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La selezione delle donatrici di sangue cordonale durante la pandemia Covid-19: ricerca sperimentale su due modelli di reclutamento

Authors:
Scuola di
Scienze della Salute Umana
Corso di laurea in INFERMIERISTICA
La selezione delle donatrici di sangue
cordonale durante la pandemia
Covid-19: ricerca sperimentale su
due modelli di reclutamento.
Relatore
Prof. Daniele Ciofi
Correlatore
Prof. Marco Tanini
Dott.ssa Lucrezia Giotti Matricardi
Candidata
Carlotta Giovani
Anno accademico 2020/2021
1
Ai miei genitori,
a me stessa.
2
INDICE
Introduzione.............................................................................................................. 7
CAPITOLO 1: LE CELLULE STAMINALI ........................................................... 11
1.1 Generalità ...................................................................................................... 11
1.2 Principi di embriologia e cellule staminali embrionali ..................................... 14
1.2.1 Cellule staminali pluripotenti indotte ........................................................ 19
1.2.2 Cellule germinali primordiali.................................................................... 19
1.3 Cellule staminali adulte .................................................................................. 20
1.3.1 Cellule staminali emopoietiche.................................................................. 22
1.3.2 Cellule staminali mesenchimali ................................................................. 26
1.3.3 Cellule mesenchimali da cordone ombelicale ............................................ 28
1.4 Cellule staminali fetali .................................................................................... 29
1.5 Cellule staminali da annessi fetali ................................................................... 29
1.5.1 Cellule staminali da liquido amniotico ...................................................... 30
1.5.2 Cellule staminali dalla placenta ................................................................ 31
1.5.3 Cellule staminali dalla membrana amniotica ............................................. 32
CAPITOLO 2: CELLULE STAMINALI DA CORDONE OMBELICALE (SCO).... 34
2.1 Il cordone ombelicale e le sue cellule .............................................................. 34
2.2 Applicazioni terapeutiche ................................................................................ 38
2.3 Il trapianto singenico ...................................................................................... 41
2.4 Il trapianto allogenico..................................................................................... 41
2.5 Il trapianto autologo ....................................................................................... 46
2.6 Le fasi del trapianto ........................................................................................ 49
CAPITOLO 3: ORGANIZZAZIONE ITALIANA DEL SISTEMA DONAZIONE E
TRAPIANTO .......................................................................................................... 52
3.1 Centro nazionale trapianti .............................................................................. 52
3.2 Centri interregionali trapianti ......................................................................... 53
3
3.3 Coordinamento regionale................................................................................ 54
3.4 Coordinamento locale ..................................................................................... 54
CAPITOLO 4: IL QUADRO NORMATIVO PER LA DONAZIONE DEL SANGUE
DEL CORDONE OMBELICALE (SCO)................................................................. 56
4.1 Il quadro normativo nella Comunità Europea .................................................. 56
4.2 Il quadro normativo in Italia ........................................................................... 58
4.3 Accordo Stato-Regioni ed esportazione delle unità di sangue cordonale all'estero
............................................................................................................................ 61
4.4 L'attuazione dell'accordo Stato-regioni in Toscana .......................................... 63
CAPITOLO 5: LA DONAZIONE DEDICATA........................................................ 66
5.1 Donazione di SCO ad uso dedicato.................................................................. 66
5.2 Decreto ministeriale 18 novembre 2009........................................................... 67
5.2.1 Le patologie regolamentate per la donazione dedicata............................... 70
CAPITOLO 6: IL PRELIEVO E IL BANCAGGIO ................................................. 75
6.1 Il prelievo di cellule staminali da cordone ombelicale ...................................... 75
6.1.1 Fase informativa e reclutamento della gestante ......................................... 75
6.1.2 Fase di raccolta........................................................................................ 78
6.1.3 Fase di conservazione e trasporto dell’Unità ............................................. 83
6.1.4 Fase di accettazione dell’Unità ................................................................. 83
6.1.5 Caratterizzazione delle unità di SCO ai fini dell’idoneità al trapianto ........ 83
6.1.6 Manipolazione, criopreservazione e stoccaggio ......................................... 86
CAPITOLO 7: I SOCIAL MEDIA COME STRATEGIA DI COMUNICAZIONE... 88
7.1 Il contesto tecnologico .................................................................................... 88
7.2 I Social Media ................................................................................................ 89
7.3 I Social Network ............................................................................................. 92
7.4 I Social Media: Facebook ed Instagram........................................................... 92
7.5 La pubblicità delle banche private ................................................................... 96
7.6 Il fallimento della bio-banca Cryo-Save........................................................... 98
4
CAPITOLO 8: LA PANDEMIA DA COVID-19 .................................................... 101
8.1 I Coronavirus ............................................................................................... 101
8.2 La storia della Pandemia da COVID-19 ........................................................ 101
8.3 La clinica del Covid-19 ................................................................................. 111
8.4 Il ruolo della rete online durante la Pandemia da Covid-19 ........................... 114
CAPITOLO 9: LA GRAVIDANZA DURANTE LA PANDEMIA DA COVID-19 .. 121
9.1 Excursus sulla preparazione al parto............................................................. 121
9.2 I corsi di accompagnamento alla nascita (CAN) ............................................ 122
9.3 Covid-19: impatto sulla salute mentale delle donne in gravidanza .................. 128
CAPITOLO 10: LA TELEMEDICINA.................................................................. 130
10.1 L’interdisciplinarietà offerta dalla sanità in rete ......................................... 130
10.2 Caratterizzazione e descrizione di un servizio di Telemedicina ..................... 134
10.3 La mappatura nazionale sull’uso della Telemedicina ................................... 137
10.4 Il ruolo della Telemedicina durante la pandemia da Covid-19 ...................... 139
CAPITOLO 11: MATERIALI E METODI 1 ......................................................... 142
11.1 Allegato 1: A3 Model .................................................................................. 146
CAPITOLO 12: RISULTATI ................................................................................ 147
12.1 Analisi generale dei dati delle gestanti afferenti alla Banca del sangue di Pisa e
alla Banca del sangue di Firenze: reclutamento attraverso la modalità on-line .... 147
12.2 Analisi dei dati delle gestanti partorienti presso i presidi ospedalieri afferenti
alla Banca del sangue di Pisa: reclutamento attraverso la modalità on-line ......... 154
12.3 Analisi dei dati delle gestanti partorienti presso i presidi ospedalieri afferenti
alla Banca del sangue di Firenze: reclutamento attraverso la modalità on-line .... 164
12.4 Analisi dei dati delle gestanti partorienti presso i presidi ospedalieri afferenti
alla Banca del sangue di Pisa: reclutamento attraverso la modalità tradizionale.. 172
12.5 Analisi dei dati delle gestanti partorienti presso i presidi ospedalieri afferenti
alla Banca del sangue di Firenze: reclutamento attraverso la modalità tradizionale
.......................................................................................................................... 176
5
12.6 Analisi del confronto tra il reclutamento on-line e il reclutamento tradizionale
delle gestanti afferenti alla Banca del sangue di Pisa e alla Banca del sangue di
Firenze............................................................................................................... 178
12.7 Analisi del confronto tra la ambedue le Banche del sangue toscane e il centro
trasfusionale di Pistoia ....................................................................................... 189
CAPITOLO 13: MATERIALI E METODI 2 ......................................................... 195
13.1 Allegato 2: questionario volto ad indagare le conoscenze e le aspettative in
merito alla sensibilizzazione alla donazione del sangue del cordone ombelicale
(SCO) mediante l’uso dei Social Media in epoca Covid-19 .................................. 196
CAPITOLO 14: RISULTATI ................................................................................ 202
CAPITOLO 15: DISCUSSIONE ........................................................................... 224
CAPITOLO 16: CONCLUSIONI .......................................................................... 229
CAPITOLO 17: ALLEGATI ................................................................................. 230
17.1 Allegato 3: Pagina ufficiale dell’associazione Donatrici Italiane Sangue
Cordone Ombelicale “Adisco Toscana – Sezione Regionale di Prato” ................. 230
17.2 Allegato 4: Pagina ufficiale Instagram dell’associazione Adisco Toscana..... 231
17.3 Allegato 5: Pagina ufficiale Facebook dell’associazione Adisco Toscana ..... 232
17.4 Allegato 6: Informativa alla donazione del sangue del cordone ombelicale,
Banca del sangue di Pisa .................................................................................... 233
17.5 Allegato 7: Consenso alla raccolta di SCO Banca del sangue di Pisa ........... 241
17.6 Allegato 8: Questionario per la donazione di SCO, Banca del sangue di Pisa 246
17.7 Allegato 9: Informativa e consenso per la donazione di SCO, Banca del sangue
di Firenze ........................................................................................................... 261
17.8 Allegato 10: Consenso alla raccolta di SCO, Banca del sangue di Firenze.... 268
17.9 Allegato 11: Questionario per la donazione di SCO, Banca del sangue di
Firenze............................................................................................................... 272
17.10 Allegato 12: Liberatoria per l’utilizzo delle immagini di minorenni e
informativa sulla privacy .................................................................................... 278
17.11 Allegato 13: Volantino informativo relativo alla donazione del sangue del
cordone ombelicale ............................................................................................ 282
6
Bibliografia ........................................................................................................... 286
Sitografia .............................................................................................................. 306
Ringraziamenti...................................................................................................... 319
7
Introduzione
La conservazione delle cellule staminali contenute nel sangue del cordone ombelicale
(SCO) costituisce una realtà in continua crescita alla quale si guarda con occhi prospettici
relativamente alle ulteriori applicazioni terapeutiche.
L’uso delle cellule staminali emopoietiche, denominate con l’acronimo CSE”, contenute
nel sangue cordonale, rappresenta un’opportunità terapeutica per il trattamento di pazienti
sia pediatrici che adulti, affetti da patologie per le quali il trapianto di progenitori
emopoietici costituisce ad oggi la terapia d’elezione.
Il trapianto di cellule staminali emopoietiche, infatti, rappresenta il Gold Standard
terapeutico per il trattamento di numerose malattie ematologiche e non ematologiche
1
.
Il trapianto ha da un lato modificato le prospettive di sopravvivenza di pazienti affetti da
malattie a prognosi infausta (quali leucemie acute e croniche, aplasie midollari) e,
dall’altro, ha migliorato la qualità di vita associata ad alcune patologie (quali talassemia
major, anemia falciforme), le quali pur non gravate da un’alta incidenza di mortalità,
comportano un concreto decadimento della qualità di vita
2
. Desta particolare interesse la
possibilità di utilizzo di questa risorsa per il trattamento di malattie ematologiche, nelle
quali la terapia ha lo scopo di resettare la situazione esistente e di attuare una sostituzione
grazie al nuovo materiale biologico trapiantato, donando al paziente affetto, da tali
patologie, una nuova speranza di vita.
Data la grande importanza terapeutica delle cellule staminali emopoietiche, e quindi
anche di quelle contenute nel sangue del cordone ombelicale, è importante non solo
cercare di incrementare il numero di unità raccolte, ma anche l’esecuzione su di esse di
solidi e ferrei controlli di sicurezza, al fine di evitare eventuali trasmissioni di patologie
infettive, e non, al ricevente.
Per poter far ciò, ogni Banca del sangue cordonale, deve mantenere come obbiettivo
principale quello di garantire un elevato grado di qualità delle unità cordonali destinate al
trapianto. Al giorno d’oggi in Italia sono presenti due possibili tipologie di impiego
1
Linee guida in tema di raccolta, manipolazione ed impiego clinico delle cellule staminali emopoietiche
(CSE). GU 227 del 30/09/2003.
2
Locatelli F, Burgio GR, “Transplant of haematopoietic stem cells in childhood: where we are and where
we are going”. Haematologica 1998, 83: 550-563
8
clinico delle cellule staminali emopoietiche da sangue cordonale: per trapianto correlato
e per trapianto non correlato
3
.
Per trapianto correlato si intende l’utilizzo di cellule staminali risiedenti nel sangue del
cordone ombelicale (SCO) in ambito familiare: queste cellule vengono trapiantate in un
fratello o in una sorella del neonato donatore, affetto/a da una patologia ematologica
potenzialmente curabile con questa metodica (donazione dedicata).
Per trapianto non correlato, invece, si intende l’uso dell’unità di sangue placentare in
pazienti non consanguinei (trapianto allogenico).
Nel tempo si sono sviluppati programmi che prevedono la conservazione di SCO ad
esclusivo uso autologo, in banche private con oneri economici a carico della famiglia. In
Italia attualmente la conservazione autologa non è permessa e qualora la madre desideri
conservare il sangue cordonale per il proprio figlio, è possibile attivare una procedura che
consente tale modalità di conservazione in strutture dislocate all’estero
4
; le spese relative
al trasporto e alla conservazione del campione sono a totale carico dei richiedenti. Tale
possibilità, infatti, è stata consentita dalla legge italiana solo a salvaguardia della libera
scelta di ogni singolo individuo, ma senza oneri economici per il servizio sanitario
pubblico, non rappresentando un livello essenziale di assistenza.
Questo perché il legislatore ha ritenuto, anche in base ai pareri espressi da organismi
scientifici, che la conservazione autologa non sia, al momento, sostenuta da una valida
motivazione sul piano razionale, scientifico, ed etico.
La normativa italiana
5
vieta la costituzione di banche private di SCO, mentre prevede ed
incoraggia la donazione solidale. Il legislatore considera interesse primario ed esclusivo
del Servizio Sanitario Nazionale la conservazione del sangue da cordone ombelicale,
donato a fini solidaristici per uso trapiantologico, prevedendone la conservazione nelle
strutture pubbliche deputate, quale erogazione di livello essenziale di assistenza, e quindi
con oneri totalmente a carico del Servizio Sanitario Nazionale.
3
Ordinanza del Ministero del Lavoro della Salute e delle Politiche Sociali del 26 febbraio 2009 recante:
“Disposizioni in materia di conservazione di cellule sta minali del sangue del cordone ombelicale”.
4
Decreto 18 Novembre 2009 “Disposizioni in materia di conservazione di cellule staminali da sangue
cordone ombelicale per uso autologo-dedicato” G.U. 31/12/2009
5 Decreto 18 novembre 2009 Disposizioni in materia di conservazione di cellule staminali da sangue del
cordone ombelicale per uso autologo-dedicato” pubblicato nella Gazzetta Ufficiale della Repubblica
Italiana anno 15n. 303.
9
Allo stesso modo, è consentita la conservazione nel territorio nazionale, senza alcun onere
per i richiedenti, di sangue del cordone ombelicale per uso autologo-dedicato, ma solo
nei casi e alle condizioni previste dalla normativa che sono i seguenti:
1. la conservazione di sangue da cordone ombelicale per uso dedicato al neonato con
patologia in atto al momento della nascita o evidenziata in epoca prenatale, o per
uso dedicato a consanguineo con patologia in atto al momento della raccolta o
pregressa, per la quale risulti appropriato l'utilizzo di cellule staminali da sangue
cordonale, previa presentazione di motivata documentazione clinico-sanitaria;
2. la conservazione per uso dedicato nel caso di famiglie a rischio di avere figli affetti
da malattie geneticamente determinate per le quali risulti appropriato l'utilizzo di
tali cellule, previa presentazione di motivata documentazione clinico sanitaria
rilasciata da un medico specialista nel relativo ambito clinico.
In Italia le cellule staminali del cordone ombelicale donate sono conservate presso 19
banche di sangue cordonale che appartengono alla Rete Nazionale delle Banche di Sangue
Cordonale, coordinate dal centro Nazionale Sangue e dal Centro Nazionale Trapianti,
entrambi facenti capo all'Istituto Superiore di Sanità che, a sua volta, si rapporta con i
registri nazionali ed internazionali dei donatori volontari adulti di cellule staminali
emopoietiche.
Il personale sanitario ha il dovere di essere informato correttamente riguardo le
potenzialità delle Cellule Staminali del sangue cordonale, per poter fornire ai futuri
genitori tutte le informazioni (basate sulla medicina dell’evidenza) necessarie per una
scelta consapevole.
Il luogo tradizionalmente deputato per fare informazione e formazione sul tema della
donazione di SCO è storicamente rappresentato dai CAN, cioè dai Corsi di
Accompagnamento alla Nascita. I CAN sono organizzati in gruppi po meno numerosi,
in cui vi partecipano donne in gravidanza con i rispettivi partner, e si articolano in vari
incontri su diverse tematiche, tra le quali la possibilità di donare il sangue cordonale. Sono
guidati da professionisti del percorso nascita, e in modo particolare, da ostetriche, come
previsto dal Profilo Professionale
6
.
6
Decreto Ministeriale 14 Settembre 1994, n. 740 “Regolamento concernente la individuazione della
figura e relativo profilo professionale dell’ostetrica/o”, pubblicato nella Gazzetta Ufficiale n. 6 del
09/01/1995.
10
Durante l’emergenza sanitaria per pandemia Covid-19, i Corsi di Accompagnamento alla
nascita sono stati sospesi, e, molte informazioni preziose che venivano veicolate sono
andate perse. L’obbiettivo di questo progetto è implementare la conoscenza della
popolazione di riferimento, ma non solo, in merito alla possibilità di donare il sangue del
cordone ombelicale.
La sensibilizzazione dei futuri genitori circa la donazione del sangue cordonale è
avvenuta attraverso l’uso dei più diffusi mezzi di comunicazione: i Social Media. In
particolar modo, Facebook ed Instagram.
Le potenzialità di questi sono vaste; grazie anche all’aumento delle connessioni internet
da mobile, che agevolano la capacità di raggiungere qualsiasi target di età e persone con
un solo “click”.
Le speranze di vita di numerosi pazienti affetti da patologie per le quali è necessario un
trapianto con CSE, sono legate all’esistenza di un numero elevato di persone disposte a
donare.
Al di dell’emergenza legata alla pandemia Covid-19, è necessario che il Sistema
Sanitario Nazionale, migliori le proprie capacità di snellire i percorsi e venire incontro al
donatore, che, in questo caso, non è un utente che ha bisogno del SSN, ma rappresenta
una risorsa preziosa per il sistema stesso.
Descriveremo un progetto di miglioramento dell’attività di sensibilizzazione e
reclutamento, dei potenziali donatori secondo metodica Lean-Thinking, ed un’indagine
conoscitiva attuata tramite questionario rivolto al personale infermieristico, per esplorare
le opinioni, di questi, in merito al loro sentire circa la possibilità di informare le coppie
circa la donazione del sangue cordonale attraverso canali alternativi, i Social Media.
11
CAPITOLO 1: LE CELLULE STAMINALI
1.1 Generalità
Le cellule staminali sono cellule dotate di caratteristiche funzionali peculiari che le
distinguono da tutte le altre cellule: esse sono cellule altamente immature, capaci di auto-
rinnovarsi e di differenziarsi dando origine ad uno o più tipi di cellule strutturalmente e
funzionalmente mature. Esse, spesso definite anche come cellule precursori, sono
elementi cellulari “madre” da cui originano altre cellule più mature, e pertanto vengono
definite come cellule altamente immature o, meglio, altamente indifferenziate; con tale
termine si indica l’assenza di caratteristiche morfologiche, antigeniche e funzionali che
sono invece tipiche delle cellule mature o differenziate a cui le cellule staminali danno
origine. La cellula staminale, indipendentemente dalla sua origine, per potersi definire
come tale, è necessario che presenti due specifiche proprietà
7
: l’autorinnovamento,
ovvero la capacità di proliferare e allo stesso tempo di automantenersi e rigenerarsi,
quindi di espandere il proprio pool staminale e riprodurre stessa per periodi di tempo
illimitati, creando una riserva stabile che duri tutta la vita. Questo processo viene definito
come clonalità, ovvero la capacità di una singola cellula di dare origine a un clone identico
a stesso. Ciò è possibile grazie a divisioni mitotiche simmetriche in cui la cellula
staminale, detta cellula “madre”, si divide dando origine a due cellule, definite a loro volta
“figlie”, identiche alla madre anche nel grado di staminalità.
La seconda proprietà è data invece, dalla capacità di eseguire divisioni asimmetriche, con
le quali, oltre ad una cellula staminale identica alla cellula madre, viene prodotta anche
una cellula che, attraverso un processo di differenziamento, presenterà struttura e funzioni
differenti. Risulta ovvio che la percentuale di cellule auto-rinnovate e differenziate,
all’interno di un tessuto o di un organo, si manterrà ad un livello di costante equilibro
quando i due tipi di divisione (simmetrica e asimmetrica) avvengono con la stessa
frequenza. Il risultato finale prevede che a ogni divisione viene prodotto un numero pari
al doppio del numero totale di cellule staminali iniziali, di cui metà sarà identico alla
7
Stem Cell Basic: Introduction. In stem Cell Information. Bethesda,MD: National Istitutes of Health, U:S
Departement of Health and human Services, 2009.
12
cellula madre. Questo fenomeno viene anche definito come la probabilità di
automantenimento (PSM Probability of self-maintenace).
Figura 1: Metodo di divisione delle Cellule Staminali.
Le cellule staminali possono quindi dare origine a cellule specializzate attraverso un
processo controllato geneticamente dal nucleo cellulare, chiamato differenziamento
cellulare
8
. Allo scopo di definire le potenzialità delle cellule staminali di differenziarsi in
diversi tipi cellulari, queste sono state classificate in base a quattro gradi o livelli di
specializzazione:
Totipotenti: cellule staminali in grado di differenziarsi in ogni tessuto embrionale
ed extra-embrionale. Le cellule staminali totipotenti sono esclusivamente lo zigote
(prodotto dalla fusione di un ovulo con uno spermatozoo) e le cellule originate
dalle prime divisioni dell’ovulo fecondato.
Pluripotenti: cellule staminali, derivate dalle totipotenti, capaci di differenziarsi
nei tre strati germinali che costituiscono la matrice embrionale di tutte le cellule
del corpo: endoderma (rivestimento interno dello stomaco, del tratto
gastrointestinale, i polmoni), mesoderma (muscoli, ossa, sangue, tratto
urogenitale), ed ectoderma (tessuti epidermici e del sistema nervoso). Tali cellule
8
Scott Francis Gilbert, “Biologia dello sviluppo”, Zanichelli 2005 (3° edizione), ISBN 8808072754
13
non possono per tanto dare origine ad un organismo adulto, perché non hanno il
potenziale per costruire i tessuti extra-embrionali, per esempio nel caso dei
mammiferi placentati non possono dare origine alla placenta.
Multipotenti: cellule staminali capaci di formare un numero limitato di tipi
cellulari specializzati e quindi capaci di dare origine alle diverse cellule mature di
uno specifico tessuto o organo. La loro funzione è di sostituire le cellule
differenziate che vengono perse attraverso fenomeni di deplezione o a causa di
danneggiamenti cellulari. Per esempio, le cellule staminali del midollo osseo e del
sangue del cordone ombelicale generano entrambe diversi tipi di cellule ematiche.
Unipotenti: cellule in grado di differenziarsi in un solo specifico tipo di cellule
mature, posseggono la proprietà caratteristica di autorinnovarsi.
Garantiscono la riparazione e il mantenimento dei tessuti sani.
In realtà, i livelli di specializzazione delle cellule staminali sarebbero cinque e
comprenderebbero anche le Cellule Staminali Oligopotenti (che si troverebbero tra le
multipotenti e le unipotenti), ovvero particolari cellule che avrebbero la capacità di
differenziarsi solo in alcuni tipi di cellule
9
, quali ad esempio quelle della linea linfoide o
mieloide; altri esempi di cellule progenitrici oligopotenti sono le cellule staminali
vascolari che hanno la capacità di diventare o cellule muscolari lisce oppure tessuto
endoteliale.
9
Majo F, Rochat A, Nicolas M, Jaoudè GA, Barrandon Y, Laboratory of Stem Cell Dynamics, Ecole
PolytechniqueFédérale de Lausanne (EPFL),1015 Lausanne CH, Switzerland, “Oligopotentstemcells
14
Figura 2: Totipotenza, pluripotenza, multipotenza e unipotenza.
In base alle conoscenze attuali le cellule staminali vengono classificate non solo in base
alla capacità multidifferenziativa, ma anche in base allo stadio di sviluppo dell’organismo
in cui vengono isolate e si riconoscono dunque quattro gruppi:
cellule staminali embrionali;
cellule staminali fetali;
cellule staminali degli annessi fetali;
cellule staminali adulte;
1.2 Principi di embriologia e cellule staminali embrionali
La Cellula Staminale fondamentale nello sviluppo dell’embrione umano è lo zigote, una
cellula staminale totipotente, il cui potenziale differenziativo è totale.
Con la fusione dei due pronuclei parentali formatisi nell’ovocita dopo la penetrazione
dello spermatozoo, e la costituzione dello zigote diploide, si conclude il processo della
fecondazione e inizia la fase embrionale di un nuovo essere. I due pronuclei non si
fondono però in uno zigote mononucleato. Essi hanno ancora il nucleolo e i cromosomi
despiralizzati. Perciò, prima duplicano il DNA e iniziano la prima divisione mitotica
15
separatamente. Poi perdono i rispettivi involucri nucleari e nucleoli. Quindi i cromosomi
si condensano, si portano insieme nel fuso mitotico, e migrano nei primi due blastomeri
che si formano per segmentazione dall’ovocita fecondato. Dalla fec ondazione sono
passate circa 30 ore. I due blastomeri sono le prime cellule staminali embrionali.
Sono cellule staminali totipotenti perché ognuna di esse è potenzialmente capace di
produrre tutti i tipi di cellule dell’organismo. Nella realtà però non è così. Uno solo dei
due blastomeri svilupperà l’embrione: quello che si divide per primo. L’altro produr
tessuti e strutture extra-embrionali. In effetti, i blastomeri dei mammiferi (incluso
l’uomo), dopo la prima divisione, si dividono ogni 12-24 ore, ma non in maniera sincrona.
Così, dallo stadio di 2 cellule (stadio 2) si passa allo stadio di 3 cellule (stadio 3), e da
questo allo stadio 4, 5, e così via. In questo modo i blastomeri si diversificano, fin dal
secondo giorno, per età, volume e posizione, e col progredire delle divisioni cellulari, si
avviano verso percorsi differenziativi diversi e tendono a perdere la totipotenza,
divenendo cellule staminali embrionali pluripotenti, cioè capaci di generare molti tipi di
cellule dell’organismo, ma non tutti.
Allo stadio 2, la corona radiata dell’ovocita si stacca e i blastomeri sono avvolti e tenuti
insieme dalla sola zona pellucida. La proliferazione cellulare continua, l’embrione
assume l’aspetto di una mora (da cui il nome di morula), ma il suo diametro (circa 100
µm) rimane pressoché costante. Fino allo stadio di 8 blastomeri, tutte le cellule
conservano la totipotenza. Ma in questa fase ha inizio il fenomeno del compattamento dei
blastomeri che si completa nella morula di 16 cellule ed esita successivamente nella
formazione della blastocisti (maggiore 32 cellule), in cui le cellule sono in gran parte
cellule staminali pluripotenti. I blastomeri, che fino allo stadio 8 presentano tra loro degli
spazi, entrano in stretto contatto l’uno con l’altro, annullando gli spazi intercellulari.
Tra i blastomeri periferici si sviluppano dei ponti proteici (gap junction proteins),
costituiti principalmente da connexine, che li compattano fortemente tra loro, realizzando
uno strato cellulare impermeabile all’interno della zona pellucida. I blastomeri interni
vengono così isolati dall’ambiente esterno. Gli ioni Na+, pompati fuori dalle cellule,
trasportano acqua che si fa spazio tra le cellule periferiche e quelle interne (meno
compatte), formando delle fessure che si allargano e confluiscono in un’unica grande
cavità detta blastocele. I blastomeri interni sono sospinti verso un polo e formano la massa
cellulare interna (MCI) o nodo embrionale. Come già sottolineato le cellule periferiche
16
invece, allungate ed appiattite, formano il trofoblasto o trofoectoderma, e daranno origine
agli annessi embrionali. L’embrione è così giunto allo stadio di blastocisti, e, nel suo
viaggio lungo la tuba, raggiunge l’utero. La membrana pellucida, che fin qui ha protetto
l’embrione, viene perduta. Può avvenire col’annidamento della blastocisti nella mucosa
della parete uterina, che si compie tra il 6° e il 9° giorno dopo la fecondazione. A partire
dal 10° giorno, la blastocisti va incontro a una serie di complesse modifiche strutturali
che esitano nella formazione, da una parte degli abbozzi della cavità amniotica, del sacco
vitellino, del corion e dei villi coriali, della placenta embrionale e del cordone ombelicale,
e dall’altra della gastrula con la differenziazione delle cellule degli strati germinativi
(Ectoderma, Mesoderma, Endoderma, e Cellule germinali). Da queste cellule, che sono
tutte Cellule staminali embrionali pluripotenti, hanno origine tutte le cellule staminali
adulte tessuto specifiche
10
11
.
10
W.J. Larsen, Embriologia umana. Idelson-Gnocchi 2002
11
I. Klimanskaya et al.,Human embryonic stem cell lines derived from single blastomers, Nature 444 (2006)
16.
Figura 3: Totipotenza, pluripotenza e multipotenza.
17
Le cellule staminali embrionali umane (human Embryonic Stem Cells o hESCs) sono
cellule pluripotenti, ricavate dalla massa cellulare interna della blastocisti, quelle
cellule, una volta estratte, possono essere messe in coltura e fatte proliferare quali linee
indifferenziate oppure si può procedere facendole differenziare nella linea cellulare
voluta dal ricercatore.
Furono descritte per la prima volta nel 1998 da parte del dottor Thomson, dopo essere
state isolate dalle masse cellulari interne di blastocisti umane, donate a scopi di ricerca.
Come la loro controparte murina, le cellule hESCs hanno il potenziale di differenziarsi
in quasi tutti i tipi cellulari del corpo umano. Le cellule hESC sono state differenziate
in cellule neuronali, epidermiche, adrenali e cheratinociti
12
; cellule dell'endotelio, del
rene, dell'osso, del muscolo e del cuore
13
; del pancreas e del fegato
14
. È stata anche
riportata la diffferenziazione di cellule hESCs in cardiomiociti elettrofisiologicamente
comparabili con cardiomiociti umani normali
15
. Studi in modelli animali hanno
dimostrato che il trapianto di cellule derivanti da cellule hESC può trattare con
successo una varietà di malattie congenite, incluse malattie cardiovascolari e diabete,
o danni da traumi a carico del midollo spinale
16
17
, il che sottolinea ancora una volta
la grande potenzialità di utilizzo di queste cellule nella rigenerazione tissutale e nella
medicina moderna anche se viene spesso riportata una mortalità a causa di teratomi
18
19
. Una caratteristica peculiare delle cellule ES murine, infatti, è la loro capacità a
formare, una volta iniettate in topi immunodeficienti, teratomi che contengono svariati
12
Green, H., Easley, K., and Iuchi, S. (2003). Marker succession during the development of keratinocytes
from cultured human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 100, 15625-15630.
13
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14
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15
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16
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17
Gerecht-Nir, S., and Itskovitz- Eldor, J. (2004). human embryonic stem cells: a potencial source for
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18
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19
Fujikawa, T., Oh, S.H., Pi, L., Hatch, H.M., Shupe, T., and Petersen, B.E. (2005). teratoma formation
leads to failure of treatment for type I diabetes using embryonic stem cell-derived insulin-producing cells.
Am J pathol 166, 1781-1791
18
tipi di cellule, alcune altamente differenziate, altre parzialmente indifferenziate,
provenienti dai differenti foglietti germinali. La formazione di teratomi in vivo è così
strettamente associata alle cellule Es che la loro formazione viene comunemente usata
per comprovare il grado di staminalità delle popolazioni cellulari
20
.
Attualmente le fonti di staminali embrionali sono tre:
linee cellulari derivate negli USA prima del 2001: le uniche consentite perché
già derivate quando cominciarono le polemiche sulla liceità dell'utilizzo di
staminali embrionali; Gli scienziati però sono spesso scettici sulla bontà del
loro utilizzo dato che non sono state prodotte con i criteri utilizzati attualmente
per l'applicazione clinica.
embrioni creati e conservati in seguito a trattamenti per la fertilità: parliamo di
Blastocisti soprannumerarie rimaste inutilizzate dopo le procedure di
fecondazione in vitro. In Italia è vietata qualsiasi sperimentazione su embrioni
umani, nonché la produzione di embrioni utilizzabili per l'estrazione di linee
cellulari embrionali. Sono vietate le attività dirette alla produzione di embrioni
umani a fini di ricerca o di sperimentazione, ogni forma di selezione a scopo
eugenetico degli embrioni e dei gameti diretta ad alterare il patrimonio
genetico, nonché la fecondazione di un gamete umano con un gamete di specie
diversa per la produzione di ibridi e chimere. Per quanto riguarda la
crioconservazione degli embrioni, fino al 2004 non era possibile. Tutti gli
embrioni prodotti per la fecondazione medicalmente assistita andavano
impiantati in utero in un unico e contemporaneo impianto (che non superasse
comunque i tre embrioni)
21
. Con la sentenza 151/2009 la Corte Costituzionale
ha dichiarato l'incostituzionalità di questo comma della legge 40/2004.
Attualmente, quindi, si ha la possibilità di crio-congelare gli embrioni prodotti
ma non impiantati per scelta medica in relazione alla tutela dello stato di salute
della madre.
trasferimento nucleare di cellule somatiche. Negli ultimi anni, i dilemmi etici
sollevati dall'uso di embrioni per ottenere cellule staminali, hanno stimolato la
20
Chambers, I., and Smith, A. (2004). Self-renewal of teratocarcinoma and embryonic stem cells.
Oncogene 23, 7150-7160.
21
Legge 19 febbraio 2004, n. 40. “Norme in m ateria di procreazione medicalmente assistita”.
19
ricerca verso fonti alternative di staminali embrionali senza dover distruggere
embrioni e poter così anche rientrare nei progetti di ricerca che possono
accedere ai fondi pubblici. Un esempio ci è dato dagli studi effettuati sulle
cellule staminali pluripotenti indotte e sulle cellule germinali. Nonostante ci
siano molti ostacoli tecnici queste strade sembrano le più promettenti.
1.2.1 Cellule staminali pluripotenti indotte
Le cellule staminali pluripotenti indotte sono state derivate da fibroblasti murini per la
prima volta nel 2006
22
. Si ottengono riprogrammando geneticamente le cellule
somatiche attraverso specifici fattori di trascrizione, ottenendo cellule con staminali
e pluripotenza simili alle ESC. Proprio come le cellule staminali embrionali si
autorinnovano e si trasformano in qualsiasi tipo di cellula o tessuto.
Le Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) sono definite cellule somatiche
riprogrammate ad uno stato di pluripotenza e rappresentano una promettente fonte
alternativa di cellule staminali paziente-specifiche. Le iPSCs, infatti, presentano
problematiche di tipo etico ridotte, rispetto alle hESCs, in quanto non prevedono
l’impiego di embrioni umani. Sebbene le iPSCs possano, teoricamente, offrire
innumerevoli potenzialità terapeutiche, l’applicazione delle metodiche di
riprogrammazione in campo clinico è limitata dalla necessità di selezionare le cellule
così riprogrammate. Questo processo può essere eseguito esclusivamente in vitro,
mentre non è possibile formare iPSCs direttamente in vivo, restringendone, quindi,
l’impiego a tecniche di trapianto.
1.2.2 Cellule germinali primordiali
Le Cellule Germinali Primordiali (PGCs, dall’inglese Primordial Germ Cells) sono
cellule diploidi che si formano, a livello embrionale, durante la gastrulazione a partire
dalla porzione prossimale dell’epiblasto. Attraverso segnali chemotattici, lePGCs,
migrano dalla loro posizione originale, in prossimità del sacco vitellino, alla Cresta
Genitale, porzione dell’embrione che da origine alle gonadi. Queste cellule, che
normalmente si sviluppano in gameti maturi, possono essere coltivate in condizioni
22
Takahashi K and Yamanaka S. (2006) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and
adult fibroblast cultures by defined factors”. Cell; 126: 663-676.
20
specifiche per la produzione di linee cellulari che possiedono tutte le caratteristiche note
delle hESCs derivate dalle blastocisti. Sebbene tecnicamente sia difficoltoso, possono
essere derivate da materiale fetale (di origine abortiva) di età gestazionale variabile dalla
quinta alla nona settimana
23
. Possono dare origine a tutti i derivativi somatici (con una
particolare propensione al differenziamento neurale) ed a gameti maturi, attraverso la
formazione di corpi embrioidi (Ebs), se coltivate in presenza di specifici fattori di crescita.
Tali fattori di crescita sono garantiti, in vivo, dal contatto con specifiche cellule somatiche
localizzate nella niche, rappresentate dalle cellule del Sertoli nel maschio e dalle cellulle
della granulosa nella femmina. La loro capacità proliferativa, però, è stata dimostrata ad
oggi solo in vitro. In vivo, infatti, non hanno la capacità di formare teratomi
24
.
1.3 Cellule staminali adulte
Le cellule staminali adulte (ASC), dette anche somatiche o tessuto-specifiche, sono
cellule staminali multipotenti in quanto possono dare origine solo ad alcuni tipi cellulari,
con diversi gradi di potenzialità: ogni tipo di cellula staminale adulta produce un insieme
limitato di cellule specializzate caratteristiche di un particolare tessuto.
Le ASC rappresentano quindi una piccola sottopopolazione del compartimento
proliferante di un dato tessuto e nell’adulto si ritrovano, in numero molto piccolo, in tutti
gli organi, situate in sedi specifiche, dette nicchie. In alcuni casi esse possono rimanere
quiescenti per molti anni, per poi essere attivate da una malattia o da una lesione; mentre
in altri casi sono regolarmente attive, per esempio quando ci sia necessità di sostituire
frequentemente le cellule, come avviene per le cellule epiteliali della cute e dell’intestino.
Le cellule staminali adulte sono, quindi, fondamentali per il mantenimento in vita
dell’organismo e dei suoi tessuti. Infatti, la sola divisione cellulare delle cellule mature,
già specializzate, non riuscirebbe a far fronte alla degradazione dei tessuti essenzialmente
per due motivi:
ogni volta che viene replicato il DNA di una cellula, nel processo di divisione
cellulare, c’è il rischio di errori di copiatura del codice genetico; se le nuove
23
Shamblott, M.J., Axelman, J., wang, S., Bugg, E.M., Littlefield, J. W., Donovan, P.J., Blumenthal,
P.D., Huggins, G.R., and Gearhart,J.D. (1998). Derivation of pluripotential stem cells from cultured
human primordial germ cells. Proc Natl Acad Sci USA 95, 13726-13731.
24
Turpenny L, Spalluto CM, Perret RM, O' Shea M, Hanley KP, Cameron IT, Wilson DI and Hanley NA
(2006). “Evaluating Human Embryonic Germ Cells: concord and conflict as pluripotent stem cells”. Stem
Cells; 24: 212-220.
21
cellule provenissero tutte da cellule mature, gli errori si accumulerebbero in breve
tempo, portando alla morte dell’organismo (aumento, in particolar modo, delle
patologie a carattere tumorale);
in molti casi le cellule mature dei tessuti sono talmente complesse da non potersi
più dividere.
Il processo di replicazione delle cellule staminali adulte avviene secondo due modali
specifiche: la divisione simmetrica, che permette la generazione di due cellule staminali
identiche tra loro, e la divisione asimmetrica, che invece permette la generazione di una
cellula staminale identica a quella di partenza e di una cellula progenitrice, la cui capaci
proliferativa è minore rispetto alla staminale a causa di un commitment differenziativo,
ovvero di un programma che le induce a differenziare in un determinato tipo cellulare.
Le ASC sono quindi cellule relativamente indifferenziate e, quando si dividono,
mantengono le dimensioni della popolazione staminale e, allo stesso tempo, danno luogo
a una progenie che duplicandosi differenzia, prima, in una popolazione di transizione,
mentre in un secondo tempo assume le caratteristiche funzionali di cellule completamente
differenziate. Questa graduale specializzazione avviene sia per il ricambio omeostatico di
cellule morte del tessuto, che per la sostituzione di cellule danneggiate in seguito ad
insulto. Un fattore di primo piano nel mantenimento della popolazione staminale e nella
regolazione della differenziazione in vivo è il microambiente in cui è sita la cellula
staminale stessa e che prende il nome di nicchia staminale (o stem cell niche).
Nella nicchia di appartenenza le cellule staminali mantengono il self -renewal e sono
mantenute quiescenti in uno stato indifferenziato. La nicchia staminale riveste quindi un
ruolo chiave per l’equilibrio tra quelli che sono due poli opposti come autorinnovamento
e differenziazione: uno sbilanciamento potrebbe indirizzare verso un eccessivo self-
renewal portando a un’espansione cellulare abnorme, evento che incanala verso la tumori-
genesi; mentre un’eccessiva differenziazione condurrebbe verso una deplezione del
compartimento di ASC, con il rischio di incapacità di mantenimento dell’omeostasi
tissutale e di ricambio cellulare.
22
Uno studio
25
segnala che le cellule staminali adulte sono state derivate da diversi organi
e tessuti, quali: midollo osseo, sangue periferico, epitelio della pelle, apparato digerente,
polpa dentale, midollo spinale, vasi sanguigni, muscolo scheletrico, retina, cornea, cuore,
fegato, pancreas e cervello. La scoperta di staminali nel cervello
26
è stata sorprendente
perché prima si pensava che i neuroni di un individuo fossero quelli presenti sin dalla
nascita, mentre oggi sappiamo che le cellule staminali cerebrali provvedono al rinnovo di
alcuni neuroni in alcune zone del cervello. La presenza di cellule staminali adulte è stata
quindi rilevata in tutti i tessuti che si sviluppano dai tre foglietti germinativi.
Anche se i fattori e i processi che governano il potenziale differenziativo delle cellule
staminali non sono ancora ben noti, c’è sempre un più crescente interesse per quanto
riguarda l’utilizzo delle ASC al fine di riparare e rigenerare i tessuti adulti
27
.
A questo proposito è quindi importante parlare delle cellule staminali del midollo osseo
che a loro volta si dividono in cellule staminali emopoietiche, che hanno il compito di
creare le cellule del sangue (globuli rossi, globuli bianchi, piastrine, etc.) e le cellule
staminali mesenchimali, che generano ossa e cartilagine.
1.3.1 Cellule staminali emopoietiche
Le cellule staminali emopoietiche (CSE) o, in inglese, Hematopoietic Stem Cells (HSC)
sono ritenute essere le cellule progenitrici di tutte le cellule prodotte nel midollo osseo e
immesse nel sangue periferico. Le HSC sono, infatti, in grado di autoriprodursi e di dare
vita ad altre linee cellulari dalle quali, in seguito ad un processo maturativo e
differenziativo, derivano tutte le cellule del sangue come i globuli rossi, i globuli bianchi
e le piastrine. La HSC sono cellule staminali adulte multipotenti, in grado di proliferare
mantenendo intatta la potenzialità di replicarsi; in altri termini sono capaci di riprodurre
25
Almeida-Porada G, Porada C, Zanjani ED, Department of Veterans Affairs Medical Center, University
of Neva da Reno, Reno, Nevada, USA, Adult stem cell plasticity and methods of detection”. Rev Clin Exp
Hematol. 2001 Mar;5(1):26-41. PMID: 11486730
26
Vande Velde G, Couillard-Després S, Aigner L, Himmelreich U, van der Linden A, Biomedical MRI
Unit/Molecular Small Animal Imaging Center, Department of Imaging and Pathology, Faculty of Medicine,
KU Leuven, Flanders, Belgium, “In situ labeling a nd imaging of endogenous neural stem cell proliferation
and migration”. Wiley Interdiscip Rev Na nomed Nanobiotechnol. 2012 Aug 29. doi: 10.1002/wnan.1192.
PMID: 22933366
27
La Francesca S, Methodist DeBakey Heart & Vascular Center, The Methodist Hospital, Houston, Texas,
“Nano Technology a nd Stem Cell Therapy for CV Diseases: Potential Applications”. Methodist Debakey
Cardiovasc J. 2012 Jan;8(1):28-35. PMID: 22891108, PMCID: PMC3405790
23
stesse e, contemporaneamente, produrre cellule figlie che, attraverso successivi
processi di differenziazione e maturazione, daranno origine agli elementi maturi.
Proprio per questa caratteristica le HSC esplicano e mantengono la loro funzione per tutta
la vita
28
; esse si riproducono continuamente (potenziale proliferativo giornaliero delle
CSE è di 1¹-10¹² cellule figlie) e possono seguire linee di maturazione
morfologicamente e funzionalmente diverse, a seconda del condizionamento determinato
dal tipo di stimolo o di mediatore presente. Principalmente le HSC possono differenziarsi
in due diverse linee cellulari, ovvero: la linea linfoide da cui sia avvia la linfopoiesi
(linfociti B, T e NK) e la linea mieloide da cui si sviluppa la mielopoiesi, processo che
porta alla produzione di granulociti, monociti, megacariociti, piastrine e globuli rossi
maturi.
Figura 4: Differenziamento delle Cellule Staminali Emopoietiche.
28
Warren LA, Rossi DJ, Department of Pathology, Harvard Medical School, Harvard University, Boston,
MA 02115, USA, “Stem cells and aging in the hematopoietic system”. Mech Ageing Dev. 2009 Jan-
Feb;130(1-2):46-53. Epub 2008 Apr 8. PMID: 18479735
24
Figura 5: Produzione di globuli bianchi, rossi e piastrine da Cellula Staminale
Emopoietica.
Le CSE compaiono intorno al 16° - 18° giorno della vita embrionale nel sacco vitellino;
sono cellule di origine mesodermica che proprio nel sacco vitellino danno inizio alla
produzione di cellule ematiche e del sistema vascolare, prima ancora che cominci
l’organogenesi; sono state perciò denominate anche emangioblasti
29
.
In questa fase (fase extra-embrionale dell’emopoiesi), l’emopoiesi è intravascolare ed
essenzialmente eritroide, cioè produce quasi esclusivamente globuli rossi. Questa fase
dell’emopoiesi raggiunge l’apice alla 4°-5° settimana di vita e cessa alla 14° -15°
settimana. A partire dalla 5°-6° settimana le CSE si trasferiscono nel fegato, dove
l’emopoiesi diviene extra vascolare, e dal fegato cominciano, a partire dalla 10° settimana
di vita, a migrare verso la milza e il midollo osseo. Quindi mentre l’eritropoiesi comincia
a comparire nel fegato dalla 6° settimana (fase epatica), nella milza comparirà dalla 12°
29
Teixeira V, Arede N, Gardner R, Rodríguez-León J, Tavares AT, Instituto Gulbenkian de Ciência, 2780-
156 Oeira s, Portugal, “Targeting the hemangioblast with a novel cell type-specific enhancer”. BMC Dev
Biol. 2011 Dec 28;11:76. PMID: 22204590, PMCID: PMC3273444
25
settimana (fase epatosplenica). Tra la 10° e la 12° settimana si sviluppa nel fegato anche
la mielopoiesi, cioè la produzione di leucociti o globuli bianchi del tipo mieloide
(granulociti o polinucleati); questa procederà poi insieme all’eritropoiesi e si
accompagnerà a un’ulteriore migrazione di CSE verso il midollo osseo.
La fase midollare dell’emopoiesi ha inizio a partire dalla 11°-12° settimana;
successivamente dalla 18° settimana l’emopoiesi epatica comincia a decrescere e viene
progressivamente sostituita dall’emopoiesi midollare, che diviene prevalente dalla 28°
settimana e quasi esclusiva dopo la 36° settimana di vita fetale. Alla nascita l’emopoiesi
è di norma tutta midollare. Quindi il fegato fetale umano prima di 15-18 settimane è un
organo eritropoietico molto efficiente, anche se privo di attività linfoide e quindi di
immunocompetenza. D’altra parte, un trapianto in utero di CSE, eseguito nel feto dopo
17-18 settimane di vita (a parte i casi di immunodeficienza congenita severa) ha scarse
probabilità di superare la barriera immunologia fetale
30
.
Al momento della nascita le CSE si trovano in numero relativamente alto nel sangue del
cordone
31
ombelicale, oltre che nel midollo osseo; dopo la nascita e nel corso della vita,
invece, si troveranno quasi esclusivamente nel midollo osseo. Solo poche CSE possono
essere reperite nel sangue periferico, ma mediante un trattamento con particolari fattori
di crescita (G-CSF e GM-CSF), queste cellule possono essere indotte a trasferirsi in
numero elevato dal midollo osseo al sangue periferico (mobilizzazione) ed è così
possibile effettuarne la raccolta da una vena periferica con una semplice procedura di
leucoaferesi. Le CSE vengono facilmente riconosciute per la presenza, sulla loro
membrana, di alcune molecole proteiche (antigeni) e in particolare di una molecola
denominata CD34. Il profilo antigenico che distingue queste cellule è: CD34+, CD33-,
CD38-, HLA-DR-
32
. L’impiego di anticorpi monoclonali specifici per questi antigeni
permette di determinare il numero esatto di CSE presenti in campioni di midollo osseo,
30
Touraine JL, Department of Transplantation & Clinical Immunology, Hôpital Edouard Herriot, Lyon,
France, “In utero transplantation of fetal liver stem cells into human fetuses”. J Hematother. 1996
Apr;5(2):195-9. PMID: 8723800
31
Solves Alcaina P, Perales Marín A, Mirabet Lis V, Brik Spinelli M, Soler García MA, Roig Oltra R,
Banco de Sangre de Cordón Umbilical, Centro de Transfusión, Valencia, España, “Donors selection and
retrieval of units in an umbilical cord blood bank”. Med Clin (Barc). 2007 Oct 27;129(15):561-5. PMID:
17988611
32
Wisniewski D, Affer M, Willshire J, Clarkson B, “Further phenotypic characterization of the primitive
lineage- CD34+CD38-CD90+CD45RA- hematopoietic stem cell/progenitor cell sub-population isolated
from cord blood, mobilized peripheral blood and patients with chronic myelogenous leukemia”. Blood
Cancer J. 2011 Sep;1(9):e36. Epub 2011 Sep 30. PMID: 22829197, PMCID: PMC3255253
26
di sangue periferico o di sangue cordonale, e di separarle dalle altre cellule nucleate
(progenitori, precursori e cellule mature), ottenendo delle sospensioni quasi pure di CSE.
Le vere CSE costituiscono nel midollo osseo una massa di tessuto molto piccola,
probabilmente secondo alcuni ricercatori nell’ordine di 1 mg o di 1 milione circa di
cellule. Oltre il milione di CSE vere, nel midollo osseo si trova un numero molto maggiore
di cellule progenitrici emopoietiche in stadi maturativi più o meno avanzati che si
distinguono dalle CSE per un diverso profilo antigenico, e in particolare per essere
CD34-. Tutte le cellule emopoietiche, sia staminali vere sia cellule progenitrici,
rappresentano dallo 0,8% al 3% delle cellule nucleate del midollo osseo. Queste cellule
hanno una capacità riproduttiva portentosa e generano 300-600 miliardi al giorno di
cellule mature in sostituzione di quelle che muoiono. Qualunque malattia che coinvolga
direttamente le CSE può avere conseguenze molto gravi sulla produzione e/o sulla
funzione delle cellule periferiche, infatti sono proprio le CSE che rendono possibile il
successo del trapianto di midollo osseo proliferando nel ricevente fino a ricostituire un
nuovo midollo osseo e rinnovare le cellule del sangue e del sistema immunitario; è
pertanto ovvio che anche sospensioni di CSE ottenute dal sangue di cordone ombelicale
33
o dal sangue periferico possano sostituire il midollo osseo agli effetti del trapianto.
1.3.2 Cellule staminali mesenchimali
Il midollo osseo contiene, insieme alle CSE, un altro tipo di cellule staminali adulte
multipotenti denominate cellule staminali mesenchimali (CSM); esse sono state isolate
dalla componente stromale del midollo osseo (dove rappresentano circa lo 0,01% di tutte
le cellule nucleate) per la prima volta negli anni '70 da Friedenstein e collaboratori.
Il midollo osseo rappresenta la nicchia biologica delle cellule staminali mesenchimali,
qui, infatti, svolgono una funzione di richiamo delle cellule staminali ematopoietiche
circolanti nel midollo (Homing) e sono di supporto all’ematopoiesi poiché, dando origine
alle cellule stromali del microambiente midollare, hanno un ruolo essenziale nella
regolazione dell’emopoiesi midollare, soprattutto per quanto riguarda la proliferazione e
la differenziazione delle cellule mieloidi e delle cellule linfoidi sia B che T.
33
McGuckin CP, Forraz N, Newcastle Centre for Cord Blood, Stem Cell Institute, Institute of Human
Genetics, Newcastle University, “Umbilica l cord blood stem cells--an ethical source for regenerative
medicine”. Med Law. 2008 Mar;27(1):147-65. PMID: 18592888
27
Le MSC sono state descritte come cellule aderenti alla plastica, con morfologia
fibroblastoide e non fagociti che
34
presentano inoltre la peculiare capacità di differenziare
spontaneamente, sia in vitro che in vivo, in tutti i tessuti specializzati di derivazione
embrionale mesodermale (tessuto osseo, tessuto cartilagineo e tessuto adiposo).
In particolare, sono facilmente isolabili grazie alla loro capacità adesiva; sono facilmente
separabili da altre tipologie cellulari grazie all'espressione di un set di marcatori di
membrana specifici; sono facilmente espandibili in vitro e in grado di espletare funzioni
immunosoppressive e immunomodulatorie. Sono in grado di migrare spontaneamente nei
tessuti di origine ed anche selettivamente in tessuti danneggiati dove promuovono la
rigenerazione del tessuto compromesso sia mediante il differenziamento che la secrezione
paracrina di fattori antinfiammatori. Presentano, inoltre, una spiccata plasticità funzionale
ed un potenziale differenziativo multilineare
35
36
.
Recentemente è stato dimostrato che, in particolari condizioni sperimentali in vitro (ma
anche inseguito ad impianto ectopico in vivo) le cellule mesenchimali (probabilmente una
sottopopolazione di cellule dotate di pluripotenza e definite per questo Multipotent Adult
Progenitor Cells) possono differenziare in tipologie cellulari di tessuti con diversa origine
embrionale, come ad esempio il tessuto nervoso ed il tessuto epatico.
Queste osservazioni hanno portato a confutare il paradigma classico della multipotenza
delle cellule staminali adulte intesa come capacità differenziativa limitata proprio lineare.
Questa definizione è stata sostituita dalla nuova teoria della "developmental plasticity",
ossia la capacità di oltrepassare i confini differenziativi segnati dal tessuto di
appartenenza
37
38
. Oltre che dal midollo osseo le MSC sono stata isolate in maniera quasi
ubiquitaria, tanto da fare ipotizzare la loro presenza in tutti gli organi ed i tessuti post-
natali. Infatti, nonostante ancora oggi la principale fonte di MSC rimanga il midollo
34
Haniffa MA, Collin MP, Buckley CD, Dazzi F. Mesenchymal stem cells: the fibroblasts' new
clothes?” Hematologica 2009 Feb; 94 (2): 258-63 Epub 2008 Dec 23.
35
Chamberlain G, fox J, Ashton B, Middleton J. “Concise review: mesenchymal stem cells: their
phenotype, differentiation capacity, immunological features, a nd potential for homing”. Stem Cells 2007
Nov; 25 (11): 2739-49. Epub 2007 Jul 26.
36
Minquell JJ, Erices A, Conget P. “Mesenchymal stem cells”. Exp Biol Med (Maywood) 2001 Jun; 226
(6): 507-20
37
Devine Sm, Cobbs C, Jennings M, Bartholomew A, Hoffman R. “Mesenchymal stem cells distribute to
a wide range of tissues following systemic infusion into nonhuman primates. Blood 2003 Apr 15;101 (8):
2999-3001 Epub 2002 Dec 12.
38
Vallabhaneni KC, Tka chuk S, Kiyan Y, Shushakova N, Haller H, Dumler I, Eden G. “Urokinase
receptor mediates mobilization, migration, and differentiation of mesenchymal stem cells. Cardiovasc.
Res. 2010 dec 16.
28
osseo, sono presenti anche in altri tessuti quali il tessuto adiposo, la placenta e la gelatina
di Wharton del cordone ombelicale. Il tessuto adiposo è considerato una fonte molto
promettente dato che è possibile ottenere una grande quantità di cellule attraverso
lipoaspirazione mantenendo lo stesso potenziale differenziativo delle MSC da midollo
39
.
Ad oggi, tuttavia, la fonte alternativa più utilizzata di cellule mesenchimali è quella del
sangue del cordone ombelicale.
1.3.3 Cellule mesenchimali da cordone ombelicale
Le Cellule mesenchimali sono state isolate anche nella gelatina di Wharton del cordone
ombelicale, presentano caratteristiche molto simili a quelle isolate dal midollo osseo e
sono facilmente prelevabili e crio-conservabili
40
.
Esse tendono a differenziarsi in adipociti, osteociti, neuroni, cardiomiociti, condrociti e
cellule endoteliali. Studi recenti descrivono un semplice metodo per ottenere e
crioconservare le cellule staminali estratte dalla gelatina di Wharton del cordone
ombelicale. La procedura operativa
41
per il prelievo di MSC nata dalla collaborazione tra
la Banca Toscana del Sangue Placentare dell'Azienda Ospedaliera Universitaria di
Careggi-Firenze (BTSP) e l'Unità di Ostetricia e Ginecologia dell'Ospedale di Pistoia (ad
oggi ancora in fase di sperimentazione) vengono estratti durante l'intervento di parto
cesareo elettivo nel modo meno traumatico: dopo l'estrazione del feto, il medico provvede
al secondamento manuale, estraendo la placenta esercitando un massaggio-spremitura sul
fondo uterino ed al tempo stesso una progressiva trazione sul funicolo. Vengono quindi
eseguiti un tampone colturale sulla placenta e uno sul cordone ombelicale, viene inoltre
prelevata la sezione terminale del cordone ombelicale e riposta in un contenitore sterile
che verrà poi inviato all'analisi istopatologica. Placenta e cordone, clampato con pinza
emostatica, vengono adagiati sopra un telino monouso e si procede al prelievo di sangue
39
Kuhbier JW, Weyand B, Sorg H, Ra dtke C, Vogt PM, reimers K. “Stem cells from fatty tissue: A new
resource for regenerative medicine?” Chirurg 2010 Sep; 81 (9): 826-32
40
Lee ST, Maeng H, Chwae YJ et al. Effect of mesenchymal stem cell transplantation on the engraftment
of human hematopoietic stem cells and leukemic cells in mice model department of Internal Medicine,
Yonsei University College of Medicine, Seodaemun-ku Shinchon-dong 134, seoul 120-752, South Korea,
PMID 18293059. Int J Hematol. 2008 Apr; 87(3): 327-37. Epub 2008 Feb 22.
41
Chao KC, Chao KF, FU YS et al. Islet-like Clusters derived from mesenchimal stem cells in wha rton’s
jelly of the human umbilical cord for transplantation to control type 1 diabetes Institute of Toxicology,
College of Medicine, National Taiwan University, Taipei, Taiwan. PMID 18197261. PloS One 2008 Jan
16; 3 (1): 1451
29
cordonale. Il cordone ombelicale viene quindi reciso dall'inserzione placentare e posto in
un doppio involucro di sacche in PVC sterili, che a loro volta vengono poste in un
contenitore sterile di materiale plastico ed inviate alla Banca Toscana del Sangue
Placentare per l'isolamento, l'espansione e il congelamento delle MSC.
1.4 Cellule staminali fetali
Le cellule staminali fetali hanno caratteristiche intermedie tra le staminali embrionali e le
adulte. Si pensa infatti che le cellule staminali ottenute da tessuti fetali abbiano proprietà
ed immunofenotipo simili a quelli delle cellule staminali isolate da tessuto adulto mentre
il loro potenziale differenziativo sia maggiore così come il loro potenziale terapeutico
42
.
Le cellule staminali fetali sono infatti descritte come multipotenti. Sono ottenute da
organi e tessuti (fegato, coclea, spina dorsale) provenienti da feti abortiti.
Le cellule isolate dal fegato di feti abortivi formano epatociti, quelle della coclea formano
cellule sensoriali e neuroni e quelle isolate dalla spina dorsale differenziano in cellule
cartilaginee. Gli organi possono essere prelevati da feti tra la 15° e la 19° settimana di
gestazione. Il tessuto neurale fetale è stato già utilizzato in ambito terapeutico contro il
morbo di Parkinson con evidenze di miglioramenti clinici
43
.
1.5 Cellule staminali da annessi fetali
L’impiego degli annessi fetali (sangue placentare, cordone ombelicale, membrane amnio-
coriali e liquido amniotico) è stato ipotizzato, in alcuni campi della medicina moderna,
fin dall’inizio del secolo scorso, ma solo negli ultimi anni ha acquisito concretezza grazie
al notevole impulso della ricerca, con sempre più vaste prospettive terapeutiche.
Le due più importanti caratteristiche di questi tessuti che giustificano il loro utilizzo in
ambito trapiantologico sono rappresentate dalla loro capacità rigenerativa dovuta alla
presenza di cellule staminali e dalla possibilità di utilizzare questi annessi come substrato,
per favorire la crescita di nuovi aggregati cellulari al fine di riparare tessuti danneggiati
(come avviene per gli innesti di membrana amniotica e probabilmente in un futuro non
lontano per i vasi cordonali).
42
O' Donoghue, K., and Fisk, N. M. (2004). Fetal stem cell. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol 18,
853-875
43
Lindvall, O. Stem cell for cell therapy in Parkinson's disease. Pharmacol Res 47, 279-287 (2003)
30
Questa ultima caratteristica è legata alla non “immunogenicità” di alcuni annessi fetali,
che quindi non determinano lo scatenarsi di risposte immunitarie da parte del tessuto o
organo ospite nel quale vengono impiantati, superando in questo modo la problematica
del rigetto (tolleranza). A questo proposito è interessante osservare che queste sono delle
importanti caratteristiche tipiche della gravidanza: infatti la gestazione è caratterizzata
dalla continua crescita cellulare, dalla progressiva differenziazione dei tessuti fetali e
dalla “tolleranza” del sistema immunitario della madre nei confronti dell’embrione,
meccanismo questo ancora non del tutto chiarito
44
.
1.5.1 Cellule staminali da liquido amniotico
Il liquido amniotico contiene cellule dei tessuti embrionali ed extra-embrionali
differenziate ed indifferenziate derivanti dall’ectoderma, dal mesoderma e
dall’endoderma
45
. Si pensa che queste cellule provengano dall’amnios, dalla pelle e dai
tratti respiratori, alimentari, urogenitali del feto. La tipologia e le caratteristiche delle
cellule del liquido amniotico variano con l’epoca gestazionale e con eventuali patologie
fetali. Recentemente sono state riportate in letteratura evidenze sperimentali che
dimostrano la presenza di cellule staminali fetali mesenchimali con potenziale
differenziativo verso elementi cellulari derivanti dai tre foglietti embrionali.
Per comprovare che il liquido amniotico contiene cellule staminali pluripotenti è stata
fondamentale la dimostrazione che il differenziamento dei vari tipi cellulari può essere
ottenuto a partire da un’unica cellula positiva per i marcatori mesenchimali e negativa per
quelli ematopoietici. Le cellule del liquido amniotico possono essere ottenute da un
piccolo campione di liquido durante la procedura di amniocentesi e si utilizzano i primi
3 ml di liquido estratto. Possono essere facilmente espanse in coltura, mantengono la
stabilità genetica e possono essere indotte al differenziamento. Nonostante le cellule
staminali del liquido amniotico non siano così primitive come le cellule ES mantengono
un potenziale differenziativo più ampio rispetto alle cellule staminali adulte.
44
M. Ta nini, A. Bani, F.M. Nuzzi: “Il prelievo degli annessi fetali a scopo di trapianto. In Gianluca
Castelnuovo, Riccardo Menici, Marcello Fedi. - La donazione in Italia- Springer- Verlag Italia 2011.
45
In 'T Anker, P.S., Sherjon,S.A., Kleijburg-van der Keur, C., Noort, W. A., Claas, F.H., Willemze, R.,
Fibbe, W.E., and Kanhai, H.H. (2003). Amniotic fluid as a novel source of mesenchymal stem cells for
therapeutic transplantation. Blood 102, 1548-1549.
31
Altre due caratteristiche peculiari sono: la capacità di formare in vitro corpi embrioidi
(Embryoid Bodies) ovvero ammassi cellulari tridimensionali positivi per marcatori
specifici di tutti e tre i foglietti germinativi, e la totale assenza di teratomi nei topi
immunodeficienti iniettati con queste cellule. L’analisi del loro profilo fenotipico
dimostra come le cellule isolate dal liquido amniotico siano positive per un marcatore di
superficie specifico delle cellule embrionali: Stage-Specific Embryonic Antigen (SSEA)-
4, per il fattore di trascrizione principe delle cellule staminali Oct-4, e non esprimono altri
marcatori (come CD4, CD3…). Questo profilo di espressione è di particolare interesse in
quanto dimostra la presenza tra le cellule del liquido amniotico di progenitori che
condividano alcuni marcatori chiave espressi dalle cellule ES
46
. L’espansione o la
generazione in vitro è una grossa sfida e sarebbe naturalmente molto interessante da un
punto di vista terapeutico ma tuttavia lo stato dell’arte è ben lontano da un’applicazione
pratica. E’ possibile crioconservare le cellule staminali contenute nel liquido amniotico.
Banche pubbliche e private sono attive sia in Italia che in molti altri paesi.
1.5.2 Cellule staminali dalla placenta
Anche la placenta attira l'interesse come sito alternativo di cellule da impegnarsi nella
medicina rigenerativa. Cellule isolate da diverse regioni placentari, infatti, presentano una
notevole plasticità. I principali tipi di cellule staminali/progenitrici isolati dai tessuti
placentari fetali sono le cellule amniotiche epiteliali, le cellule amniotiche mesenchimali
stromali, le cellule corioniche mesenchimali stromali e le cellule del trofoblasto
47
.
La placenta, inoltre, è coinvolta nel processo di mediazione della tolleranza fetale e
possiede cellule con proprietà immunomodulatorie
48
. Queste caratteristiche possono
dimostrarsi fondamentali in un'eventuale applicazione clinica. La placenta secondo
recenti ricerche risulta più ricca di cellule staminali rispetto al sangue del cordone
ombelicale e anche questa può essere crioconservata e potrebbe essere usata per curare
46
De Coppi, P.,Bartsch, G.,Jr., Siddiqui, M.M.,Xu, T.,Santos, C.C.,
Perin,L.,Mostoslavsky,G.,Serre,A.C.,Snyder, E.Y.,Yoo, J.J.,et al. (2007). Isolation of amniotic stem cell
lines with potential for therapy. Nat Biotechnol 1 25, 100-106.
47
Parolini O., Alviano F., Bagnara G.P. et al. (2008) Concise review: isolation and characterization of
cells from human term placenta: outcome of the first international workshop on placenta derived stem
cells. Stem Cells, 26: 300-311.
48
Mellor, A.L., and Munn, D.H. (2000). Immunology at the maternal-fetal interface: lessons for T cell
tolerance and suppression. Annu Rev Immunol 18,367-391.
32
malattie del sangue come anemie, talassemie e altre patologie che finora trovano una
possibilità di cura solo con il trapianto di midollo o con il cordone ombelicale
49
. Il tessuto
placentare, infine, è facilmente recuperabile e manipolabile senza procedure invasive e
non solleva questioni etiche.
1.5.3 Cellule staminali dalla membrana amniotica
Per quanto riguarda la membrana amniotica, negli ultimi 10-15 anni, la tecnica di
ricostruzione oculare tramite l’amnios ha trovato impiego su vasta scala
50
. In caso di
difetto tessutale, ad esempio, rimpiazzando la matrice stromale assente, la membrana
amniotica funziona come membrana basale di supporto in modo tale che il processo di
epitelizzazione si possa attuare su questa
51
. Altri settori della medicina stanno
sperimentando l’utilizzo della membrana amniotica: in dermatologia per la medicazione
e protezione delle ustioni cutanee o per favorire la cicatrizzazione di ulcere, in chirurgia,
per prevenire la formazione di aderenze post-chirurgiche
52
, in ambito uro-ginecologico
per la ricostruzione delle vie urinarie
53
o lesioni genitali in caso di esiti di terapie radianti.
La membrana amniotica macroscopicamente si presenta come un sottile foglietto
trasparente sufficientemente elastico e resistente. È un tessuto non immunogenico,
caratteristica che ne consente l’impianto senza rischi di rigetto e senza la necessità di far
ricorso ad una successiva terapia immunosoppressiva; questo fenomeno può essere
spiegato dal fatto che la membrana amniotica esprime antigeni HLA incomplet
54
.
Inoltre, le cellule epiteliali dell’amnios coltivate in vitro, producono fattori
antinfiammatori tanto che il terreno di coltura, se posto sulla superficie corneale, dimostra
attività antinfiammatoria
55
. In generale si può affermare che la membrana basale della
49
Sericov V, Hounshell C., Larkin S., Green W., Ikeda H., Walters MC, Kuypers FA. Human term
placenta as a source of hematopoietic cells. Exp Biol Med (Maywood) 2009 Jul: 234 (7): vi.
50
Perin L., Sedrakyan S.,Da Sacco S., De Filippo R. : Characterization of human amniotic fluid stem
cells and their pluripotential capability. Methods Cell Biol. 2008; 86: 85-89.
51
Tseng SGC, Kim IGC. Transpalntation of preserved human of amniotic membrane for reconstruction in
severely damaged rabbit corneas. Cornea 1955; 14: 473 84
52
Trelford JD, Trelford-Sauder M. The amnios in surgery, past and present. Am J Obstet Gynaecol 1979;
134: 844-845.
53
Brandt FT, Albuquerque CD, Lorenzato FR. Female urethral recostruction with amnion graft. Int J
Surg Investig 2001; 1: 409-14.
54
Tancer ML, Katz M, Perez Veridiano N. Vaginal epithelialization with human amnios. Obstet Gynecol
1979; 54: 345-9
55
Akle CA, Adinolfi M, Welsh KL et al. Immonigenicity of human ephitelial cell after transplantation
into volunteers. Lancet 191; 2: 2003-5
33
membrana amniotica facilita la migrazione delle cellule epiteliali
56
, rinforza l’adesione
delle cellule epiteliali basali, promuove la differenziazione epiteliale e previene
l’apoptosi. I frammenti di membrana amniotica utilizzati per il trapianto sono ottenuti da
placenta di gestanti che abbiano raggiunto la 35° settimana di gravidanza e sottoposte a
taglio cesareo elettivo, allo scopo di evitare il rischio di contaminazioni batteriche durante
il passaggio della placenta attraverso il canale del parto
57
.
56
Kamiya K, Wang M, Uccida S et al. Topical application of culture supernant from human amniotic
ephitelial cells suppesses infiammatory reaction in cornea. Experimental Eye Reserch 2005; 80:671-679
57
Bourdreau N, Sympson CJ, Werb Z, et al. Suppression of ICE and apoptosis in Mammary apithelial
cells By Extracellular matrix. Science 1995; 267: 891-893
34
CAPITOLO 2: CELLULE STAMINALI DA CORDONE
OMBELICALE (SCO)
2.1 Il Cordone ombelicale e le sue cellule
Il cordone ombelicale, o funicolo ombelicale, si forma nel primo mese di vita del feto, di
norma tra il 1e il 38° giorno dal concepimento, quando le cellule della morula che
danno origine all’embrione si differenziano da quelle che costituiranno la placenta e gli
annessi fetali. Inizialmente il cordone ombelicale risulta essere costituito da quattro vasi:
due arterie e due vene.
Nel corso dello sviluppo embrionario, le due arterie ombelicali, si portano verso le due
arterie iliache congiungendosi ad esse; delle due vene ombelicali, invece, la destra diviene
atresica, persistendo solo la sinistra. Il cordone ombelicale definitivo, dunque, appare
costituito da due arterie ed una sola vena. Le arterie hanno la funzione di trasportare il
sangue venoso dal feto alla placenta, carico di prodotti di rifiuto, quali anidride carbonica,
urea, acido urico e bilirubina; contemporaneamente, attraverso la membrana materno-
fetale, le sostanze nutritive e l’ossigeno passano dal sangue materno
58
a quello fetale,
giungendo al feto attraverso la vena ombelicale. Questi tre vasi sono ricoperti e protetti
dalla cosiddetta “Gelatina di Wharton”, una sostanza gelatinosa molto resistente,
costituita da collagene, glicosamminoglicani e acido ialuronico. Essa, costituisce nel feto
un esempio di tessuto mucoso maturo, un particolare tipo di tessuto connettivo giovane
largamente diffuso nell’embrione; viene definito maturo perché le cellule stromali
presenti in questo tessuto, mostrano differenti gradi di differenziazione, che vanno dalle
cellule mesenchimali ai miofibroblasti
59
.
Al momento della nascita, il cordone ombelicale può misurare fino a 60-65 cm di
lunghezza, e contiene, insieme alla placenta, circa 100-180 ml di sangue. Il sangue del
cordone è ricco di Cellule Staminali Emopoietiche, che dimostrano di possedere una più
elevata attività di telomerasi
60
, un maggior numero di cellule stimolanti la formazione di
58
Benirschkle K, kaufmann P. Anatomy and pathology of the umbilical cord. In: Springer, ed. Pathology
of the human placenta. New York; 2006.
59
Can A, Karahuseyinoglu S. Concise review: human umbilical cord stroma with regard to the source of
fetus-derived stem cells. Stem Cells. 2007; 25: 2886-2895
60
Sakabe H, Yahata N, Kimura T, Zeng ZZ, Minamiguchi H, Kaneko H, Mori KJ, Ohyashiki K, Ohyashiki
JH, Toya ma K, Abe T, Sonoda Y, “Human cord blood-derived primitive progenitors are enriched in
35
colonie nel lungo periodo (come di quelle in grado di ripopolare il sistema immunitario
dopo SCID
61
- dall’inglese “Severe Combined Immuno Deficiencies-) e, soprattutto, un
più intenso potenziale proliferativo in vitro
62
rispetto alle CSE midollari.
Le SCO sono note, inoltre, per la capacità di secernere numerose citochine e fattori di
crescita, come il Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) e il Fibroblast Growth
Factor (FGF-2)
63
, che stimolano processi di neoformazione vascolare.
La potente attività emopoietica di queste staminali CD34+, derivate del sangue del
cordone ombelicale, pessere attribuita al fatto che esso è una fonte molto più immatura
di cellule staminali rispetto alle altre fonti adulte. Riesce ad ottenere una ricostruzione
ematopoietica conseguente all’ablazione del midollo osseo, coronata da successo, anche
se in ritardo, attraverso il trapianto di appena un decimo delle staminali necessarie rispetto
alle tecniche che utilizzano quelle del midollo osseo
64
. Le capacità di differenziazione di
questa popolazione di staminali si sono dimostrate eccezionali nei più vari tessuti
dell'organismo: dai neuroni
65
, agli epatociti
66
, dagli osteoblasti
67
alle cellule muscolari
cardiache
68
alle dopaminergiche della sostanza nigra.
CD34+c-kit- cells: correlation between long-term culture-initiating cells and telomerase expression”.
Leukemia 1998;12:728734.
61
Hogan CJ, Shpall EJ, McNulty O, McNiece I, Dick JE, Shultz LD, Keller G, Engraftment and
development of human CD34(+)-enriched cells from umbilical cord blood in NOD/LtSz-scid/scid mice”.
Blood. 1997; 90: 8596.
62
Theunissen K, Verfaillie CM, “A multifactorial analysis of umbilical cord blood, adult bone marrow and
mobilized peripheral blood progenitors using the improved ML-IC assay”. Exp Hematol. 2005;33:165–
172.
63
Mayer H, Bertram H, Lindenmaier W, Korff T, Weber H, Weich H, “Vascular endothelial growth factor
(VEGF-A) expression in human mesenchymal stem cells: autocrine and paracrine role on osteoblastic and
endothelial differentiation”. J Cell Biochem. 2005;95:827–839.
64
Riordan NH, Chan K, Marleau AM, Ichim TE, Medistem Laboratories Inc, Tempe, Arizona, USA,
“Cord blood in regenerative medicine: do we need immune suppression?”. J Transl Med. 2007 Jan 30;5:8.
PMID: 17261200, PMCID: PMC1796850
65
Jeong JA, Gang EJ, Hong SH, Hwang SH, Kim SW, Yang IH, Ahn C, Han H, Kim H. Rapid neural
differentiation of human cord blood-derived mesenchymal stem cells. Neuroreport. 2004;15:17311734
66
Kang XQ, Zang WJ, Bao LJ, Li DL, Song TS, Xu XL, Yu XJ. Fibroblast growth factor-4 and
hepatocyte growth factor induce differentiation of human umbilical cord blood-derived mesenchymal
stem cells into hepatocytes. World J Gastroenterol. 2005;11:74617465.
67
Hutson EL, Boyer S, Genever PG. Rapid isolation, expansion, and differentiation of osteoprogenitors
from full-term umbilical cord blood.Tissue Eng. 2005;11:14071420.
68
Kadivar M, Khatami S, Mortazavi Y, Shokrgozar MA, Taghikhani M, Soleimani M. In vitro
cardiomyogenic potential of human umbilical vein-derived mesenchymal stem cells. Biochem Biophys
Res Commun.2006;340:639647.
36
Un loro aspetto fondamentale risiede nelle loro proprietà antinfiammatorie e
immunomodulatrici, determinate dalla secrezione di citochine inibitorie immunitarie,
come interleuchina Il-10 ed il Transforming Growth Factor (TGF-beta).
Così come le cellule staminali emopoietiche prelevate dal midollo osseo e da sangue
periferico, anche le CSE presenti nel sangue cordonale possono essere utilizzate ad uso
trapiantologico. Il primo trapianto di cellule staminali da sangue cordonale fu eseguito
nel 1988 da Eliane Gluckman, per curare un bambino affetto da anemia aplastica
costituzionale di Fanconi
69
; da allora, l’impiego di cellule del cordone ombelicale è ormai
una realtà terapeutica consolidata.
I vantaggi nell’utilizzo del sangue cordonale sono molteplici
70
:
assenza di rischi legati a procedure invasive di prelievo per la madre e per il
neonato, al contrario invece di quelli presenti nel prelievo di CSE da midollo osseo
(per esempio il rischio anestesiologico);
assenza di rischi legati al rifiuto della donazione, evenienza possibile nel momento
in cui viene proposta la procedura di prelievo del midollo osseo;
pronta disponibilità alla richiesta nell’ordine di giorni o settimane, contro i mesi
che possono essere necessari per il reperimento di un donatore di midollo osseo.
ridotta capacità delle stesse di esercitare un’aggressione immunologica nei
confronti dei tessuti del ricevente, grazie al loro elevato grado di immaturi
immunologica (immaturità dei linfociti CD8+), e pertanto, in una ridotta incidenza
di GvHD (Graft Versus Host Disease), acuta e cronica.
Questo porta a ridurre l’importanza del livello di compatibilità HLA
donatore/ricevente, con la conseguente possibilità di impiego delle CSE cordonali
anche in situazioni di non consanguineità e/o di parziale compatibilità HLA
donatore/ricevente;
69
Wagner JE, Gluckman E, Division of Hematology/Oncology and Blood and Marrow Transplantation,
Department of Pediatrics, University of Minnesota Medical School, Minneapolis, MN 55455, USA,
“Umbilical cord blood transplantation: the first 20 years”. Semin Hematol. 2010 Jan;47(1):3-12. PMID:
20109607
70
Gurudutta GU, Satija NK, Singh VK, Verma YK, Gupta P, Tripathi RP, Stem Cell & Gene Therapy
Resea rch Group, Institute of Nuclear Medicine & Allied Sciences, Delhi, India, “Stem cell therapy: a
novel & futuristic treatment modality for disaster injuries”. Indian J Med Res. 2012;135:15-25. PMID:
22382178, PMCID: PMC3307178
37
migliori benefici a distanza per quanto concerne la sopravvivenza a lungo
termine
71
.
Esistono comunque anche degli svantaggi nell’utilizzo del sangue cordonale:
volume di sangue limitato (di solito intorno ai 70 cc di sangue), solitamente
insufficiente per trapiantare soggetti oltre i 40 Kg. Le linee guida internazionali,
infatti, raccomandano una dose minima di cellule nucleate per un trapianto di
midollo pari a 2-3 x 107 per ogni Kg di peso del ricevente. Il rischio di
complicanze fatali associate a questo tipo di trapianto è, infatti, inversamente
proporzionale al numero di cellule infuse. La possibilità di trapiantare due unità
cordonali nello stesso individuo, di espandere le cellule staminali del sangue
cordonale o di procedere ad una diretta iniezione intraossea dei progenitori
emopoietici cordonali rende possibile ipotizzare l’impiego routinario di questa
sorgente di progenitori emopoietici, anche per trapiantare pazienti con un peso
corporeo superiore ai 40-50 Kg;
maggior frequenza di ritardo di attecchimento delle cellule staminali trasfuse;
maggior rischio di recidiva della malattia dopo trapianto, a causa della riduzione,
nel paziente, del conflitto immunologico esercitato dalle cellule
immunocompetenti nei confronti delle cellule neoplastiche del ricevente,
fenomeno mediato dai linfociti-T e definito Graft Versus Leukemia
72
(GVL).
possibilità di trasmettere cellule staminali emopoietiche con anomalie genetiche
non evidenziate nei primi sei mesi di vita.
71
Liao Y, Geyer MB, Yang AJ, Cairo MS, Department of Pediatrics, New York-Presbyterian Morgan
Stanley Children's Hospital, Columbia University, New York, NY 10032, USA, “Cord blood
transplantation and stem cell regenerative potential”. Exp Hematol. 2011 Apr;39(4):393-412. Epub 2011
Jan 13. PMID: 21238533
72
Choi S, Reddy P, Blood and Marrow Transplantation Program, Department of Internal Medicine,
Division of Hematology/Oncology, University of Michigan Comprehensive Cancer Center, Ann Arbor, MI
48109-0942, USA, “Gra ft-versus-host disease”. Panminerva Med. 2010 Jun;52(2):111-24. PMID:
20517195
38
2.2 Applicazioni terapeutiche
Il trapianto di cellule staminali emopoietiche (TCSE) rappresenta da anni la terapia
d’elezione per il trattamento di molte malattie ematologiche
73
e non.
Ricordiamo, infatti, che le principali indicazioni al trapianto sono rappresentate da
patologie neoplastiche come le leucemie, linfomi di Hodgkin e non Hodgkin, alcuni
tumori solidi come il neuroblastoma e mielomi multipli. Altre indicazioni importanti sono
rappresentate da malattie da immunodeficienza o da errori congeniti
74
, come la sindrome
da immunodeficienza severa (SCID), l’aplasia midollare, le talassemie, l’anemia aplastica
e l’anemia di Fanconi.
Le basi biologiche del trapianto sono state poste negli anni ’50, con l’individuazione delle
cellule staminali emopoietiche nel sangue midollare, e del sistema maggiore di
istocompatibilità HLA (Human Leukocite Antigens). Negli anni ’50 e ’60 sono stati
effettuati i primi tentativi di trapianto, ed il primo trapianto effettuato con esito positivo
è quello pubblicato da Gatti e collaboratori nel novembre del 1968
75
. Nel 1975 sono stati
pubblicati i risultati dei primi 110 pazienti trapiantati, fornendo le basi per l'applicazione
clinica del trapianto di midollo osseo su larga scala. Poche altre terapie hanno inciso così
profondamente sulla storia naturale di molte patologie come il trapianto di cellule
staminali emopoietiche (TCSE). Il trapianto, ha da un lato modificato le prospettive di