ESTIMULACIÓN DE CÉLULAS DENDRÍTICAS DERIVADAS DE MÉDULA ÓSEA DE RATÓN TRATADAS CON NANOPARTÍCULAS DE PLATA

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ESTIMULACIÓN DE CÉLULAS DENDRÍTICAS DERIVADAS DE MÉDULA ÓSEA
DE RATÓN TRATADAS CON NANOPARTÍCULAS DE PLATA
MATERIALES Y MÉTODOS
Castro-Gamboa Sandra1, García-Iglesias Trinidad1, Ortiz-Lazareno Pablo César2, Quintero-Ramos Antonio1, Castell-Rodríguez Andrés Eliú3, Piñon-Zarate Gabriela3, Bogdanchikova Nina4, Prestryakov
Alexey5, Garcia-Garcia Maritza Roxana6*
RESULTADOS
Las células dendríticas (DCs) tienen la capacidad de iniciar una respuesta inmune de novo antígeno específica.
Para potenciar y direccionar dicha respuesta las nanopartículas de plata (AgNPs) podrían representar una
alternativa por su efecto estimulante en las DCs a través de la producción de especies reactivas de oxígeno
(ROS).
INTRODUCCIÓN OBJETIVO
Estimar el efecto estimulante de las AgNPs sobre BMDCs a
través de ROS.
Día 0 Día 3 Día 6 Día 9
Diferenciación BMDCs
1) Micrografías de
diferenciación de BMDCs.
Las micrografías muestran
la evolución desde células
totales de médula ósea y su
diferenciación en 3, 6 y 9
días.
1)
Índice de Estimulación
Diferenciación Análisis de
Viabilidad/Citotoxicidad
con Citometría de Flujo
Células
Totales de
Méldula
Ósea
Células
Dendríticas
Inmaduras
(iDC)
Ratones
C57BL/6J
Viable:
Calceína AM+
No Viables:
EthD-1+
snCHO
transfectadas con
GM-CSF
9 días
Estímulos
0 ng/ml
62.5 ng/ml
125 ng/ml
250 ng/ml
500 ng/ml
1000 ng/ml
2000 ng/ml
AgNPs
𝑆𝐼 =Ẋ𝑂𝐷 𝑡𝑟𝑒𝑎𝑡𝑒𝑑 𝑐𝑒𝑙𝑙𝑠
Ẋ𝑂𝐷 𝑛𝑜𝑛 𝑡𝑟𝑒𝑎𝑡𝑒𝑑 𝑐𝑒𝑙𝑙𝑠
SI= Índice de Estimulación
Ẋ= Media
OD= Densidad Óptica
DMSO 40 %
Ensayo MTT
Selección de
Dosis
Células dendríticas maduras
(mDC)
CONCLUSIONES
Con base en los resultados observados se concluye que:
•Las AgNPs inducen un efecto estimulante y no citotóxico en las BMDCs en concentraciones de 62.5, 125 y 250 ng/ml.
•Dichas concentraciones de AgNPs producen en las BMDCs una elevación de ROS y superóxido principalmente a las 24 h que podría producir el
efecto estimulante observado tanto a las 24 h, como a las 48.
REFERENCIAS
•AshaRani PV, Mun GLK, Hande MP, Valiyaveettil S. Cytotoxicity and genotoxicity of silver nanoparticles in human cells. ACS Nano. 2009; 3:279-290.
•Kang K, Jung H, Lim JS. Cell Death by Polyvinylpyrrolidine-Coated Silver Nanoparticles is Mediated by ROS-Dependent Signaling. Biomol Ther (Seoul). 2012 Jul; 20(4):399-405.
•Cheong TC, Shin EP, Kwon EK, Choi JH, Wang KK, Sharma P, ... Jeon JH. Functional manipulation of dendritic cells by photoswitchable generation of intracellular reactive oxygen species. ACS chemical biology. 2014; 10 (3): 757-765.
•Piñón-Zárate G, Herrera-Enríquez MÁ, Hernández-Téllez B, Jarquín-Yáñez K, Castell-Rodríguez AE. GK-1 improves the immune response induced by bone marrow dendritic cells loaded with MAGE-AX in mice with melanoma. J Immunol Res. 2014; 2014:
158980.
•Na YR, Jung D, Gu GJ, Seok SH. GM-CSF Grown Bone Marrow Derived Cells Are Composed of Phenotypically Different Dendritic Cells and Macrophages. Mol Cells. 2016 Oct;39(10):734-741
AGRADECIMIENTOS
CONACyT Proyecto de Ciencia BásicaCB-2015-254174
Instituciones:
Palabras clave: Derivadas de Médula Ósea, Citotoxicidad, ROS, Nanopartículas de
Plata (AgNPs)
* Autor de Correspondencia: Dra. en C. Maritza R. García García, Universidad
Autónoma de Guadalajara. Correo electrónico: mary_roxy13@hotmail.com
ROS
Superóxido
Análisis de Presencia de
ROS/Superóxido por
Citometría de Flujo
ab139476- Cellular ROS/Superoxide
Detection Assay Kit
LIVE/DEAD ® Viability/Cytotoxicity Kit
*for mammalian cells* Molecular Probes-
Invitrogen
Caracterización de AgNPs
Caracterización de AgNPs Argovit.
a) Espectros UV-Vis de la preparación de AgNPs en agua desionizada.
b) Imagen de TEM de AgNPs utilizando diferentes aumentos, c)
Distribución de tamaño de AgNPs. d) Espectro ATR-FTIR de AgNPs
liofilizados Argovit ™en comparación con PVP sólido. AgNPs:
nanopartículas de plata. UV-Vis: ultravioleta-visible. TEM: microscopía
electrónica de transmisión. FTIR: espectroscopia infrarroja por
transformada de Fourier. ATR: reflectancia total atenuada (Imagen
traducida de Juarez-Moreno, 2016).
Argovit ®
Vector Vita
Solución acuosa de AgNPs
Recubrimiento de PVP como estabilizador
Concentración del 20%
2.4% de plata metálica 17.6% de PVP
Nanoesferas de 30±10 nm
Radio hidrodinámico de 70 nm
Potencial Z de -15
1Centro Universitario de Ciencias de la Salud, UDG. 2Centro de Investigación Biomédica de Occidente, IMSS. 3Facultad de Medicina, UNAM. 4Centro de
Nanociencias y Nanotecnología, UNAM.5Tomsk Polytechnic University, Tomsk, Russia
6Universidad Autónoma de Guadalajara.
Análisis de Estimulación en BMDCs
tratadas con AgNPs
Tiempos:
•24 h
•48 h
•72 h
Tiempos:
•24 h
•48 h
•72 h
Tiempos:
•30 min
•24 h
•48 h
•72 h
2)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 (Ctrl. -) 62.5 125 250 500 1000 2000 DMSO
(Ctrl. +)
SI
24 h 48 h 72 h
**
AgNPs (ng/ml)
Análisis de Viabilidad/Citotoxicidad en
BMDCs tratadas con AgNPs
0.00%
20.00%
40.00%
60.00%
80.00%
100.00%
0 (Ctrl. -) 62.5 125 250 DMSO (Ctrl. +)
CÉLULAS VIABLES (%)
24 h 48 h 72 h
*
AgNPs (ng/ml)
2) Análisis de Estimulación. Los
datos fueron analizados por la
prueba de Kruskall Wallis para
análisis intergrupal y
posteriormente con U de Mann
Whitney para identificación de
diferencias entre grupos de forma
pareada. Los datos se expresan en
Media± Desviación Estándar. *
p>0.05 en relación al grupo control
(BMDCs con 0 ng/ml de AgNPs) de
cada tiempo (24,48 y72 h).
3) Análisis de Índice de
Estimulación. Los datos fueron
analizados por la prueba de ANOVA
de 1 vía con post hoc de T3 de
Dunnet. Los datos se expresan en
Media ± Desviación Estándar. *
p>0.05 en relación al grupo control
(BMDCs con 0 ng/ml de AgNPs) de
cada tiempo (24,48 y72 h).
Abreviaturas: BMDCs: Células Dendríticas Derivadas de Médula Ósea. AgNPs: Nanopartículas de Plata. DMSO: Dimetil sulfóxido. ROS: Especies Reactivas de Oxígeno. ANOVA:
Análisis de Varianza. MFI: Intensidad Media de Fluorescencia.SI:Índice de Estimulación.
Producción de ROS en BMDCs tratadas
con AgNPs
Producción de Superóxido en BMDCs
tratadas con AgNPs
3)
6)
5)
4)
7)
6) Porcentaje (%) Relativo de Células Superóxido +.
BMDCs positivas a las presencia de Superóxido tratadas con diferentes
concentraciones de AgNPs a 30 minutos, 24,48 y72 h por citometría de flujo en
relación al grupo control positivo (Superóxido+). Los datos se expresan en media
± desviación estándar del porcentaje relativo de Células Superóxido+, analizados
por ANOVA de Welch con post hoc de T3 de Dunnet. * p>0.05 en relación al grupo
sin tratamiento (0 ng/ml AgNPs).
7) MFI Relativa de Células Superóxido +.
MFI de las células superóxido+, en relación al grupo control positivo
(Superóxido+). Los datos se expresan en media ± desviación estándar del MFI
relativo de las células superóxido+, analizados por ANOVA de Welch con post hoc
de T3 de Dunnet. *p>0.05 en relación al grupo sin tratamiento (0 ng/ml AgNPs).
0%
20%
40%
60%
80%
100%
30 min 24 h 48 h 72 h
% Relativo de Células
Superóxido+
Superóxido (-)
0 ng/ml
62.5 ng/ml
125 ng/ml
250 ng/ml
Superóxido (+)
4) Porcentaje (%) Relativo de Células ROS +.
BMDCs positivas a la presencia de ROS tratadas con diferentes concentraciones
de AgNPs a 30 minutos, 24,48 y72 h por citometría de flujo en relación al grupo
control positivo (ROS+). Los datos se expresan en media ± Desviación estándar
del porcentaje relativo de Células Superóxido+, analizados por ANOVA de Welch
con post hoc de T3 de Dunnet. * p>0.05.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
30 min 24 h 48 h 72 h
% Relativo de Células ROS+
ROS (-)
0 ng/ml
62.5 ng/ml
125 ng/ml
250 ng/ml
ROS (+)
5) MFI Relativa de Células ROS +.
MFI de las células ROS+, en relación al grupo control positivo (ROS+). Los datos se
expresan en media ± desviación estándar del MFI relativo de las células ROS+,
analizados por ANOVA de Welch con post hoc de T3 de Dunnet. *p>0.05 en
relación al grupo sin tratamiento (0 ng/ml AgNPs).
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
30 min 24 h 48 h 72 h
MFI Relativo Células Superóxido+
Superóxido (-)
0 ng/ml
62.5 ng/ml
125 ng/ml
250 ng/ml
Superóxido (+)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
30 min 24 h 48 h 72 h
MFI Relativo Células ROS+
ROS (-)
0 ng/ml
62.5 ng/ml
125 ng/ml
250 ng/ml
ROS (+)
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