Protocolo para el control de enfermedades infecciosas en Anfibios durante estudios de campo

Abstract

Protocolo para el control de la diseminación de patógenos que han sido asociados a la pérdida de anfibios a nivel global. El objetivo del manual, es proteger a los anfibios de enfermedades que puedan ser transmitidas involuntariamente por los seres humanos.

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Protocolo para el control de enfermedades infecciosas en
Anfibios durante estudios de campo.
Gabriel A. Lobos, Marcela Vidal, M. Antonieta Labra, Claudio Correa, Felipe Rabanal, H. Díaz-Páez,
Alejandra Alzamora y Claudio Soto
Introducción
La declinación de anfibios a nivel global, constituye un proceso complejo de dimensionar y evaluar,
en especial en países como Chile, donde se presenta un escenario con escasa información de
inventarios y conocimiento de las poblaciones a nivel local. En este sentido, la Red Chilena de
Herpetología RECH, se ha propuesto como misión elaborar un primer protocolo para el control de
la diseminación de patógenos que han sido asociados a la pérdida de anfibios a nivel global. El
objetivo del manual, es proteger a los anfibios de enfermedades que puedan ser transmitidas
involuntariamente por los seres humanos.
Chile presenta una batracofauna compuesta solo por anuros (ranas y sapos), estando
ausente los demás ordenes vivientes. De acuerdo a Frost et al. (2006) y Frost (2011), se reconocen
para Chile las familias Bufonidae (Rhinella, Nannophryne), Calyptocephalellidae (Telmatobufo,
Calyptocephalella), Ceratophryidae (Telmatobius, Atelognathus, Batrachyla), Leiuperidae
(Pleurodema) y Cycloramphidae (Hylorina, Alsodes, Eupsophus, Rhinoderma, Insuetophrynus).
Además se debe considerar la presencia de la rana africana de garras de la familia Pipidae
(Xenopus laevis). Respecto al número de especies descritas en Chile, las últimas revisiones señalan
56 especies (Ortiz y Díaz-Páez 2006, Veloso 2006), 57 especies (IUCN 2011) y 59 especies (Vidal et
al 2008).
En términos de biodiversidad, dos aspectos son relevantes para la batracofauna nacional.
Por una parte, destaca su alto grado de endemismo, con aproximadamente un 58% de las especies
en esta categoría y con la presencia de numerosos microendemismos (Alsodes tumultuosus de La
Parva, Eupsophus migueli de Mehuín, Telmatobius dankoi de Las Cascadas, cerca de Calama, solo
por mencionar algunos ejemplos de especies que no se encuentran en áreas protegidas) (Díaz-
Páez et al 2008, Ortiz y Heatwole 2010). Un segundo aspecto interesante corresponde a la
presencia de géneros monotípicos (Calyptocephalella, Hylorina, Insuetophrynus), lo que es propio
de linajes antiguos con baja diversificación.
En la actualidad, existe una creciente preocupación a nivel global por la declinación o
desaparición de numerosas poblaciones de anfibios (Alford & Richards 1999, Stuart et al. 2008,
Collins 2010, Blaustein et al. 2011). Diversas hipótesis han sido señaladas en este sentido, como el
cambio climático (Pounds 2001, Carey & Alexander 2003), la perdida de hábitat (Petranka et al.
1993), aumento de la radiación ultravioleta (Anzalone et al. 1998, Lizana & Pedraza 1998),
enfermedades (Johnson et al. 1999, Kiesecker et al. 2001, Mazzoni et al. 2003, Weldon et al.

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2004), contaminación (Lips 1998, Davidson et al. 2001) e introducción de especies (Gamradt y Kats
1996, Hecnar & M`Closkey 1997, Lawler et al. 1999, Kats y Ferrer 2003). Por estas razones, hoy los
anfibios juegan un rol importe como especies centinelas de procesos globales que sin duda
también pueden afectar a los seres humanos.
En este contexto, enfermedades emergentes como las producidas por el hongo chytrido,
Batrachochytrium dendrobatidis, y virus del género Ranavirus, han sido asociados con fenómenos
de declinación de poblaciones de anfibios en distintas partes del mundo. Por otro lado, se ha
podido comprobar que diversos trematodos (más de 40 especies de más de 30 géneros y dos
familias) parasitan a los anfibios y utilizan sus larvas como hospedadores intermediarios,
generando malformaciones importantes en ellos (Speare 2001). Además, algunos géneros de
nemátodos como Rhabdias, normalmente presentes en los pulmones de diversos anfibios, pueden
resultar letales cuando estos alcanzan una alta densidad en sus hospedadores (Bosch 2003). En
Chile, Bourke et al. (2010) y Solís et al. (2010) constituyen los primeros reportes de la presencia de
B. dendrobatidis en poblaciones naturales, por lo que, se hace perentoria la necesidad de reducir
la diseminación de patógenos producto de la manipulación de estos organismos. De hecho, la
manipulación de anfibios puede facilitar la diseminación de patógenos hacia nuevos ambientes,
como puede ocurrir durante procedimientos de rescates y relocalizaciones, captura de individuos
para investigación, manipulación de anuros en laboratorios (Xenopus laevis) o comercio de
anfibios (por ejemplo el caso de Calyptocephalella gayi). Esto implica que se requiere con urgencia
establecer un manual básico para la manipulación de anfibios en el campo, el que se entrega a
continuación. Este protocolo sigue los criterios sugeridos por Speare (2001). Es importante
considerar que la captura y manipulación de anfibios, se encuentra regulada en el país, por lo que
para este tipo de actividad se requiere de un permiso que es otorgado por el Servicio Agrícola y
Ganadero de Chile.
Por otra parte, hacemos ver que en el actual contexto de enfermedades emergentes, la
translocación de anfibios (e.g., rescates y relocalización, capturas científicas, comercio e
intercambio de anfibios), representa un serio peligro, sobre todo para especies de anfibios
vulnerables, debido a la potencial diseminación de patógenos. Por esta razón, los procedimientos
de captura, manipulación y desinfección de materiales deberían ajustarse a un protocolo estricto,
que propenda a disminuir este riesgo. Finalmente, cabe señalar que el presente protocolo esta
pensado para proyectos de investigación, comercio de anfibios, desarrollo de Líneas Bases y otros
estudios que requieren de un contacto más estrecho con anuros o sus sitios de reproducción. En el
caso de los naturalistas, las medidas preventivas que puedan desprenderse del presente protocolo
son necesarias para disminuir el riesgo de transmisión de patógenos. Del mismo modo, medidas
simples como portar guantes y bolsas desechables para la potencial manipulación de anfibios, son
altamente recomendables.

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Protocolo
Dos aspectos son fundamentales, en primer lugar, la planificación de estos protocolos antes de ir
al campo, y en segundo lugar, la concientización que debemos tener acerca de nuestra
responsabilidad en la manipulación de anfibios. Frente al desconocimiento del estado sanitario de
la mayoría de las poblaciones de anfibios del país, es que resulta aconsejable la adopción de
principios precautorios, a la espera de mayor evidencia científica sobre la presencia de
enfermedades y sus impactos en poblaciones de anuros silvestres.
1- Disminución del riesgo entre sitios
Es importante poder disminuir el riesgo de transmisión de patógenos entre sitios. Debido a las
dificultades prácticas de diferenciar los sitios, es que se recomienda como principio precautorio
considerar a cada cuerpo de agua (e.g., lago, laguna, charca) como un sitio independiente,
debiendo evitarse la transferencia de material entre los sitios. En el caso de cursos de aguas (e.g.,
ríos, arroyos, esteros), normalmente se trabaja con estaciones de muestreos (el número
dependerá de la magnitud del estudio), por lo que también siguiendo un criterio precautorio, se
recomienda considerar a cada estación de muestreo como un sitio independiente. En el caso de
ambientes terrestres (e.g. bosques, praderas, vegas), donde se observa una mayor homogeneidad
ambiental, se sugiere considerar sesiones de trabajo de acuerdo a esfuerzos de muestreos (un día,
mediodía; de acuerdo a la magnitud del trabajo).
Calzado y vestimenta
- Para las personas que realizan investigación en anfibios, es altamente recomendable
trabajar con botas de goma o trajes de agua, debido a la facilidad de su limpieza y
desinfección. El calzado debe ser limpiado y desinfectado (ver más adelante) antes de ir a
un terreno, con lo que se disminuye de forma importante el riesgo de diseminación de
patógenos. Una vez en terreno, el calzado debe ser desinfectado, antes de visitar un
nuevo sitio o comenzar una nueva sesión de trabajo.
- Se debe remover todo el barro y restos vegetales del calzado, ya sea con abundante agua
del lugar visitado o con agua potable previamente embotellada. Este paso resulta
fundamental, ya que la materia orgánica interactúa con los desinfectantes, inactivándolos
o reduciendo su eficacia. Por otro lado, la presencia de barro permite la existencia de
microambientes donde el patógeno puede sobrevivir debido a que el desinfectante no
puede penetrar. Posteriormente el calzado debe ser sumergido en una solución
desinfectante de virkon 1% (10 g/l, DuPont Animal Health Solutions) por un minuto. Como
alternativa se puede repetir el mismo procedimiento con una solución de cloro
(hipoclorito de sodio) al 4%, sin embargo su acción es significativamente menor al virkon
(e.g. cloro destruye Ranavirus después de 15 min). Otra ventaja del virkon, es que es un
producto biodegradable (no así el cloro), situación que facilita su manejo y disposición en

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terreno. Otros desinfectantes y con su eficacia aparecen en Tabla 1. En el caso de trabajos
con especies seriamente amenazadas, se recomienda cambio de calzado entre sitios.
- Si bien no se hace necesaria la desinfección de toda la vestimenta usada, si es
recomendable desinfectar la parte baja de pantalones (o polainas), cuando no se utilizan
botas de goma o trajes de agua. Para esto se debe seguir el mismo método usado para el
calzado.
- En el caso de estudios más invasivos (toma de muestras de órganos, necropsias) puede ser
adecuado el uso de trajes de papel desechables (trajes para pintar), los que deben ser
eliminados una vez terminada la jornada de trabajo en un sitio, o bien en caso de
trasladarse a otro sitio.
Tabla 1. Estrategias adecuadas para la eliminación de Batrachochytrium dendrobatidis y Ranavirus
en estudios de campo. Las concentraciones y tiempos de acción, son los valores mínimos efectivos.
Obtenidos de Speare et al. (2004).
Propósito
Desinfectante
Concentración
Tiempo
Patógeno
que
combate
Desinfectar
equipamiento
quirúrgico y otros
instrumentos (e.g.,
balanza)
Etanol
70%
1 min
B. dendrobatidis
Ranavirus
Vircon
1 mg/ml
1 min
B. dendrobatidis
Ranavirus
Cloruro de Benzalc
onio
1 mg/ml
1 min
B. dendrobatidis
Desinfectar
equipamiento de
transporte y
contenedores
Hipoclorito de Sodio
(blanqueador)
1%
1 min
B. dendrobatidis
Hipoclorito de Sodio
(blanqueador)
4
%
1
5
min
Ranavir
us
Cloruro de
d
idecil
-
dimetil amonio
1 en 1000 ml
30 seg
B. dendrobatidis
Secado completo
3 horas o
mas
B. dendrobatidis
Calor
60
°C
5 min
15 min
B. dendrobatidis
Ranavirus
Esterilización
con luz UV
1 min
B. dendrobatidis
Desinfectar
calzado
Hipoclorito de Sodio
(Blanqueador)
1%
1 min
B. dendrobatidis
Hipoclorito de Sodio
(Blanqueador)
4
%
1
5
min
Ranavirus
Cloruro de
d
idecil
-
dimetil amonio
1 en 1000 ml
1 min
B. dendrobatidis
Secado completo
3 horas o
mas
B. dendrobatidis
Desinfectar ropa
(e.g., bolsas, ropa)
Lavado caliente
60 °C o mas
5 min
15 min
B. dendrobatidis
Ranavirus

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Materiales desechables:
- Resulta necesario el uso de guantes de nitrilo (guates azules) desechables, para evitar
dañar la delicada piel de los anfibios.
- Cuando se requiera muestrear, medir o pesar individuos, se recomienda el uso de bolsas
plásticas herméticas (e.g. ziploc) en las que se pueden mantener de forma cada individuo.
Las bolsas puede ser nuevas, o si reutilizadas, deben estar previamente desinfectadas,
enjuagadas con agua y secas. Larvas o guarisapos del mismo sitio (poza, charco), pueden
ser manejados en un recipiente plástico, previamente desinfectado, enjuagado y seco.
- Una vez manipulados los individuos, tanto adultos como larvas deben ser liberados en el
lugar exacto de la captura. Para este motivo, se pueden marcar durante la captura los
sitios con perros plásticos (y cintas reflectantes en el caso de capturas nocturnas).
- Una vez finalizada la manipulación de los individuos, todo el material utilizado (guantes,
bolsas plásticas, recipientes, perros, cintas, etc.), deben ser dispuestos en una bolsa
plástica limpia (bolsa de basura), para su posterior desinfección o destrucción en
incineradores.
- Al finalizar el trabajo, se deben desinfectar todo el material desechable utilizado (guantes,
blosas plásticas), sumergiendo este en una solución de virkon al 1%. utilizados, con una
botella aspersora (con una solución de alcohol al 70% o cloro al 0,4%). Los manipuladores
de anfibios pueden rociarse el traje de papel antes de sacárselo (con los guantes puestos)
y finalmente eliminar los guantes y el traje.
Equipos y otros materiales
Los equipos y materiales de trabajo (e.g., redes, chinguillos, pesolas, balanzas), deben ser
desinfectados antes de llevarlos al campo. Para material pequeño como balanzas, pie de metro y
otros, se recomienda el uso de etanol al 70% o cualquier desinfectante de la tabla 1. En el caso de
redes, debido a su mayor tamaño, se recomienda rociar una solución desinfectante como virkon
1%, con el uso de un aspersor adecuado.
Vehículos
Las ruedas y neumáticos de los vehículos podrían facilitar la diseminación de patógenos. Por ello,
es necesario que al finalizar el trabajo en un sitio, ellos sean lavados y desinfectados con alguno de
los desinfectantes que aparecen en la Tabla 1 (por ejemplo, virkon 1%). Se debe tener cuidado con
aplicar estas sustancias a una distancia prudente para no contaminar cuerpos o cursos de aguas.
Del mismo modo, la desinfección del calzado es importante para no contaminar indirectamente
los neumáticos de los vehículos (es común sacudirse el barro del calzado en los neumáticos y otras
estructuras de los vehículos).
Manipulación de animales
Los animales solo deben ser manipulados en casos justificados. Muchas veces, como suele suceder
en estudios de impacto ambiental, solo se requiere el reconocimiento y conteo de animales, sin

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ser necesaria su manipulación. Sin embargo, en caso de ser necesaria la manipulación, siempre es
importante considerar el riesgo de transmisión de patógenos a los animales. Para ello se
recomienda:
- Desinfectar las manos antes de la manipulación. Usar guantes de látex para el manejo de
animales (sin talco). Una forma práctica y segura es usar doble guante. Los guantes deben
ser dispuestos en una bolsa plástica limpia para su eliminación (bolsa sucia). La finalización
del trabajo debe ser el cierre de la bolsa sucia (manipulada con guantes), a la que se
comprime y saca el aire, se arrojan los guantes de los manipuladores y la última persona
en sacarse sus guantes (revirtiéndolos) sella la bolsa con cinta adhesiva plástica. Al
finalizar, todos se deben desinfectar las manos (por ejemplo, con alcohol gel de uso
comercial). El procedimiento se debe ejecutar en cada sitio.
- En el caso de disponer a los anfibios en bolsas de recolecta, ellas deben ser de usos
individuales y eliminadas luego de su utilización. El marcaje de animales con dispositivos
subcutáneos como microchips, corte de dedos y toma de muestra de tejidos, es de alto
riesgo para la transmisión de enfermedades (Speare 2001). De ser necesario, se debe
promover el uso de elementos desechables, desinfección de equipos. En el caso de heridas
se debería contar con sustancias sellantes de uso veterinario, las que disminuyen el riesgo
de infección.
- Es importante recalcar que las sustancias desinfectantes no deben estar en contacto con
los cursos o cuerpos de aguas, ni tampoco con la piel de los animales.
2- Disminución del riesgo dentro del sitio
Al igual que como se señaló para el manejo entre sitios, es necesario considerar medidas
tendientes a disminuir el riesgo de transmisión dentro del sitio, a objeto de que los investigadores
no eleven el nivel natural de infección que pueda existir en una población. Muchas de las medidas
señaladas entre sitios, deberían ser consideradas para este punto. Adicionalmente se debería
considerar:
- Uso de guantes sin talco (nitrilo) y bolsas pláticas individuales por cada anfibio.
- Todo el equipo debe ser desinfectado en terreno.
- De ser necesaria la captura y transporte de anfibios, ello se debe realizar en contenedores
individuales.
- Los contenedores pueden ser reutilizados previa desinfección con, virkon, alcohol, cloro, u
otro desinfectante adecuado.
- Implementos como reglas y pesolas deben estar libres de secreciones y se deben
esterilizar con alcohol al 70% o hipoclorito de sodio al 0.4%, las superficies de los
implementos deben estar en contacto al menos 30 segundos con las sustancias
desinfectantes.
- En caso de pesar los anfibios en bolsas, ellas deben ser individuales y desechadas. Este
procedimiento evita el contacto de los animales con los instrumentos. Eventualmente la

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toma de medidas morfométricas simples como el largo hocico cloaca pueden ser
obtenidos con el animal en la bolsa.
- En el caso de detectar anfibios enfermos, ellos pueden ser colectados con guantes o una
bolsa plástica y puestos en un recipiente para su traslado a un laboratorio ya sea para su
diagnóstico o eliminación. Estos animales no pueden ser reintroducidos.
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