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Metagenómica marina: un enfoque al descubrimiento de nuevos biosurfactantes para su posible aplicación ambiental

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Abstract and Figures

Abstract Marine microorganisms represent the greatest percentage of marine species. Since they have to adapt to changing environmental conditions, such as high or low pH, temperature, pressure and limited substrate, marine microorganisms produced a wide range of metabolites that cannot be found elsewhere. Over the years, marine bacteria have provided chemical structures and metabolites with biotechnological potential including antibiotics, enzymes, vitamins, drugs and biosurfactants, among others. Biosurfactants are surface–active compounds synthesized by a wide variety of living cells, principally bacteria. They are amphiphilic structures, and so, possess both hydrophobic (water insoluble) and hydrophilic (water soluble) moieties which allow them to reduce surface tension between two phases. Because of their specific action, low toxicity and biodegradability, biosurfactants have become an important biotechnological product that can be applied in different industries, including food processing, cosmetics, agriculture, oil industry, and environmental bioremediation. A considerable number of marine microorganisms able to produce biosurfactants have been reported. However, it is now widely accepted that less than 1% of microbes can be isolated using traditional culturing techniques, leaving the vast majority of microorganisms unexplored. This chapter summarizes the important aspects of applications, production, and characterization of microbial biosurfactants isolated from marine microorganisms. An emerging cultivation–independent method for their genetic identification is discussed.
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AVANCES Y PERSPECTIVAS DE LA BIOTECNOLOGÍA
EN LA PENÍNSULA DE YUCATÁN
Editado por
Roberto Zamora–Bustillos
Juan José Sandoval–Gío
Coordinadores
Sección Alimentaria
Víctor Manuel Toledo López
Sección Ambiental
Beatriz Adriana Rodas Junco
Sección Bioinformática
Ernesto Pérez Rueda
Sección Animal y Marina
Mariel Gullian Klanian
Sección Agrícola y Vegetal
Felipe Vázquez Flota
Sección Bioingeniería y Fermentaciones
Gerardo Rivera Muñoz
Sección Enzimática y Microbiana
Elizabeth de la Luz Ortiz Vázquez
Sección Médica y Farmacéutica
Miguel Enrique Rosado Vallado
D.R. © Tecnológico Nacional de México, 2018
Libro electrónico
ISBN 978-607-97344-6-6
Coordinadores de obra
Roberto Zamora–Bustillos
Juan José Sandoval–Gío
Cuidado de edición y revisión ortotipográfica
Alejandrina Garza de León
Diseño editorial, de cubierta, infografía y formación
Adrián Ramos Garza
Imágenes
Propiedad de los autores de los textos
Editado en Mérida–México
Made in Merida–Mexico
208 ambiental
Resumen
El ambiente marino es un hábitat en donde se desarrollan diversos organismos
entre los cuales encontramos un elevado número de especies bacterianas, las
cuales producen una gran cantidad de metabolitos secundarios. La capacidad
de producir estas moléculas les permite adaptarse o contrarrestar los cambios fisico-
químicos generados en el ambiente, tales como las variaciones en los niveles de pre-
sión, temperatura, salinidad, alcalinización o acidificación del agua, disponibilidad
limitada de nutrientes y asimilación de compuestos exógenos o contaminantes. Des-
de un punto de vista biotecnológico, las estructuras químicas producidas bajo estas
condiciones pueden ser aprovechadas en diferentes procesos industriales. A lo largo
de los años se han aislado diversos compuestos a partir de organismos marinos, sin
embargo, a pesar de la gran diversidad de bacterias marinas, actualmente se sabe
que menos del 1% pueden ser aisladas utilizando técnicas de cultivo tradicionales,
lo que deja el 99% de los microorganismos sin estudiar. En la actualidad, el uso de
técnicas independientes de cultivo (como la secuenciación masiva) permite el análisis
de las comunidades bacterianas, sin la necesidad de realizar aislamientos previos, lo
que resulta en una visión amplia de la diversidad microbiana y genética contenida en
cualquier muestra ambiental.
Este capítulo resume los aspectos importantes en el escrutinio de biosurfactantes
microbianos aislados de microorganismos marinos, incluyendo una reseña del esta-
do actual de los principales biosurfactantes producidos por estos microorganismos,
sus mecanismos de biosíntesis y la metagenómica marina como un nuevo enfoque
alternativo para su identificación genética.
Alejandra Ramos–Castillo1, Ulises García–Cruz1
César De Los Santos–Briones2, *Ma. Leopoldina Aguirre–Macedo1
Metagenómica marina: un enfoque al
descubrimiento de nuevos biosurfactantes
para su posible aplicación ambiental
* Autor de correspondencia: leopoldina.aguirre@cinvestav.mx
1 Departamento de Recursos del Mar, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN
Unidad Mérida, km 6 antigua carretera a Progreso, Cordemex, 97310, Mérida, Yucatán, México
2 Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C., calle 43 Núm. 130, Col. Chuburná de
Hidalgo, 97200, Mérida, Yucatán, México
avances y perspectivas de la biotecnología en la península de yucatán 209
Palabras clave
Biosurfactantes, metagenómica marina, tensoactivos microbianos,
ramnolípidos, surfactina
Abstract
Marine microorganisms represent the greatest percentage of marine species.
Since they have to adapt to changing environmental conditions, such as high
or low pH, temperature, pressure and limited substrate, marine microorgan-
isms produced a wide range of metabolites that cannot be found elsewhere. Over
the years, marine bacteria have provided chemical structures and metabolites with
biotechnological potential including antibiotics, enzymes, vitamins, drugs and bio-
surfactants, among others. Biosurfactants are surface–active compounds synthesized
by a wide variety of living cells, principally bacteria. They are amphiphilic structures,
and so, possess both hydrophobic (water insoluble) and hydrophilic (water soluble)
moieties which allow them to reduce surface tension between two phases. Because
of their specific action, low toxicity and biodegradability, biosurfactants have become
an important biotechnological product that can be applied in different industries,
including food processing, cosmetics, agriculture, oil industry, and environmental
bioremediation. A considerable number of marine microorganisms able to produce
biosurfactants have been reported. However, it is now widely accepted that less than
1% of microbes can be isolated using traditional culturing techniques, leaving the
vast majority of microorganisms unexplored.
This chapter summarizes the important aspects of applications, production, and char-
acterization of microbial biosurfactants isolated from marine microorganisms. An
emerging cultivation–independent method for their genetic identification is discussed.
Keywords
Biosurfactants, Marine metagenomics, Microbial tensioactives,
Rhamnolipids, Surfactin
En los últimos años se ha dado un gran énfasis a la regulación de surfactan-
tes sintetizados químicamente. Esto debido al impacto ambiental causado
por su uso, dada su alta toxicidad hacia ciertos organismos (Lechuga et al.,
2016) y por su capacidad de depositarse en los ecosistemas de numerosas
Introducción. Características generales
de los biosurfactantes
210 ambiental
maneras (Maguire, 1999). Los surfactantes son compuestos de naturaleza
anfipática, lo que significa que poseen un motivo hidrofílico y uno hidrofóbi-
co, lo que les permite disminuir la tensión superficial entre dos fases (Rosen
y Kunjappu, 2012). Se denomina Biosurfactantes (BS) a aquellos surfactan-
tes que son producidos por organismos biológicos incluyendo bacterias, ar-
queas y hongos (Jackson et al., 2015). Generalmente son metabolitos secun-
darios excretados por los microorganismos, sin embargo, también pueden
ser intracelulares; en este caso permanecen unidos a la pared celular. Los
BS pueden jugar roles esenciales en los microorganismos que los producen
ya sea actuando como agentes antimicrobianos (Ron y Rosenberg, 2001; Go-
maa, 2013) o participando en la formación de biopelículas (Pamp y Tolker–
Nielsen, 2007) y en los procesos celulares de señalización y diferenciación
(Van Hamme et al., 2006). En algunas especies bacterianas los biosurfactan-
tes están involucrados en la movilidad “swarming”, en la cual las bacterias
sufren una transfiguración importante convirtiéndose en formas filamento-
sas hiperflageladas, lo que les permite un desplazamiento multicelular rá-
pido y coordinado a través de una superficie solida o semisólida (Kearns,
2011; Wang et al., 2014). Sin embargo, su principal papel fisiológico es el
de aumentar la disponibilidad de sustratos inmiscibles en agua mediante la
reducción de la tensión superficial de la interfase, lo que facilita su biodis-
ponibilidad y por consiguiente su biodegradación (Fiechter, 1992). Los BS
son un grupo estructuralmente diverso de moléculas que presentan amplias
ventajas en comparación con sus contrapartes sintetizadas químicamente,
tales como: una baja toxicidad y una alta biocompatibilidad; su amplia va-
riedad de estructuras químicas disponibles, dependiendo de su fórmula mo-
lecular, les permite tener grupos funcionales diferentes lo cual les confiere
mecanismos de acción específicos (Kosaric, 1992). Debido a su naturaleza
biológica y a la amplia variedad de organismos que los sintetizan, los biosur-
factantes son activos a diferentes temperaturas, pH y salinidad, y pueden ser
sintetizados a partir de diferentes fuentes renovables de carbono, así como
de desperdicios industriales (Cameotra y Makkar, 1998; Muthusamy et al.,
2008). El amplio rango de estructuras químicas y el reciente incremento en
la demanda de productos de origen biológico debido a la preocupación am-
biental global, han contribuido a promover el uso de los biosurfactantes por
sobre aquellos producidos por síntesis química.
De acuerdo con el Transparency Market Research (Sekhon et al., 2012), el mer-
cado global de los biosurfactantes fue valuado en 1.73 billones de dólares
en el año 2011 y se espera que el valor alcanzará los 2.2 billones de dólares
para 2018, con una producción de aproximadamente 476,512 toneladas.
A pesar de tener muchas ventajas, existen algunos factores que limitan la
comercialización de los biosurfactantes. Éstas incluyen la baja eficiencia de
producción a nivel celular y a gran escala, el alto costo de su producción y
el relativo bajo conocimiento que se tienen acerca de su síntesis molecular.
avances y perspectivas de la biotecnología en la península de yucatán 211
Los surfactantes microbianos son compuestos orgánicos de gran diversidad
estructural incluyendo péptidos, ácidos grasos, fosfolípidos, glicolípidos,
antibióticos y lipopéptidos. Los microorganismos también producen, en al-
gunos casos, surfactantes que son combinaciones de muchas estructuras
químicas como los surfactantes microbianos poliméricos. Actualmente se
han purificado y caracterizado la estructura química de muchos surfactantes
microbianos. De aquí que debido a su amplia variedad y propiedades espe-
cíficas, los biosurfactantes pueden ser clasificados atendiendo tres criterios:
estructura química, carga iónica de la parte superficialmente activa de la
molécula y peso molecular, siendo esta última la clasificación más referencia-
da, diviendose en biosurfactantes de alto y bajo peso molecular (Figura 1A,
1B). Los biosurfactantes de bajo peso molecular suelen ser lipopéptidos o
glicolípidos. Entre estos últimos se encuentran los ramnolípidos producidos
por diversas especies del género Pseudomonas y los soforolípidos, produci-
dos mediante fermentación con levaduras no patógenas. Por otra parte, los
biosurfactantes de alto peso molecular suelen ser polisacáridos, proteínas,
lipoproteínas, lipopolisacáridos o mezclas complejas de estos polímeros y
son producidos por diferentes bacterias. Estos últimos no son tan eficaces
en cuanto a la reducción de la tensión superficial entre fases, pero sí son
buenos emulsionantes. Además, se ha demostrado que son muy eficaces a
bajas concentraciones y poseen una considerable afinidad por el sustrato.
Los biosurfactantes pueden ser sintetizados por una amplia variedad de
organismos, incluyendo bacterias, arqueas y hongos (Cuadro 1). Estos or-
ganismos productores habitan en diversos ambientes marinos (Satpute et
al., 2010) y terrestres (Bento et al., 2005), así como en ambientes extremos
(Cameotra y Makkar, 1998; Darvishi et al., 2011) prosperando en un amplio
rango de temperaturas, pH y salinidad. También pueden ser aislados de am-
bientes no perturbados en las que tienen papeles fisiológicos que no implican
la solubilización de los contaminantes hidrófobos, como por ejemplo, los pro-
cesos de motilidad y colonización de superficies (Van Hamme et al., 2006). En
los últimos años, los surfactantes producidos por microorganismos marinos,
principalmente por bacterias marinas, han sido objeto de estudio de diversos
investigadores, particularmente por el uso potencial que tienen en la biorre-
mediación de mares contaminados con petróleo crudo (Maneerat, 2005).
Diferentes grupos bacterianos clasificados como productores de biosurfactan-
tes, entre éstos se encuentran los organismos pertenecientes a los géneros
Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Mycobacterium, Nocardia, Flavobacterium,
Corynebacterium, Clostridium, Acinetobacter, Thiobacillus, Serratia, Arthrobacter
Síntesis de los principales biosurfactantes microbianos:
ramnolípidos, surfactina y soforolípidos
212 ambiental
y Alcanivorax. Los más importantes biosurfactantes bacterianos utilizados hoy
en día, y de los que mejor se han elucidado operones, enzimas y rutas meta-
bólicas requeridas para su producción, han sido los ramnolípidos derivados de
varias especies de Pseudomonas y la surfactina un lipopéptido sintetizado por
Bacillus subtilis (Shete et al., 2006; Das et al., 2008; Pesci et al., 1997; Pearson
et al., 1997).
Cuadro 1
Principales biosurfactantes producidos por bacterias, arqueas y hongos
Microorganismo Clasificación Biosurfactante producido
BACTERIA
Acinetobacter calcoaceticus Surfactante polimérico Emulsan
Acinetobacter calcoaceticus Surfactante polimérico Biodispersan
Bacillus subtilis Lipopéptido Surfactina
Bacillus licheniformis Lipopéptido Lichenisina
Bacillus polymyxa Lipopéptido/Lipoproteina Polymixina
Brevibacillus brevis Lipopéptido/Lipoproteina Gramicidina
Pseudomonas aeruginosa Glicolípido Ramnolípido
Pseudomonas putida Glicolípido Ramnolípido
Pseudomonas chlororaphis Glicolípido Ramnolípido
Pseudomonas fluorescens Surfactante polimérico Carbohidrato–proteína–lípido
Rhodococcus spp. Glicolípido Lípido deTrehalosa
Serratia marcescens Lipopéptido/Lipoproteina Serrawettina
ARQUEA
Halovivax a21 Glicolípido/Lipopéptido ––
Haloarcula d21 Glicoproteína ––
HONGOS
Trichosporon asahii Glicolípido Soforolípido
LEVADURAS
Candida bombicola Glicolípido Soforolípido
Candida apicola Glicolípido Soforolípido
Candida antartica Glicolípido Lípido de Manosileritritol
Candida tropicalis Surfactante polimérico Mannan–lípido–proteina
Candida lipolytica Surfactante polimérico Liposan
Debaryomyces polymorphus Surfactante polimérico Carbohidrato–proteína–lípido
avances y perspectivas de la biotecnología en la península de yucatán 213
Ramnolípidos
Los ramnolipidos son glicolípidos sintetizados por un gran número de ce-
pas del género Pseudomonas, y están formado por una o dos unidades de
ramnosa (mono– y di–ramnolípidos, Figura 1A, 1B) ligadas a una o dos
unidades de ácidos grasos β–hidroxi con una cadena larga de carbonos en-
tre C8 a C12 (Toribio et al., 2010). La síntesis de los ramnolípidos está bajo
la regulación de los sistemas de quorum sensing (QSS, por sus siglas en
inglés) las y rhl. QSS controla el activador transcripcional del sistema rhl
(RhlR) a ambos niveles; transcripcional y postranscripcional (Pesci et al.,
1997). El regulón (3’–rhlABRI–5’) contiene los genes rhlAB y rhlC requeridos
para la producción de los ramnolípidos; rhlAB está organizado en un operón
y es responsable de la producción de mono ramnolípidos, mientras que
rhlC contribuye a la producción de di–rhamnolípidos (Rahim et al., 2001).
Estas tres enzimas son las responsables de los pasos finales de la síntesis
de ramnolípidos (Figura 2). En promedio, los ramnolípidos reducen la ten-
sión del agua de 72.80 mN/m a 25–30 mN/m (Desai y Banat, 1997). Algu-
nas especies como Pseudomonas aeruginosa pueden producir ramnolípidos
a partir de sustratos como alcanos, succinato, piruvato, citrato, fructosa,
glicerol, aceite de oliva, glucosa y manitol (Robert et al., 1989; Perfumo et
al., 2009). Debido a su excelente biocompatibilidad y fácil degradación,
los ramnolípidos pueden ser usados en los procesos de biorremediación
tales como la recuperación terciaria del petróleo y la descontaminación de
hidrocarburos en ambientes marinos (Banat, 1995).
Surfactina
La surfactina es un surfactante cristalino producido por Bacillus subtillis
(Makkar y Cameotra 1997). Esta molécula consiste en un péptido circular de
siete aminoácidos (L–glutamina, L–leucina, D–leucina, L–valina, L–asparagina,
D–leucina y L–leucina) ligada a una cadena de ácidos grasos hidrofóbicos de
13 a 15 carbonos (Figura 1C). Los residuos de L–glutamina y L–asparagine,
en las posiciones 1 y 5, respectivamente, constituyen el dominio polar. En el
extremo opuesto, los residuos de valina y leucina en las posiciones 2, 3, 4, 6
y 7 se extienden hacia el frente de la cadena de ácidos grasos para formar el
dominio hidrófobo mayor (Hue et al. 2001). La biosíntesis de la surfactina es
catalizada por la enzima surfactina sintetasa, un complejo péptido sintetasa
no–ribosmal (NRPS, por sus siglas en inglés) codificado por el operón indu-
cible srfA (25 kb), formado por las subunidades SrfA, SrfB, y SrfC (Nakano
et al., 1988; Nakano et al., 1991). Las subunidades forman siete módulos
que comprenden 24 dominios catalíticos. Cada módulo es responsable de la
incorporación y modificación de un aminoácido especifico en la cadena pep-
tídica. Una enzima externa (tioesterasa/acetiltransferasa) llamada SrfD juega
un papel importante en la reacción de iniciación de síntesis de surfactina
(Steller et al., 2004). Todos los genes responsables para la síntesis de la sur-
factina que están codificados por NRPS muestran un alto grado de similitud
214 ambiental
en su organización estructural a través de las diferentes especies bacterianas
(Das et al. 2008). La péptido sintetasa requerida para el motivo aminoácido
de la surfactina está codificada por cuatro marcos abiertos de lectura ORF1
(srfA–A), ORF2 (srfA–B), ORF3 (srfA–C) y ORF4 (srfA–D). El gen sfp codifica una
fosfopanteteinil transferasa y se ha catalogado como el segundo gen esencial
en la producción de surfactina.
Figura 1. Biosurfactantes de diferentes pesos moleculares. Estructuras de A) un
monoramnolípido, y B) un diramnolípido producidos por
Pseudomonas aeruginosa
.
C) Molécula de Surfactina, un surfactante de alto peso molecular producido durante
el proceso de degradación de hidrocarburos en
Bacillus sp.
OH OHCH CHCH2
(CH2)n
CH3
(CH2)n
CH3
CH2
O O
O O
C CO
OH OH
CH3
OH
OH OHCH CHCH2
(CH2)n
CH3
(CH2)n
CH3
CH2
O
O
O
O
O O
C CO
OH
OH
OH
O
CH3
CH3
A)
B)
C)
OO
O
OO H
O
O
O
O
OH
O
O
HNNH
NH
NH
NH
OH HN
H
N
avances y perspectivas de la biotecnología en la península de yucatán 215
Soforolípidos
Muchos biosurfactantes bacterianos han sido explorados, purificados y sus
estructuras han sido descritas; sin embargo, los biosurfactantes producidos
por hongos son menos conocidos. En este sentido se presta una mayor aten-
ción a los bisurfactantes producidos por diversas cepas de levaduras, ya que
son capaces de sintetizar biosurfactantes a gran escala, utilizando diferentes
sustratos como fuentes de carbono, justificando así el uso de levaduras para
procesos industriales económicos (Bhardwaj et al., 2013). Bajo este esquema
se ha observado que los soforolípidos son un grupo de glicolípidos producidos
por diversas especies de levaduras tales como Candida bombicola, Candida api-
cola, Candida bogoriensis y Yarrowia lipolytica. El estudio de estas moléculas se
describió por primera vez en 1961 como glicósidos de hidroxi–ácidos grasos
de soforosa, producidos por Torulopsis magnoliae (Gorin et al., 1961). Estos
metabolitos consisten de una cola de ácido graso hidrófobo de 16 o 18 átomos
de carbono y una cabeza hidrófila de hidratos de carbono conocida como so-
forosa. Una de sus grandes propiedades es que alcanza grandes rendimientos
cuando es producido a partir de levaduras. Se han descrito mayores rendi-
mientos (entre 120 y 40 g / l) de este tensioactivo fúngico, cuando la fuente de
carbono son residuos de ácidos grasos de sebo, grasa animal, glicerol y ácido
oleico, mientras que el extracto de levadura y urea se han usado como fuente
de nitrógeno (Bhardwaj, 2013).
Figura 2. Ruta bioquímica con algunos de los principales genes y
enzimas involucradas en la síntesis de mono– y di–ramnolípidos
en
Pseudomonas aeruginosa
. (Basado en Dusane
et al.
, 2010)
.
Biosíntesis de
ramnosa
Síntesis De Novo de
los Ácidos grasos
D–Glucosa
AlgC RhlG
RhlB
Rml A, B, C, D RhlA
RhlC
Ácidos grasos
D–Glucosa 1–P 3–Hidroxiacil–ACP
dTDP–L–Ramnosa HAA
LPS
Mono–ramnolípido
Biosíntesis de
ramnolípidos
Di–ramnolípido
216 ambiental
En los últimos años, los surfactantes producidos por microorganismos ma-
rinos, principalmente por bacterias marinas, han sido objeto de estudio de
diversos investigadores, particularmente por el uso potencial que tienen en
la biorremediación de mares contaminados con petróleo crudo (Maneerat,
2005). Los surfactantes bacterianos han recibido especial atención debido a
su alta diversidad de estructuras químicas, estabilidad en condiciones extre-
mas y su potencial de producción a gran escala. Una estrategia de escrutinio
eficiente es la clave del éxito en el descubrimiento de nuevas moléculas de
interés industrial y comercial. Hasta ahora se han desarrollado y aplicado
con éxito una amplia gama de métodos (limitados a un número manejable
de muestras) para el aislamiento de microorganismos productores de biosur-
factantes. La selección de nuevos biosurfactantes microbianos generalmente
consiste en tres sencillos pasos: muestreo, aislamiento de cepas e investi-
gación de cepas. En este contexto, se realizan ensayos tales como actividad
hemolítica, adhesión bacteriana a hidrocarburos, ensayo de colapso en gota,
ensayo de emulsión, medición de tensión superficial y ensayo de dispersión
de aceite para identificar eficazmente bacterias productoras de biosurfactan-
te y evaluar su eficacia (Satpute et al., 2008; Thavasi et al., 2011). También
se han implementado diferentes diseños experimentales con el objetivo de
mejorar la producción, tal es el caso de la metodología de superficie de res-
puesta (RSM, por sus siglas en inglés) que se ha utilizado para optimizar un
medio barato para la producción de liquenisina, un surfactante producido por
Bacillus licheniformis (Coronel–León et al., 2016).
En otro estudio llevado a cabo por Malavenda et al. (2015), se identifica-
ron biosurfactantes a partir de aislamientos bacterianos psicrotolerantes
provenientes de sedimentos del Ártico y la Antártida enriquecidos con hi-
drocarburos a una escala de microcosmos. En este trabajo los surfactantes
fueron caracterizados parcialmente a través de cromatografía de capa fina
revelando que la mayoría de los aislamientos seleccionados eran capaces
de producir tensioactivos glicolipídicos. Los autores reportaron, por primera
vez, que los surfactantes bacterianos podían ser aislados a partir de am-
bientes expuestos a bajas temperaturas, lo que refuerza la idea de que las
comunidades microbianas contenidas en dichos ambientes poseen un alto
potencial biotecnológico. Khemili–Talbi et al. (2015), por otra parte, des-
cribieron como la cepa C21 Natrialba sp., una arquea halófila extrema, fue
aislada de agua salina contaminada con petróleo en Ain Salah, Argelia. Esta
cepa resultó capaz de degradar compuestos aromáticos tales como fenol,
naftalefo y pireno, mientras crecía en condiciones salinas a través de la
Aislamiento de microorganismos marinos
productores de biosurfactantes mediante técnicas
de cultivo tradicionales
avances y perspectivas de la biotecnología en la península de yucatán 217
síntesis de algunas enzimas clave, incluyendo surfactantes. La producción
del biosurfactante durante el crecimiento de la cepa fue estimada midiendo
el índice de emulsificación E24 y la tensión superficial del medio de cultivo
libre de células.
Otro estudio realizado por da Silva et al. (2015) utilizó medio de agar sangre
para el aislamiento de bacterias productoras de biosurfactantes bajo concen-
traciones de alta salinidad de suelos que fueron colectados en la isla oceánica
brasileña Trindade. La producción de biosurfactantes se realizó mediante el
método oil–spreading. Bozo–Hurtado et al. (2012) caracterizaron biosurfactan-
tes de seis cepas bacterianas aisladas de muestras de agua de mar y sedimen-
tos provenientes del Atlántico Venezolano. Las concentraciones relativas del
surfactante fueron determinadas indirectamente midiendo la CMC y la tensión
superficial de cada sobrenadante libre de células recuperado del cultivo de las
diferentes cepas. De acuerdo con los resultados, los autores reportaron que los
organismos productores de biosurfactantes son comunes en ambientes que
no necesariamente han sido expuestos a derrames de petróleo y podrían ser
utilizados como herramientas potenciales en la biorremediación.
Todos los estudios mencionados anteriormente se basan en el aislamiento
de bacterias por métodos tradicionales de cultivo, los cuales siguen siendo la
herramienta más eficaz y potente para el descubrimiento de nuevas molécu-
las en microbiología; sin embargo, esto está limitado por el hecho de que la
gran mayoría de las bacterias son no–cultivables (Torsvik et al., 1996). Esta
limitante ha sesgado enormemente nuestro conocimiento sobre la diversidad
bacteriana y por lo tanto ha reducido la capacidad de descubrir y aprovechar
su potencial biotecnológico.
En la actualidad, se sabe que la proporción de tipos bacterianos cultiva-
bles en medios convencionales es apenas de 0.1 a 10% de la población
total contenida en una muestra ambiental (Torsvik y Øvreås 2002), lo que
conduce a una visión incompleta de la diversidad bacteriana y genética de
la misma. La incapacidad de poder cultivar en el laboratorio la mayoría de
los microorganismos ha restringido durante mucho tiempo la posibilidad
de utilizarlos y aprender acerca de ellos, sin embargo, con el surgimien-
to de la metagenómica esto podria cambiar. La metagenómica implica el
análisis genómico de microorganismos cultivables e incultivables mediante
extracción directa de material genético recuperado directamente de mues-
tras ambientales y su posterior análisis (Handelsman, 2004). El desarrollo
de este tipo de herramientas moleculares, así como los avances en las
Metagénomica como una nueva herramienta para el
descubrimiento de nuevos metabolitos de interés
218 ambiental
tecnologías de computación para el análisis de datos biológicos (bioinfor-
mática) han permitido comenzar a caracterizar desde un punto de vista
genómico estos microorganismos aún no cultivables. Ambos factores han
generado las condiciones necesarias para implementar los estudios de di-
versidad bacteriana de diferentes ambientes a partir del estudio masivo
del conjunto de genomas (metagenoma) de los microorganismos presentes
en dichas muestras, incluyendo aquéllos que no son cultivables en el labo-
ratorio (Handelsman, 2004). El análisis del metagenoma bacteriano por
técnicas moleculares y bioinformáticas ha evidenciado que algunos grupos
bacterianos no son fáciles de cultivar y que la diversidad de esta mayoría
no cultivable es muy amplia (Keller y Zengler, 2004), abriendo toda una
ventana de posibilidad para el descubrimiento de nuevos compuestos con
aplicaciones biotecnológicas.
Entre los métodos moleculares utilizados por la métagenómica destacan las téc-
nicas de reasociación del ADN, hibridación del ADN, tecnologías de clonación,
secuenciación y otros métodos basados en PCR. En cuanto al área de la bioin-
formática, ésta ha tenido una expansión notoria durante los últimos años y está
siendo aplicada en problemas que implican evaluar y entender la dispersión y
la variación los marcadores genéticos, tales como los procesos de ensamblaje
de metagenomas, predicción de genes, búsqueda de homologías, asignación
funcional, descripción de comunidades bacterianas, simulaciones y reconstruc-
ciones de rutas metabólicas, entre otros (De Filippo et al., 2012; Luscombe et
al., 2001). Hasta el momento, se han descrito metagenomas provenientes de
diversos ambientes incluyendo: ecosistemas acuáticos, minas, suelos agrícolas
y forestales, entre otros (Venter et al., 2004; Carbonetto et al., 2014; Ding et al.,
2015; Méndez–García et al., 2015). En algunos casos, se han aportado novedo-
sos aspectos de la ecología microbiana en un ecosistema en particular (Tyson et
al., 2004), mientras que en otros se han descubierto elementos genéticos que
podrían tener aplicación en la industria (Venter et al., 2004; Wang et al., 2000) o
en los procesos de biorremediación (Yergeau et al., 2012).
Actualmente, la metagenómica es una técnica muy poderosa que puede re-
solver tanto la composición filogenética, así como el potencial metabólico de
la comunidad bacteriana a través de dos caminos: el escrutinio basado en la
función y aquel basado en el análisis por secuencia. El escrutinio basado en
función requiere la creación de una biblioteca metagenómica que contenga
fragmentos del ADN total de la comunidad. Uno de los mayores desafíos
técnicos es la construcción de una biblioteca con suficiente cobertura del
metagenoma de la comunidad, y requiere un gran número de clonas; sin
embargo, es un enfoque poderoso con el potencial para descubrir nuevas
funciones de genes conocidos, al igual que nuevos genes, familias de genes
y, por tanto, sus correspondientes proteínas. Por otra parte, los enfoques
basados en secuencias usualmente implican el diseño y uso de cebadores de
avances y perspectivas de la biotecnología en la península de yucatán 219
PCR o sondas de hibridación para los genes de interés; por ejemplo, en un
estudio en el año 2004 se utilizó el locus sfp para la detección por PCR de
la producción de surfactina por B. amyloliquefaciens y B. circulans (Hsieh et
al., 2004). Del mismo modo, P. rugulosa NBRC 10877 también se identificó
como un nuevo productor de glicolípidos surfactantes basándose en el análi-
sis de secuencias de ADNr (Morita et al., 2006).
El ambiente marino es un vasto repertorio inexplorado de compuestos con
estructuras y actividades únicas con un alto valor industrial biotecnológico,
por lo que el análisis de grandes fragmentos secuenciados a partir de meta-
genomas es el enfoque más reciente que se ha utilizado en el descubrimiento
de genes en microorganismos marinos. El primer estudio de este tipo fue el
realizado a través de la secuenciación masiva de los genomas bacterianos en
muestras del Mar de los Sargazos (Venter et al., 2004), el cual concluyó en la
identificación de una gran cantidad de genes novedosos. En un esfuerzo por
conocer más a fondo la diversidad microbiana de nuestros océanos utilizando
herramientas como la metagenomica, se han iniciado proyectos en el ámbito
mundial como el TARA Oceans Expedition (Pesant et al., 2015) que es un es-
fuerzo sin precedentes en donde se obtuvieron alrededor de 35,000 muestras
que contenían millones de microorganismos (incluyendo bacterias) recolecta-
das en más de 150 estaciones oceánicas alrededor del mundo, elegidos por
su importancia climática o biodiversidad. Otro proyecto similar es el “Ocean
Samplig Day” (Kopf et al., 2015), incluido el proyecto Micro B3 el cual fue una
campaña de muestreo simultáneo de los océanos del mundo llevada a cabo
en el solsticio de verano (21 de junio) de los años 2014 – 2016.
En todos estos proyectos se aprovechan al máximo las tecnologías actuales
de secuenciación para explotar de manera eficiente la generación de datos a
gran escala con aplicaciones biotecnológicas. De esta manera, la secuencia-
ción metagenómica se está convirtiendo en una poderosa tecnología para el
descubrimiento de nuevos productos naturales a partir de la exploración del
material genético de los microorganismos presentes en una muestra, inclu-
yendo aquellos que no son cultivables. Actualmente, se cree que la metage-
nómica es una de las herramientas más prometedoras en la identificación de
genes de interés como los que codifican para la producción de enzimas tales
como: celulasas, lipasas, xilanasas, amilasas, proteasas y otras enzimas de
importancia industrial (Bashir et al., 2014), de tal forma que sin duda repre-
senta tambien una oportunidad para el escrutinio de nuevos biosurfactantes.
Los microorganismos marinos representan el mayor grupo de especies mari-
nas no descritas y tienen la capacidad de adaptarse a cambios en el ambiente,
tales como las variaciones en la presión, temperatura o pH, sustrato limitado
en aguas profundas y/o contaminación o presencia de algunos compuestos
como los hidrocarburos o metales pesados. Debido a estas características se
220 ambiental
ha establecido que los ambientes marinos son hábitats adecuados donde se
pueden encontrar bacterias productoras de biosurfactantes (Satpute et al.,
2010; Jackson et al., 2015). Con base en esto se espera que el número de
genes novedosos identificados con esta tecnología supere el número de genes
y metabolitos identificados a través de métodos dependientes de cultivo.
En los últimos años, los datos derivados de la secuenciación masiva del gen del
ARN ribosómico 16S condujeron al descubrimiento de una nueva diversidad
filogenética, con aparición de nuevos grupos taxonómicos no clasificados, que
reflejan microorganismos aún no descubiertos por los estudios previos (Pervin
et al., 2013). La secuenciación del ARN ribosómico 16S (16S ARNr) es un méto-
do común usado para identificar y comparar la diversidad bacteriana presente
en una muestra dada. Esta nueva forma de analizar nuestro entorno permite
estudiar la filogenia, la taxonomía y el potencial biotecnológico de las comuni-
dades bacterianas difíciles de estudiar (particularmente las no–cultivables), lo
que podría significar el descubrimiento de nuevas moléculas con ciertas propie-
dades físico–químicas las cuales tengan una aplicación industrial o ambiental.
A diferencia de los biosurfactantes identificados por técnicas de microbiología,
las herramientas metagenómicas permiten la detección de dichas moléculas a
partir del material genético, ya sea de cepas aisladas o extraído directamente
de las muestras ambientales.
El escrutinio del gen de surfactina en cepas marinas de diferentes especies de
Bacillus se realizó utilizando PCR. Este trabajo reveló la amplificación de los
fragmentos del gen sfp de seis especies diferentes de Bacillus aisladas de mues-
tras de sedimentos marinos. La metodología utilizada en este estudio resultó
ser útil para determinar la fiabilidad y facilidad de los métodos moleculares de
detección (Porob et al., 2013). Como lo pudieron corroborar Thies et al. (2014)
al desarrollar un método sencillo para la producción heteróloga del lipopéptido
biosurfactante serrawettin W1 (swrW), utilizando un gen que fue clonado y ex-
presado en Escherichia coli BL21 Gold obteniendo grandes resultados. Los auto-
res reportaron que el sistema de expresión descrito en su trabajo abre un nuevo
camino para la producción a escala industrial de este biosurfactante. Otro caso
es el presentado por el proyecto BioSurf que impulsan el desarrollo de nuevos
procesos rentables para la fabricación microbiana y enzimática de biosurfactan-
tes utilizando métodos de biología molecular. Los resultados obtenidos incluyen
la identificación de nuevos microorganismos patentables y la síntesis enzimática
de biosurfactantes con potencial de explotación económica (http://www.biosurf.
fraunhofer.de/). En un estudio más reciente, Thies et al. (2016) identificaron los
Identificación de biosurfactantes
a través del enfoque metagenómico
avances y perspectivas de la biotecnología en la península de yucatán 221
genes responsables de la actividad biosurfactante de clonas pertenecientes a
una biblioteca metagenómica construida a partir del ADN aislado de una biope-
lícula adherida a una superficie sólida en el drenaje de un matadero en Düren,
Alemania. Los autores reportaron que las clonas SA343 y SA354 producían
aproximadamente 65 mg de biosurfactante por cada litro de cultivo de E. Coli en
medio líquido. En este estudio los surfactantes fueron identificados a través de
la técnica de cromatografía en capa fina.
Actualmente, la gran demanda en el mercado y el creciente interés por los
biosurfactantes ha dado lugar a la publicación de varias patentes sobre estas
moléculas producidas por diferentes tipos de bacterias, incluyendo Bacillus,
Pseudomonas y Acinetobacter. Shete et al. (2006) presentaron una revisión del
esfuerzo por patentes otorgadas sobre estos compuestos; destacando los tipos
de microorganismos, las moléculas producidas, el proceso de producción y sus
potenciales aplicaciones industriales. La revisión incluye 35 patentes de Emul-
san, un complejo polisacárido extracelular que es uno de los emulsionantes
más eficientes usados en la remoción de petróleo (Chamanrokh et al., 2010),
30 patentes sobre bioemulsificantes y biosurfactantes producidos por los
miembros del género Bacillus y 29 de especies del género Pseudomonas y otras
80 patentes de biosurfactantes y bioemulsificantes de otros microorganismos.
Hoy en día es posible encontrar alrededor de 3150 resultados de “Patentes
de Biosurfactantes Bacterianos” usando Google Patent Search. Esta búsqueda
incluye métodos para controlar plagas utilizando biosurfactantes (US8680060
B2), producción microbiológica de nuevos biosurfactantes (US4355109 A,
WO2013110132 A1, EP 0401700 A2), tratamiento de infecciones microbianas
con agentes tensioactivos bacterianos (WO2002012271 A2), su producción
como emulsionantes oleosos (US 6060287 A), y su uso como tratamiento de
hábitats contaminados con hidrocarburos (US 8980619 B2).
Conclusiones
Los análisis metagenómicos han permitido la identificación de secuencias codi-
ficantes de proteínas, basándose en la homología de genes utilizando diversos
algoritmos de búsqueda de similitud como BLAST, COG y KEGG. Este mismo
principio podría ser utilizado en la identificación de nuevos biosurfactantes
(Jackson et al., 2015). Otros métodos de identificación aplicados al descubri-
miento de estas moléculas parten del escrutinio de bibliotecas metagenómicas
utilizando diferentes pruebas para su identificación, entre los que podemos
encontrar: El ensayo de la actividad hemolíticautilizando agar nutritivo suple-
mentado con 5% de sangre, siendo la lisis de las células de la sangre un indi-
cativo de la producción de biosurfactantes (Banat, 1993), o el ensayo de aceite
atomizado, donde un rocío fino de gotas de aceite es aplicado a la superficie
de placas de agar de manera que la producción de biosurfactantes puede ser
222 ambiental
observada instantáneamente en forma de halos alrededor de las colonias o
clonas metagenómicas productoras de dicho metabolito (Burch et al., 2010).
Sin duda alguna los ambientes marinos han demostrado ser el hogar de más
microorganismos que cualquier otro ambiente en la tierra y la adaptación de
los microorganismos a dichos cambios ambientales les ha llevado a obtener
una gran diversidad genética, en consecuencia, las bacterias marinas han re-
sultado ser una fuente atractiva de nuevos productos naturales con potencial
uso biotecnológico. A lo largo de los años, miles de nuevos compuestos han
sido aislados de fuentes marinas; sin embargo, la biodiversidad de las bac-
terias marinas no ha sido completamente explorada, dejando inaccesible su
potencial biotecnológico. Basados en métodos de cultivo, los microorganis-
mos han proporcionado compuestos con potencial para una gran variedad
de procesos industriales, sin embargo, se estima que a la tasa actual de cul-
tivo de nuevas moléculas (tales como bacterias productoras de antibióticos
potenciales) más de 107 aislados tendrán qué ser examinados para encon-
trar una nueva clase de molécula (Baltz, 2007). Con la ayuda de las nuevas
técnicas metagenómicas el escrutinio de genes novedosos puede realizarse
de una manera más eficiente en una comunidad microbiana completa.
La metagenómica marina nos ayudará no sólo a comprender las actividades de
los microorganismos marinos sino también a aplicar ese conocimiento en bene-
ficio tanto de la investigación básica como de las aplicaciones biotecnológicas.
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DNA derived from environmental samples is a rich source of novel bioactive molecules. The choice of the habitat to be sampled predefines the properties of the biomolecules to be discovered due to the physiological adaptation of the microbial community to the prevailing environmental conditions. We have constructed a metagenomic library in Escherichia coli DH10b with environmental DNA (eDNA) isolated from the microbial community of a slaughterhouse drain biofilm consisting mainly of species from the family Flavobacteriaceae. By functional screening of this library we have identified several lipases, proteases and two clones (SA343 and SA354) with biosurfactant and hemolytic activities. Sequence analysis of the respective eDNA fragments and subsequent structure homology modelling identified genes encoding putative N-acyl amino acid synthases with a unique two-domain organisation. The produced biosurfactants were identified by NMR spectroscopy as N-acyltyrosines with N-myristoyltyrosine as the predominant species. Critical micelle concentration and reduction of surface tension were similar to those of chemically synthesised N-myristoyltyrosine. Furthermore, we showed that the newly isolated N-acyltyrosines exhibit antibiotic activity against various bacteria. This is the first report describing the successful application of functional high-throughput screening assays for the identification of biosurfactant producing clones within a metagenomic library.
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Article
Quorum sensing (QS) has received significant attention in the past few decades. QS describes population density dependent cell to cell communication in bacteria using diffusible signal molecules. These signal molecules produced by bacterial cells, regulate various physiological processes important for social behavior and pathogenesis. One such process regulated by quorum sensing molecules is the production of a biosurfactant, rhamnolipid. Rhamnolipids are important microbially derived surface active agents produced by Pseudomonas spp. under the control of two interrelated quorum sensing systems; namely las and rhl. Rhamnolipids possess antibacterial, antifungal and antiviral properties. They are important in motility, cell to cell interactions, cellular differentiation and formation of water channels thatare characteristics of Pseudomonas biofilms. Rhamnolipids have biotechnological applications in the uptake of hydrophobic substrates, bioremediation of contaminated soils and polluted waters. Rhamnolipid biosurfactants are biodegradable as compared to chemical surfactants and hence are more preferred in environmental applications. In this review, we examine the biochemical and genetic mechanism of rhamnolipid production by P. aeruginosa and propose the application of QS signal molecules in enhancing the rhamnolipid production.
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Natrialba sp.strain C21 was isolated from oil contaminated saline water in Ain Salah (Algeria) and has exhibited a good potential for degrading phenol (3 % v/v), naphthalene (3 % v/v), and pyrene (3 % v/v) at high salinity with high growth, enzymatic activity and biosurfactant production. Successful metabolism of aromatic hydrocarbon compounds of the strain Natrialba sp. C21 appears to require the ortho-cleavage pathway. Indeed, assays of the key enzymes involved in the ring cleavage of catechol 1, 2-dioxygenase indicated that degradation of the phenol, naphthalene and pyrene by strain Natrialba sp.C21 was via the ortho-cleavage pathway. Cells grown on aromatic hydrocarbons displayed greater ortho-activities mainly towards catechol, while the meta-activity was very low. Besides, biosurfactants derived from the strain C21 were capable of effectively emulsifying both aromatic and aliphatic hydrocarbons and seem to be particularly promising since they have particular adaptations like the increased stability at high temperature and salinity conditions. This study clearly demonstrates for the first time that strain belonging to the genera Natrialbais able to grow at 25 % (w/v) NaCl, utilizing phenol, naphthalene, and pyrene as the sole carbon sources. The results suggest that the isolated halophilic archaeon could be a good candidate for the remediation process in extreme environments polluted by aromatic hydrocarbons. Moreover, the produced biosurfactant offers a multitude of interesting potential applications in various fields of biotechnology.
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Aims: Apply Response Surface Methodology (RSM) to develop and optimize an economical medium for lichenysin production, which is a surfactant produced by Bacillus licheniformis and evaluate the application of lichenysin in the prevention and disruption of pathogenic microorganism biofilm that creates health problems in the food industry and hospitals. Results: An economical medium containing molasses was optimized to enhance lichenysin production by response surface methodology (RSM). A production of 3.2 g l(-1) of lichenysin was achieved with an optimum medium containing 107.82 g l(-1) of molasses, 6.47 g l(-1) of NaNO3 and 9.7 g l(-1) of K2 HPO4 /KH2 PO4 , in which molasses and phosphate salts had a significant effect on biosurfactant production. Lichenysin was effectively applied in a surface pre-treatment to avoid microbial biofilm development of MRSA (68.73%) and Candida albicans (74.35%), with ED50 values of 8.3 and 17.2 μg ml(-1) , respectively. It was also very efficient in a surface post-treatment to remove biofilms of MRSA (55.74%) and Yersinia enterecolitica (51.51%), with an ED50 of 2.79 and 4.09 μg ml(-1) , respectively. Conclusions: Lichenysin was found to have notable anti-adhesion activity, being able to prevent and eliminate the biofilm formation by pathogenic strains associated with foodborne illness. This new medium resulted in a four-fold increase in production compared with the non-optimized medium. Significance and impact of study: Molasses can be regarded as a useful resource for biotechnological applications, such as the production of lichenysin. The use of agro-industrial substrates has an important role in the sustainable and competitive development of several industrial sectors, as well as in industrial residues management. Additionally, lichenysin is particularly effective in preventing biofilm formation by strains problematic for the food industry and in the hospital environment. Lichenysin also efficiently disrupts biofilm. This article is protected by copyright. All rights reserved.
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Ocean Sampling Day was initiated by the EU-funded Micro B3 (Marine Microbial Biodiversity, Bioinformatics, Biotechnology) project to obtain a snapshot of the marine microbial biodiversity and function of the world’s oceans. It is a simultaneous global mega-sequencing campaign aiming to generate the largest standardized microbial data set in a single day. This will be achievable only through the coordinated efforts of an Ocean Sampling Day Consortium, supportive partnerships and networks between sites. This commentary outlines the establishment, function and aims of the Consortium and describes our vision for a sustainable study of marine microbial communities and their embedded functional traits.
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The production of several virulence factors by Pseudomonas aeruginosa is controlled according to cell density through two quorum-sensing systems, las and rhl. The las system is comprised of the transcriptional activator protein LasR and of LasI, which directs the synthesis of the autoinducer PAI-1. Similarly, the rhl system consists of the transcriptional activator protein RhlR and of RhlI, which directs synthesis of the autoinducer PAI-2 (formerly referred to as factor 2). To study the interrelation between the two P. aeruginosa quorum-sensing systems, we fused a lacZ reporter gene to lasR, rhlR, and rhlA and monitored expression of these three genes under various conditions. Our data indicate that lasR and rhlR are expressed in a growth-dependent manner, with activation of each gene occurring during the last half of log-phase growth. We also show that the las quorum-sensing system controls the rhl quorum-sensing system in two ways. First, we found that LasR and PAI-1 activated rhlR transcription. Second, we showed that PAI-1 blocked PAI-2 from binding to RhlR, thereby inhibiting the expression of rhlA. Our data thus indicate that the las system exerts two levels of control on RhlR, transcriptional and posttranslational.
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• Actinomycetes are the main source of clinically important antibiotics, most of which are too complex to be synthesized by combinatorial chemistry. • Additional actinomycete-produced antibiotics likely could be discovered by subjecting soils and marine sediments to innovative enrichments and whole-cell screening methods. • Combinatorial biosynthesis methods can generate derivatives of complex antibiotics and other secondary metabolites that would be difficult to generate using medicinal chemistry. • Sequencing actinomycete genomes may provide insights useful in devising novel antimicrobial agents.
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Biosurfactants are the surface-active molecules synthesized by microorganisms. With the advantage of environmental compatibility, the demand for biosurfactants has been steadily increasing and may eventually replace their chemically synthesized counterparts. Marine biosurfactants produced by some marine microorganisms have been paid more attention, particularly for the bioremediation of the sea polluted by crude oil. This review describes screening of biosurfactant-producing microorganisms, the determination of biosurfactant activity as well as the recovery of marine surfactant. The uses of marine biosurfactants for bioremediation are also discussed.