Content uploaded by Alexander Meleshko
Author content
All content in this area was uploaded by Alexander Meleshko on May 11, 2022
Content may be subject to copyright.
30
Pediatric Hematology/Oncology and Immunopathology
2021 | Vol. 20 | № 2 | 30‒38
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Первый опыт применения локально
изготовленных CAR-T-клеток
у пациентов с рецидивным/
рефрактерным острым
лимфобластным лейкозом в Беларуси
О.В. Алейникова1, А.А. Мигас1, Е.А. Столярова1, А.В. Пунько1, Л.В. Мовчан1, А.В. Клыч1,
О.А. Мишкова1, А.В. Гиль1, А.Н. Мелешко1, Н.Е. Конопля2
1ГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии», Респу-
блика Беларусь, Минский район, д. Боровляны
2ГУ «Республиканский научно-практический центр онкологии и медицинской радиологии им. Н.Н. Алексан-
дрова», Республика Беларусь, Минский район, аг. Лесной
Результаты лечения рецидивного/рефрактерного острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) с
помощью как стандартной, так и высокодозной химиотерапии являются неудовлетворительными
и требуют разработки новых терапевтических опций. Применение подходов иммунотерапии
открывает новые перспективы перед пациентами, у которых цитотоксическая химиотерапия
оказалась неэффективной или непереносимой. Данная статья представляет собой описание
опыта использования изготовленных на базе Республиканского научно-практического центра
детской онкологии, гематологии и иммунологии CD19 CAR-Т-клеток после режима лимфодеплеции
флударабином и циклофосфамидом у 2 пациентов старше 18 лет с рефрактерным рецидивом
ОЛЛ. Иные возможности консервативного лечения для этих пациентов были исчерпаны. Данное
исследование одобрено независимым этическим комитетом и утверждено решением ученого совета
ГУ «Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии»
(Республика Беларусь). Химерный рецептор 2-го поколения был сконструирован из анти-CD19
scFv-фрагмента антитела, трансмембранного домена CD28, сигнальных доменов белков 4-1BB
и CD3z и трансдуцирован в Т-лимфоциты в составе лентивирусного вектора pWPXL. Клеточный
продукт был получен путем сепарации и раздельного процессинга CD4- и CD8-лимфоцитов
в присутствии интерлейкина-7 и интерлейкина-15. Оценивались субпопуляционный состав
полученного CAR-T-клеточного продукта и экспрессия иммунных контрольных точек. Полученные
результаты свидетельствуют о высокой антилейкемической активности полученных CAR-T-
клеток. Выполнялся мониторинг персистенции CAR-T-клеток, определялся уровень минимальной
остаточной болезни, а также спектр воспалительных цитокинов в крови. Оба пациента ответили
на CAR-T-терапию снижением уровня бластных клеток. Лечение сопровождалось синдромом
высвобождения цитокинов, контролируемым рекомбинантным моноклональным антителом к
человеческому рецептору интерлейкина-6 – тоцилизумабом. Разработанная и воспроизведенная
технология лабораторно полученных CAR-T-клеток может применяться для лечения пациентов
с тяжелым рецидивным/рефрактерным В-линейным ОЛЛ в качестве терапии спасения и дать
дополнительные шансы на их излечение.
Ключевые слова: острый лимфобластный лейкоз, рецидив, рефрактерность, химерные антигенные
рецепторы, CAR-T-клетки, синдром высвобождения цитокинов
Алейникова О.В. и соавт. Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии.
2021; 20 (2): 30–38. DOI: 10.24287/1726-1708-2021-20-2-30-38
The rst experience of using locally manufactured CAR-T cells
in patients with relapsed/refractory acute lymphoblastic leukemia
in Belarus
O.V. Aleinikova1, A.A. Migas1, E.A. Stolyarova1, A.V. Punko1, L.V. Movchan1, A.V. Klych1, O.A. Mishkova1, A.V. Hill1,
A.N. Meleshko1, N.E. Konoplya2
1Belarusian Research Center for Pediatric Oncology, Hematology and Immunology, Borovlyany, Minsk region, Republic of Belarus
2N.N. Alexandrov National Cancer Centre, Lesnoy, Minsk region, Republic of Belarus
The results of treatment of recurrent/refractory acute lymphoblastic leukemia (ALL) with both standard and high-dose
chemotherapy are unsatisfactory and require the development of new therapeutic options. The use of immunotherapy approaches
opens up new perspectives for patients whose cytotoxic chemotherapy was ineective or intolerable. This article describes the
experience of using CD19 CAR-T cells manufactured at the Republican Scientic and Practical Center for Pediatric Oncology,
Hematology and Immunology after lymphodepletion with udarabine and cyclophosphamide in two patients over 18 years of age
with refractory relapse of ALL. Other possibilities of conservative treatment for these patients have been exhausted. The study
was approved by the Independent Ethics Committee and the Scientic Council of the Belarusian Research Center for Pediatric
Oncology, Hematology and Immunology (Republic of Belarus). The chimeric 2nd generation receptor was constructed from the
anti-CD19 scFv antibody fragment, the CD28 transmembrane domain, signaling domains of the 4-1BB and CD3z proteins, and
transduced into T-lymphocytes as part of the pWPXL lentiviral vector. The cell product was obtained by separation and separate
processing of CD4 and CD8 lymphocytes in the presence of IL-7 and IL-15. The subpopulation composition of the resulting CAR-T
2021 ФГБУ «НМИЦ ДГОИ
им. Дмитрия Рогачева»
Минздрава России
Поступила 23.03.2021
Принята к печати 15.04.2021
2021 by «D. Rogachev NMRCPHOI»
Received 23.03.2021
Accepted 15.04.2021
Correspondence:
Olga V. Aleinikova,
Corresponding Member of the National
Academy of Sciences of Belarus,
dr. med. sci., Professor, Senior Researcher,
Center for Pediatric Oncology, Hematology
and Immunology (Republic of Belarus)
Address: 43 Frunzenskaya St., Borovlyany
223053, Minsk region, Republic of Belarus
E-mail: aleinikova2004@mail.ru
Контактная информация:
Ольга Витальевна Алейникова,
член-корр. НАН РБ, д-р мед. наук,
профессор, главный научный сотрудник
Республиканского научно-практического
центра детской онкологии, гематологии и
иммунологии (Республика Беларусь)
Адрес: Республика Беларусь, 223053,
Минский район, д. Боровляны,
ул. Фрунзенская, 43
E-mail: aleinikova2004@mail.ru
10.24287/1726-1708-2021-20-2-30-38
31
Трансплантация и клеточные технологии
Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии
2021 | Том 20 | № 2 | 30‒38
cell product and the expression of immune checkpoints were assessed. The results obtained indicate a high antileukemic activity
of the obtained CAR-T cells. Monitoring of CAR-T cells' persistence, the level of minimal residual disease, and the spectrum of
inammatory cytokines in the blood was performed. Both patients responded to CAR-T therapy by lowering their blast cell levels.
Treatment was accompanied by a cytokine release syndrome controlled by a recombinant monoclonal antibody to the human
IL-6 receptor, tocilizumab. The developed and replicated laboratory-derived CAR-T cell technology can be used to treat patients
with severe relapsed/refractory B-line ALL as rescue therapy and provide additional chances for their cure.
Key words: acute lymphoblastic leukemia, relapse, refractoriness, chimeric antigen receptors, CAR-T cells, cytokine release
syndrome
Aleinikova O.V., et al. Pediatric Hematology/Oncology and Immunopathology. 2021; 20 (2): 30–38.
DOI: 10.24287/1726-1708-2021-20-2-30-38
Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) в насто-
ящее время является курабельным забо-
леванием у детей более чем в 90% случаев
(рисунок 1).
Выживаемость у подростков и молодых взрослых
несколько хуже и составляет, по данным Белорус-
ского детского канцер-субрегистра, 6 ± 6% для
бессобытийной выживаемости (БСВ) и 70 ± 5% для
общей выживаемости (ОВ) (рисунок 2).
Успех в лечении был достигнут путем опти-
мизации химиотерапии (ХТ) в первой линии на
последовательных протоколах МВ и улучшения сопро-
водительной терапии, однако у 10–15% пациентов в
возрасте от 1 до 18 лет и 30–40% пациентов в возрасте
от 19 до 30 лет развивается рецидив заболевания, а
исходы после рецидивов ОЛЛ остаются неудовлет-
ворительными. С помощью интенсивной комбиниро-
ванной ХТ и последующей аллогенной трансплантации
гемопоэтических стволовых клеток можно добиться
излечения от 30 до 50% всех детей с рецидивом ОЛЛ.
В последнее десятилетие появление иммуноте-
рапии меняет терапевтические парадигмы для паци-
ентов, у которых цитотоксическая ХТ оказалась
неэффективной или непереносимой. Биспецифи-
ческие активаторы Т-клеток (BiTE) – блинатумомаб
или Т-клетки, экспрессирующие химерные анти-
генные рецепторы (CAR) могут успешно задейство-
вать цитотоксический потенциал (аутологичных
или аллогенных) Т-лимфоцитов против бластных
клеток пациента с острым лейкозом. Несмотря на
различия в дизайне CAR, в этих испытаниях наблю-
даются сходные показатели ремиссии и профили
токсичности. Токсичность возникает в основном
в результате гиперактивации иммунной системы,
что приводит к синдрому высвобождения цитокинов
(СВЦ). Тяжелый СВЦ ассоциирован с дозой CAR-Т-
клеток и с продвинутой стадией заболевания [1–3].
На стойкость CAR-T-клеток влияет дизайн CAR.
В данной статье мы сообщаем о нашем опыте
использования локально изготовленных CD19 CAR-Т-
клеток после режима лимфодеплеции флударабином
и циклофосфамидом у 2 молодых людей с рефрак-
терным рецидивом ОЛЛ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Данное исследование одобрено независимым
этическим комитетом и утверждено решением
ученого совета ГУ «Республиканский научно-прак-
тический центр детской онкологии, гематологии и
иммунологии» (Республика Беларусь).
Селекция и экспансия Т-клеток
В качестве исходного материала для полу-
чения первичной культуры Т-клеток использовали
Рисунок 1
Оптимизация терапии детей на протоколе МВ
в Республике Беларусь
Figure 1
Therapy optimization for children on MB protocols
in the Republic of Belarus
Рисунок 2
Результаты выживаемости у подростков и молодых
взрослых в Республике Беларусь
Figure 2
Survival outcomes in adolescents and young adults in the
Republic of Belarus
32
Pediatric Hematology/Oncology and Immunopathology
2021 | Vol. 20 | № 2 | 30‒38
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
продукт афереза реципиента. Изоляцию популяций
CD4+ и CD8+ Т-клеток проводили раздельно методом
иммуномагнитной селекции с использованием соот-
ветствующих наборов CD4/CD8 Positive Isolation Kit
(Thermo Fisher scientific, Норвегия). Т-клетки инку-
бировали в полной среде RPMI 1640 (Thermo Fisher
scientific, Бразилия) с добавлением рекомбинантных
цитокинов интерлейкина (ИЛ)-7 и ИЛ-15 (Miltenyi
Biotec GmbH, Германия) в конечной концентрации
10 нг/мл. Активацию Т-клеток осуществляли с
использованием иммуномагнитных частиц Dynabeads
Human T-activator CD3/CD28 (Thermo Fisher scientific,
Норвегия). Продолжительность экспансии клеточного
продукта составила 13 сут, смену среды производили
по достижении плотности 2 × 106 клеток/мл.
Генетическая модификация Т-клеток
Рекомбинантные псевдотипированные лентиви-
русные частицы, предназначенные для трансдукции
Т-клеток, получали путем транзиторной котранс-
фекции клеточной линии 293Т (ATCC CRL-3216)
лентивирусной системой второго поколения. Транс-
фер-вектор S4, полученный на основе плазмиды
pWPXL (Addgene #12257), содержал бицистронную
экспрессионную кассету, кодирующую последова-
тельность CAR 2-го поколения к белку CD19 человека,
а также транкированного варианта белка EGFR чело-
века (рисунок 3).
В качестве пакующего вектора использовали
плазмиду pCMV-dR8.91. Белок оболочки VSV-G коди-
ровался вектором pMD2.G (Addgene #12259). Функ-
циональный титр вирусных частиц определяли
методом трансдукции клеток линии 293Т серией
последовательных разведений. В контроль безо-
пасности вирусного супернатанта входило опре-
деление рекомбинантно-компетентных вирусных
частиц (RCL) методом количественной полиме-
разной цепной реакции (ПЦР), микробиологический
контроль. Трансдукцию Т-клеток реципиента прово-
дили в присутствии рекомбинантного фибронектина
RetroNectin (Takara Bio, США). Множественность
инфекции составила 5 TU/клетку.
Иммунофенотипический анализ клеточного
продукта
Оценку субпопуляционного состава Т-клеток
осуществляли методом проточной цитометрии с
использованием антител к антигенам TIM-3, TIGIT,
LAG-3, PD1, CD3, CD4, CD8, CD45, CD45RO, CCR7,
CD62L, CD95 (Miltenyi Biotec GmbH, Германия). Опре-
деление функционального титра рекомбинантных
лентивирусных частиц, а также уровня трансдукции
Т-клеток проводили с использованием антител
FAB9577R (R&D systems, США) к транкированному
варианту белка EGFR человека.
Оценка экспансии и персистенции CAR-Т-клеток
в организме реципиента
Анализ проводили на материале костного мозга
и периферической крови методами проточной цито-
метрии (определение Т-клеток с эктопической
экспрессией рекомбинантного белка EGFRt), а также
количественной ПЦР с олигонуклеотидами, компле-
ментарными последовательностями CAR.
Оценка уровня минимальной остаточной болезни
Оценку уровня минимальной остаточной болезни
(МОБ) проводили методом проточной цитометрии в
соответствии с описанным ранее протоколом [4], а
также путем количественного определения уровня
экспрессии химерного онкогена BCR/ABL1 [5] и
реаранжировок Ig/TCR [4].
Пациенты
Пациент Б-к, 30 лет, диагноз: ОЛЛ (в костном
мозге 31% бластов), L2, pre-B-иммунофенотип был
установлен в июле 2019 г. В лейкемических клетках
не было выявлено таких химерных онкогенов, как
TEL/AML, BCR/ABL, Е2А/PBX1, перестроек гена
MLL. Согласно цитогенетическому исследованию в
бластных клетках была установлена субмикроскопи-
ческая del(12p), затрагивающая ген ETV6. Также был
выявлен минорный тетраплоидный субклон лейке-
мических клеток с субмикроскопической делецией
короткого плеча двух хромосом 12. Лечение забо-
левания проводилось по протоколу ALL MB-2015 с
достижением морфологической ремиссии после окон-
чания индукционной терапии.
Первый очень ранний изолированный костно-
мозговой рецидив заболевания возник в августе
2020 г. (через 1 год от начала лечения на этапе
консолидации 6). В рецидиве бластные клетки имели
common-B-иммунофенотип, пул лейкемических
клеток был представлен сложным кариотипом (гипо-
Рисунок 3
Генетическая карта разработанного CAR
Figure 3
Genetic map of the developed chimeric antigen receptor
33
Трансплантация и клеточные технологии
Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии
2021 | Том 20 | № 2 | 30‒38
плоидия в сочетании с 3 структурными аберрациями).
В исследовании FISH химерный ген TEL/AML1 не
был выявлен, однако имелась делеция одной копии
гена TEL 12p12.2 (моносомия хромосомы 12), не
было перестроек генов MLL, TCF3, IGH, CRLF2, ABL1,
ABL2, NTRK3, PDGFRB, JAK2 и ZNF384, не выявлены
инверсия MEF2D/BCL9 и реаранжировка гена MEF2D,
но имелась делеция второй копии генов CRLF2, ABL1,
NTRK3, JAK2 и ZNF384 (моносомия хромосом Y,
9, 15 и 12). Учитывая очень ранний рецидив ОЛЛ и
неблагоприятный прогноз по течению и исходу забо-
левания, пациенту был выполнен аферез лимфо-
цитов, после чего стартовала вторая линия терапии.
Терапия рецидива заболевания включала 6-дневный
курс профазы метилпреднизолоном, блок полихимио-
терапии FLAI (флударабин, цитозар, идарубицин),
однако ремиссия по основному заболеванию после
проводимого лечения не была достигнута, в сентябре
2020 г. в костном мозге определялось 67,0% бластов.
В связи с тем, что все возможные методы стан-
дартного лечения были исчерпаны, пациент имел
крайне неблагоприятный прогноз по течению и исходу
заболевания, единственным возможным шансом
добиться ремиссии явилось проведение CAR-T-кле-
точной терапии.
На этапе включения в исследование по приме-
нению CAR-T-клеточной терапии у пациента отме-
чалось тяжелое, но компенсированное состояние,
обусловленное прогрессированием основного
заболевания (содержание бластов в костном мозге
составило 94,5%, отмечалось увеличение печени на
5–5,5 см, селезенки – на 7–7,5 см от края
реберной дуги), контролируемым инфекционным
процессом (синдром системного воспалительного
ответа, инфекция кровотока, вызванная Candida
guilliermondii, Klebsiella pneumonia), носитель-
ством мультирезистентной бактериальной флоры
(Acinetobacter baumanii, Klebsiella pneumoniae). По
данным компьютерной томографии органов грудной
клетки отмечались единичные периваскулярные
очаги уплотнения легочной ткани в S6 слева и S8
справа. По данным магнитно-резонансной томо-
графии установлено кровоизлияние в головной
мозг в хронической стадии, выявлены признаки
лейкоэнцефалопатии, неокклюзионной внутренней
и наружной гидроцефалии. Кроме того, у пациента
была диагностирована тяжелая периферическая
нейропатия III степени согласно критериям CTCAE 5.0.
После получения разрешения на проведение
терапии в Министерстве здравоохранения Республики
Беларусь, а также подписания пациентом информи-
рованного согласия была проведена CAR-T-клеточная
терапия.
Пациент Б-ч, 30 лет, диагноз: Common-В-кле-
точный ОЛЛ, Ph+ был установлен в августе 2014 г.
Лечение заболевания проводилось по протоколу ALL
MB-2008 + иматиниб. Изолированный костномоз-
говой Ph+-рецидив I диагностирован в январе 2019 г.,
в связи с чем была проведена терапия второй линии,
которая включала 8 блоков полихимиотерапии по
протоколу Hyper CVAD + нилотиниб. В марте 2019 г.
была достигнута ремиссия II. В дальнейшем пациент
получал поддерживающую терапию нилотинибом. За
период проводимой терапии пациенту был найден
аллогенный HLA-совместимый неродственный донор
для проведения аллогенной трансплантации гемо-
поэтических стволовых клеток, однако в сентябре
2020 г. был диагностирован очередной изолиро-
ванный костномозговой Ph+-рецидив II ОЛЛ. Пациенту
был проведен блок полихимиотерапии FLAG (флуда-
рабин, цитозар), однако ремиссия не была достиг-
нута (на 26.10.2020 в костном мозге определялось
14,2% бластов). Поскольку и в этом случае все
возможные методы консервативного лечения были
исчерпаны, а пациент имел крайне неблагоприятный
прогноз по основному заболеванию, единственным
возможным шансом добиться ремиссии также
явилось проведение CAR-T-клеточной терапии. В
связи с чем пациенту был выполнен аферез лимфо-
цитов.
На этапе включения в исследование по приме-
нению CAR-T-клеточной терапии содержание бластов
в костном мозге пациента составило 73%, отме-
чалось увеличение печени на 1,5 см, исследуемый
не являлся носителем резистентной бактериальной
флоры, кроме того, после комплексного обследо-
вания у него не было выявлено очагов инфекции.
После получения разрешения на проведение терапии
в Министерстве здравоохранения Республики Бела-
русь, а также подписания пациентом информиро-
ванного согласия была проведена CAR-T-клеточная
терапия.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Получение клеточного продукта и его функцио-
нальная характеристика
В ходе экспансии ex vivo Т-лимфоцитов реципи-
ентов были получены конечные продукты в количе-
стве, превышающем в 2 раза расчетную дозу введения.
Субпопуляционный состав и содержание Т-лимфо-
цитов, экспрессирующих CAR, соответствовали требо-
ваниям экспериментального протокола (таблица 1).
Полученный продукт соответствовал заявленным
в протоколе критериям безопасности: микробиологи-
ческая чистота, отсутствие RCL.
Экспансия и персистенция CAR+-Т-клеток in vivo
Оценку эффективности экспансии и перси-
стенцию Т-лимфоцитов, экспрессирующих CAR к
34
Pediatric Hematology/Oncology and Immunopathology
2021 | Vol. 20 | № 2 | 30‒38
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
белку CD19 человека, проводили на материале кост-
ного мозга и периферической крови реципиента на
контрольных точках, обозначенных в эксперимен-
тальном протоколе.
Для пациента Б-к содержание CAR-Т-клеток
по данным иммунофенотипирования на 5-е сутки
от начала терапии составляло 15%, на 8-е сутки –
97,6% всех Т-клеток периферической крови.
В случае пациента Б-ч согласно данным имму-
нофенотипирования (рисунок 4А, Б), а также
количественной ПЦР (рисунок 4В) пик экспансии
CAR+-клеток пришелся на 14–22-й дни от момента
введения клеточного продукта.
Мониторинг уровня минимальной остаточной
болезни
Для пациента Б-к удалось зафиксировать
снижение количества CD45+-, CD19+-, CD20+-клеток
в материале периферической крови с 70% на день 0
до 0,01% уже на день 5 после введения клеточного
продукта, на 8-е сутки содержание целевой попу-
ляции опустилось ниже порога определения (0,01%).
У пациента Б-ч по данным иммунофенотипиче-
ского анализа уровень МОБ опустился ниже порога
определения (0,01%) уже на 16-е сутки от момента
введения клеточного продукта как в периферической
крови, так и в костном мозге (рисунок 5).
Количественное определение транскрипта химер-
ного онкогена BCR/ABL1 в материале костного мозга
реципиента Б-ч продемонстрировало устойчивое
снижение показателя МОБ (рисунок 6). К 56-му дню
от начала проведения CAR-Т-терапии снижение
составило более 4 логарифмов от начального
значения. Анализ МОБ для пациента Б-ч выполнялся
по клональным реаранжировкам TCRG и делеции
Vk-KDE и показал отрицательное значение МОБ на
56-й и 70-й дни после инфузии CAR-T [6].
Оба пациента имели высокий бластоз в костном
мозге на момент трансфузии CAR-T-клеток. У обоих
пациентов после введения CAR-T-клеток развились
токсические осложнения, характерные для данного
вида терапии. Так, СВЦ развился у обоих пациентов,
несмотря на профилактическое введение им тоци-
лизумаба в день 0 в дозе 8 мг/кг.
Пациент Б-к развил СВЦ III степени тяжести на
5-е сутки, включая гемодинамическую нестабиль-
ность, требующую болюсов внутривенной жидкости,
вазопрессоров и неинвазивной искусственной венти-
ляции легких. После введения 2 доз тоцилизумаба
8 мг/кг с интервалом 8 ч состояние пациента
несколько стабилизировалось, однако после крат-
ковременного улучшения возникли признаки прорывной
инфекции, септического шока и на 10-е сутки пациент
умер. На аутопсии обнаружены тотальный геморра-
гический некроз легкого, признаки нарушения крово-
обращения и септические очаги преимущественно в
виде эмболов из мицелия гриба Mucor corymbifera. При
бактериологическом исследовании выявлены Klebsiela
pneumonia и Acinetobacer baumanii. В костном мозге
обнаружено небольшое количество бластов в состо-
янии некробиоза.
У пациента Б-ч СВЦ II степени тяжести манифе-
стировал на 8-й день лихорадкой и падением сату-
рации О2. После введения 1 дозы тоцилизумаба
Таблица 1
Характеристика конечного клеточного продукта
Table 1
Characterization of the final cell product
Параметр
Parameter
Реципиент
Recipient
Б-ч
B-ch Б-к
B-k
CD4+CD8+CD4+CD8+
Общий прирост (разы)
A total increase (fold) 187 180 167 44
Уровень трансдукции (% EGFRt+-клеток)
The level of transduction (% of EGFRt+ cells) 27 20 30 18
Субпопуляционный состав (%):
Subpopulation composition (%):
стволовые клетки памяти
memory stem cells
центральные клетки памяти
central memory cells
эффекторные клетки памяти
eector memory cells
терминальные эффекторы
terminal eectors
2,1
25,3
65,5
7,1
11
48
29,1
11,9
5,1
50,2
42,6
2
27,8
59,3
12,5
0,3
Экспрессия рецепторов иммунных контрольных точек (%):
The expression of immune checkpoints receptors (%):
TIM-3
TIGIT
LAG-3
PD1
97,4
5,8
0,5
1,5
99,9
10,1
1,1
0,2
Нет данных
No data available
Нет данных
No data available
Нет данных
No data available
Нет данных
No data available
Нет данных
No data available
Нет данных
No data available
Нет данных
No data available
Нет данных
No data available
35
Трансплантация и клеточные технологии
Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии
2021 | Том 20 | № 2 | 30‒38
Рисунок 4
Экспансия и персистенция CAR+-Т-клеток in vivo (па-
циент Б-ч): А, Б – данные иммунофенотипирования;
В – количественная ПЦР
Figure 4
Expansion and persistence of CAR+-T cells in vivo (patient
B-ch): A, Б – immunophenotyping data; В – quantitative PCR
results
Рисунок 6
Оценка уровня МОБ методом количественной ПЦР,
пациент Б-ч
Figure 6
MRD assessment by quantitative PCR, patient B-ch
Рисунок 5
Оценка уровня МОБ методом иммунофенотипирова-
ния, пациент Б-ч
Figure 5
Minimal residual disease (MRD) assessment by
immunophenotyping, patient B-ch
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
% CAR+от Т-лимфоцитов
% of CAR+ cells in T cells
День терапии
Day of therapy
Костный мозг
Bone marrow
Периферическая кровь
Peripheral blood
0 3 7 10 14 16 22 28 43 56 70
Костный мозг
Bone marrow
Периферическая кровь
Peripheral blood
200
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
1,00Е+06
1,00Е+05
1,00Е+04
1,00Е+03
1,00Е+02
1,00Е+01
Количество CAR-Т (клетки/мкл)
CAR-T cell count (cells/µL)
Количество копий CAR в 1 мкг ДНК
CAR copy number in 1 µg DNA
День терапии
Day of therapy
Периферическая кровь
Peripheral blood
0 3 7 10 14 16 22 28 43 56 70
День терапии
Day of therapy
2 4 7 22 28 43 56 70
А
Б
В
0,01
0,1
1
10
100
Уровень МОБ, %
MRD level, %
Костный мозг
Bone marrow
Периферическая кровь
Peripheral blood
«-»10 1 3 7 14 16 22 28 43 56 70
День терапии
Day of therapy
0,001
0,01
0,1
1
10
100
1000
Уровень МОБ, %
MRD level, %
-10
Диагноз: рецидив
Diagnosis: a relapse
16 28 43 56 70
День терапии
Day of therapy
состояние пациента стабилизировалось. На 10-й день
от момента инфузии CAR-T-клеток у пациента разви-
лась нейротоксичность II степени согласно крите-
риям CTCAE 5.0, которая проявлялась делирием с
нарушением ориентации во времени и пространстве,
снижением когнитивных функций с расстройством
сознания. Неврологические нарушения были купиро-
ваны назначением дексаметазона 10 мг каждые 6 ч в
течение 4 дней и леветирацетама в терапевтической
дозе.
На 70-й день от момента трансфузии CAR-T-
клеток пациент Б-ч находится в полной молеку-
лярной ремиссии: BCR/ABL p190 – 6,6 × 10–4, МОБ по
мишеням Ig/TCR – отрицательно. Пациент готовится
к трансплантации костного мозга от неродствен-
ного донора. Клинические характеристики пациентов
приведены в таблице 2.
Проведенное нами исследование спектра цито-
кинов у обоих пациентов (таблица 3) показало, что,
начиная со 2-го дня от момента введения CAR-T-
клеток, уровень всех ежедневно исследуемых цито-
кинов повышался к моменту проявления клинических
симптомов СВЦ, особенно ИЛ-2R и ИЛ-6. Эти пока-
затели могут быть хорошими биомаркерами начина-
ющегося СВЦ для своевременного его купирования
рекомбинантным моноклональным антителом к чело-
веческому рецептору ИЛ-6 – тоцилизумабом.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Результаты лечения рецидивного/рефрактер-
ного ОЛЛ с помощью как стандартной, так и высо-
кодозной ХТ являются неудовлетворительными и
требуют разработки новых терапевтических опций.
Клеточная терапия, а именно адаптивные Т-лимфо-
циты, экспрессирующие CAR, становится эффек-
тивным методом лечения этих пациентов. Идея
адаптивной иммунотерапии с использованием
лимфоцитов возникла в начале 1990-х годов. Многие
36
Pediatric Hematology/Oncology and Immunopathology
2021 | Vol. 20 | № 2 | 30‒38
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ведущие североамериканские центры, такие как
Мемориальный онкологический центр Слоун Кетте-
ринг (MSKCC), Университет Пенсильвании (UPenn),
Детская больница Филадельфии (CHOP), Онколо-
гический исследовательский центр Фреда Хатчин-
сона (FHCRC) и Национальный институт рака (NCI)
разработали продукты CAR-T и приступили к их
клиническим испытаниям в терапии В-клеточных
злокачественных новообразований. В 2012 г. UPenn
был первым, где создали исследовательский альянс
с фармацевтической компанией для разработки
коммерческого продукта CAR-T-клеток [7].
По последним оценкам, общая стоимость
продуктов CAR-T-клеточной терапии, созданных с
Таблица 2
Клиническая характеристика пациентов
Table 2
Clinical characteristics of the patients
Параметр
Parameter Пациент Б-к
Patient B-k Пациент Б-ч
Patient B-ch
Возраст, годы
Age, years 30 30
Диагноз
Diagnosis В-клеточный ОЛЛ, рецидив I
B-cell ALL, relapse I B-клеточный ОЛЛ, Ph+, рецидив II
B-cell ALL, Ph+, relapse II
Бласты костного мозга на момент
проведения CAR-T, %
Bone marrow blasts at the time of CAR-T, %
94,5 73
Инфекция на момент проведения CAR-T
Infections at the time of CAR-T Cепсис
Sepsis –
СВЦ:
Cytokine release syndrome:
начало
onset
длительность
duration
III степень
Grade III
5-е сутки
Day 5
3 дня
3 days
II степень
Grade II
8-е сутки
Day 8
2 дня
2 days
Нейротоксичность:
Neurotoxicity:
начало
onset
длительность
duration
–
II степень
Grade II
10-й день
Day 10
4 дня
4 days
Костный мозг на день 14
Bone marrow on Day 14 –Миелокариоциты – 3 × 109, бласты – 0
Myelokaryocytes – 3 × 109, blasts – 0
Костный мозг на день 28
Bone marrow on Day 28 –Миелокариоциты – 52,0 × 109, бласты – 0,75
Myelokaryocytes – 52.0 × 109, blasts – 0.75
Таблица 3
Спектр цитокинов у пациентов Б-к и Б-ч
Table 3
The spectrum of cytokines in the patients B-k and B-ch
Пациент
Patient Показатель
Parameter Нормальные
значения
Normal range
День
Day
–1 2 3 5 7 9 10 11 13
Б-к
B-k ИЛ-1b, пг/мл
IL-1B, pg/ml < 5 15,8 8,58 15 – 127 – –
ИЛ-2R, Е/мл
IL-2R, U/ml 223–710 4080 5222 > 7500 – > 7500 – –
ИЛ-6, пг/мл
IL-6, pg/ml < 5,9 9995 18778 1405 – 347 000 – –
ИЛ-8, пг/мл
IL-8, pg/ml < 62 5730 7500 1075 – 7500 – –
ИЛ-10, пг/мл
IL-10, pg/ml < 9,1 15,5 15,5 23,3 – 1000 – –
ФНО-a, пг/мл
TNF-a, pg/ml < 8,1 44,3 68,3 20,2 – 204 – –
Тоцилизумаб, 8 мг/кг
Tocilizumab, 8 mg/kg
Б-ч
B-ch ИЛ-1b, пг/мл
IL-1B, pg/ml < 5 – < 5 < 5 < 5 7,05 14,8 < 5 < 5
ИЛ-2R, Е/мл
IL-2R, U/ml 223–710 – 813 1527 2763 5735 > 7500 6961 3410
ИЛ-6, пг/мл
IL-6, pg/ml < 5,9 < 2 302 206 253 3373 6167 146 6,3
ИЛ-8, пг/мл
IL-8, pg/ml < 62 < 5 35,8 25,8 32,8 191 443 113 34,2
ИЛ-10, пг/мл
IL-10, pg/ml < 9,1 < 5 8,72 49 296 623 192 39,5 5
ФНО-a, пг/мл
TNF-a, pg/ml < 8,1 – 13,7 18,4 20,8 47,7 44,1 13,8 6,54
Примечание. ФНО-a – фактор некроза опухоли-a.
Notes. IL – interleukin; TNF-a – tumor necrosis factor a.
37
Трансплантация и клеточные технологии
Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии
2021 | Том 20 | № 2 | 30‒38
использованием существующих производственных
подходов, составляет 150 000–475 000 долларов [3].
CAR-T-продукты могут производиться с исполь-
зованием ручной обработки, которая является
трудоемкой и сложно масштабируемой, однако значи-
тельно менее затратной. В основном это связано с
индивидуальным характером терапии CAR-T в соче-
тании с отсутствием технологий мелкомасштаб-
ного производства, предназначенных для клеточной
терапии, а также с необходимостью быстрого полу-
чения материала для ранней фазы испытаний. По
такому пути пошли некоторые центры, имеющие
соответствующие лаборатории, такие как Медицин-
ский центр Шиба (Израиль) [8]. В Республиканском
научно-практическом центре детской онкологии,
гематологии и иммунологии (Республика Беларусь)
1 июня 2019 г. была открыта новая лаборатория
генетических биотехнологий, которая предназна-
чена для производства биологических продуктов
(вакцины, клеточные продукты) для лечения злока-
чественных новообразований. Одной из главных
задач явилась отработка технологической схемы
мануального изготовления CAR-T-лимфоцитов на
первом этапе, их полномасштабное тестирование
и проведение клинического испытания. На втором
этапе возможно автоматизированное производство
клеточного продукта на биореакторах открытого
типа.
Полученные нами результаты свидетельствуют
о высокой антилейкемической активности полу-
ченных CAR-T-клеток. Так, пациент Б-ч на 70-й день
от момента трансфузии CAR-T-клеток находится
в полной молекулярной ремиссии: BCR/ABL p190 –
6,6 × 10–4, МОБ по мишеням Ig/TCR – отрицательно. На
аутопсии пациента Б-к в костном мозге обнаружено
небольшое количество бластов в состоянии некро-
биоза, несмотря на то, что он умер на 10-е сутки от
введения CAR-T-клеток. Высокую антилейкемическую
активность CAR-T-клеток отмечают многие исследо-
ватели [9, 10] даже после неудачной терапии ОЛЛ
блинатумомабом [8].
У обоих наших пациентов развился СВЦ, потребо-
вавший введения рекомбинантного моноклонального
антитела – тоцилизумаба, эффективность которого
была показана купированием клинических прояв-
лений СВЦ и нормализацией уровня цитокинов. СВЦ
наблюдается у некоторых пациентов после других
иммунобиологических препаратов, включая ритук-
симаб, муромонаб и блинатумомаб, но он встреча-
ется почти у всех пациентов, успешно пролеченных
CAR-T-клетками [4, 5, 11]. Признаки и симптомы
СВЦ возникают вторично по отношению к экспансии
CAR-T-клеток и активации иммунной системы,
начиная от легких конституциональных симптомов
лихорадки и миалгии до тяжелых угрожающих жизни
последствий, включая резистентную к жидкости гипо-
тензию и полиорганную дисфункцию, требующую
интенсивной терапии. Тяжесть СВЦ коррелирует с
повышением уровня нескольких ключевых цитокинов,
включая интерферон-g, ИЛ-6, ИЛ-5, ИЛ-10 и грану-
лоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий
фактор [1, 12].
Симптомы СВЦ могут имитировать синдром
системной воспалительной реакции. Хотя большин-
ство лихорадок, наблюдаемых у пациентов с СВЦ,
связано с высвобождением провоспалительных
цитокинов, а не с сепсисом, сопутствующие некон-
тролируемые инфекции могут усугублять СВЦ и
приводить к смерти пациентов [2, 13]. В нашем
случае пациент Б-ч на момент проведения терапии
CAR-T-клетками имел контролируемый инфекци-
онный процесс (синдром системной воспалительной
реакции, инфекцию кровотока, вызванную Candida
guilliermondii, Klebsiella pneumonia) и являлся носи-
телем мультирезистентной бактериальной флоры
(Acinetobacter baumanii, Klebsiella pneumoniae),
что усугубило его состояние и привело к леталь-
ному исходу на 10-е сутки после трансфузии
CAR-T. На аутопсии был обнаружен недиагности-
рованный прижизненно Mucor. Таким образом,
терапию CAR-Т-клетками следует проводить паци-
ентам при отсутствии у них системного инфекцион-
ного процесса, а всех больных с CAR-T-клетками, у
которых развивается лихорадка, следует лечить от
потенциальной инфекции [11].
Нейротоксичность – еще одно распространенное
осложнение, связанное с терапией CAR-T-клетками,
которое возникает у некоторых пациентов даже без
выявленного заболевания центральной нервной
системы. Если СВЦ обычно проявляется через
1–7 дней после инфузии CAR-T, то начало проявления
симптомов нейротоксичности менее предсказуемо,
но обычно происходит после начала СВЦ. Симптомы
сильно различаются: от легкой дезориентации,
зрительных галлюцинаций до тревожных расстройств
[2, 14]. У пациента Б-ч нейротоксичность II степени
развилась на 10-е сутки и проявилась делирием с
нарушением ориентации во времени и пространстве,
снижением когнитивных функций с расстройством
сознания.
Современные методы лечения нейротоксичности,
вызванной CAR, направлены на ослабление воспали-
тельной реакции. Тоцилизумаб не проникает через
гематоэнцефалический барьер и не может действо-
вать на рецепторы ИЛ-6 в центральной нервной
системе. В то время как анти-ИЛ-6-терапия показана
для лечения нейротоксичности у пациентов с сопут-
ствующим тяжелым СВЦ, больных с нейротоксично-
стью в отсутствие тяжелого СВЦ, для пациентов с
продолжающейся тяжелой нейротоксичностью после
38
Pediatric Hematology/Oncology and Immunopathology
2021 | Vol. 20 | № 2 | 30‒38
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
лечения тоцилизумабом или силтуксимабом пока-
заны высокие дозы кортикостероидов [15, 16].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В заключение мы можем констатировать, что
разработанная и воспроизведенная технология
лабораторно полученных CAR-T-клеток может
применяться для лечения пациентов с тяжелым реци-
дивным/рефрактерным В-линейным ОЛЛ в качестве
терапии спасения и дать дополнительные шансы на
их излечение.
ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ
Не указан.
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ
Авторы статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о
котором необходимо сообщить.
ORCID
Aleinikova О.V. ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0143-1921
1. Teachey D.T., Lacey S.F., Shaw P.A.,
Melenhorst J.J., Maude S.L., Frey N., et
al. Identication of predictive biomark-
ers for cytokine release syndrome after
chimeric antigen receptor T-cell ther-
apy for acute lymphoblastic leukemia.
Cancer Discov 2016; 6 (6): 664–79. DOI:
10.1158/2159-8290.CD-16-0040
2. Fitzgerald J.C., Weiss S.L., Maude S.L.,
Barrett D.M., Lacey S.F., Melenhorst J.J.,
et al. Cytokine release syndrome after
chimeric antigen receptor T cell ther-
apy for acute lymphoblastic leukemia.
Crit Care Med 2017; 45 (2): e124–31. DOI:
10.1097/CCM.0000000000002053
3. Walker A., Johnson R. Commercialization
of cellular immunotherapies for cancer.
Biochem Soc Trans 2016; 44: 329–32.
4. Winkler U., Jensen M., Manzke O.,
Schulz H., Diehl V., Engert A. Cytokine-re-
lease syndrome in patients with B-cell
chronic lymphocytic leukemia and high
lymphocyte counts after treatment with
an anti-CD20 monoclonal antibody (ritux-
imab, IDEC-C2B8). Blood 1999; 94 (7):
2217–24.
5. Bugelski P.J., Achuthanandam R.,
Capocasale R.J., Treacy G., Bouman-
Thio E. Monoclonal antibody-induced
cytokine-release syndrome. Expert Rev
Clin Immunol 2009; 5 (5): 499–521. DOI:
10.1586/eci.09.31
6. Meleshko A.N., Savva N.N., Fedasen-
ka U.U., Romancova A.S., Krasko O.V.,
Eckert C., et al. Prognostic value of
MRD-dynamics in childhood acute
lymphoblastic leukemia treated accord-
ing to the MB-2002/2008 protocols.
Leuk. Res 2011; 35 (10): 1312–20. DOI:
10.1016/j.leukres.2011.04.013
7. Vairy S., Garcia J.L., Teira P., Bitten-
court H. CTL019 (tisagenlecleucel):
CAR-T therapy for relapsed and refrac-
tory B-cell acute lymphoblastic leu-
kemia. Drug Des Devel Ther 2018; 12:
3885–98.
8. Jacoby E., Bielorai B., Avigdor A., Itzhaki O.,
Hutt D., Nussboim V., et al. Locally pro-
duced CD19 CAR T cells leading to clinical
remissions in medullary and extramedul-
lary relapsed acute lymphoblastic leu-
kemia. Am J Hematol 2018; 93 (12):
1485–92. DOI: 10.1002/ajh.25274. Epub
2018 Sep 26. PMID: 30187944.
9. Martino M., Alati C., Canale F.A.,
Musuraca G., Martinelli G., Cerchione C.
A Review of Clinical Outcomes of CAR
T-Cell Therapies for B-Acute Lympho-
blastic Leukemia. Int J Mol Sci 2021; 22
(4): 2150. DOI: 10.3390/ijms22042150
10. Aamir S., Anwar M.Y., Khalid F., Irfan
Khan S., Ashar Ali M., Ehsan Khattak Z.
Systematic Review and Meta-analy-
sis of CD19-Specic CAR-T Cell Therapy
in Relapsed/Refractory Acute Lymph-
oblastic Leukemia in the Pediatric and
Young Adult Population: Safety and E-
cacy Outcomes. Clin Lymphoma Mye-
loma Leuk 2020; 21 (4): e334–47. DOI:
10.1016/j.clml.2020.12.010
11. Teachey D.T., Rheingold S.R., Maude S.L.,
Zugmaier G., Barrett D.M., Seif A.E., et al.
Cytokine release syndrome after blinatu-
momab treatment related to abnormal
macrophage activation and ameliorated
with cytokine-directed therapy. Blood.
2013; 121 (26): 5154–7. DOI: 10.1182/
blood-2013-02-485623
12. Lee D.W., Gardner R., Porter D.L.,
Louis C.U., Ahmed N., Jensen M., et al.
Current concepts in the diagnosis and
management of cytokine release syn-
drome. Blood 2014; 124 (2): 188–95.
13. Frey N.V., Levine B.L., Lacey S.F.,
Grupp S.A., Maude S..L, Schuster S.J., et
al. Refractory cytokine release syndrome
in recipients of chimeric antigen receptor
(CAR) T cells. Blood 2014.
14. Maude S.L., Frey N., Shaw P.A., Aplenc R.,
Barrett D.M., Bunin N.J., et al. Chimeric
antigen receptor T cells for sustained
remissions in leukemia. N Engl J Med
2014; 371 (16): 1507–17.
15. Neelapu S.S., Tummala S., Kebriaei P.,
Wierda W., Gutierrez C., Locke F.L., et
al. Chimeric antigen receptor T-cell the-
rapy – assessment and management of
toxicities. Nat Rev Clin Oncol 2018; 15 (1):
47–62. DOI: 10.1038/nrclinonc.2017.148
16. Vormittag P., Gunn R., Ghorashian S.,
Veraitch F.S. A guide to manufacturing
CAR T cell therapies. Curr Opin Biotech-
nol 2018; 53: 164–81. DOI: 10.1016/j.
copbio.2018.01.025. Epub 2018 Feb 18.
PMID: 29462761.
Литература
