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BIOPROSPECCIÓN Y CONSERVACIÓN DE CEPAS NATIVAS DEL NEMATODO
ENTOMOPATÓGENO Heterorhabditis EN PANAMÁ
1
Eric M. Candanedo Lay
2
, Gregorio Aranda Caballero
3
,
Alci Cabezón Puchicama
4
, Luisa Daniela Reina Peña
5
RESUMEN
El Laboratorio de Nematología (NEMALAB) inició en el 2014 un programa para la
bioprospección de nematodos entomopatógenos (NEP), principalmente en las áreas de
influencia del Centro de Investigación Agropecuaria Oriental (CIAOr) del IDIAP, en las
provincias de Colón, Darién y Panamá. Para los muestreos de suelos de las prospecciones
se dio prioridad a fincas o sitios en donde no se aplican plaguicidas. Al mismo tiempo, se
estableció un Programa de Producción y Crianza de larvas sanas de la polilla mayor de los
apiarios, Galleria mellonella, en una de tres dietas artificiales evaluadas con anticipación,
para multiplicación y mantenimiento in vivo de las cepas nativas de NEP que se hallaran.
También se estableció un Banco de Cepas Nativas de NEP para depositar y mantener las
cepas encontradas, para usos futuros en estudios taxonómicos para identificar las especies
de las cepas depositadas (por morfometría y biología molecular) y la realización de pruebas
de eficacia de las cepas en el control biológico de plagas insectiles. Se han aislado 16
cepas nativas de NEP (NEMALAB 1H a NEMALAB 16H) identificadas por taxonomía
convencional (morfometría) bajo microscopio compuesto de luz, dentro del género
Heterorhabditis (8 de Colón, 5 de Darién, 1 de Panamá, 1 de Coclé y 1 de Panamá Oeste),
en la rizosfera de 12 cultivos (ají dulce, cacao, café Robusta, cítricos, guineo Patriota,
jengibre, maíz, papaya, piña, plátano Cuerno Rosado, yuca y toronja). Cada cepa fue geo
etiquetada en coordenadas UTM y se registró la altitud del hallazgo en msnm, para
referencias futuras. Las cepas con su bacteria simbionte incorporada internamente,
Photorhabdus spp., se mantienen en el cepario en agua destilada. Para mantener las cepas
vivas, activas y patogénicas estas se refrescan mensualmente infectando larvas sanas de
G. mellonella y recuperando especímenes del tercer estadío juvenil infectivo (J3), que
emergen de los cadáveres de las larvas infectadas y muertas colocadas en “trampas de
White”.
Palabras claves: Muestreo de rizosfera, Galleria mellonella, dieta artificial, pruebas de
eficacia, banco de cepas.
1
Recepción:15 de enero de 2019. Aceptación: 30 de enero de 2020.
2
Instituto de Investigación Agropecuaria de Panamá (IDIAP). Centro de Investigación Agropecuaria Oriental
(CIAOr). Ph.D. en Nematología. e-mail: emcandanedo@gmail.com
3
IDIAP. Centro de Investigación Agropecuaria Oriental (CIAOr). Lic. en Biología. e-mail:
garandacaballero9@gmail.com.
4
IDIAP. Centro de Investigación Agropecuaria Oriental (CIAOr). Bachiller. e-mail: alsicabe4@gmail.com.
5
IDIAP. Centro de Investigación Agropecuaria Oriental (CIAOr). Lic. en Adm. Empr. Agrop. e-mail:
luisa16.lpa@gmail.com
BIOPROSPECTION AND CONSERVATION OF NATIVE CEPAS OF THE
ENTOMOAGRAPHIC NEMATOR Heterorhabditis IN PANAMA
ABSTRACT
In the year 2014 the Nematology Lab (NEMALAB) established a program for bioprospecting
entomopathogenic nematodes (EPN’s), mainly in the areas of influence of IDIAP’s Oriental
Agricultural Research Center, at Colon, Darien and Panama provinces. For prospection,
soil samples were collected primarily from farms or sites where pesticides are not applied.
At the same time, a Program for the Production and Rearing of healthy larvae of apiary’s
greater moth, Galleria mellonella, was established in one of three previously evaluated
artificial diets, for the multiplication and in vivo maintenance of the native EPN strains. A
Native Strains Bank was also established for depositing and maintaining found strains, for
future uses in taxonomic studies for species identification of deposited strains (by
morphometry and molecular biology) and the making of efficacy trials for biological control
of insect pests. To November 2018 16 EPN’s native strains have been isolated (NEMALAB
1H to NEMALAB 16H) identified by conventional taxonomy (morphometry) under a
compound microscope, within the genus Heterorhabditis (8 from Colon, 5 from Darien, 1
from Panama, 1 from Cocle and 1 from West Panama), in the rhizosphere of 12 crops
(sweet pepper, cocoa, Robusta coffee, citrus, Patriota guinea, ginger, corn, papaya,
pineapple, Cuerno Rosado plantain, yucca, and grapefruit). Each strain was geo-labeled
in UTM coordinates and its altitude was registered in masl, for future references. The strains
and their internally incorporated symbiont bacterium, Photorhabdus spp., were maintained
at the strains bank in distilled water. To maintain them alive, active and pathogenic they
were monthly refreshed by infecting healthy larvae of G. mellonella and recovering
specimens of their third infective juvenile stage (J3) as they emerge from the cadavers of
the infected and dead larvae, placed on top of “White traps”.
Key words: Sampling in rhizosphere, Galleria mellonella, artificial diets, efficacy trials,
strains bank.
INTRODUCCIÓN
Las plagas y enfermedades de los cultivos están entre las limitantes más serias de
la producción agrícola en Panamá. Su presencia es inevitable e induce a la aplicación de
plaguicidas químicos como principal herramienta de los productores para su manejo y
control. El uso indiscriminado de estos productos de la síntesis química, además de
incrementar el costo de producción, contamina los agroecosistemas y sus cuencas
hidrográficas y puede provocar la aparición de poblaciones de plagas cada vez más
resistentes, entre estas las plagas insectiles. Al disminuir la eficacia, el productor tiende a
incrementar las dosis de aplicación de estos agroquímicos, con el objetivo de proteger su
inversión, escapando o controlando el daño. Esto crea un círculo vicioso que, con
frecuencia, termina con la pérdida de rentabilidad de los cultivos y el abandono de la
actividad por los productores. Lo último tiene serias consecuencias no solo para el
productor si no para los trabajadores agrícolas y sus familias que quedan sin fuentes de
ingresos, para las empresas agropecuarias que ven disminuida su clientela y para la
sociedad en su conjunto. Consciente de esta problemática, el Instituto de Investigación
Agropecuaria de Panamá (IDIAP) lleva años privilegiando la investigación agropecuaria
orientada a la generación de tecnologías amigables a los agroecosistemas. Estas van
desde tácticas muy específicas como la resistencia genética, el control etológico y el control
biológico, entre otras, hasta estrategias muy amplias, con enfoque holístico, como el
Manejo Integrado de Plagas (MIP) y el Manejo Integral de Cultivos (MIC), que permiten
producir alimentos de manera amigable y sostenible en el tiempo. Las tácticas específicas
pueden luego integrarse a nuevas estrategias de MIC y MIP, luego de su validación y
prueba. Una de ellas es el control biológico y, dentro de este, el de plagas insectiles clave
con nematodos entomopatógenos. Estos nematodos son utilizados en muchos países por
la amplia gama de insectos que les sirven de hospederos, su alta eficacia biológica, su bajo
costo de producción (comparados con los agroquímicos) y de aplicación, así como por su
inocuidad para el ser humano y los animales domésticos. Portan una bacteria patógena
que es la que mata los insectos y con la que mantienen una simbiosis mutualista de la que
ambos se benefician: los nematodos entomopatógenos proveen a la bacteria simbionte el
transporte y la entrada al hemocele de los insectos, donde la liberan; la bacteria simbionte
se multiplica, mata al insecto por septicemia y los nematodos se alimentan de la bacteria y
de los detritus o detritos producidos por la descomposición de los cadáveres de los insectos
causada por la bacteria. Sin embargo, lo más conveniente es utilizar cepas nativas, mejor
adaptadas a las condiciones agroclimatológicas locales, que cepas importadas de otros
países que los comercializan a precios más altos que las producidas localmente. El IDIAP
evaluó preliminarmente estos nematodos en la década de 1990, en el marco del
PRECODEPA (Programa Regional Cooperativo de Papa) y desde el año 2014 se ha
retomado esta línea de investigación a través de un proyecto específico y a través de una
Tesis de Maestría de la Universidad Interamericana de Panamá, con la colaboración del
IDIAP (IDIAP, 2014; Morales, 2016).
El objetivo central de este trabajo era la búsqueda y mantenimiento de cepas
nativas de nematodos entomopatógenos, con énfasis en las áreas de influencia del Centro
de Investigación Agropecuaria Oriental (CIAOr) del Instituto de Investigación Agropecuaria
de Panamá (IDIAP), en las provincias de Panamá (Este), Colón y Darién para,
posteriormente, identificar las especies y evaluar su eficacia biológica sobre distintas
plagas insectiles.
MATERIALES Y MÉTODOS
Bioprospecciones
Entre 2014 y 2018 se realizaron más de 35 prospecciones de cepas nativas de
nematodos entomopatógenos (NEP), principalmente en las provincias de Panamá (Este),
Colón y Darién, áreas correspondientes al Centro de Investigación Agropecuaria Oriental
(CIAOR), incluyendo algunas en las provincias de Panamá Oeste y Coclé. Para las
bioprospecciones se seleccionaron, preferiblemente pero no exclusivamente, fincas en las
que no se aplican plaguicidas de la síntesis química. Entre los años 2014 y 2015 las
bioprospecciones consistían en la recolección de cadáveres de larvas de plagas insectiles
dispersas sobre la superficie del suelo y a profundidades entre 15 cm y 20 cm; entre 2015
y 2018, en la recolección de muestras compuestas de suelo de la rizosfera de distintos
cultivos a profundidades similares. Por separado, se recolectaron muestras compuestas de
suelo de la rizosfera de diversos cultivos y, con ayuda de un GPS, se registraba la ubicación
geográfica en coordenadas UTM y la altitud en metros sobre el nivel del mar (msnm) de
cada una, para poder reubicar, posteriormente, aquellas en las que se encontrara una cepa
nativa de nematodo entomopatógeno (NEP).
Captura de las cepas nativas de NEP con un insecto trampa
La bioprospección por el método de recolección de cadáveres se suspendió en el
2015 por ser muy poco eficaces y difíciles de implementar y se reemplazó por el muestreo
de suelos. En el Laboratorio de Nematología del CIAOR (NEMALAB), en Tanara, El
Naranjal, Chepo, las muestras de suelo eran homogenizadas y colocadas en tres u ocho
envases plásticos con tapa, según la cantidad de suelo recolectada y la disponibilidad de
larvas de la “polilla mayor de los apiarios”, Galleria mellonella, producidas en dieta artificial
en el laboratorio y utilizadas como “insecto trampa” para la captura de NEP. En cada
envase se colocaban unos 400 cm3 del suelo dejando un espacio libre, para el intercambio
de oxígeno y CO2, entre la superficie del suelo y la tapa del envase.
Figura 1. Captura de nematodos entomopatógenos (NEP) en muestras de suelo con
el insecto trampa, Galleria mellonella.
Sobre el suelo se depositaron de tres a seis larvas vivas y sanas de G. mellonella y
se colocó la tapa sobre la que, previamente, se habían hecho una serie de pequeños hoyos
con un alfiler caliente, para permitir la entrada y salida de gases. Las larvas de G. mellonella
entran en el suelo buscando oscuridad y, en las muestras positivas, los juveniles infectivos
J3 (juveniles dauer) del NEP las buscan y, al encontrarlas, penetran en su hemocele por
las aberturas naturales (boca, espiráculos y ano). El género de NEP Heterorhabditis,
adicionalmente, puede penetrar a través del tegumento intersegmental de las larvas
insectiles, con la ayuda de un diente dorsal que poseen en su región labial (Figura 1).
Extracción de las cepas nativas de NEP
Dos a cuatro días después de colocar las larvas de G. mellonella sobre el suelo, las
que son infectadas por los J3 del NEP experimentan un cambio en su coloración, reducen
su metabolismo y mueren por septicemia (infección generalizada) de 24 a 48 horas
después de la introducción de la bacteria patógena simbionte, Photorhabdus sp., en el caso
del género de NEP Heterorhabditis. Una o dos larvas son abiertas con un bisturí y
observadas bajo un estereoscopio, recolectando por separado hembras hermafroditas
(primera generación) y hembras anfimícticas y machos (segunda generación) que se
conservan en formalina al 5% para su posterior identificación convencional (morfometría)
a nivel de especies, utilizando claves de identificación (Figura 4). La identificación
convencional será confirmada por biología molecular. El resto de las larvas muertas se
enjuagan profusamente en agua destilada y se colocan en “trampas de White” construidas
con envases de boca ancha de 300 a 400 ml de capacidad y fondo plano sobre el que se
coloca un fondo de plato Petri pequeño (5 cm de diámetro) o un dispositivo similar, invertido
(Figura 2). La superficie plana expuesta del Petri invertido se cubre con papel filtro cuyos
bordes lleguen hasta el fondo del envase grande y se vierte agua destilada o del grifo, sin
rebasar la superficie del plato Petri. El papel filtro se humedece completamente por
capilaridad y sobre el Petri se colocan todas las larvas muertas de G. mellonella, a razón
de una trampa de White por cada envase con suelo (White, 1927). De seis a ocho días
después (9 a 12 días después de haber colocado las larvas sanas de la polilla sobre el
suelo), consumido completamente el cuerpo de la larva de G. mellonella, miles de
especímenes de una nueva generación de juveniles infectivos dauer (J3) abandona el
cadáver por carencia de alimento y, por gravedad, se precipitan al fondo del envase grande
(Figura 3), donde son recolectados (en la naturaleza, pasan al suelo en busca de nuevos
hospederos). A cada nueva cepa nativa se le asigna un código de identificación provisional
y se deposita en el cepario o Banco de Cepas Nativas.
Conservación e incremento de las cepas nativas almacenadas
Los juveniles infectivos J3 de las nuevas cepas, portando la bacteria simbionte
fresca, adquirida en el cadáver insectil abandonado, no se alimentan y se mantienen en el
cepario o Banco de Cepas Nativas, en agua destilada. Estos juveniles dauer pueden
mantenerse vivos durante semanas, sin alimentarse, pues poseen un metabolismo muy
reducido. Mensualmente, se realizan reinfecciones de las cepas nativas almacenadas en
platos Petri con el fondo cubierto con papel de filtro, sobre el que se colocan larvas sanas
de G. mellonella que reciben un inóculo de la cepa que se desea refrescar. De este modo
se conservan e incrementan las poblaciones de las cepas nativas encontradas para,
posteriormente, identificar las especies por taxonomía convencional y biología molecular.
También para la realización de pruebas de eficacia biológica sobre distintas plagas
insectiles claves en diversos cultivos de importancia económica en Panamá.
Figura 2. Larvas de
Galleria mellonella en
trampas de White.
Figura 3. Juveniles
infectivos dauer.
Figura 4. Hembras
hermafroditas, hembras
anfimícticas y machos en el
hemocele de un NEP.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El método de bioprospección por recolección de cadáveres de plagas insectiles era
poco eficiente y muy laborioso para implementar. Con frecuencia no se encontraban
cadáveres de las larvas insectiles o, cuando se encontraban, podían no contener juveniles
infectivos de NEP, ya que los insectos habían muerto por otras causas o porque ya los
NEP habían abandonado el cadáver insectil, totalmente descompuesto, y estaban en el
suelo. No fue posible hallar cepas nativas de NEP con este método tras un año de estarlo
implementando.
Las bioprospecciones por recolección de muestras compuestas de suelos en la
rizosfera de los cultivos dieron resultados positivos desde el inicio de su implementación.
Luego de múltiples bioprospecciones, principalmente en las áreas de influencia del Centro
de Investigación Agropecuaria Oriental (CIAOr), se hallaron 16 cepas nativas de
nematodos entomopatógenos, todas identificadas dentro del género Heterorhabditis
(Cuadro 1). La identificación de las especies de cada cepa está en progreso. Las mismas
están el cepario del Laboratorio de Nematología (NEMALAB) del CIAOr donde se
mantienen en suspensión en agua destilada y se conservan vivas mediante reinfecciones
mensuales en larvas de la polilla mayor de los apiarios, Galleria mellonella. La
conservación in vivo en larvas de la polilla también permite que la bacteria simbionte se
mantenga viva y patogénica.
Las cepas se denominaron provisionalmente, a medida que eran halladas, NEMALAB 1
hasta NEMALAB 16 (Cuadro 1). Se incluye información adicional como la rizosfera de los
cultivos en que fueron encontradas, las coordenadas UTM de cada una (para referencia
futura o recuperación), la altitud en metros sobre el nivel del mar (msnm), las comunidades
y provincias de los hallazgos y los productores en cuyas fincas se realizaron las
bioprospecciones de los hallazgos. La identificación del género en que se ubican las cepas
nativas encontradas se realizó por taxonomía convencional (morfometría), utilizando
distintas claves de identificación como Nguyen and Smart, 1995; Nguyen, 2007; Nguyen
and Hunt, 2007; Malan et al., 2011; Hunt and Nguyen, 2016.
Cuadro 1. Cepas nativas del nematodo entomopatógeno Heterorhabditis spp.
halladas en múltiples bioprospecciones. Años? (2014 – 2018).
Cacao
164 Quebrada Ancha Colón
Cacao
135 Lago Alajuela Colón
Café Robusta
161 Lago Alajuela Colón
Cítricos
100 Lago Alajuela Colón
Guineo Patriota
161 Lago Alajuela Colón
Cacao
21 Cabras Panamá
Maíz
34 Boca Toma, Natá Coclé
Piña
133 Las Zanguengas Pmá. Oeste
Papaya
61 Sansoncito Darién
Piña
63 Sansioncito Darién
Plátano Cuerno Rosado
58 Sansioncito Darién
Yuca
45 Sansioncito Darién
Jengibre
129
Q Ancha, Salamanca
Colón
Toronja
134
Q Ancha, Salamanca
Colón
Ají Dulce
69 Sansoncito Darién
Café Robusta
84 Buena Vista Colón
18 P 0179619, 0933377
Abenicio Vásquez
NEMALAB 7H
NEMALAB 8H
Onesio Martínez
NEMALAB 9H
18P 0179660, 0933384
Abenicio Vásquez
NEMALAB 10H
18 P 0179656, 0933383
Abenicio Vásquez
NEMALAB 11H
18 P 0179635, 0933384
Abenicio Vásquez
NEMALAB 12H
Código de entrada en el
CEPARIO
Abilio Ramos
Cabo Zarso, lote 3, parcela 31
Cultivo
Coordenadas UTM
Comunidad
Provincia
Productor
17 P 0684039, 1007241
17 P 0554058, 0932965
17 P 0622633, 0992501
Esperanza Mesa
Manuel Ureña
NEMALAB 5H
NEMALAB 6H
Altitud
(msnm)
Manuel Ureña
Manuel Ureña
Manuel Ureña
17 P 0648419, 1026745
17 P 0656210, 1031239
17 P 0656200, 1031207
17 P 0656116, 1031118
17 P 0656200, 1031207
NEMALAB 1H
NEMALAB 2H
NEMALAB 3H
NEMALAB 4H
NEMALAB 13H
17 P 0648318, 1026662
Esperanza Meza
NEMALAB 14H
17 P 0648320, 1026664
Esperanza Meza
NEMALAB 15H
18 P 0181455, 0932142
Nicolás Bravo
NEMALAB 16H
17 P 0642846, 1026750
Finca del IDIAP
La cabeza, vulva y cola de una hembra hermafrodita se observa en la Figura 5,
mientras que en la Figura 6, el macho (cabeza y cola); el juvenil infectivo dauer (J3) en la
Figura 7. Son microfotografías de la cepa nativa NEMALAB 1H (la primera cepa hallada),
encontrada en la rizosfera de un cultivo de cacao (Theobroma cacao), creciendo a 164
msnm, en la finca del señor Esperanza Meza, en Quebrada Ancha, distrito de Salamanca,
provincia Colón.
Figura 5. Cabeza (A), vulva (B) y cola de hembra hermafrodita de Heterorhabditis spp. (C)
Figura 6. Cabeza (A) y cola con espícula y costillas de la bursa (B), macho,
Heterorhabditis sp. (40X).
Figura 7. Cabeza con diente dorsal (A), campo lateral (B) y cola de juvenil infectivo
dauer (C) de Heterorhabditis sp. (100X).
CONCLUSIONES
El método de bioprospección de cepas nativas de nematodos entomopatógenos por
muestreo de suelos de la rizosfera de diversos cultivos (años 2015 - 2018) fue más
eficaz para la captura de juveniles infectivos J3 (juveniles dauer) que el de la recolección
de cadáveres de larvas insectiles utilizado inicialmente (año 2014 - 2015).
A
B
A
B
C
A
B
C
En las áreas muestreadas del CIAOR existen condiciones agroclimatológicas que
favorecen la predominancia del género Heterorhabditis sobre el género Steinernema,
del cual no se hallaron cepas nativas en más de treinta biopropecciones realizadas que
incluyeron las provincias de Panamá (Este), Colón y Darién.
Queda pendiente la identificación de especies de las cepas nativas halladas por
taxonomía convencional y por biología molecular (ADN), así como las pruebas de su
eficacia en laboratorio y campo sobre plagas insectiles de distintos cultivos.
BIBLIOGRAFÍA
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