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Estudios específicos 4 4.6 E ST U DIO S E X PE R I M E N TA L E S

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El objetivo principal de este Manual es el desarrollo de un compendio de técnicas y protocolos estándares para el inventario y monitoreo de poblaciones de anfibios, actualizado con los procedimientos, herramientas y técnicas de análisis más recientes y adaptado a las condiciones y realidades nacionales. Su contenido está destinado a ayudar a superar algunas de las dificultades que se pueden enfrentar al configurar un programa de inventario y monitoreo para anfibios. Pretendemos brindar una orientación práctica sobre cómo diseñar y llevar a cabo estudios que puedan servir para múltiples aplicaciones más allá de las necesidades de un proyecto particular. En este manual compilamos las experiencias y consejos de numerosos especialistas sobre diferentes temáticas que pudieran permitir a los lectores y usuarios de este manual obtener la mayor cantidad y calidad de datos durante la realización de futuros proyectos de investigación relacionados con estas temáticas.
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Estudios específicos 4
4.6 ESTUDIOS EXPERIMENTALES
Mariana Pueta1,2, Fabián G. Jara3, Marcelo F. Bonino1 & M. Gabriela
Perotti1
1 Laboratorio de Ecología, Biología Evolutiva y Comportamiento de Herpetozoos, INIBIOMA
(CONICET–UNComa), Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Medioambiente,
Centro Regional Universitario Bariloche- Universidad Nacional del Comahue, San Carlos de
Bariloche, Rio Negro, Argentina.
2 Departamento de Biología General, (CRUB-UNComa), Centro Regional Universitario
Bariloche-Universidad Nacional del Comahue, San Carlos de Bariloche, Rio Negro, Argentina.
3 Grupo de Ecología de Macroinvertebrados Acuáticos, INIBIOMA (CONICET–UNComa),
Instituto de Investigaciones en Biodiversidad y Medioambiente, Centro Regional Universitario
Bariloche- Universidad Nacional del Comahue, San Carlos de Bariloche, Rio Negro, Argentina.
4.6 Estudios experimentales 186
Las investigaciones en biología y ecología comienzan con la observación de
ciertos patrones o fenómenos que despiertan curiosidad. Estas observacio-
nes pueden variar en escala, desde escalas muy grandes y extensas (paisaje)
a escalas muy locales (una comunidad); también, pueden ser de largo o de
corto plazo. Si los patrones observados se relacionan con procesos naturales
reales, pueden constituir entonces modelos que explican un fenómeno bioló-
gico observado. Dicho fenómeno podrá ser validado a través de experimen-
tos siguiendo un diseño experimental (Caja 4.6.1)(1,2) (Ver también Sección 2
Diseño de Muestreo en este manual).
El diseño de experimentos rigurosos permite identificar relaciones causa y
efecto y umbrales de respuesta mediante una cuidadosa manipulación de
varios factores de interés, mientras se controlan otros factores que podrían
confundir los resultados o la interpretación de los mismos(3,4). En general, un
experimento es un procedimiento utilizado para verificar, refutar o validar
una o más hipótesis; normalmente, un experimento se puede ejecutar por
uno o más de los siguientes motivos: (a) determinar las principales causas de
variación en una variable respuesta medida, (b) identificar condiciones que
dan lugar a una respuesta máxima o mínima, (c) comparar las respuestas
obtenidas en diferentes escenarios de variables controlables, (d) obtener un
modelo matemático/biológico para predecir respuestas futuras(5).
En un contexto biológico, el término modelo a menudo se refiere a organis-
mos o especies que sirven como una plataforma ampliamente utilizada para
la investigación experimental. En anfibios, el enfoque experimental ha gene-
rado evidencias para una mejor comprensión de la fisiología, biología evo-
lutiva, ecología y comportamiento de estos organismos. Además de su valor
intrínseco como grupo de vertebrados, los anfibios se han destacado como
modelo animal en la investigación biológica y biomédica, en áreas como la
fisiología y la biología del desarrollo, principalmente. Un ejemplo de la im-
portancia que han tenido los anfibios, como organismos empleados en el
aporte de nuevo conocimiento a través de la experimentación biomédica, se
observa a través de la contribución de varios premios Nobel en fisiología y
medicina que han involucrado la experimentación con anfibios como anima-
les de laboratorio, lo que ha aportado a innumerables tratamientos y terapias
para humanos, así como grandes avances en la comprensión de los princi-
pios básicos de genética, fisiología, bioquímica y comportamiento animal(6).
También los anfibios son utilizados como modelo para abordar paradigmas
fundamentales en ecología, por ejemplo, aspectos relacionados a competen-
cia intra- e inter-específica, interacción depredador-presa, parasitismo, en-
tre otros(7-10). En las últimas décadas los anfibios han resultado ser modelos
sumamente adecuados para el estudio de diferentes problemáticas tanto a
4.6 Estudios experimentales 187
Caja 4.6.1 - Esquema generalizado de los componentes lógicos de un
programa de investigación. Adaptado de Underwood(1)
escala global como regional, como el estudio de estresores antropogénicos
tales como la pérdida de hábitat, la contaminación (11,12, citando solo un par
de ejemplos de Argentina), la introducción y/o translocación de especies que
4.6 Estudios experimentales 188
pueden resultar invasoras (ejemplo en Argentina:13), las enfermedades emer-
gentes (14; en Argentina15-17), y el cambio climático global(18-23). También los
anfibios han constituido un modelo de estudio en enfoques de biología evo-
lutiva del desarrollo (“Evo-Devo”)(24) con abundantes estudios en Argentina
como, variación y diversificación morfológica (e.g.25-28), desarrollo músculo-
esqueleto (e.g.29).
La experimentación en biología debe incluir un diseño experimental ade-
cuado y un uso apropiado de análisis estadísticos en un marco de prueba
de hipótesis (30,31; ver también Sección 2, Diseño de Investigación de este
Manual). Por lo general, luego de formulada la pregunta o hipótesis a tes-
tear, en un experimento se debe poder identificar factores o variables in-
dependientes (tratamientos o condiciones) que se vinculan con las causas
que queremos estudiar y variables respuesta o dependientes (características
o rasgos a medir en los individuos experimentales) que se relacionan con
los efectos a estudiar. En términos generales, la limitación más importante
sobre una correcta interpretación del resultado de un experimento se debe
a la dificultad de diferenciar el efecto de un tratamiento del efecto de otros
factores no controlados en el diseño, lo cual puede conducir a una confusión
de diferencias entre tratamientos. El experimento más simple consiste en va-
riar una sola condición (la variable independiente) y medir una o más varia-
bles respuesta, mientras se mantienen constantes todas las demás condicio-
nes(31). Los efectos de variar la condición (efecto del tratamiento) se evalúan
por comparar la/las variables respuesta medidas para un grupo de sujetos
(o unidades experimentales) que suele denominarse grupo de tratamiento o
grupo experimental, con otro grupo de individuos (o unidades experimen-
tales) denominados grupo control(3,31). El control es de suma importancia en
todo experimento y es uno de los puntos más importantes del enfoque ex-
perimental(3,30). Idealmente, los sujetos o unidades experimentales deben ser
asignados aleatoriamente a los grupos experimentales y al control y trata-
dos de manera idéntica, excepto con respecto a la variable independiente en
estudio(31). Diseños con muchos tratamientos o factores combinados deben
usarse con cuidado, especialmente porque en los estudios biológicos la inte-
racción entre efectos es común y además porque resulta complicado luego
analizar las interacciones entre los factores. En el caso de trabajar con más
de un tipo de variable independiente o tratamiento, el diseño experimental
debe ser lo suficientemente adecuado para poder establecer causas princi-
pales y/o interacciones de dichos tratamientos sobre la variable respuesta.
En este sentido al aumentar el numero de tratamientos se incrementaran los
grupos experimentales y con ello será necesario incrementar el número de
réplicas para poder obtener conclusiones valederas.
4.6 Estudios experimentales 189
La mayoría de los estudios experimentales en anfibios se han realizado con
estados embrionarios o larvales ya que son más fáciles de mantener en con-
diciones experimentales que los juveniles o adultos, asimismo esto puede
depender mucho de cada especie o de la pregunta o hipótesis que se for-
mula(32,33). Los experimentos pueden realizarse puertas adentro ya sea en un
área experimental de laboratorio o en incubadoras o cámaras tipo “Walk-in”
(espacios completos adecuados con condiciones que puedan ser controla-
das, como temperatura, fotoperíodo), o pueden realizarse al aire libre. Al
aire libre, pueden realizarse en ámbitos más “naturales”, ya sea en tanques
y/o recipientes en los exteriores de un predio o laboratorio o en clausuras
(mesocosmo) colocadas directamente en los humedales en el caso de esta-
dios embrionarios y larvarios (ver Figura 4.6.1), o sitios terrestres habitados
por juveniles y adultos de las especies bajo estudio. Un mesocosmo es un
sistema experimental (clausura) al aire libre que examina el entorno natu-
ral en condiciones en las que pueden controlarse ciertas variables y pue-
de definirse como un recinto experimental de entre 1 a varios miles de li-
tros de capacidad(34,35). En el caso de larvas de anfibios es aconsejable contar
con recipientes relativamente pequeños (de entre 1 a 5 litros de capacidad).
Para experimentos simulando sistemas acuáticos lénticos, los mesocosmos
son una herramienta fundamental, especialmente si los experimentos son
de mediano o largo plazo ya que permiten generar condiciones ambientales
intermedias entre experimentos en microcosmos más pequeños y la mayor
complejidad biológica de los sistemas naturales, en los que suelen no poder
identificarse las relaciones mecanicistas(34,35). Recipientes más pequeños y sin
la complejidad ambiental de un mesocosmo acuático se utilizan en experi-
mentos a corto plazo o para la evaluación de ciertas preguntas puntuales de
experimentos más complejos. La experimentación con juveniles o adultos de
anfibios es más compleja dado los requerimientos de mantenimiento para
asegurar el bienestar de los animales. En general se utilizan terrarios con
vegetación natural, humedad constante o una fuente de agua y provisión de
alimento(36-40). En muchos casos estos experimentos complementan estudios
a campo, son de corta duración y es una gran ventaja la cercanía del lugar
experimental y los sitios de colecta(37,40-42). Mesocosmos terrestres para man-
tener anfibios en estadios post-metamórficos, juveniles o adultos se suelen
utilizar en experimentos relacionados con temáticas de disturbios ambien-
tales de origen antrópico, como contaminantes(20,34,43,44), y también cuando se
plantean preguntas teóricas relativas a estudios morfológico-funcionales, fi-
siológicos, por nombrar solo algunas temáticas de estudio (e.g.45).
4.6 Estudios experimentales 190
Figura 4.6.1. Mesocosmos colocados
en ambientes naturales (clausuras),
en este caso empleados en estudios
de interacciones tróficas que inclu-
yen anfibios. Estas clausuras per-
miten el intercambio de agua con el
exterior facilitando la alimentación
de las larvas de anuros. Foto: F. Jara.
4.6.1 Métodos, técnicas y protocolos previos y durante
los ensayos experimentales
i) Consideraciones y protocolos para minimizar exposición y transmisión
de patógenos. Uso y desinfección del material que se emplea en el campo
El trabajo de campo con anfibios en cualquiera de los estadios de desarrollo
de su ciclo de vida implica, en general, tener contacto, ingreso y manipula-
ción con ambientes acuáticos de distinto tipo, tanto lóticos como lénticos. Por
lo tanto, es necesario tener en cuenta una serie de consideraciones y recomen-
daciones. Se desarrollan brevemente, a modo de recordatorio, ciertas pautas
de cuidado, ya que este apartado también está desarrollado en la Sección
4.10 Registro de hongos. Protocolos en campo y laboratorio de este Manual.
Consideraciones generales
Es importante tener en cuenta que resulta conveniente tener conjuntos o gru-
pos de elementos y equipo de muestreo menor (redes-bateas-baldes, etc.)
que posibiliten su utilización, indefectiblemente, SOLO en la localidad de
estudio SIN INTERCAMBIO entre otras localidades.
En el caso que el equipo sea reutilizable y que no pueda ser replicado para su
uso individual en distintos sitios, ya sea por su costo o por su tamaño (botas-
Waders-aparatos multiparamétricos del tipo de registro de oxígeno disuel-
to, pH, conductividad, etc.), es imprescindible que se siga un protocolo de
4.6 Estudios experimentales 191
desinfección cada vez que se termina con la visita a un sitio de estudio, para
evitar translocación de organismos (e.g.: algas) o transmisión y dispersión de
hongos, bacterias u otros patógenos.
Elementos de desinfección y tratamiento del material de muestreo em-
pleado
A continuación, se presentan una serie de pautas de cuidado y desinfección
de los elementos y el material de muestreo (Tabla 4.6.1; ampliada de la Sec-
ción 4.10, Registro de hongos. Protocolos en campo y laboratorio); dichas
pautas constituyen tanto elaboración de los autores de esta Sección por ex-
periencias propias, como recopilación de información de otras publicacio-
nes(46-48) y están enfocadas principalmente a minimizar la transmisión y dis-
persión de enfermedades presentes en especies de anuros de Argentina y la
región como: quitridiomicosis (Batrachochytrium dendrobatidis), ranavirus(15),
oomicetes(16,17,49-53); y también considerando la dispersión de otros organis-
mos considerados invasores, recientemente detectados, como el alga “Didy-
mo” (Didymosphenia geminata), que ya está presente en diferentes cuerpos
de agua de Argentina (e.g.: ambientes fluviales y lacustres a lo largo de la
Patagonia Andina desde Neuquén a Tierra del Fuego)(48,54).
De acuerdo a lo anteriormente presentado, resulta imperativo cumplir con
dichas recomendaciones cuando se trabaja con anfibios, además constituye
una responsabilidad promulgarlas en otros grupos de investigación cuyas
tareas estén asociadas a muestreos y trabajo de campo en ambientes acuáti-
cos lóticos o lénticos. A partir del trabajo conjunto con diferentes organismos
nacionales, provinciales y municipales, se diseñó un protocolo que derivó en
una resolución emitida por la Administración de Parques Nacionales, sobre
la importancia de estas prácticas (Resolución Nro. 000774, 2010-Apéndice
4.6.1). También es importante tener en cuenta todas estas pautas cuando se
trabaja entre áreas antropizadas y áreas prístinas. Por ejemplo, los ambientes
acuáticos urbanos están muy impactados, muchos de los cuales reciben una
gran variedad de sustancias químicas, bacterias, etc. que podrían ser trans-
portadas a aquellos humedales más prístinos o ubicados en áreas protegidas
o mejor conservadas.
ii) Consideraciones sobre registro de datos ambientales y colecta de mate-
rial biológico (adultos, larvas y huevos) en ambientes naturales
Consideraciones generales
Para el estudio de anfibios en un contexto en el que se va a trabajar siguiendo
un diseño experimental es necesario tener claro como primer paso, cual es
la pregunta, objetivo o hipótesis a estudiar. Asumiendo que la pregunta está
4.6 Estudios experimentales 192
formulada, el paso siguiente requiere revisar la metodología completa de
colecta que se va a emplear, esto incluye considerar la solicitud de permisos
de trabajo teniendo en cuenta todas las jurisdicciones que correspondan (Na-
cional, Provincial, Municipal, ver Sección 5) y realizar un listado, revisión
y chequeo de todo el equipo necesario para el trabajo que se realice en la
naturaleza.
Una vez establecido todo el material y equipo necesario para el estudio, se
debe chequear todo aquel que requiera calibración, baterías, uso de memo-
Tabla 4.6.1. Métodos de desinfección
de material de campo cuando se
trabaja en ambientes acuáticos (las
especies de Oomycetes que se citan
infectan anfibios con distribución
en Argentina(16,83); alga invasora
Didymo48).
PROPÓSITO DESINFECTANTE CONCENTRACIÓN TIEMPO PATÓGENO
Desinfección
equipo tipo
quirúrgico (pinzas,
tijeras, etc.)
Etanol 70% 1 minuto Quitridio
Ranavirus
Agua caliente 100 °C 10 minutos
Oomycetes
(Saprolegnia, Achlya,
Scoliolegnia)
Desinfección
equipo de colecta
y recipientes de
colecta
Hipoclorito de
Sodio (Lavandina
de uso doméstico)
4% 15 minutos Quitridio
Ranavirus
2% mínimo 1
minuto Didymo
Secar
completamente
3 horas o
más Quitridio
Calor 60 °C
5 minutos Quitridio
15 minutos Ranavirus
20 minutos Didymo
37 °C 4 horas Quitridio
Esterilización con
RUv 1 minuto Ranavirus
(solamente)
Enjuague con
agua hervida 100 ° C varios
enjuagues
Oomycetes
(Saprolegnia, Achlya,
Scoliolegnia)
Desinfección de
botas/wader
Hipoclorito de
Sodio (Lavandina
de uso doméstico)
4% 15 minutos
Quitridio
Didymo
Oomycetes
(Saprolegnia, Achlya,
Scoliolegnia)
2% por lo menos
1 minuto Didymo
Secar
completamente
3 horas o
más
Quitridio
Didymo
Desinfección de
telas o prendas
usadas en el campo
Agua caliente 60 °C o más
5 minutos Quitridio
1 minuto Didymo
15 minutos Ranavirus
varios
enjuagues
Oomycetes
(Saprolegnia, Achlya,
Scoliolegnia)
4.6 Estudios experimentales 193
ria, actualización de software u otro requerimiento particular (aireadores,
heladeras portátiles con conexión a baterías, linternas, pH-metros, oxímetro,
termómetros digitales, cámaras fotográficas, notebooks, teléfonos celulares,
dataloggers, uso de lápiz para evitar que las anotaciones no se borren con el
contacto con el agua, es recomendable también usar papel que pueda mojar-
se y no romperse como papel de tela, etc.).
Algo importante a tener en cuenta en relación a los organismos que se van a
colectar es la posibilidad de exposiciones previas de dichos organismos con
ciertos estímulos que puedan influir de manera no controlada en los expe-
rimentos. A los organismos que no han sido expuestos a ciertos factores de
interés suele denominárselos individuos “naïve” o “no expuestos”. Un ejem-
plo típico está relacionado con la capacidad de los embriones de detectar
estímulos químicos desde estadios muy tempranos del desarrollo(55). Enton-
ces, en un experimento que, por ejemplo, estudia el efecto de claves quími-
cas de depredadores sobre el comportamiento y morfología de renacuajos,
la opción más adecuada es llevar anfibios adultos al laboratorio (machos y
hembras reproductivos) y estimular su reproducción en el laboratorio para
la obtención de huevos fecundados. Sin embargo, esto a veces puede resultar
logísticamente complicado, por lo que una opción muy utilizada también es
colectar embriones en estadios tempranos (gástrula), para asegurar que los
individuos a utilizar en el experimento no han tenido experiencia previa con
dichas claves químicas, no han llegado a “oler” estímulos del depredador. De
esta forma, al finalizar el experimento y comparar grupo experimental y gru-
po control, los resultados podrán asociarse al tratamiento aplicado y podrán
descartarse los efectos de exposición previa. También en larvas de anfibios
como en adultos podemos colectar organismos no expuestos a un factor a
estudiar. Por ejemplo, si se quiere estudiar el efecto de una especie exótica
sobre larvas o adultos de anfibios, bastará con colectar individuos de sitios
donde se conozca que históricamente no habita dicha especie exótica(56,57).
Localización y colecta de muestras
1) Huevos/masas de huevos. El conocimiento detallado, si es posible, del modo
reproductivo de la/las especies a estudiar facilitará el diseño de muestreo de
huevos o masas de huevos en el campo, tanto para ensayos que se realicen en
el laboratorio como en el campo. Esto es, conocer uno o mas aspectos como,
el periodo del año en que se desarrolla la actividad reproductiva, los sitios o
microhábitats que eligen para la oviposición las especies, las características
de los huevos y el tipo de ovipostura (Figura 4.6.2), la tasa y duración del
desarrollo, estadio y tamaño a la eclosión, y tipo de cuidado parental si lo
hay (ver Sección 3.1 Relevamiento de oviposturas y embriones de este Ma-
4.6 Estudios experimentales 194
nual para más detalles). En caso de ensayos experimentales en el laboratorio,
las masas de huevos pueden ser trasladadas en bolsas tipo “Ziploc”® o en
botellones plásticos.
2) Larvas. Las larvas pueden hallarse en diferentes tipos de hábitats, desde
cuerpos de agua someros, lagunas más profundas, arroyos, ríos y todos ellos
también podrán variar en su complejidad; por ejemplo, fondos con rocas, tron-
cos, o vegetación densa. Esta diversidad de ambientes y su complejidad hace
que, al momento de monitorear y colectar las larvas de anfibios deban em-
plearse diferentes técnicas; por ejemplo, el uso de redes permite barridos de la
columna de agua en cuerpos de agua someros y perímetros de lagunas más
profundas con poca vegetación. El uso de trampas embudo (Figura 4.6.3A, B)
resulta efectivo en hábitats profundos o con cierta complejidad (presencia de
piedras o rocas, troncos, o en el caso de presentar vegetación muy densa, cuan-
do es difícil el uso de redes), y el empleo de cercos que suele ser efectivo para
lagunas de gran superficie y cierta profundidad (Figura 4.6.3C; ver Sección 3.2
Relevamiento de renacuajos de este Manual para más detalles).
A B
C D
Figura 4.6.2. Tipos de ovipostura.
A. Pleurodema thaul- cordones gelati-
nosos adheridos a vegetación de la
columna de agua; B. Pleurodema bu-
foninum- cordones gelatinosos dis-
persos entre vegetación de fondo de
humedales someros; C. Rhinella papi-
llosa- cordones gelatinosos dispersos
en el fondo de humedales rocosos;
D. Batrachyla sp.- huevos individua-
les ubicados en “nidos” entre la ve-
getación húmeda. Foto A: F. G. Jara;
Fotos B, C y D: M. G. Perotti.
4.6 Estudios experimentales 195
Es importante, de existir conocimiento previo, tener en cuenta los comporta-
mientos de las larvas de la/s especies de estudio ya que pueden ser relevantes
al momento de su colecta o muestreo en los hábitats naturales. Por ejemplo,
debemos considerar si tienen hábitos diurnos o nocturnos, si se movilizan
de manera solitaria o gregaria, y que tipo de micro-ambientes frecuentan.
En nuestra experiencia el uso de ciertos elementos resulta muy adecuado
para el traslado de larvas al laboratorio, como el uso de botellones/recipien-
A B
C
Figura 4.6.3. Empleo de trampas y
cercos en lagunas rocosas y profun-
das en Laguna Blanca, Neuquén. A
y B: Trampas embudo para captura
de renacuajos. C: Clausura con redes
en laguna profunda(83). Fotos A y B:
M. G. Perotti; Foto C: S. Ortubay, to-
mada de84
4.6 Estudios experimentales 196
tes plásticos, con tapa, con aireación mediante aireadores transportables y
teniendo en cuenta que dichos recipientes deben estar completos de agua
para evitar movimientos bruscos dentro de la botella/recipiente durante el
traslado.
3) Adultos. La inspección de potenciales sitios de reproducción de anfibios
requiere de una serie de visitas. Para aquellas especies con hábitos diurnos,
resulta más sencilla su detección, colecta y realización de ensayos tanto en
el campo, como en el laboratorio. Sin embargo, en su gran mayoría, los anfi-
bios presentan hábitos y actividad nocturna, hecho que puede dificultar su
detección (ver Sección 3.3 Relevamiento de postmetamórficos de este Ma-
nual para más detalles). Dependiendo del sitio a muestrear, la visita noctur-
na debe ser bien planificada pues puede resultar desaconsejada por factores
externos al estudio biológico en sí mismo (por ejemplo, en zonas urbanas
donde la seguridad es un aspecto que hay considerar). Por lo que una al-
ternativa puede ser la localización de huevos o masas de huevos, como un
método indirecto adecuado de detección de actividad de adultos. Lo más
recomendable es trasladar los adultos en cajas plásticas con aireación y papel
o algodón humedecido.
iii) Consideraciones para el montado y elementos para su ejecución en el
campo y en condiciones controladas en el laboratorio.
Antes de iniciar cualquier experimento se necesita definir claramente el ob-
jetivo o pregunta de manera de definir exactamente como se realizará el di-
seño experimental. Esto permitirá calcular, por ejemplo, la cantidad mínima
necesaria de unidades experimentales para poder obtener resultados confia-
bles (ver Sección 2 Diseño de Muestreo).
Por lo tanto, en esta sección el objetivo es describir en detalle aspectos prác-
ticos a la hora de montar un experimento o ensayo experimental, tratando
de aportar información útil y práctica, particularmente cuando los recursos
de tiempo, de espacio o de equipamiento puedan resultar escasos. Estas re-
comendaciones permitirán llevar adelante los estudios propuestos, basados
en una pregunta específica (hipótesis) y utilizando un diseño experimental
apropiado.
1) Adecuación y mantenimiento de los organismos
1.1. Huevos. En general, la extracción en la naturaleza de huevos o masas de
huevos involucra ciertos cuidados en su transporte al laboratorio. Es muy
importante tener en cuenta que las oviposturas o conjunto de huevos/em-
4.6 Estudios experimentales 197
briones deben sufrir la menor alteración posible durante su manipulación y
transporte, ya que los movimientos bruscos, impactos mecánicos sobre los
huevos, hipoxia, pueden ocasionar mortandad y además pueden interferir
en el tiempo de desarrollo(58). También el incremento drástico de la tempe-
ratura de los huevos durante el traslado de los mismos puede generar altas
tasas de mortalidad por lo que trasladar los mismos en recipientes refrigera-
dos es la mejor opción.
Para su mantenimiento en el laboratorio, previo al montado de los ensayos
experimentales, las bateas o piletas de gran capacidad (500 L) resultan ade-
cuadas, ya que posibilitan suficiente espacio. Se debe tener en cuenta la ubi-
cación de las mismas, evitando áreas donde reciban sol directo que pueda
generar un rápido incremento de la temperatura. También, es importante
que el agua sea declorinada como se explica más adelante (ver en Acondi-
cionamiento de las unidades experimentales”). Cuando se encuentran en el
exterior es importante considerar cubrir con tul o malla mosquitera las pile-
tas de mantenimiento y cría, para que de esta manera se evite el ingreso de
aves o insectos depredadores y al mismo tiempo permita el ingreso de la luz
solar que es muy importante para el desarrollo de huevos y larvas. El agua
de estos contenedores con huevos debe ser monitoreada regularmente, así
como el estado de los huevos y considerar que, si hay evaporación, deberá
reponerse la cantidad evaporada.
El empleo de recipientes como vasos y capsulas de Petri (Figura 4.6.4A) sue-
len ser útiles en el montado de unidades experimentales (réplicas) cuando se
trabaja con huevos/embriones de anuros, donde se puede ubicar un número
establecido de los mismos, que dependerá de la pregunta y el diseño experi-
mental. Muchas veces, el material de vidrio especifico de laboratorio (vasos
de precipitado) es costoso, por lo que puede ser reemplazado por otros reci-
pientes, por ejemplo, porta-velas de vidrio (Figura 4.6.4B) o vasos de plástico
(recipientes plásticos, en general de 500 ml o de menor capacidad; Figura
4.6.4C), aunque es recomendable el uso de vidrio para evitar descartar plás-
ticos al final de los ensayos y como hábito de cuidado del ambiente.
En casos particulares como la determinación del número de huevos en la
ovipostura, existen herramientas y métodos sencillos:
a. Detección y conteo de oviposturas. Hay especies que resultan más senci-
llas de estudiar como las que suelen ubicar sus huevos en cordones o masas
gelatinosas en las orillas de humedales y lagunas, ya sea libres o adheridas
a la vegetación sumergida, ya que son fácilmente detectables a simple vista.
Otras especies ubican las oviposturas debajo de troncos, en cavidades de
troncos o suspendidas o formando nidos sobre vegetación (Figura 4.6.2D).
4.6 Estudios experimentales 198
En todos los casos es conveniente recorrer los ambientes, el perímetro com-
pleto del sitio de estudio en el caso de lagunas someras, marcar las ovipostu-
ras con algún tipo de identificación (plástico, tela), de manera de identificar
y realizar conteos precisos a lo largo de sucesivos muestreos o visitas.
b. Conteo de huevos. Respecto al conteo de huevos en ambientes natura-
les y en el laboratorio en especies con diferentes modos reproductivos, se
recomiendan a continuación una serie de métodos posibles a realizar en el
campo (conteo a simple vista) y otros combinando otras herramientas en el
laboratorio, como análisis de fotografías, uso de lupa, etc., dependiendo del
modo reproductivo
c. Conteo de huevos a simple vista (“ojo desnudo”) en el campo. Un mé-
todo simple es el empleo de bateas blancas graduadas o cuadriculadas que
puedan estar inmersas en la columna de agua, de manera de alterar lo menos
posible a la masa de huevos (Figura 4.6.5, panel superior). De esta manera,
el fondo blanco permite mejor visibilidad y distinción de los huevos como
unidades para su conteo; así mismo la graduación facilita también el conteo.
Por otro lado, se debe considerar, en caso que se desee optimizar el tiempo
de trabajo de campo, realizar fotografías de dichas oviposturas en las bateas
para su posterior conteo en el laboratorio. En algunos casos las oviposturas
A B
C
Figura 4.6.4. A. Uso de Cápsulas de
Petri; B. Uso de porta-velas de vi-
drio; C. Vasos plásticos. Fotos: M. G.
Perotti.
4.6 Estudios experimentales 199
son terrestres y estas se sitúan en el suelo húmedo del bosque que circunda
los humedales (Figura 4.6.6A). Este es el caso de algunas especies del género
Batrachyla (e.g. B. taeniata y B. leptopus59) en este caso los huevos son puestos
a fines del verano sobre el suelo, o bien semienterrados y cubiertos por detri-
tus orgánicos (Figura 4.6.6B). Para contar el tamaño de puesta en estos casos
es necesario recurrir a pinceles pequeños para ir removiendo de a poco la
capa de sedimento y así ir colectando con una espátula o cuchara todos los
huevos que componen la puesta.
d. Conteo de huevos en el laboratorio: los huevos de anfibios pueden con-
tarse a “ojo desnudo”, o como se señaló anteriormente, a través de fotografías
realizadas en el sitio de estudio. En el caso del conteo de huevos mediante
fotografías deben considerarse ciertas pautas: debe procurarse una fotogra-
fía en la que la mayor parte de la imagen se encuentre en foco (para ello una
toma cenital es lo recomendado), una iluminación adecuada, homogénea,
evitando sombras. En la medida de lo posible, si la cámara lo permite, utili-
zar modalidad manual, tomando nota de la distancia focal, sensibilidad ISO
y velocidad de obturación. Lo ideal es unificar las condiciones lumínicas y
parámetros para todas las fotografías.
Figura 4.6.5. Panel superior, reci-
pientes graduados. Panel inferior,
marcas por conteo a través de soft-
ware ImageJ. Fotos: M. G. Perotti.
4.6 Estudios experimentales 200
Para el procesamiento de datos, en este caso el conteo de huevos de una
fotografía, una herramienta muy versátil y muy usada es el software libre
“ImageJ” (https://imagej.nih.gov/ij/; Figura 4.6.5 panel inferior).
1.2. Larvas. Basados en nuestra experiencia y la de otros investigadores (e.g.:60,
https://www.ieu.uzh.ch/en/research/ecology/change/labprotocols.html), las
larvas no se mantienen saludables cuando se crían y mantienen por tiempo
prolongado dentro del laboratorio, con luz artificial y en recipientes de menos
de 1 L de capacidad. Contrariamente y en general, se mantienen en buenas
condiciones si son criadas en piletas o contenedores en el exterior del laborato-
rio, cuidando la ubicación de las piletas, las condiciones del agua, la incidencia
de luz y la protección por ingreso de depredadores u otros organismos. Cuan-
do el experimento requiere el empleo de recipientes pequeños que típicamen-
te se usan dentro del laboratorio o la cámara incubadora, como alternativa
estos recipientes pueden ubicarse en un recinto al aire libre (e.g.: Gazebo) que
permite ciertas variaciones ambientales naturales en luz y temperatura y dón-
de puede llevarse a cabo el experimento (Figura 4.6.7).
Para el mantenimiento de las larvas, se debe establecer un protocolo siste-
matizado de alimentación, que dependerá del tipo de pregunta formulada
para el experimento o ensayo, y de la especie y de la velocidad con la que se
pretende que las larvas crezcan. Si el recipiente de mantenimiento lo permi-
te, es importante evaluar la velocidad a que las larvas dejan de tener comida
disponible para reponerla. Si los recipientes son muy chicos se recomienda
extraer el excedente del alimento y renovar el agua frecuentemente para evi-
tar que el agua pierda sus cualidades. Recomendamos como alimento una
mezcla de algas/fitoplancton y proteína brindada por comida para peces,
para lo cual, utilizamos uno o dos tipos de microalgas de fácil cultivo (e.g.,
Scenedesmus sp., Chlamydomonas sp., entre otras), en combinación con comida
para peces de agua dulce (VitaFish®)61. En el caso de mesocosmos con mucho
sustrato y fitoplancton dicha mezcla puede administrarse como suplemen-
Figura 4.6.6. Ejemplo de especies
que colocan sus huevos en tierra.
A. zonas secas aledañas al humedal
donde Batrachyla taeniata y B. lepto-
pus depositan los huevos; B. huevos
de B. taeniata semienterrados por de-
tritus. Fotos: F. G. Jara.
4.6 Estudios experimentales 201
taria ya que permite asegurar la presencia de suplemento proteico. Asimismo,
los recipientes pequeños pueden necesitar de limpieza diaria del fondo con
un “limpiafondo” que puede realizarse con una manguera pequeña (como las
típicas mangueras empleadas con aireadores en peceras). Cabe destacar que
si los renacuajos son carnívoros habrá que reemplazar el alimento vegetal por
invertebrados acuáticos o bien larvas de otros anuros de los cuales se alimenta.
El uso de pipetas automáticas o micropipetas de hasta 1000 µL (Figura 4.6.8)
suele ser de mucha utilidad a la hora de establecer una alícuota similar para
todos los sujetos experimentales. Dichas pipetas son muy útiles también
para la manipulación de cualquier estimulo experimental de fase liquida,
por ejemplo, claves químicas.
1.3. Adultos. Para el mantenimiento de juveniles o adultos de anfibios suelen
utilizarse terrarios (acuarios) de vidrio o cajas plásticas. En todos los casos
es deseable que los recintos estén ubicados en lugares con mínimo disturbio
para ayudar a minimizar el estrés de los animales. Los recintos más simples
y que suelen usarse en situaciones de mantenimiento a corto plazo, son re-
cintos con un sustrato de toallas de papel con humedad constante y algún
tipo de refugio(38,39,41). Lo óptimo sería mantenerlos en un recinto con vege-
tación natural y cierta complejidad ambiental que incluya zonas con agua,
refugios, rocas, etc.(36,40,62). Los alimentos más utilizados son gusanos, moscas
Figura 4.6.7. Carpa gazebo ubicada
en el jardín del laboratorio. Foto: M.
Pueta.
4.6 Estudios experimentales 202
de la fruta (Drosophila sp.) o pequeños grillos(36-40). La densidad de animales
por recinto no solo dependerá del tamaño del mismo sino también del obje-
tivo de estudio y de las interacciones sociales que entre ellos puedan suceder
(e.g.: intercambio de estímulos químicos, agresión)(41,62). Si el mantenimiento
es en un lugar cerrado debe sistematizarse y controlarse el ciclo de luz-oscu-
ridad y la temperatura adecuada según la época del año y/o el objetivo del
estudio. En el caso de experimentos en mesocosmos terrestres, estos recintos
suelen también ser los de mantenimiento y suelen estar construidos de plás-
tico, o de tela plástica y malla metálica o de aluminio. En muchos casos los
mesocosmos para mantenimiento y experimentación con anfibios adultos se
hacen utilizando sólo paredes artificiales y aprovechando el suelo natural,
en esos casos se debe tener en cuenta la profundidad de dichas paredes para
evitar que los anfibios escapen cavando, y en todos los casos es aconsejable
algún tipo de cobertura semitransparente para que los anfibios no puedan
escapar ni ser atacados por depredadores.
2) Montado de experimentos
En general, para montar un experimento se recomienda tener en cuenta la
ubicación de las unidades experimentales (réplicas) tanto en exterior como
Figura 4.6.8. Pipeta automática.
Foto: V. H. Meneses
4.6 Estudios experimentales 203
en interior (laboratorio), ya que se necesita controlar las variables que po-
drían, si no son controladas, producir resultados y conclusiones erróneas.
Por ejemplo, estas variables podrán ser: la luz (diferencias en la exposición al
sol y la sombra; diferencias en la intensidad de iluminación, en el caso de uso
de estantes en un laboratorio o incubadora o cámara “Walk-In”), la inclina-
ción del terreno, etc. Vamos a dar un ejemplo: supongamos un experimento
en que buscamos determinar si el volumen de agua (experimentos conocidos
como efectos del hidroperíodo) afecta atributos en las larvas de anfibios. Si
nuestra metodología consiste en modificar el volumen de agua (modificar el
hidroperíodo) en nuestras unidades experimentales, y las mismas se encuen-
tran a la intemperie, éstas deberán estar alojadas debajo de un techo o inver-
nadero para evitar que las precipitaciones alteren nuestros tratamientos y
poder nosotros controlar la variacion del hidroperiodo deseada en nuestro
diseño experimental.
Cuando se trabaja con mesocosmos, en cámaras incubadoras o habitaciones
adecuadas con control de variables como temperatura y luz (cámara Walk-In)
con estanterías donde se ubicarán las réplicas del experimento, es conveniente
planear el empleo de bloques aleatorios donde los tratamientos se distribuyan
al azar en cada bloque (un bloque puede ser un estante en el laboratorio; un
área en el terreno que contenga representados los distintos tratamientos; un
contenedor o pileta compartimentada). Cada bloque entonces contendrá una
réplica de cada tratamiento. Por ejemplo, en la Figura 4.6.9 se muestra un es-
quema de una pileta donde se ha tabicado de manera de representar en dicha
unidad (bloque) tres tratamientos. Podría ser un bloque donde cada comparti-
mento representa un tipo de estímulo (1-químico, 2-visual, 3-sin estímulo) por
parte de los depredadores empleando jaulas en los mesocosmos (ver a conti-
nuación ejemplo de estimulación visual y química de depredadores). De esta
Figura 4.6.9. Ejemplo de Pileta com-
partimentada a modo de bloque.
4.6 Estudios experimentales 204
manera, durante el procesamiento de datos, el análisis estadístico en bloques
permitirá eliminar el sesgo (la confusión), si es que existe, por ejemplo, por la
ubicación de las unidades experimentales en ambientes que no son totalmente
homogéneos en sus condiciones (diferente exposición a la luz).
Muchas veces es necesario readecuar las incubadoras para permitir introdu-
cir aireadores que brinden oxígeno para los recipientes de trabajo y de esta
manera controlar también esta variable (oxigenación de los recipientes) que
podría introducir sesgo a los experimentos. Los recipientes de hasta un litro
pueden adquirirse como insumos de vidrio para laboratorio o en cotillones
en el caso de vasos plásticos de hasta un litro. Las piletas de mantenimiento
o los mesocosmos de experimentación pueden ser de fibra de vidrio o lona
similar a las piletas Pelopincho®, o bebederos para animales de granja. Los
mesocosmos acuáticos medianos también se pueden armar a partir de reci-
pientes plásticos fáciles de adquirir (palanganas; Figura 4.6.10).
Figura 4.6.10. Piletas de manteni-
miento con marcos que permiten
montar filtros o mallas y distintos
tipos de mesocosmos acuáticos ubi-
cados en el exterior del laboratorio.
Fotos: M. G. Perotti, F. Jara.
4.6 Estudios experimentales 205
Acondicionamiento de las unidades experimentales
-Previamente al armado de un experimento, todos los recipientes que vayan
a emplearse tanto nuevos como reciclados, tendrán que ser lavados adecua-
damente para retirar cualquier resto de alimento u olores que alteren el com-
portamiento de los animales experimentales, deben eliminarse los rótulos
viejos, así como tener en cuenta el protocolo de desinfección explicado en el
apartado anterior.
-Luego, los recipientes o mesocosmos deben ser llenados con agua en caso
de trabajar con embriones y larvas, o poner una mínima cantidad de agua
en caso de trabajar con adultos. En general se observan dos variantes en
los trabajos publicados, una es directamente colocar agua declorinada
(eliminando el cloro que pudiera contener, si es agua de red), que puede
obtenerse teniendo recipientes de gran volumen donde se deje el agua el
tiempo necesario para la evaporación por completo del hipoclorito de so-
dio (24-48 hs). La otra variante es con agua filtrada del humedal de donde
provienen los animales experimentales. En el caso de trabajar con mesocos-
mos, la opción de utilización de agua filtrada del ambiente original facilita
que los mesocosmos rápidamente desarrollen fitoplancton, facilitando la
alimentación de los animales y permitiendo un ambiente con condiciones
más similares al natural. Tanto en acuarios como en mesocosmos puede
agregarse un fondo o sustrato, que puede ser hojarasca o sedimento de
las lagunas, plantas acuáticas o bien plantas artificiales confeccionadas con
plástico, etc. (Figura 4.6.11). No es recomendable el uso de agua filtrada del
humedal en el caso de trabajar con estímulos químicos naturales, ya que el
filtrado no elimina dichos estímulos. Por otro lado, cuando se introduzcan
elementos provenientes del ambiente natural habrá que controlar que no
contengan ninguna especie animal como caracoles, sanguijuelas, larvas o
adultos de insectos depredadores, etc.
Los mesocosmos terrestres se construyen típicamente incluyendo el suelo
natural en su instalación; sin embargo, las jaulas o tanques sobre el suelo
también pueden usarse para manipulaciones terrestres con la adición de sus-
tratos y condiciones ambientales apropiadas(34). Los mesocosmos terrestres
pueden ser muy complejos y costosos ya que se debe proporcionar suficiente
espacio para que los animales realicen actividades terrestres críticas como
alimentarse, excavar e invernar y al mismo tiempo permitir contar con sufi-
cientes réplicas(34,44). Finalmente, en algunos casos, tanto en larvas de anfibios
como en adultos es posible llevar a cabo diseños experimentales completos
con preguntas sencillas directamente a campo, pero limitando las variables
a controlar(34,42,62-66).
4.6 Estudios experimentales 206
-Una vez que los recipientes o los mesocosmos están acondicionados podre-
mos proceder a distribuir los tratamientos entre las unidades experimenta-
les. Lo más adecuado es rotular colocando solo un código a cada unidad y
de esta manera tendremos la mínima información a la hora de registrar los
datos en cada réplica (doble ciego). Este tipo de metodología ayuda a dis-
minuir sesgos introducidos por el observador(31). Es importante que, en la
planilla final, al lado de cada código de la unidad experimental, se coloque
a qué tratamiento ha sido asignado, además de toda la información que sea
necesaria posteriormente en el análisis de datos.
-Proceder a alojar a los animales experimentales. Es muy importante saber
con cuántos animales experimentales se cuenta para poder asignar, por un
lado, igual número de réplicas por tratamiento y por otro, igual cantidad de
Figura 4.6.11. Diferentes elementos
como jaulas plásticas o complejidad
simulando vegetación. Foto: M. G.
Perotti.
4.6 Estudios experimentales 207
individuos por réplica, (excepto que se pretenda medir efectos de la densi-
dad de individuos). En el caso de experimentos de corto plazo realizados en
recipientes de 1 L o menos, y cuando existen problemas en la cantidad de
individuos disponibles para desarrollar el experimento, es preferible trabajar
con uno o pocos individuos por recipiente y muchas réplicas, que trabajar
con pocas réplicas y varios o muchos individuos por réplica. De esta manera,
el mayor número de réplicas dará resultados más confiables. Es importante
también tener en cuenta que, si se trabaja con varios individuos por réplica,
deberá considerarse la variable a medir como un promedio de los individuos
por réplica, ya que, si se consideran como datos individuales dentro de la
misma réplica incurrirá en “pseudoreplicación”(67) (consultar también Sec-
ción 2 Diseño de Muestreo). Si la cantidad de individuos por réplica/meso-
cosmo supera los diez individuos, en general se recomienda hacer reconteos
y asegurarse que el número de individuos sea igual en todas las réplicas.
Los individuos deben provenir de diferentes oviposturas (diferentes proge-
nitores-camadas) de una población, para controlar el efecto genético/paren-
tal que podría llevar a errores o sesgos en la interpretación de los resultados.
También si se quiere medir o controlar el efecto materno o de camada en el
diseño, se debe tener en cuenta el origen (camada o masa original de huevos)
de los individuos experimentales. En caso de querer medir efectos sobre di-
ferentes poblaciones será necesario colectar oviposturas de estas diferentes
poblaciones y mantenerlas separadas.
En el caso de cubrir las piletas o mesocosmos con tela semitransparente (tul
o malla mosquitera) que impida la colonización por otros animales o la acti-
vidad de depredadores, se debe tener en cuenta que esta cobertura permita
la observación por parte del experimentador.
Finalmente, como los anfibios presentan variaciones interanuales en la re-
producción, es probable que la disponibilidad en la cantidad de huevos/
embriones, larvas o adultos también varíe de un año a otro, por lo que siem-
pre hay que tener en cuenta estas variaciones antes de llevar a cabo un ex-
perimento. Si se quiere simular la densidad en condiciones naturales, habrá
que medir la densidad en la naturaleza para poder obtener una densidad por
área o volumen y luego adaptar esa densidad a las réplicas.
Complejización ambiental en las réplicas/mesocosmos
Otra consideración importante es el uso de elementos o dispositivos experi-
mentales dentro de los mesocosmos que sean necesarios para llevar a cabo
adecuadamente el experimento. En todos los casos dichos elementos y su
4.6 Estudios experimentales 208
distribución espacial deben ser similares en todas las réplicas, con la sola
variación del efecto a evaluar. Por ejemplo, al evaluar efectos indirectos de
los animales depredadores sobre las larvas de anfibios, es decir, cuando se
quiere evaluar el efecto de estímulos que indican peligro ya sea químicos
y/o visuales no debería verse afectada la supervivencia de las larvas por
depredación directa. Para esto, el uso de jaulas para mantener al depreda-
dor es muy adecuado, por lo general se confeccionan en plástico, de manera
sencilla, ya sea perforando botellas y cubriendo uno de sus extremos con tela
mosquitera; o directamente construidas con malla plástica (Figura 4.6.11).
En experimentos que incluyen el uso de jaulas, es necesario que todos los
mesocosmos contengan al menos una (incluidos los controles). Este aspecto
es muy importante para evitar resultados confusos como puede ser el efecto
de presencia de un elemento diferente (jaula) en los mesocosmos. Un ejem-
plo práctico con el uso de jaulas sería que, los mesocosmos que correspon-
dan al tratamiento que considere un efecto indirecto del depredador (quími-
co y visual) contengan una jaula con un depredador vivo, mientras que los
mesocosmos “control” contengan las jaulas vacías. Otro ejemplo de mayor
complejidad experimental podría ser el caso de querer separar el efecto de
estimulación visual del de estimulación química, entonces podrían asignarse
mesocosmos con jaulas con depredador vivo, otros con jaulas con una imi-
tación de depredador (confeccionado con material inocuo, e.g.: moscas de
pesca) y mesocosmos “control” con jaulas vacías.
Consideraciones para estudios comportamentales
El desarrollo de experimentos que involucren la medición de una o más
variables comportamentales requiere de ciertas consideraciones específicas
que se suman a todas las consideraciones experimentales que se han explica-
do previamente. Un punto crítico al momento de desarrollar un experimento
con registro de variables asociadas a rasgos de la conducta es que estas pue-
den ser moduladas a corto plazo por el ambiente circundante, los disturbios
sensoriales, la subjetividad del observador, las experiencias previas de los
animales, el bienestar de los animales en cautiverio, etc. Por lo tanto, las va-
riables de disturbio introducidas por el ambiente experimental o el experi-
mentador deben ser minimizadas o controladas.
Cuando una variable conductual sea registrada alternadamente por más de
un observador, es necesario establecer un criterio conjunto para dicho re-
gistro; lo más apropiado es realizar correlaciones entre registros de los dis-
tintos observadores, lo que se denomina fiabilidad inter observador. Estas
correlaciones son más fáciles de realizar cuando se cuenta con filmaciones
4.6 Estudios experimentales 209
de los animales desde las cuales luego se evaluarán los comportamientos.
Sin embargo, en experimentos donde no se puede filmar y las observaciones
de comportamiento son por observación directa, se pueden realizar prue-
bas piloto previas a las experimentales y generar dicha fiabilidad. Lo ideal
en el registro de conductas es filmar, de esta manera el disturbio generado
por el experimentador es mínimo y, además, al quedar el registro fílmico, se
pueden registrar varias variables desde una misma filmación que por obser-
vación directa podría ser muy complicado. Otra ventaja de filmar las eva-
luaciones de comportamientos, es poder hacerlo sobre más de una unidad
experimental a la vez si el tamaño del recipiente de experimentación no es
muy grande. Sin embargo, en mesocosmos acuáticos grandes, al aire libre y
con complejidad ambiental puede ser más pertinente la observación directa
que las filmaciones, ya que el reflejo en la superficie del agua es muy difícil
de evitar en las filmaciones. Una recomendación útil al momento de hacer
observaciones directas, tanto en mesocosmos montados directamente en si-
tios naturales como en zonas externas al laboratorio, es el uso de lentes po-
larizados, que por sus características de filtrado de la luz permiten ver más
fácilmente a través de la columna de agua; además, a la hora de planificar
el trabajo, tener en cuenta que los días ventosos dificultan la observación de
comportamientos bajo el agua, haciendo casi imposible la observación deba-
jo de la superficie del agua. En el análisis de videos, ya sea para análisis de
trayectorias, velocidad de desempeño locomotor, entre otros, existen varios
software libres, por ejemplo Tracker©, https://physlets.org/tracker/ que se
ha utilizado con éxito en estudios de desempeño(68). Para la toma de tiempos
en ciertos comportamientos también se puede usar directamente un cronó-
metro digital mientras se reproducen los videos. Recomendamos el libro de
Martin y Bateson(31) como una guía básica de protocolos de observación y
registro de comportamientos.
Los disturbios sensoriales deben ser tenidos en cuenta de acuerdo al esta-
dio de los anfibios y la pregunta planteada. Por ejemplo, olores ambienta-
les pueden ser de alto disturbio en el estudio con estímulos químicos entre
adultos de anfibios. O, las vibraciones en terreno (el acercamiento brusco de
un observador a un mesocosmo) pueden ser muy disruptivas para la eva-
luación de movimiento en renacuajos. Además, cuando las evaluaciones de
comportamiento requieren que los animales sean trasladados de su lugar de
mantenimiento al recinto experimental, se debe siempre prever un tiempo
de adaptación al nuevo recinto. Para experimentos de comportamiento de
corto plazo y especialmente si las evaluaciones de conducta se realizan sobre
un individuo por vez, es recomendable trasladar a los individuos de su lugar
de mantenimiento principal (e.g.: pileta) a nuevos recipientes que sean simi-
lares a los empleados en las evaluaciones y mantenerlos allí uno o dos días
4.6 Estudios experimentales 210
previos al comienzo del experimento. Siempre que se pueda, es ideal que
dichos recipientes de mantenimiento a corto plazo y los de evaluación sean
de materiales y tamaños similares.
El tiempo o la hora del día en el cual se generan los registros conductuales es
sumamente importante y debe mantenerse a lo largo de todo el experimento
y en la replicación de experimentos similares para que sean comparables.
Las condiciones de temperatura y fotoperiodo pueden ser controladas en el
caso de trabajar dentro de un laboratorio o ser aleatoriamente distribuidas
si se trabaja al aire libre. Igualmente, como mencionáramos antes, en el caso
de alta heterogeneidad ambiental, es importante considerar el trabajo en
bloques experimentales. Un caso especial a tener en cuenta es el estudio de
rasgos asociados a comportamientos reproductivos en adultos de anfibios,
como selección de vocalizaciones o discriminación de estímulos químicos;
en general estos experimentos deben realizarse durante la noche mediante
filmaciones con cámaras en modo nocturno(37,40). En el caso de no poder rea-
lizar experimentos durante la noche, una alternativa para experiencias en la-
boratorio es revertir el ciclo de luz oscuridad para que el investigador pueda
trabajar de día, pero se debe tener en cuenta el biorritmo y que los animales
estén adecuados fisiológicamente al modo nocturno(37).
En el caso de estudios donde la variable respuesta implica orientación es-
pacial de los anfibios, por ejemplo, en estudios de elección de estímulos, se
debe tener en cuenta la lateralización motora o de procesamiento visual en
anfibios, lo cual implica un sesgo innato en ciertos casos, o modulado por ex-
periencias previas en otros, en cuanto a la orientación de las repuestas hacia
“izquierda” o “derecha(69-71). La forma más común de controlar el sesgo de
laterización es alternando la orientación (frente-contrafrente) de los distintos
individuos experimentales al comenzar pruebas de preferencia o, alternar
el lugar de ubicación de los estímulos. En experimentos de selección, ubica-
ción espacial o preferencia, también deben mantenerse controladas las claves
contextuales (e.g.: la sala de experimentación) ya que los anfibios adultos po-
drían orientarse por otras claves contextuales distintas a las que se quieren
evaluar(72). Por ejemplo, si la sala experimental tiene paredes heterogéneas,
se puede establecer un perímetro alrededor del recinto experimental con una
cortina de tela o plástico de color uniforme.
En algunas situaciones experimentales se debe tener en cuenta si la variable
comportamental a registrar depende de cierto estado motivacional y/o fisio-
lógico de los sujetos experimentales. Por ejemplo, si se quiere evaluar qué
región del cuerpo de un renacuajo es preferida para ataques directos de un
insecto depredador se debería privar de alimento al depredador por algunas
4.6 Estudios experimentales 211
horas (dependiendo de cada especie y tiempo de digestión) para asegurarse
la motivación para atacar(73). También, si se quiere evaluar la conducta de
ramoneo o alimentación de renacuajos en función de ciertos estímulos con-
textuales se debería privar de alimento a los renacuajos un tiempo previo a la
evaluación para asegurar que están motivados para alimentarse(74).
En estudios de aprendizaje y conducta es muy importante el uso de animales
“naïve” o sin experiencia previa con ciertos estímulos de interés. En el caso
de renacuajos y estudios de aprendizaje relacionado a estímulos químicos
naturales es muy importante lo que mencionáramos previamente sobre la
colecta de embriones en estadio de gástrula. El uso de animales naïve es
excluyente si se quiere investigar si un comportamiento es innato o puede
ser modulado por aprendizaje(75). Asimismo, en la búsqueda de capacidades
de aprendizaje, si no se trabaja con animales naïve no se podrán separar
los efectos de mecanismos de aprendizaje previos (inhibición latente, ha-
bituación, sensibilización) de los resultados que se obtengan en el experi-
mento(76). Una excepción es cuando se estudian capacidades de aprendizaje
en contextos nuevos o con estímulos novedosos o artificiales, por ejemplo,
el aprendizaje por discriminación de geometría en anuros adultos(72). Otras
características de las larvas de anfibios a tener en cuenta particularmente
en estudios de aprendizaje y dependiendo del tipo de estudio a desarrollar
es el aprendizaje social. Por ejemplo, existe evidencia de transmisión social
del reconocimiento de depredadores en larvas de anfibios, incluso en espe-
cies que no son gregarias(77,78). En este sentido, cuando se evalúan respuestas
conductuales y particularmente capacidades de aprendizaje individual con
estímulos plausibles de aprendizaje social, es aconsejable realizar las evalua-
ciones con réplicas conformadas por un solo sujeto experimental.
Hay varias características de los estudios de comportamiento y de los de
aprendizaje que hace que los grupos control en el diseño no sean como los
típicos grupos control que hemos mencionado previamente (en el que sólo se
altera el tratamiento en estudio). Asimismo, un resultado de mediciones de
una conducta en función de un tratamiento dado tiene que poder asociarse
exclusivamente con la pregunta experimental y no así con disturbios am-
bientales o la metodología experimental. Mencionaremos algunos ejemplos
de controles experimentales específicos y algunos ejemplos de controles in-
ternos en el trabajo experimental. Por ejemplo, los grupos control en experi-
mentos de aprendizaje se diseñan en base al mecanismo de aprendizaje que
se quiera evaluar (e.g.: condicionamiento pavloviano, habituación-sensitiza-
ción, etc.) y están ampliamente explicados en la literatura; sin importar con
qué especie animal o con qué estímulos se trabaje, esos grupos control deben
estar presentes en el diseño experimental(75,77,79). La alta variabilidad indivi-
4.6 Estudios experimentales 212
dual en conductas como la locomoción en larvas de anfibios hace que sea
muy útil incorporar comparaciones de locomoción interindividual para ge-
nerar la variable respuesta final, por ejemplo, comparar la locomoción (tiem-
po, frecuencia, etc.) durante la exposición a un estímulo con la locomoción
previo a la exposición a dicho estímulo(61,75,79). En el estudio de la importancia
de señales visuales o químicas en anuros adultos el uso de moldes o dummys
es una forma de controlar ciertas características muy variables de los anuros
vivos que, para reducirlas en el diseño, se requeriría de un número muy alto
de réplicas. Por ejemplo, para evaluar el peso de claves visuales de machos
(e.g.: saco vocal) en la elección de pareja por una hembra en un test de do-
ble elección, Taylor y colaboradores(62,81) construyeron un molde de anuro
macho con saco vocal expansible y lo colocaron junto a un reproductor de
vocalizaciones. Con el molde se controlaban otras variables asociadas a un
individuo vivo (tamaño, color, motivación, etc.) y el control propiamente del
experimento lo constituía otro reproductor localizado del lado contrario y
sin molde de anuro macho junto a él(62,81). En otro caso, para evaluar el rol
de ciertas secreciones glandulares de machos en la elección de una hembra,
Brunetti y colaboradores (resultados no publicados) construyeron moldes de
anuros machos que colocaban junto a reproductores de vocalización y que
bañaban con secreciones glandulares o con agua (grupo control). De esta for-
ma el comportamiento de la hembra sólo podía tener como factor de cambio
las secreciones y no alguna otra clave asociada a un macho adulto vivo.
Consideraciones cuando se estudian aspectos relativos
al incremento de la radiación ultravioleta (RUV) y a
enfermedades infecciosas
Desde los años ’90 se ha comenzado a poner énfasis en estudios relativos al
efecto del cambio climático, el incremento de la RUV y diferentes enferme-
dades emergentes que han demostrado afectar la biología y ecología de los
anfibios, disminuyendo poblaciones e incluso ocasionando la desaparición
de especies, particularmente, en ambientes naturales “prístinos” donde hay
poco impacto humano.
Radiación Ultravioleta
Los estudios experimentales que buscan evaluar el efecto de la RUV sobre
embriones o larvas de anfibios pueden ser desarrollados tanto en incubado-
ras o cámaras tipo “Walk-in”, o pueden realizarse en el exterior con inciden-
cia de radiación solar natural. Es recomendable seguir algunas pautas indi-
cadas en varios apartados que fueron desarrollados anteriormente, a saber:
4.6 Estudios experimentales 213
Minimizar la manipulación de los individuos
Mantener la asepsia y cuidado de las condiciones del agua empleada
durante el desarrollo experimental
En el caso del trabajo experimental en el laboratorio es recomendable:
Limitar el tiempo de exposición del personal que manipula el set experi-
mental bajo incidencia de RUV al mínimo necesario.
Asegurar el empleo de gafas adecuadas por parte de todo el personal que
participe en la manipulación de organismos bajo lámparas e incubadoras
que emitan RUV
En cuanto a equipamiento, en el caso de estudios de RUV en laboratorio
existen incubadoras acondicionadas con iluminación UV y PAR (con lámpa-
ras UV-A: radiación entre 315 y 400 nanómetros; UV-B: radiación entre 280
y 315 nanómetros; y espectro visible o radiación fotosintéticamente activa
(PAR): radiación entre los 400 y los 700 nanómetros) (e.g. Incubadora San-
yo MLR-5®; Figura 4.6.12A). Pueden usarse lámparas especiales como lám-
paras fluorescentes del tipo Spectroline X-15-B (Spectronics Corp.®, y en el
caso de lámparas con el espectro visible (PAR) por ejemplo, Philips daylight,
TLT 40W/54RS® (Figura 4.6.12B)(82).
También, en caso de realizar experimentos de RUV con luz natural (radia-
ción solar), es usual para bloquear RUV el empleo de placas de policarbonato
que son testeadas con espectroradiómetro de manera de tener un control de
la cantidad de luz que estas placas están filtrando y en función de la necesi-
dad de filtrar mayor o menor intensidad de RUV (Figura 4.5.12C)(82).
Enfermedades Emergentes
El efecto deletéreo de estas enfermedades en el normal desarrollo del ciclo de
vida de los anfibios, considerados centinelas de calidad ambiental o bioindi-
cadores, puede estudiarse a través del trabajo experimental. Para ello es im-
portante, además de tener presentes los protocolos para minimizar la expo-
sición y transmisión de patógenos durante el muestreo (Tabla 4.6.1), seguir
ciertos protocolos al momento del montado de este tipo de experimentos.
A continuación, explicamos nuestra experiencia con la manipulación y mon-
tado de experimentos para el estudio del Oomycetes sobre embriones de
anfibios. Dicha experiencia corresponde a estudios en especies de mohos
acuáticos presentes en ambientes del bosque ecotonal del norte patagónico
como Saprolegnia sp., Achlya sp., Scoliolegnia sp. (Oomycetes). Las pautas y
recomendaciones a seguir serán:
4.6 Estudios experimentales 214
Mantener asepsia en todos los recipientes a emplear en los ensayos expe-
rimentales; para ello y evitando la contaminación de hongos provenien-
tes del campo, es aconsejable que los recipientes sean de vidrio, tratados
en estufa y secados.
Las oviposturas y/o larvas colectadas a campo, deben ser lavadas en la-
boratorio, con la menor manipulación posible y previamente al montado
del experimento según la siguiente metodología:
Figura 4.6.12. Experimentación con
embriones y larvas de anfibios. A.
Laboratorio, empleo de Incubadora
ad hoc Sanyo MLR-5; B. Uso de lám-
paras UV-PAR en incubadora (Spec-
troline X-15-B); C. Exterior, uso de
placas de policarbonato (empleada
como filtro en experimentos de ra-
diación ultravioleta con luz natural).
Fotos: M. G. Perotti.
A B
C
4.6 Estudios experimentales 215
El agua proveniente de los respectivos ambientes de colecta de los anfi-
bios debe ser hervida por al menos 10 minutos para asegurar la mortali-
dad de esporas y micelio de potenciales mohos acuáticos. Posteriormen-
te, el agua se deja enfriar para luego lavar mediante varios enjuagues los
embriones y/o larvas de anfibios a emplear en el ensayo(17,47).
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4.6 Estudios experimentales 219
Apéndice 4.6.1
4.6 Estudios experimentales 220
4.6 Estudios experimentales 221
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Article
Full-text available
Invasive predators can exert strong selection on native populations. If selection is strong enough, populations could lose the phenotypic variation caused by adaptation to heterogeneous environments. We compare frog tadpoles prior to and 14 years following invasion by crayfish. Prior to the invasion, populations differed in their intrinsic developmental rate, with tadpoles from cold areas reaching metamorphosis sooner than those from warm areas. Following the invasion, tadpoles from invaded populations develop faster than those from non-invaded populations. This ontogenetic shift overwhelmed the intraspecific variation between populations in a few generations, to the point where invaded populations develop at a similar rate regardless of climate. Rapid development can have costs, as fast-developing froglets have a smaller body size and poorer jumping performance, but compensatory growth counteracts some costs of development acceleration. Strong selection by invasive species can disrupt local adaptations by dampening intraspecific phenotypic variation, with complex consequences on lifetime fitness.
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Anuran amphibians of the Andean-Patagonian forest show a wide variety of adaptations to different aquatic environments and regional environmental conditions. These adaptations include particularities in their life cycles, such as that all or most of the cycle occur out of water. This work summarizes information about the life cycle of the anuran Batrachyla taeniata, or banded wood frog, which reproduces from midsummer to midautumn, laying eggs out of the water, in the moist soil, where they are incubated. Particularly our studies were carried out in the forest of the Llao Llao Municipal Park, where the species lives in different aquatic environments. Tadpoles hatch when autumn rains cause an increase in water level or during flooding of a wetland, in a state of development that allows them to feed immediately and continue their growth in the water at low temperatures for several months before arrival of spring. Through field observations and incubation of eggs under laboratory conditions we were able to determine the high dependence that exists between precipitation, temperature and the effective development of eggs and their subsequent hatching. Finally, we point out the potential effects of climate change on a regional scale and how this phenomenon could affect the survival of this common species of rainforests of the Nahuel Huapi National Park.
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Animal movement and dispersal are key factors in population dynamics and support complex ecosystem processes like cross‐boundary subsidies. Juvenile dispersal is an important mechanism for many species and often involves navigation in unfamiliar habitats. For species that metamorphose, such as amphibians, this transition from aquatic to terrestrial environments involves the growth and use of new morphological traits (e.g., legs). These traits strongly impact the fundamental ability of an organism to move in novel landscapes, but innate behaviors can regulate choices that result in the realized movements expressed. By assessing the integrative role of morphology and behavior, we can improve our understanding of juvenile movement, particularly in understudied organisms like amphibians. We assessed the roles of morphological (snout‐vent length and relative leg length) and performance (maximal jump distance) traits in shaping the free movement paths, measured through fluorescent powder tracking, in three anuran species, Pacific treefrog (Hyliola regilla), Western toad (Anaxyrus boreas), and Cascades frog (Rana cascadae). We standardized the measurement of these traits to compare the relative role of species' innate differences versus physical traits in shaping movement. Innate differences, captured by species identity, were the most significant factor influencing movement paths via total movement distance and path sinuosity. Relative leg length was an important contributor but significantly interacted with species identity. Maximal jump performance, which was significantly predicted by morphological traits, was not an important factor in movement behavior relative to species identity. The importance of species identity and associated behavioral differences in realized movement provide evidence for inherent species differences being central to the dispersal and movement of these species. This behavior may stem from niche partitioning of these sympatric species, yet it also calls into question assumptions generalizing anuran movement behavior. These species‐level effects are important in framing differences as past research is applied in management planning.
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Numerous factors are contributing to the loss of biodiversity. These include complex effects of multiple abiotic and biotic stressors that may drive population losses. These losses are especially illustrated by amphibians, whose populations are declining worldwide. The causes of amphibian population declines are multifaceted and context-dependent. One major factor affecting amphibian populations is emerging infectious disease. Several pathogens and their associated diseases are especially significant contributors to amphibian population declines. These include the fungi Batrachochytrium dendrobatidis and B. salamandrivorans, and ranaviruses. In this review, we assess the effects of these three pathogens on amphibian hosts as found through experimental studies. Such studies offer valuable insights to the causal factors underpinning broad patterns reported through observational studies. We summarize key findings from experimental studies in the laboratory, in mesocosms, and from the field. We also summarize experiments that explore the interactive effects of these pathogens with other contributors of amphibian population declines. Though well-designed experimental studies are critical for understanding the impacts of disease, inconsistencies in experimental methodologies limit our ability to form comparisons and conclusions. Studies of the three pathogens we focus on show that host susceptibility varies with such factors as species, host age, life history stage, population and biotic (e.g., presence of competitors, predators) and abiotic conditions (e.g., temperature, presence of contaminants), as well as the strain and dose of the pathogen, to which hosts are exposed. Our findings suggest the importance of implementing standard protocols and reporting for experimental studies of amphibian disease.
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Human activities have altered continental ecosystems worldwide and generated a major environmental crisis, prompting urgent societal questions on how to best produce goods while at the same time securing sustainable ecological services and raising needs to better understand and predict biodiversity and ecosystems dynamics under global changes. To tackle these questions, experimentation on ecosystems is necessary to improve our knowledge of processes and to propose scientifically sound management strategies. Experimental platforms able to manipulate key factors of global change and including state of the art observation methodologies are available worldwide but how to best integrate them has been rarely addressed. Here, we present and discuss the case of the national research infrastructure AnaEE France dedicated to the study of continental ecosystems and designed to congregate complementary experimental approaches in order to facilitate their access and use through a range of distributed and shared services. The conceptual design of AnaEE France includes five modules. Three modules gather experimental facilities along a gradient of experimental control ranging from highly controlled Ecotron facilities, semi-natural field mesocosms to in natura experimental sites covering major continental ecosystems (forests, croplands, grasslands, and lakes). In addition, AnaEE France also includes shared instruments that can be implemented in experiments and analytical platforms specifically dedicated to environmental biology. To promote reuse of data, generalize results and improve predictive models, AnaEE France further gathers modeling and information systems. The implementation of AnaEE France allowed for mutual synergies, improved the technical skills, stimulated new experiments and helped our scientific community to enter into the big data sharing era.
Article
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As a consequence of anthropogenic environmental change, the world is facing a possible sixth mass extinction event. The severity of this biodiversity crisis is exemplified by the rapid collapse of hundreds of amphibian populations around the world. Amphibian declines are associated with a range of factors including habitat loss/modification, human utilisation, exotic/invasive species, environmental acidification and contamination, infectious disease, climate change, and increased ultraviolet-B radiation (UVBR) due to stratospheric ozone depletion. However, it is recognised that these factors rarely act in isolation and that amphibian declines are likely to be the result of complex interactions between multiple anthropogenic and natural factors. Here we present a synthesis of the effects of ultraviolet radiation (UVR) in isolation and in combination with a range of naturally occurring abiotic (temperature, aquatic pH, and aquatic hypoxia) and biotic (infectious disease, conspecific density, and predation) factors on amphibians. We highlight that examining the effects of UVR in the absence of other ecologically relevant environmental factors can greatly oversimplify and underestimate the effects of UVR on amphibians. We propose that the pathways that give rise to interactive effects between multiple environmental factors are likely to be mediated by the behavioural and physiological responses of amphibians to each of the factors in isolation. A sound understanding of these pathways can therefore be gained from the continued use of multi-factorial experimental studies in both the laboratory and the field. Such an understanding will provide the foundation for a strong theoretical framework that will allow researchers to predict the combinations of abiotic and biotic conditions that are likely to influence the persistence of amphibian populations under future environmental change.
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Most of the literature on temperature–organism interactions rely on mean temperature (mostly air), disregarding the real complexity of this variable. There is a growing consensus about the importance of considering the temperature fluctuations as a mechanism improving organism's performance. Tadpoles are small body size ectotherm organisms that behave isothermally with their environment. As such, are good models for studying their thermal biology relative to their immediate environment. We studied six anuran tadpole species in North Patagonia, Alsodes gargola, Hylorina sylvatica, Batrachyla taeniata, Pleurodema thaul, P. bufoninum and Rhinella spinulosa, distributed in a West-East altitudinal cline with different environments and thermal conditions. We evaluated the relationship between thermal descriptors at a local scale and the thermal biology patterns of these temperate tadpoles. We estimated thermal tolerance limits and thermal sensitivity of locomotion of each species. The different aquatic environments showed important differences in local thermal conditions, associated with observed differences in the thermal traits in these tadpoles. Species exposed to lower temperature fluctuations and lower environmental mean temperatures showed lower swimming optimal temperatures and narrower thermal tolerance ranges. We found greater variability in the upper than in the lower critical limits in these Patagonian anuran tadpoles. Minimum critical temperatures were close to freezing temperature, possibly in detriment of their tolerance to high temperatures. Overall, our results suggest that these species are adapted to low temperatures. Finally, warming tolerances and predicted thermal safety margins, show that none of the studied species appear to be under thermal stress that may compromise their survival at the present time or in the near future, under a moderate climate change scenario.
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Odontoprynus americanus tadpoles were used to determine the safety concentration of pyriproxyfen (PPF) insecticide by acute and sublethal toxicity tests (nominal range tested 0.01 to 10 [± 15%] PPF mg/L). Median lethal concentration (LC50) and no, and lowest-observed-effect concentrations (NOEC and LOEC, respectively) were calculated. We also assessed the effect on the activities of glutathione S-transferse (GST), acetylcholinesterase (AChE), and carboxylesterase (CbE) and compared to control (CO) tadpoles. Based on the 48-h NOEC value, two sublethal concentrations of PPF (0.01 and 0.1mg/L) were assayed to detect effects on enzymes activities (GST and CbE), thyroid hormone's levels (triiodothyronine; T3 and thyroxine; T4), heart function, and tadpoles swimming behaviour. The results showed that the LC50 values of O. americanus tadpoles were 3.73 PPF mg/L and 2.51 PPF mg/L at 24-h and 48-h, respectively (NOEC ¼ 0.1 mg/L; LOEC ¼ 1 mg/L, for both times). PPF concentrations at 48 h, induced enzymatic activities such as GST (212.98%e242.94%), AChE (142.15%e165.08%), and CbE (141.86%e87.14%) significantly respect to COs. During the 22 days of chronic PPF exposure, GST (0.01 mg/L 88%e153% NOEC), AChE (177.82% NOEC), and T4 (70% NOEC) also significantly increased respect to COs. Similarly, heart rate (fH) and ventricular cycle length (VV interval) in CO tadpoles were significantly higher than PPF treated. Finally, at NOEC tadpoles exhibited significant effects on the behavioral endpoint (swimming distance, mean speed, and global activity; P < 0.05).
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Ectotherms are vulnerable to climate change, given their dependence on temperature, and amphibians are particularly interesting because of their complex life cycle. Tadpoles may regulate their body temperature by using suitable thermal microhabitats. Thus, their physiological responses are the result of adjustment to the local thermal limits experienced in their ponds. We studied three anuran tadpole species present in Argentina and Chile: Pleurodema thaul and Pleurodema bufoninum that are seasonal and have broad geographic ranges, and Batrachyla taeniata, a geographically restricted species with overwintering tadpoles. Species with restricted distribution are more susceptible to climate change than species with broader distribution that may cope with potential climatic changes in the environments in which they occur. We aim to test whether these species can buffer the potential effects of climate warming. We used ecological niche models and the outcomes of their thermal attributes (critical thermal limits, optimal temperature, and locomotor performance breadth) as empirical evidence of their capacity. We found that Pleurodema species show broader performance curves, related to their occurrence, while the geographically restricted B. taeniata shows a narrower thermal breadth, but is faster in warmer conditions. The modeled distributions and empirical physiological results suggest no severe threats for these three anurans. However, the risk level is increasing and a retraction of their distribution range might be possible for Pleurodema species, and some local population extinctions may happen, particularly for the narrowly distributed B. taeniata.