Konverziós ráta értékek meghatározása a Kluyveromyces marxianus CBS712 gomba törzs etanol termelésének jellemzéséhez

Abstract

Agrártudományi Közlemények (2010) 42, 23-27
A Kluyveromyces marxianus CBS712 törzs jellemzésének keretében különböző paraméterek mellett vizsgáltuk az etanol termelést. Az etanol termelés hatékonyságának meghatározására konverziós rátákat állapítottunk meg. Ezen érték meghatározásához elengedhetetlen a maradék glükóz mennyiségének a vizsgálata, amely megállapítására két különböző módszert választottunk: a vékonyréteg kromatográfiát (VRK) és a glükóz-oxidáz enzimet fölhasználó módszert. Kísérleteink során a VRK módszer bizonyult a megfelelőbbnek, így ezen adatokat, illetve az etanol termelési értékeket fölhasználva konverziós ráta értékeket határoztunk meg. A legmagasabb konverziós ráta 55,3%: 45 °C-on 5,6% (v/v) etanolt termelve, amely értékek összevethetők az iparban alkalmazott IMB törzsekével.

Full text

A
GRÁRTUDOMÁNYI
K
ÖZLEMÉNYEK
,
2010/42.
23
Konverziós ráta értékek meghatározása a
Kluyveromyces marxianus CBS712 gomba
törzs etanol termelésének jellemzéséhez
Erdei Éva
1, 4
– Pócsi István
1
– Molnár Mónika
2
–
Gyémánt Gyöngyi
3
– Nagy János
4
Debreceni Egyetem
Természettudományi és Technológiai Kar,
1
Mikrobiális Biotechnológiai és Sejtbiológiai Tanszék
3
Szervetlen és Analitikai Kémiai Tanszék, Debrecen
2
Nyíregyházi Főiskola, Agrár és Molekuláris Kutató Intézet,
Nyíregyháza
4
Debreceni Egyetem
Agrár- és Gazdálkodástudományok Centruma,
Mezőgazdaság-, Élelmiszertudományi és Környezetgazdálkodási
Kar, Földhasznosítási, Műszaki és Területfejlesztési Intézet,
Debrecen
erdeie@yahoo.com
ÖSSZEFOGLALÁS
A Kluyveromyces marxianus CBS712 törzs jellemzésének
keretében különböző paraméterek mellett vizsgáltuk az etanol
termelést. Az etanol termelés hatékonyságának meghatározására
konverziós rátákat állapítottunk meg. Ezen érték
meghatározásához elengedhetetlen a maradék glükóz
mennyiségének a vizsgálata, amely megállapítására két különböző
módszert választottunk: a vékonyréteg kromatográfiát (VRK) és a
glükóz-oxidáz enzimet fölhasználó módszert. Kísérleteink során a
VRK módszer bizonyult a megfelelőbbnek, így ezen adatokat,
illetve az etanol termelési értékeket fölhasználva konverziós ráta
értékeket határoztunk meg. A legmagasabb konverziós ráta 55,3%:
45 °C-on 5,6% (v/v) etanolt termelve, amely értékek összevethetők
az iparban alkalmazott IMB törzsekével.
Kulcsszavak: Kluyveromyces marxianus, etanol, glükóz
SUMMARY
The ethanol production of the Kluyveromyces marxianus
CBS712 strain was investigated among different kind of condition.
We defined the conversion rate in order to know the efficiency of
the ethanol production. To determine this value, it is crucial to
characterize the residual glucose concentracio. We chose two
method to determine the amount of residual glucose. The first
method is the thin layer chromatography (TLC) and the second
method is the method of the glucose-oxidase enzyme. We found
that the TLC method is reliable than the other method. The
conversion rates were determined from these values and the
ethanol values. The maximal ethanol production of the
characterized Kluyveromyces marxianus CBS712 strain (5.6%
(v/v) ethanol at 45 °C, 55.3% conversion rate) is comparable to
those strains which are applied in industrial ethanol production
nowadays.
Keywords: Kluyveromyces marxianus, ethanol, glucose
BEVEZETÉS
A fosszilis energiaforrások kimerülőben vannak,
így életünkben egyre nagyobb szerepet kapnak a
megújuló energiaforrások.
Az egyik lehetséges ilyen energiaforrás a bioetanol.
Számos országban gazdaságilag számottevő szerepet
tölt be a bioetanol termelés, például Brazíliában, az
Amerikai Egyesült Államokban és Indiában is. A
trópusi területeken meghatározó bioetanol előállítási
technológia az SSF (simultaneous saccharification
and fermentation), melynek általános előnye, hogy az
enzimes kezelés és a fermentációs lépés
egybevonásával jelentős energia takarítható meg.
Ezen technológia alkalmazása során kedvező, ha
minél magasabb hőmérsékleten folyik a termelés
(Singh et al., 1998b), amit nagy hőtűrő képességű
élesztők felhasználásával lehet elérni. A
termotoleráns élesztők közül kiemelkedő a
Kluyveromyces marxianus hőtűrése, melynek IMB3
törzsét az iparban már használják
45 ºC-on (Singh et al., 1998a).
Kísérleteink során mi is arra törekszünk, hogy –
az SSF technológiához alkalmazkodva – az általunk
használt Kluyveromyces marxianus CBS712 törzs a
lehető legmagasabb hőmérsékleten a lehető
leggazdaságosabban termeljen etanolt. Az etanol
termelés gazdaságosságának a mutatója a konverziós
ráta, melynek értékét a fermentáció végén
megmaradó kiindulási anyag (a mi esetünkben a
glükóz) mennyiségéből és a termelt etanolból
állapíthatjuk meg. Kritikus pont tehát, hogy ezen
értékeket a lehető legpontosabb módszerekkel
határozzuk meg.
Az etanol mérése gázkromatográffal történik, amely
egy olyan analitikai módszer, amellyel ezred százalék
pontossággal meg lehet határozni az anyagok
mennyiségét.

A
GRÁRTUDOMÁNYI
K
ÖZLEMÉNYEK
,
2010/42.
24
A maradék glükóz mennyiségének a meghatározására
két módszert választottunk: a vékonyréteg
kromatográfiát (VRK) és a glükóz-oxidáz enzimet
fölhasználó módszert. A VRK esetében a minta egy
adott lemezen (HPTCL-szilika gél) és egy
meghatározott közegben fut, majd az előhívás után a
lemezen látható a mintában lévő glükóz mennyisége
egy fekete pontként, mely pont színének
intenzitásából meghatározható a mennyisége. Az
enzimes módszer esetében a glükóz-oxidáz (GOD) a
glükózt glükonsavvá alakítja.
A reakcióban keletkező hidrogén-peroxidot (H
2
O
2
) a
peroxidáz (POD) bontja és a Trinder-féle indikátor
reakcióban 500 nm-en jól mérhető színes
kondenzációs termék keletkezik. Az
abszorbancianövekedés arányos a minta glükóz
koncentrációjával. Ezen módszerek felhasználásával
a konverziós ráta értékek meghatározása a lehető
legpontosabb lesz.
Jelen dolgozat a vékonyréteg kromatográfiás
módszert (VRK) hasonlítja össze a glükóz-oxidáz
enzimet fölhasználó módszerrel a maradék glükóz
mennyiségének a meghatározására. Ezen értékek,
illetve a korábban meghatározott etanol termelési
adatok fölhasználásával konverziós ráta értékeket
számoltam, mely érték az etanol termelés
hatékonyságának a mutatója.
ANYAG ÉS MÓDSZER
Az etanol termelés vizsgálata
Az etanol termeltetést MYFM tápoldatban (3 g/l
élesztő kivonat (BBL
TM
), 2 g/l pepton (Difco), 2 g/l
KH
2
PO
4
, 2 g/l (NH
4
)
2
SO
4
, 1 g/l MgSO
4
* 7H
2
O, 1 g/l
MgSO
4
* H
2
O,) végeztük, amely tápoldatot
kiegészítettük az adott kísérletnek megfelelő
mennyiségű glükózzal (Hack és Marchant, 1998). Az
előtenyészethez 1 telepet MYFM tápoldatban
inokuláltunk (100 ml-es lombik 50 ml tápoldat és
10g/l glükózt tartalmazott). Az inkubálás
körülményei: 45 ºC, 24 óra, 200 rpm. A 250 ml-es
lombikban rázatott 100 ml tápoldatot, amelyet a
megfelelő mennyiségű glükózzal kiegészítettünk,
3 ml előtenyészettel inokuláltuk. Az etanol
koncentráció meghatározása 12, 16, 20, illetve
24 órás tenyészetekből történt. A törzs etanol
termelését 45 ºC, 46 ºC, 47 ºC és 48 ºC-on
vizsgáltuk.
Az etanol mérése gázkromatográffal történt
HP-5-ös oszlopon, 1% izopropanolt használva belső
standardként.
A glükóz mérése vékonyréteg kromatográfia
segítségével
Az 5 µl minta (fermentlé) HPTCL szilika gél 60
(20×20 cm) lemezen az alábbi közegben lett
megfuttatva: 30 ml diklórmetán, 25 ml metanol, 6 ml
víz. Az előhívás 10%-os kénsavas abszolút etanolban
történt.
Száradás után hőlégsterilizátorban 120 °C-on
5 percig volt a lemez. Fényképezés után a kiértékelés
dr. Lázár István által kifejlesztett CPAtlas 1.0
program segítségével történt.
A glükóz mérése glükóz-oxidáz enzim segítségével
A reagens összetevői (11 mM fenol, 0.76 mM
4-aminoantipirin, 4kU/l glükóz oxidáz és 1kU/l
peroxidáz) 0.1 M pH 6.6 foszfát pufferben vannak
feloldva. A reakcióközeg 10 µl mintát (fermentlé) és
1 ml reagenst tartalmaz; ezen reakció 1 perc alatt
játszódik le, amelynek eredménye 500 nm-en
detektálható. Az adatok kiértékelése a kalibrációs
görbéhez viszonyítva történik (Leary et al., 1992).
EREDMÉNYEK
A Kluyveromyces marxianus CBS712 törzs etanol
termelésének vizsgálata során a célunk az, hogy
megtaláljuk azokat a termelési paramétereket,
amelyeket alkalmazva a lehető legmagasabb
hőmérsékleten a lehető leggazdaságosabban tudjunk
etanolt termeltetni. Előkísérleteinkben megvizsgáltuk
a Kluyveromyces marxianus CBS712 törzs
növekedését, ahol azt tapasztaltuk, hogy a törzs
45 ºC-on való növekedése nem tér el drasztikusan az
alacsonyabb hőmérsékleteken (35 ºC és 40 ºC)
tapasztalhatótól. Ezzel párhuzamosan megmértük a
termelt etanol mennyiségét, melynek a maximuma
20, 24 óránál található, és optimalizáltuk a kiindulási
glükóz koncentrációt (160-240 g/l).
Főkísérleteinkben ezért 45 ºC, 46 ºC, 47 ºC és
48 ºC-on vizsgáltuk az etanol termelést (1. ábra)
annak érdekében, hogy megállapítsuk, mi az a
legmagasabb hőmérséklet, ahol az élesztő a legtöbb
etanolt termeli.
A termelés gazdaságossága nemcsak attól függ,
hogy milyen magas hőmérsékleten tudunk etanolt
termelni, hanem az alkalmazott glükóz
hasznosításának mértékétől is. Ennek érdekében meg
kell határoznunk a maradék glükóz mennyiségét,
amelyből konverziós rátákat tudunk számolni. A
maradék glükóz mennyiségének meghatározásánál
elengedhetetlen a lehető legpontosabb eredményt adó
módszer alkalmazása. Kísérleteinkben ezért
vékonyréteg kromatográfiával (VRK) (3. ábra) és
glükóz-oxidáz enzim segítségével is meghatároztuk a
maradék glükózt (2. ábra). A 2. és a 3. ábra adatai a
45 °C-on végzett fermentáció eredményeit mutatják,
mert ezen a hőmérsékleten kaptam a legmagasabb
etanol termelési értékeket, valamint a
leggazdaságosabb konverziós ráta adatokat. Ezeket a
kísérleteket magasabb hőmérsékleten is elvégeztem
(46 °C, 47 °C, 48 °C-on), és hasonló tendenciát
tapasztaltam, mint a 45 °C-on végzett kísérletben.
Ezen adatokat felhasználva állapítottuk meg a
konverziós ráta értékeket (4. ábra). Minden egyes
ábrán 3 párhuzamos mérés átlagát és szórását
tüntettem fel.

A
GRÁRTUDOMÁNYI
K
ÖZLEMÉNYEK
,
2010/42.
25
1. ábra: Kluyveromyces marxianus CBS712 törzs etanol termelése növekvő hőmérsékleten
Figure 1: Ethanol production of the Kluyveromyces marxianus CBS712 strain at increasing temperature
Ethanol % (v/v)(1), initial glucose concentration(2)
2. ábra: A maradék glükóz mennyisége vékonyréteg kromatográfia (VRK) és glükóz-oxidáz enzim (Glu-ox.)
felhasználásával 45 °C-on
Figure 2: Determination of amount of residual glucose with Thin Layer Chromatography (TLC) and glucose-oxidase enzyme (Glu-ox.) at
45 ºC
Amount of residual glucose(1), Thin Layer Chromatography (TLC)(2), glucose-oxidase enzyme (Glu-ox.)(3), initial glucose concentration(4)
3. ábra: A maradék glükóz mennyisége VRK lemezen
* 160 g/l , 180 g/l, 200 g/l, 220 g/l, 240 g/l kiindulási glükóz koncentráció mellett láthatjuk a glükóz fogyását a fermentáció 12., 16., 20. és
24. órájában(1)
Figure 3: The amount of residual glucose on TLC layer
160 g/l, 180 g/l, 200 g/l, 220 g/l, 240 g/l initial glucose concentration(1)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
etanol % (v/v) (6)
45 ?C (7)
46 ?C (8)
47 ?C (9)
48 ?C (10)
20 h
24 h
160 g/l (1)
20 h
24 h
200 g/l (3)
20 h
24 h
220 g/l (4)
20 h
24 h
240 g/l (5)
20 h
180 g/l (2)
24 h
20 h
24 h
160 g/l (1)
20 h
24 h
200 g/l (3)
20 h
24 h
220 g/l (4)
20 h
24 h
240 g/l (5)
20 h
180 g/l (2)
24 h
0
1
2
3
4
5
6
7
8
etanol % (v/v)(1)
45 °C
46 °C
47 °C
48 °C
20 h
24 h
20 h
24 h
160 g/l
20 h
24 h
20 h
24 h
200 g/l
20 h
24 h
20 h
24 h
220 g/l
20 h
24 h
20 h
24 h
240 g/l
20 h
24 h
20 h
180 g/l
24 h
Kiindulási glükóz koncentráció(2)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Maradék glükózmennyiség (g/L) (1)
12 óra (2)
16 óra (3)
20 óra (4)
24 óra (5)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Maradék glükózmennyiség (g/L)(1)
12 h
16
h
20 h
24
h
VRK(2) Glu-ox.(3)
160 g/l
180 g/l
200 g/l
220 g/l
240 g/l
VRK(2) Glu-ox.(3)
VRK(2) Glu-ox.(3)
VRK(2) Glu-ox.(3)
VRK(2) Glu-ox.(3)
Kiindulási glükóz koncentráció(4)
12h
16h
20h
24h
12h
16h
20h
24h
12h
16h
20h
24h
12h
16h
20h
24h
12h
16h
20h
24h
180 g/l* 160 g/l* 200 g/l* 220 g/l* 240 g/l*

A
GRÁRTUDOMÁNYI
K
ÖZLEMÉNYEK
,
2010/42.
26
4. ábra: Kluyveromyces marxianus CBS712 törzs konverziós rátái az adott hőmérsékleteken
Figure 4: Conversion rate of the Kluyveromyces marxianus CBS712 strain at the given temperature
Percent of conversion rate(1), initial glucose concentration(2)
KÖVETKEZTETÉSEK
A Kluyveromyces marxianus CBS712 törzs etanol
termelését 45 ºC, 46 ºC, 47 ºC és 48 ºC-on vizsgáltuk
emelkedő glükóz koncentráció (160-240 g/l) mellett.
Az eredményekből kitűnik, hogy a termelt etanol
mennyiségét csak kismértékben befolyásolja az egyre
magasabb glükóz koncentráció; alapvetően a
hőmérséklet a meghatározó tényező. A legmagasabb
etanol koncentrációt 45 ºC-on mértük, 6,11% (v/v)
(1. ábra). Ez az érték összevethető az iparban
alkalmazott IMB3 törzs által termelt 6-7,2% (v/v)
értékkel (Singh et al., 1998a; Banat et al., 1992).
A maradék glükóz mennyiségének
meghatározásánál az alkalmazott két módszer között
jelentős különbséget tapasztaltunk; a glükóz oxidáz
enzimmel végzett vizsgálatok végig egy
megnövekedett értéket mutattak a VRK segítségével
meghatározott értékekhez képest (2. ábra).
Feltételezésünk, illetve a dolgozat terjedelmi korlátai
miatt nem részletezhető kontroll kísérleteink szerint
ennek oka, hogy a fermentáció alatt egy olyan
vegyület termelődik, amely befolyásolja az enzimes
mérést. Valószínűleg a fermentlében számos olyan,
az élesztő által termelt extracelluláris enzim és anyag
található, amelyeknek a hatásait a glükóz-oxidázra és
a peroxidázra nem ismerjük. Ez alapján a VRK-val
végzett vizsgálatokat tekintjük megbízható
adatoknak, annál is inkább, hiszen itt nincs
semmilyen tényező, ami befolyásolhatja a
meghatározást, kizárólag és egyértelműen csak a
glükóz, mint meghatározandó anyag látható a
VRK lemezen (3. ábra). Az adatokból kitűnik, hogy
a fermentáció előrehaladtával a maradék glükóz
mennyisége csökken, összhangban az etanol
mennyiségének a növekedésével (45 °C-on 180 g/l
glükózból kiindulva 12 óránál 39 g/l glükóz mellett
3,84% (v/v) etanol volt, míg 24 óránál 19,7 glükóz
mellett 5,49% (v/v) etanol volt).
A termelt etanol mennyiségének adatait, illetve a
kiindulási és a maradék glükóz koncentrációt
felhasználva konverziós ráta értékeket számoltunk,
amely érték az etanol termelés hatékonyságának a
legfontosabb mutatója (4. ábra). A legmagasabb
értéke 55,3% volt 45 ºC-on, amely esetben a
fermentációs közeg 180 g/l kiindulási glükózt
tartalmazott. Habár az iparban alkalmazott IMB3
törzs konverziós ráta értékei ennél magasabbak
(70-80%) (Banat et al., 1992; Banat és Marchant,
1995), figyelembe véve, hogy az általunk vizsgált
CBS712 törzs genetikailag módosítatlan, nem
mondható rossz kiindulási értéknek.
Összességében elmondhatjuk, hogy a
Kluyveromyces marxianus CBS712 törzset
jellemeztük etanol termelő képesség szempontjából,
valamint kiszámoltuk a konverziós ráta értékeket,
amihez vékonyréteg kromatográfia segítségével
határoztuk meg a maradék glükóz mennyiségét. A
Kluyveromyces marxianus CBS712 törzs ezen etanol
termelési adatai már genetikai módosítás előtt is
összevethetőek az iparban használt Kluyveromyces
marxianus IMB3 törzsével, amely tény bíztató a
távlati ipari alkalmazását tekintve.
0
10
20
30
40
50
60
70
%(1)
45 ºC
46 ºC
47 ºC
48 ºC
20 h 24 h 20 h 20 h 24 h 20 h 24 h 20 h 24 h
160 g/l
180 g/l
200 g/l
220 g/l
240 g/l
24 h
Kiindulási glükóz koncentráció(2)

A
GRÁRTUDOMÁNYI
K
ÖZLEMÉNYEK
,
2010/42.
27
IRODALOM
Banat, I. M.-Nigam, P.-Marchant, R. (1992): Isolation of
thermotolerant, fermentative yeasts growing at 52 ºC and
producing ethanol at 45 ºC and 50 ºC. World Journal of
Microbiology and Biotechnology, 8. 259-263.
Banat, I. M.-Marchant, R. (1995): Characterisation and potential
industrial applications of five novel, thermotolerant,
fermentative, yeast strains. World Journal of Microbiology
and Biotechnology, 11. 304-306.
Hack, C. J.-Marchant, R. (1998): Characterisation of a novel
thermotolerant yeast,
Kluyveromyces marxianus
var.
marxianus
: development of an ethanol fermentation process:
Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 20.
323-327.
Leary, N. O.-Pembroke, A.-Duggan, P. F. (1992): Improving
accurancy of glucose oxidase procedure for glucose
determinations on discrete analyzers. Clin. Chem., 38.
298-302.
Singh, D.-Banat, I. M.-Nigam, P.-Marchant, R. (1998a): Industrial
scale ethanol production using the thermotolerant yeast
Kluyveromyces marxianus
IMB3 in an Indian distillery.
Biotechnology Letters, 20. 8. 753-755.
Singh, D.-Nigam, P.-Banat, I. M.-Marchant, R.-McHale, A. P.
(1998b): Rewiev: Ethanol production at elevanted
temperatures and alcohol concentrations: Part II – Use of
Kluyveromyces marxianus
IMB3: World Journal of
Microbiology and Biotechnology, 14. 823-834.