agitación.
3.2.3. Una vez se determina las cantidades de inóculo y sustrato a emplear en
cada ensayo, éstas se introducen en el reactor anaerobio.
3.2.4.
3.3. Caracterización de la mezcla inóculo +sustrato
Además de los análisis que se realizan sobre el/los sustrato/s individuales y sobre el
inóculo, hay que realizar análisis del contenido de cada uno de los reactores, es decir,
sobre la mezcla inóculo+sustrato/s. Para ello existen diferentes opciones, de las cuales
se elegirá una u otra en función de la experiencia de la persona que vaya a llevar a
cabo la experimentación y en función de las características de los sustratos a emplear.
Las técnicas que se han utilizado hasta ahora son las siguientes:
3.3.1. Análisis iniciales sobre mezcla réplica: Además de las mezclas (sustrato/s
más inóculo) de cada reactor, se realiza aparte una réplica extra para
cada tipo de mezcla a analizar en el ensayo de biodegradabilidad. Esta
mezcla extra será la que se utilice para realizar los análisis iniciales, por
lo tanto, conoceremos las condiciones iniciales de cada mezcla, sin
embargo, no conoceremos si existen desviaciones entre reactores
réplicas que contienen la misma mezcla. Este método se recomienda
cuando se analicen sustratos de difícil homogeneización con el inóculo.
Antes de hacer el análisis de la muestra réplica deberemos asegurarnos
de que exista una correcta homogeneización.
3.3.2. Análisis iniciales sobre muestra del reactor: En este caso, se realiza más
mezcla de la necesaria para el ensayo de biodegradabilidad, retirando
una parte de ésta del interior de cada reactor una vez esté
correctamente homogeneizado para realizar los análisis sobre ella. De
esta forma, conoceremos las condiciones iniciales de cada reactor por
separado. Debido a que los resultados en cuanto a la producción de
biogás se expresan en función de la cantidad inicial de sustrato inicial
introducida al digestor, esta técnica requiere que a la cantidad inicial de
sustrato e inóculo introducida al digestor se le reste la cantidad
proporcional de sustrato e inóculo que se extrae del digestor para
90
realizar los análisis. Así, por ejemplo, si realizamos 500 mL de mezcla
que contiene 450 mL de inóculo más 50 gramos de sustrato
(imaginemos que su densidad sea de 1 g mL-1) y sustraemos para la
realización de los análisis iniciales 100 mL de mezcla (inóculo más
sustrato) los resultados finales habrán de calcularse en base a 40
gramos de sustrato y 360 mL de inóculo, ya que si está correctamente
homogeneizado en esos 100 mL extraeremos 10 gramos de sustrato y
90 mL de inóculo. Este método se recomienda cuando se analicen
sustratos sólidos o semisólidos y líquidos que se homogeneicen muy
fácilmente con el inóculo en poco tiempo.
3.4. Preparación de la prueba.
3.4.1. Las cámaras de fijación de CO2 deben rellenarse con NaOH 3 M, a ser
posible con indicador de pH. Si no se dispone de un indicador de pH
que indique el agotamiento de la solución, se recomienda cambiar la
solución de fijación de CO2 después de cada experimento para
asegurar la capacidad fijadora de ésta.
3.4.2. Para la purga del aire atmosférico del espacio de cabecera de los
reactores anaerobios cada uno de ellos cuenta con una entrada
regulada por medio de pinzas que se cierran mediante una rueda fija
en un canal de anchura decreciente.
3.4.3. La purga del aire atmosférico se realizará introduciendo nitrógeno
gaseoso (N2) por medio de dicha entrada con la pinza abierta, hasta
que por la celda de medida correspondiente se observe como sale el
gas de purga. Se recomienda un caudal de 2,5 litros por minuto
durante al menos 30 segundos para cada uno de los reactores, con el
fin de garantizar un intercambio estadístico de más de 5 veces el
espacio de cabeza completo, tras lo cual la pinza debe cerrarse
completamente. El sistema AMPTS II aporta información sobre el
volumen de metano estándar (0 ° C, 1 atm, seco) producido en cada
botella, que se puede usar para calcular tanto la curva de producción
específica de metano (SMP) como la del BMP final.
3.4.4. Programar el incubador a la temperatura deseada.
3.4.5. Conectar y rellenar la base de datos del software AMPTS II.
3.5. Inicio de la prueba
3.5.1. Pesar con precisión la masa de inóculo bien mezclada e introducirla en
los digestores.
3.5.2. Pesar con precisión el sustrato y añadirlo en los reactores.
3.5.3. Comprobar el pH de la mezcla si es inferior a 7.3, ajustarlo (cuando se
saca la sonda tener cuidado de no extraer material).
3.5.4. Introducir sustrato/s e inóculo en el interior del digestor (y tomar la
muestra de su interior en su caso, asegurando una correcta
homogeneidad y representatividad de ésta).
3.5.5. Se cierra el reactor, se introduce en el baño termostático.
91
3.5.6. Se conecta a la cámara de fijación de CO2 correspondiente.
3.5.7. Se procede a la purga de su espacio de cabecera con gas N2.
3.5.8. Se enciende el ordenador y el software del AMPTS II y se introducen los
datos necesarios que se verán en la siguiente sección.
3.5.9. Se arranca la medida del metano producido.
3.5.10.
3.6. Fin de la prueba
3.6.1. Cuando la producción de metano diaria sea menor del 1% del metano
total acumulado durante el ensayo, éste puede darse por terminado
(aproximadamente 30-40 días dependiendo de la velocidad de
degradación).
3.6.2. Se conservan las muestras de cada reactor en frío para su posterior
análisis
3.6.3. Se procede al análisis de las muestras (se realizan los mismos análisis
descritos en los apartados 3.1 y 3.2).
4.Manejo del Software del AMPTS II
El software para manejar el equipo AMPTS II es muy intuitivo. Además de este manual,
existe un manual propio de la casa Bioprocess Control que es necesario leer antes de
comenzar a manejar el equipo.
4.1. Para ejecutar el software es necesario que el ordenador disponga de un
buscador de internet (Internet Explorer, Mozilla Firefox o Google Chrome),
aunque no es necesario que el equipo se encuentre conectado a internet.
4.2. Una vez el buscador esté abierto es necesario localizar el IP del equipo AMPTS
II. Una vez ejecutada la búsqueda aparecerá la pantalla de entrada al software
(ver Figura 2). Se recomienda que el software y el ordenador se encuentren
continuamente encendidos y conectados al equipo AMPTS II durante la
realización de un experimento para que se produzca la descarga automática y
continua de datos desde el equipo y así evitar llegar a la saturación de la
memoria del AMPTS II con la consiguiente pérdida de datos.
4.3. Tras seleccionar con el ratón la opción de ‘Log in to the AMPTS II instrument’
nos pedirá un nombre de usuario y una contraseña (ver Figura 3).
4.4. Tras seleccionar ‘Aceptar’ podremos utilizar el software del equipo AMPTS II,
cuya primera entrada es la que se puede ver en la Figura 4.
4.5. Mediante la selección de las diferentes opciones que se encuentran en la barra
superior nos podremos mover por las diferentes pantallas del software.
4.6. La primera pantalla que encontramos es ‘Experiment’, correspondiente a los
parámetros que queremos fijar en el experimento. Aquí podremos introducir
valores como el nombre de cada reactor, su contenido, la concentración del
inóculo, la relación inóculo/sustrato, formas de medida (SV o DQOt), etc.
Algunos de estos datos serán utilizados por el propio software para el cálculo
de los resultados. Se recomienda ser muy riguroso en la introducción de estos
92
datos ya que evitará posibles confusiones a la hora de trabajar con los
resultados que proporciona el software al final del experimento.
4.7. La siguiente pantalla es la de ‘Control’, que nos permite controlar de forma
continua el experimento (ver Figura 7). Activando, pausando o parando la
medida de cada una de las células de biogás (1-15), encendido o apagado de los
motores de agitación, ajuste de la velocidad de agitación de los motores (0-
100%), así como el tiempo de funcionamiento y el tiempo de reposo de éstos.
4.8. La opción de “Graphs” se corresponde con las gráficas que el software nos
proporciona de forma online, para el control continuo del experimento en
tiempo real (ver Figura 8). De esta forma no es necesario terminar el
experimento o descargar el reporte de resultados para tener información del
transcurso del experimento. Se podrán seleccionar o deseleccionar las
diferentes celdas de medición de metano que se deseen para que se muestren
en la gráfica correspondiente. Además de la producción acumulada de metano
podremos observar las tasas de producción de metano a lo largo del tiempo.
4.9. La siguiente pantalla disponible es la de ‘Download report’ que nos permite
generar los informes de resultados de los diferentes experimentos (ver Figura
9). Estos informes se pueden presentar con los resultados expuestos en
diferentes unidades de tiempo (en horas, en días, etc.). Cuando se seleccione el
botón ‘Generate report’ nos aparecerán las opciones de descargar el informe
en formato Excel o en formato CSV (.csv).
4.10. Por último, encontramos la pantalla de ‘System’, correspondiente a los ajustes
del sistema. No se aconseja modificar ninguno de los parámetros que aquí
aparecen a no ser que se sea un usuario experto. En esta pantalla podremos
modificar la dirección IP del equipo AMPTS II, el huso horario, la contraseña de
acceso al sistema, así como la calibración de fábrica de las diferentes celdas de
medida del volumen de metano producido. Los ajustes que aparecen en el
“pantallazo”, que puede ver en la Figura 10, son los correspondientes a los
ajustes de fábrica.
RESULTADOS
Tanto académicos como técnicos utilizan la prueba BMP para determinar el
rendimiento máximo de metano (CH4) alcanzable a partir de un sustrato orgánico
determinado 9,20. El producto principal de una prueba BMP es la curva de producción
acumulada de metano a lo largo del tiempo, a partir de la cual se puede obtener el
rendimiento máximo de metano (el potencial) y la cinética de degradación del
sustrato. Generalmente se presenta como curva de producción específica de metano
(SMP). Las pruebas de BMP se realizan comúnmente por métodos volumétricos o
manométricos (basados en presión). Aunque hay diversos ejemplos que proporcionan
información detallada sobre cómo realizar las pruebas de BMP, aún falta una
validación de los resultados más allá de verificar el rendimiento de un control positivo,
o que no se exceda una cierta desviación estándar dentro de las réplicas. Dado que la
forma de la curva SMP es muy similar para la mayoría de los sustratos, éste puede ser
93
otro criterio para validar cualitativamente los resultados de la prueba BMP [22].
Una desviación significativa de esta típica curva suele asociarse con una falta de
confianza en los resultados obtenidos de las pruebas BMP. La norma alemana VDI
4630 [10] es hasta ahora la única guía de BMP que analiza la forma típica de las curvas
SMP, aunque de forma breve [22]. La representación gráfica de una curva SMP,
generalmente, debe ser similar a la línea continua de la Figura 11. Sin embargo, puede
darse el caso de que puedan aparecer curvas con diferentes formas, lo que puede
indicar la presencia de problemas en el diseño del ensayo o en la ejecución
experimental del mismo, que deben afrontarse para poder hacer estimaciones de BMP
precisas y repetibles. Con el fin de saber cómo determinadas acciones o errores, que
se pueden producir en la determinación de la prueba BMP, afectan al diseño de las
curvas SMP, Koch et al [2] llevaron a cabo el estudio de la influencia de tres posibles
defectos que se pueden cometer en la realización de la prueba, tales como: el
almacenamiento del inóculo (dos semanas y a diferentes temperaturas), la dilución del
inóculo con agua (sin dilución y a una dilución 1: 2) y la relación inóculo-sustrato (ISR)
(de 2,00 a 0,05) [22]. Se utilizaron modelos cinéticos comunes para evaluar mejor las
curvas SMP. Todos los defectos evaluados mostraron una influencia en las curvas SMP.
Sin embargo, tanto la dilución excesiva como la relación inóculo-sustrato
extremadamente baja fueron los que mostraron los mayores efectos, tanto en el
diseño de las curvas SMP como en los BMP [22]. En el caso más extremo (relación
inóculo/sustrato de 0.05), se produce una fase de retraso de varios días, y la BMP
resultante es un 15% menor que en el caso de referencia.
La Figura 11 muestra una compilación de las respuestas más extremas de los tres
defectos que se han analizado, las formas son comparables a las mostradas en la
norma VDI 4630 [10] como "formas típicas de las curvas de formación de gas". La línea
continua, como ya se ha comentado anteriormente, sería la curva normal, la línea de
trazo largo muestra la curva que representa la influencia del almacenamiento del
inóculo, la línea de trazo corto la curva que representa la influencia de la dilución del
inóculo y la línea de puntos la curva que representa el uso de una relación
inóculo/sustrato incorrecta.
Por lo tanto, estos ejemplos muestran que, con la información del diseño de las curvas
SMP se pueden identificar y abordar problemas en su procedimiento experimental, lo
que en última instancia contribuye a mediciones de BMP más precisas.
El enfoque general es simple y útil, y siempre debe ser parte de un control de calidad
para las pruebas de BMP [22].
Para poder evaluar la calidad de las curvas SMP y, por tanto, de los resultados
obtenidos, es conveniente que se incluyan las curvas SMP en todos los estudios futuros
de BMP, al menos como material complementario, como ya otros autores
recomendaron con anterioridad [9]. Sin embargo, si bien analizar el diseño de la curva
SMP puede ser útil para detectar fallos comunes que se pueden producir en las
pruebas BMP, no puede utilizarse para detectar todos los errores posibles, como
errores en el cálculo de los SV del sustrato, sesgos en la medición de metano o fugas
de biogás [31], que pueden no influir en la forma de la curva SMP. La aplicación del
método propuesto no se limita a las pruebas de BMP con alta resolución temporal,
94
pero cuanto mayor sea la resolución temporal, se pueden identificar mejor las
pequeñas discrepancias con la curva típica [22].
Figura 1. Componentes del AMPTS II: 1. Baño termostático. 2. Reactores anaerobios y
unidad de agitación. 3. Botellas de fijación de CO2. 4. Unidad de medida de volumen
del metano generado. 5. Parte trasera de unidad de medida de volumen con las
diferentes conexiones.
Figura 2. Página de entrada al software del AMPTS II.
Figura 3. Nombre de usuario y contraseña.
1
2
3
4
5
95
Figura 4. Página inicial del software AMPTS II.
Figura 5. Barra para desplazarse por las diferentes pantallas del software AMPTS II.
Figura 6. Pantalla correspondiente a los parámetros de ajuste del experimento.
96
Figura 7. Pantalla correspondiente al control del experimento.
Figura 8. Gráfica de producción acumulada de metano de un experimento.
97
Figura 9. Pantalla para la descarga de informes de resultados.
Figura 10. Pantalla para la modificación de los ajustes del sistema.
Figura 11. Una curva de producción de metano específica normal y el impacto de tres
fallas típicas en el diseño o ejecución experimental. Fuente: Adaptada de Koch, 2019
[22].
98
DISCUSIÓN
A diferencia de las experiencias con reactores en continuo, las pruebas de BMP se
realizan en discontinuo y se pueden llevar a cabo sin una gran inversión en equipos,
mano de obra y tiempo. Sin embargo, ésta y otras diferencias limitan la aplicabilidad
de los resultados de una prueba BMP en la operación de una planta a gran escala. No
obstante, a medida que han ido mejorando los modelos informáticos y la complejidad
de las expresiones matemáticas para describir el proceso de digestión anaeróbica, se
ha descubierto que la información de los experimentos en discontinuo produce
predicciones razonables del comportamiento a gran escala. Las pruebas BMP de los
sustratos a digerir y sus cargas orgánicas específicas podrían usarse para diseñar
diferentes componentes de plantas de digestión anaeróbica a gran escala, como el
tamaño de los digestores y las posibilidades de explotación del biogás producido [11].
Actualmente, el problema central de las pruebas BMP es la falta de un procedimiento
estándar y la falta de información más detalla en las publicaciones. Incluso en artículos
de revistas de referencia, los resultados de las pruebas de BMP no siempre se utilizan
de manera adecuada [2]. La literatura muestra importantes discrepancias entre los
mismos sustratos [32]. Resultados obtenidos en diferentes grupos de investigación
participantes en un estudio interlaboratorio relacionado con el BMP, donde se
investigaron todas las condiciones experimentales que influyen en la prueba, como el
inóculo, las características del sustrato y las condiciones experimentales, a partir de
cuatro sustratos, concluyó que la influencia de los inóculos y los factores
experimentales fue casi insignificante con respecto a la extensión de la biodegradación
anaeróbica, mientras que las tasas difirieron significativamente según los enfoques
experimentales [20].
Entre las grandes ventajas del uso de las pruebas BMP destaca la posibilidad de
determinar no solo la máxima cantidad de metano que se puede recuperar de un
sustrato, sino también de una mezcla de sustratos en codigestión. Asimismo, las
pruebas de BMP son una opción para medir el impacto de un pretratamiento en la
degradabilidad del sustrato, aunque se cuestiona la transferibilidad a sistemas
operados en continuo [33]. Por otra parte, las pruebas BMP permiten proporcionar las
condiciones óptimas para el proceso de DA (selección adecuada del inóculo [8,9,20],
de la relación inóculo/sustrato [22], temperatura y agitación [34]) que es clave para
lograr la mayor degradación posible. Por ello, las condiciones aplicadas en una prueba
de BMP pueden lograr las mejores condiciones posibles para el crecimiento
microbiano. lo que está implícito en el término potencial del nombre de la prueba. Por
tanto, el rendimiento de metano logrado en experimentos continuos o en plantas a
gran escala generalmente debería ser menor en comparación con el valor obtenido en
una prueba de BMP [35].
La prueba BMP permite conocer la biodegradabilidad anaeróbica de un sustrato al
dividir los BMP obtenidos por los valores teóricos correspondientes. El valor teórico se
suele calcular en base a la estequiometría del proceso de DA en función de la
composición elemental del sustrato [26] que puede medirse directamente o deducirse
del análisis macromolecular (carbohidratos, proteínas, lípidos) o incluso mediante un
análisis más detallado [27], ya que permite distinguir aún más entre los componentes
del sustrato, según sean fácilmente, difícilmente y no digeribles [7]. En una
aproximación realista de la biodegradabilidad anaeróbica, incluso si la materia
99
orgánica es 100% biodegradable anaeróbicamente, solo alrededor del 90% se
transformará en metano, ya que alrededor del 10% se utilizará para la producción de
biomasa microbiana [10,36].
Los parámetros cinéticos obtenidos a partir de las pruebas BMP permiten una
evaluación cualitativa de la cinética del proceso. Si bien la toxicidad aguda de un
inhibidor presente en el sustrato o mezcla de sustratos puede detectarse en las
pruebas de BMP, esto no es posible para la toxicidad crónica. A diferencia de los
sistemas de operación en continuo, el sustrato en una prueba de BMP solo se añade
una vez, y debido a la proporción típicamente alta de inóculo presente en el ensayo,
las pruebas sinérgicas o antagonistas que ocurren en las pruebas de BMP en
codigestión pueden ser diferentes de las que ocurren en procesos en continuo. Las
pruebas de BMP no se pueden utilizar para evaluar los efectos a largo plazo de la
disponibilidad de nutrientes o oligoelementos debido a la alimentación monótona. De
igual modo, el rendimiento de metano, la estabilidad del proceso y la tasa de carga
orgánica alcanzable en un sistema de funcionamiento continuo no pueden dilucidarse
mediante pruebas de BMP [2].
La prueba BMP es una herramienta muy importante para la investigación y de gran
importancia por su aportación al proceso de digestión anaeróbica pero tiene
limitaciones respecto a las experiencias en continuo y viceversa. Ambos procesos son
complementarios y de gran interés para los procesos de digestión anaeróbica.
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