Sitotoksik Analizlerin Su Kalitesi Değerlendirmeleri Üzerine Etkinliğinin Belirlenmesi

Abstract

In the studies carried out by us, IC50 value of water was determined by using mesenchymal stem cells and endothelial cell lines in in vitro cultures and positive and negative effect doses on the cells were determined. Depending on the results obtained, the effects on the whole organism, if necessary, can be examined in vivo on subjects. For this purpose, young wistar rats are divided into experimental groups (experimental and control) and their water needs are met with water samples obtained from the study area for 3 to 6 months. Blood and urine samples were taken from the subjects in each group at certain time points and the changes were recorded by analyzing the routine biochemistry and hemogram. In addition, the subjects in the sampling are sacrificed at monthly intervals and general examination of endogenous tissues are performed and liver, kidney and heart tissue samples are taken for histological and chemical analyzes. Some of the tissue samples are homogenized using a microwave and changes in elemental content are determined by ICP_OES. The other part is fixed in 10% formaldehyde and then 5 µm thin sections are examined histopathologically according to freeze sectioning method. These studies showed that although the known methods used in water analysis are very valuable, the water quality study carried out by cytotoxic analysis method provides reliability in terms of observing the direct effects of water quality on living tissue. In the present study, in vitro cytotoxicity studies for water samples taken from İncesu Basin are given as examples because of their striking results. Based on the obtained results, it is suggested that in vitro cytotoxicity tests should be added to routine water quality analyzes.

Full text

Turkish Journal of Agriculture - Food Science and Technology, 8(2): 478-483, 2020
DOI: https://doi.org/10.24925/turjaf.v8i2.478-483.3221
Turkish Journal of Agriculture - Food Science and Technology
Available online, ISSN: 2148-127X | www.agrifoodscience.com | Turkish Science and Technology
Determination the Effectiveness of the Cytotoxic Analysis on the Water Quality Assessments#
Nuray Emin1,3,a,*, Ekrem Mutlu2,3,b, Ayşegül Emin Güzel3,c
1Department of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering and Architecture, Kastamonu University, 37150 Kastamonu, Turkey
2Department of Aquaculture, Faculty of Fisheries, Kastamonu University, 37150 Kastamonu, Turkey
3Materials Science and Engineering, Institute of Science, Kastamonu University, 37150 Kastamonu, Turkey
*Corresponding author
A R T I C L E I N F O
A B S T R A C T
#This study was presented as an oral
presentation at the 1st International
Congress of the Turkish Journal of
Agriculture - Food Science and
Technology (Antalya, TURJAF 2019)
Research Article
Received : 29/11/2019
Accepted : 12/12/2019
In the studies carried out by us, IC50 value of water was determined by using mesenchymal stem
cells and endothelial cell lines in in vitro cultures and positive and negative effect doses on the cells
were determined. Depending on the results obtained, the effects on the whole organism, if necessary,
can be examined in vivo on subjects. For this purpose, young wistar rats are divided into
experimental groups (experimental and control) and their water needs are met with water samples
obtained from the study area for 3 to 6 months. Blood and urine samples were taken from the subjects
in each group at certain time points and the changes were recorded by analyzing the routine
biochemistry and hemogram. In addition, the subjects in the sampling are sacrificed at monthly
intervals and general examination of endogenous tissues are performed and liver, kidney and heart
tissue samples are taken for histological and chemical analyzes. Some of the tissue samples are
homogenized using a microwave and changes in elemental content are determined by ICP_OES.
The other part is fixed in 10% formaldehyde and then 5 µm thin sections are examined
histopathologically according to freeze sectioning method. These studies showed that although the
known methods used in water analysis are very valuable, the water quality study carried out by
cytotoxic analysis method provides reliability in terms of observing the direct effects of water quality
on living tissue. In the present study, in vitro cytotoxicity studies for water samples taken from İncesu
Basin are given as examples because of their striking results. Based on the obtained results, it is
suggested that in vitro cytotoxicity tests should be added to routine water quality analyzes.
Keywords:
Water quality
Cytotoxicity
Cell culture
In vivo analysis
İncesu Basin
Türk Tarım – Gıda Bilim ve Teknoloji Dergisi, 8(2): 478-483, 2020
Sitotoksik Analizlerin Su Kalitesi Değerlendirmeleri Üzerine Etkinliğinin Belirlenmesi
M A K A L E B İ L G İ S İ
Ö Z
Araştırma Makalesi
Geliş : 29/11/2019
Kabul : 12/12/2019
Tarafımızdan yürütülen çalışmalarda in vitro kültürlerde mezankimal kök hücreleri ve endotelyal
hücre hatları kullanılarak suyun IC50 değeri tespit edilerek hücreler üzerindeki pozitif ve negatif
etki dozları belirlenmektedir. Buradan elde edilen sonuçlara bağlı olarak, gerekli olması durumda
tüm organizmadaki etkileri deney hayvanları üzerinde in vivo olarak incelenebilmektedir. Bu amaçla
genç wistar sıçanları deney gruplarına (deney ve kontrol) ayrılarak, su ihtiyaçları 3 ila 6 ay süre ile
çalışma alanından temin edilen su örnekleri ile karşılanmaktadır. Belirli zaman noktalarında her bir
gruptaki deneklerden kan ve idrar numunesi alınarak rutin biyokimya analizleri ile hemogramı
analizlenerek değişimler kaydedilmektedir. Ayrıca aylık periyotlarla örneklemdeki denekler
sakrifiye edilerek endojen dokuların genel muayenesi yapılarak histolojik ve kimyasal analizler için
karaciğer, böbrek ve kalp dokusundan örnekler alınmaktadır. Doku örneklerinin bir kısmı
mikrodalga kullanılarak homojenizat haline getirilir ve element içeriğindeki değişimler ICP_OES
ile tayin edilmektedir. Diğer kısmı ise %10’luk formaldehitte tespit edildikten sonra dondurarak kesit
alma yöntemine göre 5 um’lik ince kesitleri alınarak histopatalojik olarak incelenmektedir. Bu
çalışmalar göstermişti ki su analizlerinde kullanılan bilindik yöntemler çok kıymetli olsa da
sitotoksik analiz yöntemiyle yapılan su kalitesi çalışması su kalitesinin direkt canlı doku üzerinde
etkilerinin gözlenmesi açısından güvenilirlik sağlamaktadır. Sunulan çalışmada, sonuçlarının
çarpıcılığı nedeniyle İncesu Havzasından alınan su numuneleri için yürütülen in vitro sitotoksisite
çalışmaları örnek olarak verilmiştir. Elde edilen sonuçlar ışığında in vitro sitotoksisite testlerinin
rutin su kalitesi analizlerine eklenmesi gerektiği önerilmektedir.
Anahtar Kelimeler:
Su kalitesi
Sitotoksisite
Hücre kültürü
In vivo analiz
İncesu Havzası
a
nurayemin@kastamonu.edu.tr
https://orcid.org/0000-0002-0859-2536
b
ekrem-mutlu@hotmail.com
https://orcid.org/0000-0002-6000-245X
c
eminguzel.a@gmail.com
https://orcid.org/0000-0003-1600-368X
This work is licensed under Creative Commons Attribution 4.0 International License

Emin et al. / Turkish Journal of Agriculture - Food Science and Technology, 8(2): 478-483, 2020
479
Giriş
Canlıların yaşamlarını sürdürebilmeleri için
kullanabildikleri su miktarının, dünya üzerindeki toplam su
miktarının yaklaşık yüzde biri kadar az olduğu
düşünüldüğünde, kullanılabilir ve içilebilir su
kaynaklarının korunması ve kirleticilerin etkilerinden uzak
tutulması hem insanlar hem de diğer canlılar için ciddi
önem arz etmektedir (Yılmaz ve Peker, 2013).
Ekosistemler barındırdıkları su varlığı ve kalitesiyle
insana hizmet ederler (Kocataş, 1997). Son yüzyılda nüfus
artışı, kentleşme, hızla artan endüstrileşme, atık suların
arıtılmaması, sanayi atıklarının kontrolsüz doğaya
bırakılması, ormanların bilinçsizce tahribatı, yanlış tarım
uygulamaları, ülkelerin yanlış su politikaları kullanılabilir
su miktarının azalmasına ve içilebilir suyun kalitesinin
düşmesine neden olmaktadır. Bütün bunlar insana hizmet
eden ekosistemlerin dengesini bozmakta ve hızlı bir su ve
çevre kirliliğine neden olmaktadır.
Noktasal veya noktasal olmayan kirlilik kaynaklarından
kirleticilerin alıcı ortamını su oluşturmaktadır. Atık sular;
nehir, göl, gölet ve deniz gibi alıcı ortamlara ulaştığında, su
sütunun, sedimentin biyolojik ve fiziko-kimyasal yapısında
oldukça önemli değişikliklere neden olmaktadır (Taş, 2006).
Çok hassas ekolojik karaktere sahip olan, genellikle içme suyu
temini ve sulama suyu amaçlı kurulan göletler de bu
kirleticilere maruz kalabilmektedir (Mutlu ve ark., 2013).
Yüzeysel su kaynaklarının büyük bir kısmı, özellikle ülkemiz
gibi gelişmekte olan ülkelerde endüstriyel, tarımsal ve evsel
atıkların deşarj edildiği alanlar olmakla birlikte içme,
kullanma, sulama ve su ürünleri yetiştiriciliğinde kullanılan
kaynaklar durumundadır (Kükrer ve Mutlu, 2019).
Bu kaynakların kullanım biçimini belirlemede, yüzey
sularının fiziksel, kimyasal ve biyolojik özelliklerinin
bilinmesi önem teşkil etmektedir. Yararlanılabilir su
potansiyeli, suyun miktarı ile birlikte kalitesini de ifade
etmektedir. Suyun niceliği ile birlikte niteliğinin de
bilinmesi, düzenli kontrol edilmesi günümüz dünyasında
bir zorunluluk teşkil etmektedir. Bu amaçla yapılan su
kalitesi çalışmalarında, parametrelerin ölçümleri ve su
kalitesinin belirlenebilmesi için gravimetrik,
elektrokimyasal, immünolojik ve bakteriyolojik testler
uygulanmaktadır (MEB, 2011).
Bu testlerin, yerine göre hepsi ya da bir kısmı su
analizlerinde kullanılmaktadır. Ancak, suyun canlılar
tarafından doğrudan ve/veya dolaylı, sürekli kullanımına
bağlı olarak gelişebilecek akut ve/veya kronik hastalıkları
belirleyecek çalışmalar yapılmamaktadır (Mutlu, 2019).
Bu eksiklik değerlendirilerek, su kalitesi analizlerine ilave
olarak, suyun canlılar tarafından kullanımına bağlı olarak
memeli organizmadaki değişimlerin tespitine yönelik yeni
bir yaklaşım geliştirilmiştir.
Tıbbi cihaz ve malzemeler için ISO-EN-10993 nolu
standart kapsamında uygulanan in vitro ve in vivo sitotoksik
analizler su kaynaklarının sitotoksisitesinin tespiti amacıyla
tarafımızdan kullanılmaya başlanmıştır (Emin, 2016). Bu
kapsamda 20 alt başlıktan oluşan ISO-EN-10993 nolu
standardın 5. alt başlığı hücreye dayalı sitotoksisite analizler,
uluslararası kabul gören kit ölçümleri ile kalitatif ve
kantitatif olarak gerçekleştirilmektedir. Bu amaçla
mitokondriyal dehidrogenaz aktivitesine dayalı testler
(MTT, XTT vd.) yaygın olarak kullanılmaktadır (Koç ve
ark., 2008; Emin ve ark., 2008).
Su kalitesinin fiziko-kimyasal olarak belirlenmesi su
havzasının kullanım potansiyelini belirlemede faydalı
olmaktadır. Aynı zamanda suyun tarım arazilerinde veya su
kaynağından yararlanan canlılar üzerine, dolaylı veya
doğrudan insanlar üzerine, olan etkisini belirleyebilmekte
suyun kullanım alanları hakkında bize bilgi verebilmektedir.
Ancak doğrudan suyun canlılar üzerine etkisini belirlemede
yetersiz kalmaktadır. Bu eksikliği gidermek üzere suyun
canlılar üzerine etkilerini doğrudan belirlemek amacıyla
yapılabilecek çalışmalardan birinin sitotoksik analizler
olduğu tarafımızdan değerlendirilerek yeni bir yaklaşım
denenmiştir. Bu yaklaşım doğrultusunda, in vitro memeli
hücre kültürleri üzerinde su numuneleri reaktif madde olarak
denenerek IC50 değeri yada biyouyumluluk dozu,
hücrelerin mitokondriyal dehidrogenaz aktivitesine dayalı
kitler kullanılarak tespit edilmeye çalışılmaktadır.
Materyal ve Yöntem
Sitotoksisite çalışmaları ISO-EN-10993 standardı 5. alt
başlığına uygun olarak biyomalzeme, ilaç vb. maddelerin
canlı hücreler ile in vitro, in vivo, vb koşullarda
etkileştirilmesi ve hücrelerin yaşayabilme etkilerinin
tespitine dayalı olarak gerçekleştirilmektedir. Bu analizler
sonucunda test edilen materyalin sitotoksik ya da
biyouyumlu olduğu sonucu alınmaktadır. Sitotoksik
maddeler hücrelerin yaşamsal faaliyetlerini bozarak hücre
ölümüne neden olurken, biyouyumlu olan maddeler ise
hücrelerin metabolik faaliyetlerine herhangi bir olumsuz
etki yapmamaktadır.
Bu amaçla Kastamonu Üniversitesi’nde Su Kalitesi
Laboratuvarı ile Doku Mühendisliği, Biyomalzeme ve Kök
Hücre Laboratuvarı koordinasyonu ile su kalitesi
analizlerinde yeni bir yöntem olan sitotoksik analiz
çalışmalarına başlanmıştır.
Su kalitesi analizlerinde yeni bir yaklaşım olarak
kullanılan sitotoksisite analizleri Laboratuvarımızda
yaygın olarak kullanılmaya başlanmış olup, test edilen su
örneklerinin içeriğine göre farklı sonuçlar elde
edilmektedir. Bu analizlerde suyun muhtemel sitotoksik
etkisi memeli hücre kültürlerinde test edilmektedir. Elde
edilen in vitro sitotoksisite sonuçlarına göre suyun tüm
organizmadaki etkileri gerekli görülürse deney hayvanları
üzerinde in vivo olarak incelenmektedir.
Bu amaçla su numunesi, ISO-EN-10993’ün 5. alt
başlığına göre, öncelikle in vitro hücre kültürlerinde test
edilerek sitotoksik özellikleri belirlenmeye çalışılmaktadır.
Çalışma kapsamında su numunesi, sitotoksik bir madde
muamelesi görmektedir. Suyun muhtemel sitotoksik veya
biyouyumluluk etkisi memeli hücre kültürlerinde, hücre
canlılığına dayalı şekilde test edilmektedir. Böylece suyun
hücreler üzerindeki etkilerinden yola çıkılarak, su
kaynağından dolaylı veya doğrudan yararlanan insanlar ile
diğer canlılar üzerine olan etkisi belirlenmeye
çalışılmaktadır.
In vitro çalışmalarda mezankimal kök hücreleri ve
endotelyal hücre hatları kullanılarak suyun maksimum etki
dozu olan IC50 değeri ile birlikte hücreler üzerindeki
pozitif ve negatif etki dozları belirlenmektedir. In vitro
çalışmalarda, vücutta farklı dokulara, önemli olarak bağ ve
karaciğer dokusuna farklılaşabilme, bu dokuları tamir

Emin et al. / Turkish Journal of Agriculture - Food Science and Technology, 8(2): 478-483, 2020
480
edebilme özelliği nedeniyle daha çok mezankimal kök
hücreler tercih edilmektedir. Sonuçta bu hücreler üzerine
olan etkileri birden fazla doku için genelleme
yapabilmemize imkân sağlamaktadır.
Elde edilen in vitro sitotoksisite sonuçlarına göre suyun
tüm organizmadaki etkileri deney hayvanları üzerinde in
vivo olarak incelenebilmektedir. Bu amaçla Kastamonu
Üniversitesi Deney Hayvanları Ünitesinde, temin edilen
genç wistar sıçanları denek olarak kullanılmaktadır.
Laboratuvarımızda su kalitesi üzerine yürütülen projeler
kapsamında gerçekleştirilen sitotoksik analizlere örnek
olarak, elde edilen farklı sonuçları nedeniyle,
Kastamonu’nun Taşköprü ilçesinde bulunan İncesu
Göleti’nde yapılan su kalitesinin değerlendirilmesi ve in
vitro sitotoksik analizleri çalışması seçilmiştir. Bu
çalışmanın haricinde devam eden 3 araştırma projesinde
daha in vitro yaklaşımın yanı sıra in vivo çalışmalar da
yapılmaktadır. Bu projelerden iki tanesi Doğa Koruma ve
Milli Parklar tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma,
özellikle elde edilen sitotoksik bulguların su kalitesi
SWORM sınıfları ile tam uyumlu olmaması açısından
çarpıcı bir örnek oluşturduğu için seçilmiştir.
Doğa turizmi, tarım, hayvancılık ve doğal kaynak
değerleri bakımından İncesu Havzası önemli bir konumda
bulunmaktadır. Kastamonu’ya 54 km, Taşköprü’ye 12 km
mesafede bulunan İncesu göleti, Taşköprü’nün İncesu
Köyü sınırlarındadır. 3,22 hm3 depolama hacmi olan ve
Taşköprü ilçesinde bulunan tarım arazileri ve bahçeleri
sulama amacı ile kullanılan Gölet’in temel akarsu kaynağı
İncesu Deresi’dir (Resim 1.).
Öncelikli olarak çalışma bölgesinde tespit edilen 3
istasyondan, yüzey suyu örnekleri alınarak, fiziksel ve
kimyasal analizleri yapılmış ve elde edilen verilerin
mevsimsel olarak değerlendirmeleri gerçekleştirilmiştir.
Yönetmeliğe göre en kirli ay olarak kabul gören aylardan,
Kasım ayında numuneler alınarak sterilizasyon işlemi ile
içerisindeki mikroorganizmalardan arındırıldıktan sonra
sitotoksik analizler yapılmıştır. Alınan örnekler ayrıca
mikrobiyolojik olarak test edilmiştir.
Sitotoksik Analizler
Çalışmalarda, vücut içerisindeki etkinliği ve farklı
hücre tiplerine dönüşebilme yeteneği dikkate alınarak
sıçan kemik iliği mezankimal kök hücreleri kullanılmıştır.
Öncelikle, evrensel kabul gören etik ilkeleri doğrultusunda
KÜ-HADYEK’ten alınan izinle Wistar sıçanlarından
femur kemiği tüm olarak kırılmadan çıkartılmıştır. Daha
sonra Doku Kültür Laboratuvarında kemik iliği, femur
kemiğinden aspirasyon ile çıkartılarak burada lokalize
olmuş mezenkimal kök hücreleri (MKH) aseptik
koşullarda izole edilerek saflaştırılmıştır. İzole edilen
MKH, %1 penisilin/stereptomisin ve %10 FBS (fetal
bovine serum) içeren alfa-MEM vasat içerisinde T-75
hücre kültür kaplarında ekilerek %90 nem, %5 CO2 ve
37°C‘ta ayarlı inkübatörde kültür işlemine başlanmıştır.
Ortalama 6 günde bir pasajlanarak istenilen sayıya
ulaşılana kadar hücreler çoğaltılmıştır (Resim 2a).
İstenilen sayıya kadar çoğaltılan MKH’ler, sitotoksik
analizlerde kullanılmak üzere 96 kuyucuklu petri kaplarına
2×104 MKH/kuyucuk olacak şekilde ekilmiş ve hücrelerin
zemine tutunması için 24 saat bekletilmiştir. Su kalitesinin
SWORM’a göre en düşük kalitede (sınıf III) olduğu
belirlenen Kasım ayında alınan su numuneleri için
hazırlanan 7 farklı doz, vücut su indeksine göre
hazırlanmış ve 96-kuyucuklu petri kaplarındaki MKH’ler
ile etkileştirilerek hücreler üzerindeki maksimum etki dozu
(IC50)/biyouyumluluğu MTT reaktifi (Sigma, ABD)
kullanılarak test edilmiştir.
Resim 1. Kastamonu ili (Taşköprü) İncesu Göleti'nin
uydu görüntüsü
Picture 1. Satellite image of İncesu Pond in Kastamonu
Province (Taşköprü)
Resim 2a. MKH Kültürü Faz-Kontrast mikroskop
görüntüsü
Picture 2a. Phase-Contrast microscope image of MSC
Culture
Resim 2b. MKH Kültürü Faz-Kontrast mikroskop
görüntüsü
Figure 2b. Phase-Contrast microscope image of MSC
Culture

Emin et al. / Turkish Journal of Agriculture - Food Science and Technology, 8(2): 478-483, 2020
481
Mitokondriyal Dehidrogenaz Aktivitesinin
Belirlenmesi (MTT Testi)
Mitokondriyal dehidrojenaz aktiviteleri, MTT [3-(4,5-
dimetildiyazol-2-il)-2,5 difenil tetrazolyum bromür]’ye
dayalı ticari bir kit (Sigma, ABD)) kullanılarak Emin ve
ark. (2008)’e göre analiz edilmiştir. Bu testle hücrelerin
canlılıklarının yanı sıra çoğalma yeteneklerini sürdürüp
sürdürmedikleri anlaşılmaya çalışılmıştır.
MTT testi için 1., 3., ve 7. günlerde, 96-kuyucuklu bir
petri kabında indüksiyon uygulanan hücreler
kullanılmıştır. Her bir kuyucuktaki vasat tamamen
çekilerek atılmış ve yerine serumsuz taze hazırlanmış
vasat, içerisinde %10 konsantrasyonu sağlayacak şekilde
MTT kiti ile ilave edilmiştir. Su numuneleri ile indüksiyon
uygulanmış hücrelerin, MTT ile inkübasyonu sonucunda
formazan kristallerinin oluşumu kalitatif olarak faz
kontrast mikroskobu (Resim 3) ile hücre canlılığı ise
kantitatif olarak 3 tekrarlı olacak şekilde 570 nm dalga
boyunda spektrofotometrik olarak belirlemiştir. Analiz
sonuçları su numunelerinin in vitro sitotoksik etkisi
istatistiksel olarak yorumlanmıştır.
Resim 3a. MKH kültürlerinin 3. gündeki MTT analizi
sonucu oluşan formazan kristallerinin inverted faz
kontrast mikroskobu 10× büyütme ile elde edilen görüntü
Picture 3a. Photo of the MSC cultures on day 3, obtained
by MTT analysis, obtained by inverted phase contrast
microscopy at 10X magnification of formazan crystals
Resim 3b. MKH kültürlerinin 3. gündeki MTT analizi
sonucu oluşan formazan kristallerinin inverted faz
kontrast mikroskobu 10X büyütme ile elde edilen görüntü
Picture 3. Photo of the MSC cultures on day 3, obtained
by MTT analysis, obtained by inverted phase contrast
microscopy at 10X magnification of formazan crystals.
Araştırma Sonuçları
İncesu Göleti’nde yapılan çalışmada fiziko-kimyasal
parametrelerin büyük bir kısmı I. sınıf su kalitesi özelliği
gösterirken, bir kısmı II. veya III. sınıf su kalitesi özelliği
göstermiştir. Rutin testlere ek olarak gerçekleştirilen
sitotoksik analizler ile de İncesu Göleti’ni kullanan canlılar
ve tarım ürünlerinin sulanmasında kullanımının, insanlar
üzerine olası toksik etkileri belirlenmeye çalışılmıştır. Bu
tespitlerin yapılması, söz konusu su kaynağının tarımda
kullanımının güvenirliliğini ve suyun doğrudan ya da
dolaylı olarak insanlar üzerindeki etkisinin belirlenmesi
için önemli sonuçlar vermiştir.
Kemik iliğinden elde edilen mezenkimal kök hücreleri
invert faz kontrast mikroskobu ile günlük olarak takip
edilmiş ve morfolojik özelleri incelenmiştir. Yapılan
incelemelerde MKH’ler, tek tabaka kültürlerde,
fibroblastik morfolojide hızlı bir şekilde çoğalma
göstermiştir. Farklılaşmadan, özel vasat ortamı
kullanılarak, deneyler için istenilen sayıya kadar çoğalması
sağlanmıştır. (Resim 2a, Resim 2b).
Sitotoksisite Analizi: Kalitatif ve Kantitatif MTT
Analiz Sonuçları
İnsan vücudundaki toplam su içeriği baz alınarak tespit
edilen 7 farklı dozda su reaktifi ile 7 gün süreyle
indüksiyon uygulanmıştır. 1., 3. ve 7. Günlerde alınan
örnekler MTT reaktifi ile etkileştirilerek mitokondriyal
dehidrogenaz aktiviteleri, dolayısıyla canlılıkları ve
çoğalma yeteneklerinin devam edip etmediği formazan
kristal oluşumu ile tespit edilmiştir (Demir ve ark., 2018).
Mavi-mor renkli formazan kristallerinin oluşumu,
hücrelerin mitokondriyal aktivite gösterdiğini, dolayısıyla
canlılıklarını koruduklarını işaret etmektedir. Formazan
kristalleri ne kadar fazla ve kristal boyutu ne kadar büyük
ise hücre canlılığı ve sayısının o kadar fazla olduğunu
söylenebilmektedir (Durkut ve ark., 2018; Dönmez-
Güngüneş ve ark., 2017).
MKH kültürlerinin 3. gündeki MTT analizi sonucu
oluşan formazan kristallerinin inverte faz-kontrast
mikroskobu (10X büyütme) ile elde edilen fotoğrafları
resim 3a ve 3b’de verilmiştir.
Kantitatif analiz için formazan kristalleri MTT
çözücüsü içerisinde çözülmüş ve mikroplaka okuyucu ile
570 nm dalga boyundaki beyaz ışığı absorblama değerleri,
spektrofotometrik olarak ölçülmüştür. Formazan
kristallerinin miktarı doğrudan hücre sayısı ile bağlantılı
olup, ölçülen absorbans değerleri formazan kristallerinin
miktarı ile doğru orantılı olarak değişim gösterir. Burada
herhangi bir doz uygulanmamış kontrol grubuna göre, su
örneğinden doz uygulanmış olan gruplarda hücre
canlılığında bir artış olduğu görülmüştür (Ham veri
verilmemiştir). Elde edile absorbans sonuçları %canlılık
olarak hesaplanarak grafiğe geçirilmiştir. Kontrol sıfır
noktasında kabul edilerek çizilen grafikte, yürümekte olan
diğer çalışmalarımızdan farklı olarak, 7 doz denemesinin
hepsinin canlılık üzerine pozitif etkisinin olduğu
görülmüştür. Bu etkinin 0,5 ul/ml dozdaki %5’lik artış ile
en düşük, 0,75 ul/ml dozdaki % 39’luk artışla en yüksek
artışı sağladığı görülmüştür (Grafik 1).
1.İstasyondan alınan sonuçlara benzer sonuçlar 2.
istasyon için de elde edilmiştir. Kontrol grubuna göre, doz
uygulanan gruplarda, formazan kristallerinin oluşumuna

Emin et al. / Turkish Journal of Agriculture - Food Science and Technology, 8(2): 478-483, 2020
482
göre absorbans değerlerinde artış gözlenmiştir. Yine
benzer şekilde en yüksek artış 0,75 ul/ml doz uygulanan
grupta gözlenmiştir (Ham veri verilmemiştir). %canlılık,
kontrol grubu baz alınarak hesaplanmış olup, burada
kontrol %100 kabul edilmiştir. Örnek gruplarında
%canlılık, %104 ile %138 aralığında değişim
göstermektedir. Sonuçlar 1. istasyondan alınan
örneklerden elde edilen sonuçlarla benzerlik
göstermektedir (Grafik 2).
Her iki istasyon için yapılan analizlerin toplam
değerlendirmesi yapılarak, elde edilen toplam canlılık
analizi sonucunda, İncesu göleti su içeriğinin, hücre
canlılığını korunmakla birlikte, ayrıca hücre canlılığını
artırıcı etki gösterdiği tespit edilmiştir. Bu durumda su
numunelerinin sitotoksik etkisi yerine suyun canlılar için
biyoyuyumlu olduğunu söylenebilmektedir. Uygulanan
her doz için pozitif bir etki gözlenmesine karşın canlı
vücudundaki toplam su içeriğine göre temel alınan değer
olan 0,75 ul/ml doz değerinde azami bir artış gözlenmiştir.
Grafik 1. 1. İstasyon Kantitatif MTT analiz sonuçları-2
Graphic 1. Station 1 Quantitative MTT analysis results-2
Grafik 2. 2. İstasyon Kantitatif MTT analiz sonuçları-2
Graphic 2. Station 2 Quantitative MTT analysis results-2
Tartışma ve Sonuç
Sitotoksik analizler, yönetmeliğe göre en kirli ay olarak
kabul gören ve yapılan fizikokimyasal analizlerde de en
kirli olduğu görülen aylardan, Kasım ayında alınan
numuneler ile gerçekleştirilmiştir. Sitotoksik analiz
sonuçlarının su kaynağına ve tarım arazilerine yakınlığına
göre değişiklik gösterdiği tespit edilmiştir. Gölü besleyen
dere girişinden alınan numunelerin hücre canlılığına etkisi,
gölün çıkışında tarlalar ile etkileşime girdiği noktadan
alınan numunelerin etkisinden fazla olduğu tespit
edilmiştir.
Bu sonuçlar, tarafımızca gerçekleştirilen ve çalışmaları
devam eden projelerimizdeki, yönetmelik gereği yapılan,
analiz verileri ile her zaman uyumlu sonuçlar
alınamayacağını göstermiştir. Örneğin; İncesu Göleti’nin
su kalitesi II. Sınıf olarak kabul görmesine karşın IC50
değeri tespit edilememiştir. Aksine gölet suyunun hücre
canlılığını artırdığı tespit edilmiştir. Bu etkinin özellikle
mitokondriyal etkiyi ve enerji metabolizmasını artırıcı
etkisi olan fosfat iyonlarının miktarındaki artıştan ileri
geldiği düşünülmektedir.
Suyun kullanım amacı, suyun kalite özelliklerinin
belirlenmesinde önemlidir. Balık yetiştiriciliği, hayvan
yetiştiriciliği, sulama, rekreasyon, içme suyu, enerji
üretimi, ısıtma, soğutma, petrol, gıda vb. endüstriyel ve
endüstriyel olmayan faaliyetlerin her biri farklı su kalitesi
kriterlerine gereksinim duyar. Orman ve Su İşleri
Bakanlığının 15/04/2015 tarihli ve 29327 sayılı resmi
gazetede yayınlanan yönetmeliğine göre; yerüstü sularının
sınıflandırılmasına yönelik değerlendirme, yapılan izleme
neticelerinden alınan verilerin Kıta İçi Yerüstü Su
Kaynaklarının Sınıflarına Göre Kalite Kriterleri şeması
dikkate alınarak yapılır ve SWORM’a göre sınıflandırılır.
Su örneğinin canlılar üzerine olan etkisi, elde edilen
fiziksel ve kimyasal analiz sonuçlarının, genel kabul gören
verilere ve standartlara göre yorumlanması ile dolaylı
olarak gerçekleştirilmektedir. Ancak yaptığımız
sitotoksisite testleri dolaylı toksik değer tespitinin her
zaman doğru sonuç vermediğini göstermiştir. Fiziksel ve
kimyasal parametrelerin sitotoksisite analizleri ile birlikte
yorumlanmasının su kaynağının güvenilirliği üzerine daha
net sonuçlar verdiği tespit edilmiştir.
Yürütülen çalışmalar doğrultusunda su kaynaklarının
sadece SWORM’a göre kalitesinin belirlenmesinin yeterli
olmadığı ve suyun canlılar üzerine etkisinin doğrudan
sitotoksisite analizleri ile belirlenmesi hızlı ve kesin
sonuçlar verdiği gösterilmiştir. Yürütülen bu çalışmalar su
kalitesinin tespiti ve canlılar üzerine doğrudan etkisinin
tespiti açısından ayrıca ilk olma özelliği taşımaktadır.
Bu çalışmalar göstermiştir ki su analizlerinde
kullanılan geleneksel standart yöntemler çok kıymetli olsa
da sitotoksik analiz yöntemiyle yapılan su kalitesi
çalışması, suyun direkt canlı doku üzerindeki etkilerinin
gözlenmesi açısından güvenilirlik sağlamaktadır. Bu
bakımdan sitotoksisite analizlerinin su kalite standartlarına
dâhil edilmesi ile rutin uygulama haline gelmesinin uygun
olacağı tarafımızdan mütalaa edilmektedir.
Bildirim
Söz konusu çalışma Kastamonu Üniversitesi Bilimsel
Araştırma Projeleri Koordinatörlüğünün KÜBAP-
01/2016-30 numaralı projesi kapsamında desteklenmiştir.
Çalışmanın bir bölümü 08-10 Kasım 2019 tarihinde
Antalya/Türkiye’de gerçekleştirilen “I. Uluslararası Tarım
- Gıda Bilim ve Teknoloji Dergisi Kongresi
(TURJAF)”inde sunulmuştur.
Kaynaklar
Demir AK, Elçin AE, Elçin YM. 2018. Strontium-modified
chitosan/montmorillonite composites as bone tissue
engineering scaffold. Materials Science and Engineering: C,
89: 8-14.

Emin et al. / Turkish Journal of Agriculture - Food Science and Technology, 8(2): 478-483, 2020
483
Dönmez Güngüneş Ç, Şeker Ş, Elçin AE, Elçin YM. 2017. A
comparative study on the in vitro cytotoxic responses of two
mammalian cell types to fullerenes, carbon nanotubes and
iron oxide nanoparticles. Drug and chemical toxicology,
40(2): 215-227.
Durkut S, Elçin YM. 2017. Synthesis and characterization of
thermosensitive poly (N-vinylcaprolactam)-g-collagen.
Artificial cells, nanomedicine, and biotechnology, 45(8):
1665-1674.
Emin N. 2016. The Cytotoxic Effect And The Physiological
Response In The Biomaterials Applications The Turkish
Journal Of Occupational / Environmental Medicine and
Safety Volume 2: 226-226
Emin N, Koç A, Durkut S, Elçin AE, Elçin YM. 2008.
Engineering of rat articular cartilage on porous sponges:
Effects of TGF-β 1 and microgravity bioreactor
culture. Artificial Cells, Blood Substitutes, and
Biotechnology, 36(2): 123-137.
Koç A, Emin N, Elçin AE, Elçin YM. 2008. In vitro osteogenic
differentiation of rat mesenchymal stem cells in a
microgravity bioreactor. Journal of Bioactive and Compatible
Polymers, 23(3): 244-261.
Kükrer S, Mutlu E. 2019. Assessment of surface water quality
using water quality index and multivariate statistical analyses
in Saraydüzü Dam Lake, Turkey. Environmental monitoring
and assessment, 191(2): 71.
MEB. 2011. T.C. Milli Eğitim Bakanlığı, Çevre sağlığı; Suların
analiz parametreleri. 850CK0011 Ders Notları, Ankara.
Mutlu E. 2019. Evaluation of spatio-temporal variations in water
quality of Zerveli stream (northern Turkey) based on water
quality index and multivariate statistical
analyses. Environmental monitoring and assessment, 191(6):
335.
Mutlu E, Yanık T, Demir T. 2013. Horohon Deresi (Hafik-Sivas)
Su Kalitesi Özelliklerinin Aylık Değişimleri/Horohon Stream
(Hafik-Sivas) Water Quality Characteristics and Monthly
Variations. Alınteri Zirai Bilimler Dergisi, 25(2): 45-57.
Taş B. 2006. Derbent Baraj Gölü (Samsun) Su Kalitesinin
İncelenmesi. Ekoloji Dergisi, 15,61, 6 15.
Yılmaz ML, Peker HS. 2013. Su Kaynaklarının Türkiye
Açısından Ekono-Politik Önemi Ekseninde Olası Bir Tehlike:
Su Savaşları. Çankırı Karatekin Üniversitesi İ.İ.B.F. Dergisi.
Cilt: 3, Sayı: 1, ss. 57-74, Çankırı.