THE IMPACT OF ASTAXANTHIN ON THE LEVEL OF DNA METHYLATION IN IRRADIATED IN VITRO HUMAN LYMPHOCYTES

Abstract

Objective:
To investigate an effect of astaxanthin on global DNA methylation in human peripheral blood lympho-cytes exposed to γ-radiation in vitro.

Methods:
Samples of whole blood were diluted with RPMI-1640 medium in proportion 1 : 10 and incubated at 37 °Cfor 3 h. Samples were exposed to γ-ray (emitter IBL-237C, dose-rate 2.34 Gy/min) in dose 1.0 Gy. Astaxanthin wasadded into culture medium in final concentrations 20.0 μg/ml before irradiation. The analysis of the global DNAmethylation state was carried out using modified method of neutral single-cell gel electrophoresis (Comet assay)after digestion with the methylation-sensitive endonuclease HpaII.

Results:
For every experiment the analysis of the frequency distribution of «comets» was carried out. The treatmentof non-irradiated and irradiated human peripheral blood lymphocytes with astaxanthin resulted to a statisticallysignificant (p < 0.05) shift of comet distribution with tendency to increasing level of DNA migration which indicatesincrease in the pool of cells with a reduced level of DNA methylation.

Conclusions:
It has been found that astaxanthin in concentration of 20.0 μg/ml reduced the levels of global DNAmethylation both in irradiated in vitro and native human lymphocytes. It suggests that astaxanthin has an effect onmechanisms of epigenetic regulation of gene expression.

Full text

235
EXPERIMENTAL
RESEARCH
ISSN 23048336. Проблеми радіаційної медицини та радіобіології = Problems of radiation medicine and radiobiology. 2018. Вип. 23.
УДК 579.253.2:614.876:616/008.841.5:678.48
Д. А. Курінний1✉, О. М. Демченко1, М. Г. Романенко2, С. Р. Рушковський2
1Державна установа «Національний науковий центр радіаційної медицини Національної академії
медичних наук України», вул. Мельникова, 53, м. Київ, 04050, Україна
2Навчальнонауковий центр «Інститут біології та медицини» Київського національного
університету імені Тараса Шевченка, вул. Володимирська, 64/13, м. Київ, 01601, Україна
ВПЛИВ АСТАКСАНТИНУ НА РІВЕНЬ МЕТИЛЮВАННЯ ДНК
В ОПРОМІНЕНИХ IN VITRO ЛІМФОЦИТАХ ЛЮДИНИ
Мета. Визначити вплив астаксантину на рівень глобального метилювання ДНК в опромінених
in vitro
лімфоци&
тах периферичної крові людини
Методи. Цільну кров додавали у культуральне середовище RPMI&1640 у співвідношенні 1 : 10 і витримували 3
години при 37 °С. Опромінювання γ&квантами здійснювали з використанням випромінювача IBL&237C (доза 1,0
Гр, потужність 2,34 Гр/хв). Астаксантин у кінцевій концентрації 20,0 мкг/мл додавали перед опроміненням.
Аналіз статусу глобального метилювання ДНК в лімфоцитах периферичної крові людини проводили за допомо&
гою модифікованого методу кометного електрофорезу (Сomet assay) в нейтральних умовах з використанням
чутливого до метилювання ферменту рестрикції HpaII.
Результати. Для кожного варіанту експерименту було проведено дослідження частотного розподілу «комет».
Додавання астаксантину до неопромінених і опромінених лімфоцитів людини призвело до статистично значу&
щого (
p
< 0,05) зсуву розподілів «комет» у напрямку збільшення виходу ДНК, що вказує на зростання пулу клітин
зі зниженим рівнем метилювання ДНК.
Висновки. Встановлено, що астаксантин в кінцевій концентрації 20,0 мкг/мл призводить до зниження рівня
глобального метилювання ДНК в опромінених
in vitro
та неопромінених лімфоцитах людини, що свідчить про йо&
го здатність впливати на епігенетичні механізми контролю генної експресії.
Ключові слова: астаксантин, лімфоцити периферичної крові людини, γ&опромінення, метилювання ДНК.
Проблеми радіаційної медицини та радіобіології. 2018. Вип. 23. C. 235–245. doi: 10.33145/2304_8336_2018_23_235_245.
✉Курінний Денис Аркадійович, email: kurinnyi.d@gmail.com

236
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ
ДОСЛІДЖЕННЯ ISSN 23048336. Проблеми радіаційної медицини та радіобіології = Problems of radiation medicine and radiobiology. 2018. Вип. 23.
D. A. Кurinnyi1✉, O. M. Demchenko1, M. G. Romanenko2, S. R. Rushkovsky2
1State institution «National Research Center for Radiation Medicine of the National Academy of Medical
Sciences of Ukraine», 53 Melnykova str., Kyiv, 04050, Ukraine
2Educational and Research Center «Institute of Biology and Medicine» Taras Shevchenko National
University of Kyiv, 64/13, Volodymyrska str., Kyiv, 01601, Ukraine
THE IMPACT OF ASTAXANTHIN ON THE LEVEL OF DNA METHY/
LATION IN IRRADIATED IN VITRO HUMAN LYMPHOCYTES
Objective. To investigate an effect of astaxanthin on global DNA methylation in human peripheral blood lympho&
cytes exposed to γ&radiation
in vitro
.
Methods. Samples of whole blood were diluted with RPMI&1640 medium in proportion 1 : 10 and incubated at 37 °C
for 3 h. Samples were exposed to γ&ray (emitter IBL&237C, dose&rate 2.34 Gy/min) in dose 1.0 Gy. Astaxanthin was
added into culture medium in final concentrations 20.0 μg/ml before irradiation. The analysis of the global DNA
methylation state was carried out using modified method of neutral single&cell gel electrophoresis (Comet assay)
after digestion with the methylation&sensitive endonuclease HpaII.
Results. For every experiment the analysis of the frequency distribution of «comets» was carried out. The treatment
of non&irradiated and irradiated human peripheral blood lymphocytes with astaxanthin resulted to a statistically
significant (
p
< 0.05) shift of comet distribution with tendency to increasing level of DNA migration which indicates
increase in the pool of cells with a reduced level of DNA methylation.
Conclusions. It has been found that astaxanthin in concentration of 20.0 μg/ml reduced the levels of global DNA
methylation both in irradiated
in vitro
and native human lymphocytes. It suggests that astaxanthin has an effect on
mechanisms of epigenetic regulation of gene expression.
Key words: astaxanthin, human peripheral blood lymphocytes, γ&irradiation, DNA methylation.
Problems of radiation medicine and radiobiology. 2018;23:235_245. doi: 10.33145/2304_8336_2018_23_235_245.
ВСТУП
Реалізація спадкової інформації залежить не тільки
від генотипу, але й від епігенетичних механізмів
контролю експресії генів [1]. Метилювання цитози
ну ДНК в 5му положенні відіграє центральну роль в
епігенетичних процесах [2, 3]. У випадку, якщо ме
тильовані сайти розташовані в промоторній ділянці
та першому екзоні – відбувається повне вимикання
генів [4]. Аномальні зміни інтенсивності метилю
вання ДНК тісно пов’язані з розвитком цілого ряду
хвороб, серед яких діабет ІІ типу, хвороби порушен
ня геномного імпринтингу (наприклад синдроми
Ангельмана, ПрадераВіллі, БеквітаВідемана), он
кологічні захворювання [5–9]. Для популяцій онкот
рансформованих клітин епігенетичні зміни у генах
супресорах чи протоонкогенах можуть бути більш
суттєвими і розповсюдженими, ніж мутації [10].
Іонізуюче випромінювання (ІВ) є потужним мута
генним фактором, під дією якого в клітині фор
мується весь спектр пошкоджень ДНК (одно та дво
ланцюгові розриви, хімічні модифікації основ,
зшивки ДНКДНК та ДНКбілок), які є причинами
точкових мутацій і геномних перебудов (структурних
та кількісних аномалій хромосом) [11–13]. Дані сто
INTRODUCTION
Realization of hereditary information is not sole
ly a function of genotype but depend on epige
netic regulation of gene expression [1]. DNA
methylation at the C5 position of cytosine plays
central role in epigenetic processes [2, 3]. If
methylation sites spread a promoter and first
exon the complete gene silencing occur [4].
Abnormal changes of DNA methylation are
closely associated with development of diseases,
such as type II diabetes, genomic imprinting dis
orders (PraderWilli syndrome, Angelman syn
drome, BeckwithWiedemann syndrome etc.)
and cancer [5–9]. For cancer cell populations
epigenetic alterations of tumor suppressor genes
or oncogenes may be more significant and pre
vailing than mutations [10].
Ionizing radiation (IR) is a powerful mutagen. It
causes the whole spectrum of DNA damages (sin
gle and doublestrand breaks, chemical modifica
tions of nitrogenous bases, DNADNA and DNA
protein crosslinks) which results in point mutations
and genomic rearrangements (structural and
numerical chromosomal abnormalities) [11–13].

237
EXPERIMENTAL
RESEARCH
The data concerning IRinduced delayed and
transgenerational genomic instability [14] and
radiation carcinogenesis [15] suggests that IR can
not only lead to severe genomic damages but to epi
genetic changes of gene expression. Exposure to IR
in vivo and in vitro causes global DNA hypomethy
lation in human peripheral blood lymphocytes
(PBL). The substantial fact is direct connection
between decrease in the level of DNA methylation
and growth of chromosomal instability [16].
To avoid negative influence of IR on cell genome
and epigenome the extensive search for new com
pounds, preferably of natural origin, that reduce
endpoints of primary and secondary radiation
processes. Moreover, these substances must have
low mutagenicity and toxicity.
Since 2015, we have started investigation of the
radioprotective effects of astaxanthin [17–20] – a
carotenoid of xanthophyll group, and one of the
most powerful, wellknown natural antioxidant
[21, 22]. According to results of our researches
and data of other scientific teams, astaxanthin per
se had no toxic and mutagenic activity [23–25].
In vitro experiments demonstrated that astaxan
thin significantly reduced the level of radiation
induced cytogenetic effects after irradiation of
human PBL at the G0phase of the cell cycle. It
was shown that the radioprotective action of
astaxanthin with the utmost probability may be
explained rather by stimulation of apoptosis in
population of heavily damaged cells than by its
antioxidant properties [26]. In addition, the acti
vation of cell cycle checkpoints after irradiation of
PBL cultures at the S phase was observed [20].
Hence we may suggest the influence of astaxan
thin on epigenetic processes that regulate the cell
cycle and apoptosis.
OBJECTIVE
The objective of our study was to investigate an
effect of astaxanthin on global DNA methylation
in human peripheral blood lymphocytes exposed
to γradiation (dose 1.0 Gy) in vitro.
MATERIAL AND METHODS
Blood samples were obtained by venepuncture from
four conditionally healthy volunteers (2 men and 2
women) at the age of 20–51 years old, average age
was 41 years. Only the persons, who denied any con
scious contact with wellknown or potential muta
genic agents, followed a healthy lifestyle were chosen
совно індукованої ІВ затриманої та трансгенератив
ної нестабільності геному [14] та радіаційного кан
церогенезу [15] свідчать, що окрім численних пору
шень геному ІВ призводить до епігенетичних змін
генної експресії. Дія ІВ in vivo та in vitro призводить
до зниження рівня глобального метилювання ДНК в
лімфоцитах периферичної крові (ЛПК) людини [16].
Важливим аспектом є відмічена пряма кореляція між
зниженням рівня метилювання і зростанням хромо
сомної нестабільності [16].
Для відвернення негативного впливу ІВ на геном та
епігеном клітин актуальним завданням залишається
пошук речовин, бажано природного походження, дія
яких зменшує наслідки реалізації первинних і вторин
них радіаційних процесів. При цьому їх власна токсич
ність та мутагенна активність мають бути низькими.
Починаючи з 2015 року нами проводяться дослід
ження радіопротекторних властивостей астаксантину
[17–20] – каротиноїду з групи ксантофілів, найбільш
потужного з відомих на сьогодні антиоксидантів при
родного походження [21, 22]. За результатами власних
досліджень та даними інших наукових груп, астаксан
тин відрізняється відсутністю токсичності та мутаген
ної активності [23–25]. В експериментах in vitro була
продемонстрована здатність астаксантину значно
зменшувати цитогенетичні ефекти іонізуючої радіації
при опроміненні ЛПК людини на стадії G0клітинного
циклу. Було показано, що найбільш вірогідно радіоп
ротекторний вплив астаксантину можна пояснити не
так його антиоксидантними властивостями, як акти
вацією процесів апоптозу в популяції сильно пошкод
жених клітин [26]. Крім того, було відмічено посилен
ня контролю на звірочних точках клітинного поділу
при опроміненні ЛПК на S стадії клітинного циклу
[20]. Виходячи з цього, можна припустити вплив астак
сантину на епігенетичні процеси, які регулюють
клітинний цикл та апоптоз.
МЕТА
Метою представленої роботи було визначення
впливу астаксантину на рівень глобального метилю
вання ДНК в опромінених in vitro в дозі 1,0 Гр ЛПК
людини.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ
Зразки венозної крові були отримані від чотирь
ох умовно здорових волонтерів (2 жінки, 2 чо
ловіка) віком 20–51 років, середній вік – 41 рік,
які заперечували свідомий контакт зі знаними
чи потенційними мутагенами (включаючи іо
нізуючу радіацію), вели здоровий спосіб життя.
ISSN 23048336. Проблеми радіаційної медицини та радіобіології = Problems of radiation medicine and radiobiology. 2018. Вип. 23.

for the investigation. All persons were involved in
research under conditions of informed consent.
The whole blood were diluted in RPMI1640
medium at the ratio 1:10. Some samples were
exposed to γray (dose 1 Gy, emitter IBL237C,
doserate 2.34 Gy/min). Astaxanthin (Sigma,
USA) was added into culture medium in final con
centrations 20.0 µg/m before irradiation. The
blood samples were incubated at 37 °C for 3 h.
The analysis of global DNA methylation in
peripheral blood lymphocytes was carried out using
a modified method of singlecell gel electrophore
sis (Comet assay) in neutral conditions using the
methylationsensitive endonuclease HpaII, which
recognition site corresponds to the unmethylated
DNA sequence of 5’CCGG3’ [27].
The lymphocytes were isolated by separation of
cells in a density gradient Histopaque 1077 (Sigma,
USA), according to instructions of the manufacturer.
The cell suspension was mixed with 1% lowmelting
point agarose (Sigma, USA) at 37 °C. Preparation of
microscopic slides and lysis of cells was carried out
according to the generally accepted method [28].
After the lysis, slides were washed by buffer com
posed of 5·103 М TrisHCl, 5·103 М NaCl, 5·104 М
βmercaptoethanol and 1·103 М Na2EDTA. Each
slide was then overlaid with enzyme mixture (1.5 U of
HpaI in 100 µl of Tango buffer (Fermentas)) and
incubated in a damp chamber at 37 °C for 55 min.
The reaction was stopped by washing in TBE buffer
(89 mM Trisborat, 2 mM EDTA, pH 7.5). Slides
238
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ
ДОСЛІДЖЕННЯ
Всі особи були залучені за умов поінформованої
згоди.
Цільну кров додавали у культуральне середовище
RPMI1640 у співвідношенні 1 : 10. Частина зразків
була опромінена γквантами (випромінювач IBL
237C, доза 1,0 Гр, потужність 2,34 Гр/хв). Астаксан
тин (Sigma, USA) у кінцевій концентрації 20 мкг/мл
додавали перед опроміненням. Зразки крові витри
мувались 3 години при 37 °С.
Аналіз статусу глобального метилювання ДНК в
ЛПК проводили з використанням модифікованого
методу гельелектрофорезу окремих клітин (Сomet
assay) в нейтральних умовах з використанням метил
чутливого ферменту рестрикції HpaII, сайти актив
ності якого відповідають неметильованій послідов
ності ДНК 5’CCGG3’ [27].
Виділення лімфоцитів у градієнті щільності
Histopaque 1077 (Sigma, USA) проводили згідно з
протоколом виробника. Отриману суспензію клітин
змішували з 1% легкоплавкою агарозою (Sigma,
USA) при 37 °С. Приготування слайдів та лізис клі
тин проводили за загальноприйнятою методикою
[28]. Після лізису скельця відмивали у буфері, який
складався з 5·103 М TrisHCl, 5·103 М NaCl, 5·104 М
βмеркаптоетанолу та 1·103 М Na2EDTA. Після цьо
го на слайди наносили розчин з ферментом рест
рикції (1,5 Од. HpaII у 100 мкл буфера Tango
(Fermentas)) та інкубували у вологій камері при 37 °C
протягом 55 хв. Реакцію зупиняли за допомогою бу
фера ТВЕ (89 мМ Trisborat, 2 мМ EDTA, pH 7,5),
після чого проводили електрофорез у ТВЕ буфері 7
ISSN 23048336. Проблеми радіаційної медицини та радіобіології = Problems of radiation medicine and radiobiology. 2018. Вип. 23.
Рисунок 1. Аналіз хвостових частин комет, після обробки рестриктазою HpaII, за допомогою OpenComet
Figure 1. Analysis of the comet tails after digestion with restriction enzyme HpaII using OpenComet

239
EXPERIMENTAL
RESEARCH
were electrophoresed 7 min. in TBE buffer at 4 °C,
voltage of 1 V/cm and amperage 200 mA.
To visualize the results, after electrophoresis,
slides without fixation were stained with 2 μg/ml of
DAPI (4’,6diamidino2phenylindole, Sigma,
USA). the slides were analyzed with a fluorescent
microscope Opton Axioskop (Zeiss, Germany),
connected with a Canon EOS 1000 D camera.
A total of 100 randomly chosen nucleoids
(«comets») on each slide were examined using
image processing program ImageJ (imagej.nih.gov)
with OpenComet plugin [29]. Tail moment (TM),
that bring together both the amount of DNA in the
«comet» tail and the length of the tail [30], was
chosen as a parameter to quantify the migration of
DNA into an agarose gel.
To estimate changes in global DNA methylation
we have studied the frequency distribution of indi
vidual cells depending on their TM value.
According to TM the sampling of «comets» from
all variants was divided into eleven groups from 20
(minimum excremental value of TM) to 260 (ma
ximum excremental value) with increment of 20. If
the value of TM was equal to the boundary index
then «comet» was referred to the next group.
Significance of differences between the data series
and trend of the distribution shift for TM values
was estimated by the ManWhitney criterion [31].
RESULTS AND DISCUSSION
The distribution of TM values after digestion of
nonirradiated human peripheral blood lympho
cytes (control) with restriction enzyme HpaII is
presented in Figure 2.
хв. при температурі 4 °С, напрузі 1 В/см і силі струму
у 200 mА.
Для візуалізації результатів слайди фарбували
DAPI (4’,6diamidino2phenylindole) в концентрації
2,0 мкг/мл відразу після електрофорезу без фіксації
слайдів. Аналіз результатів проводили під люмінесце
нтним мікроскопом Opton Axioskop (Zeiss, Germany),
до якого приєднували фотоапарат Canon D1000. З кож
ного слайду загалом було обраховано 100 випадково
обраних нуклеоїдів (т. з. «комет»). Зображення аналі
зували за допомогою програми ІmageJ (imagej.nih.gov)
з плагіном OpenComet [29]. Для кількісної оцінки
міграції ДНК в агарозний гель використовували по
казник Tail Moment (TM), який одночасно враховує
як кількість ДНК у хвостовій частині «комети», так і
довжину хвостової частини [30].
Для статистичного аналізу зміни рівня загального
метилювання ДНК нами було проведено досліджен
ня частотного розподілу окремих клітин залежно від
рівня ТМ. Загальна вибірка «комет», які зустрічались
в експерименті, була поділена на дванадцать груп за
значеннями ТМ, від 20 до 260 з кроком 20 (від
мінімального до максимального значення ТМ). Як
що значення ТМ дорівнювало граничному – «коме
ту» відносили до наступної групи. Достовірність
різниці між рядами даних та напрямом зсуву роз
поділу значень TM розраховували за критерієм Ма
наВітні [31].
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ
Розподіл за показником TM, який було зареєстрова
но після проведення обробки рестриктазою HpaII
неопромінених ЛПК людини (контроль), представ
лено на рис. 2.
ISSN 23048336. Проблеми радіаційної медицини та радіобіології = Problems of radiation medicine and radiobiology. 2018. Вип. 23.
Рисунок 2. Розподіл за показником TM після обробки рестриктазою HpaII неопромінених ЛПК людини
(контроль)
Figure 2. The distribution of TM values after digestion of non"irradiated cells (control) with HpaII

Analysis of the distribution, presented in Figure 2,
indicated that among nonirradiated PBL cells which
produced «comets» with TM values in the range of 20
to 80 were prevalent. It should be noted that «comets»
with a TM values from 160 (the last five groups) were
not detected. This result demonstrates the high level
of DNA methylation in intact cells and our findings
are consistent with the literature data [32, 33].
The treatment of nonirradiated human peripheral
blood lymphocytes with astaxanthin resulted to a sta
tistically significant (p< 0.05) shift of TM distribution
(Figure 3). There was a decrease in the frequency of
«comets» with TM 40 – < 60 and TM 60 – < 80.
Moreover, the «comets» with TM from 180 to 240,
which were not detected in the previous experiment,
were registered as well. The shift of the distribution
has statistically significant (p< 0.05) tendency to
increasing TM values. Considering that the growth of
the comet tail is due to the increase in the sites of
recognition of HpaII, the received data indicates the
presence of a cell population in which the astaxanthin
treatment reduces the level of methylation of DNA.
The distribution of TM values after irradiation of
lymphocytes in a dose of 1.0 Gy and further diges
tion with restriction enzyme is presented in Figure 4.
This distribution was statistically significantly dif
ferent from the control (p< 0,05) and the one
obtained after treatment with astaxanthin of non
exposed PBL (p< 0.05).
After irradiation of PBL, an increase in the number
of comets in the range of TM from 80 to 160 and a
decrease in the frequencies of cells in the first three
groups (TM range from 20 to 80) was observed. The
analysis of distribution changes showed a statistically
240
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ
ДОСЛІДЖЕННЯ
Аналіз розподілу, представлений на рисунку 2,
свідчить, що серед неопромінених ЛПК переважали
клітини, які формували комети із значеннями TМ в
межах від 20 до 80. Слід відзначити, що комет зі зна
ченням TМ від 160 (п’ять останніх груп) виявлено не
було. Отриманий результат свідчить про високий
рівень метилювання ДНК в інтактних клітинах, що
збігається з літературними даними [32, 33].
Додавання астаксантину до неопромінених ЛПК
людини призвело до статистично значущого (p< 0,05)
зсуву розподілу ТМ (рис. 3). Було зафіксовано зни
ження частот комет в групах з ТМ 40 – < 60 та з ТМ
60 – < 80. Також були зареєстровані комети з ТМ від
180 до 240, яких не було зафіксовано в попередньому
експерименті. Зсув розподілу у напрямку збільшен
ня значень ТМ виявився статистично достовірним
(p< 0,05). Оскільки зростання хвостової частини ко
мети є наслідком збільшення сайтів впізнавання
ферменту рестрикції HpaII, отриманий результат
свідчить про наявність популяції клітин, в яких до
давання астаксантину призвело до зниження рівня
метилювання ДНК.
Розподіл значень ТМ після опромінення лімфо
цитів в дозі 1,0 Гр та подальшої обробки фермен
тами рестрикції представлений на рис. 4. Даний
розподіл статистично достовірно відрізнявся як
від контрольного (p< 0,05), так і від отриманого піс
ля додавання астаксантину до неопромінених
ЛПК (p< 0,05).
Після опромінення ЛПК спостерігалось збільшен
ня числа комет в діапазоні ТМ від 80 до 160 та змен
шення частот клітин в перших трьох групах (діапа
зон ТМ від 20 до 80). Аналіз змін розподілу показав
статистично достовірне (p< 0,05) збільшення числа
ISSN 23048336. Проблеми радіаційної медицини та радіобіології = Problems of radiation medicine and radiobiology. 2018. Вип. 23.
Рисунок 3. Розподіл за показником ТМ після додавання астаксантину до неопромінених ЛПК людини
Figure 3. The distribution of the TM values after treatment of non"irradiated lymphocytes with astaxanthin

241
EXPERIMENTAL
RESEARCH
significant (p< 0.05) growth of comets with a high
level of TM compared both with untreated and trea
ted with astaxanthin nonirradiated lymphocytes.
It is known that γirradiation in a dose of 1.0 Gy
induces about 1000 singlestranded and up to 40
doublestranded DNA breaks per cell [34]. Based
on the data concerning the increase of TM after
irradiation [20] and taking account that HpaII is a
frequentcutter restriction enzyme, we can con
clude that distribution shift of TM after PBL irra
diation is evidently associated with decrease in the
level of global DNA methylation, which is consis
tent with the literature data [16] .
The treatment of PBL with astaxanthin and sub
sequent irradiation resulted to decrease in the num
ber of «comets» with TM from 20 to 80, whereas the
increase in the number of cells that formed comets
with TM from 80 to 160 was observed (Fig. 5).
Distribution of the TM values indicates a statistical
ly significant increase in the pool of irradiated cells
with a reduced level of DNA methylation compared
with the data obtained for PBL exposed to radiation
without astaxanthin treatment (p< 0.05).
The results of our study indicate that astaxan
thin causes an evident reduction in the level of
global DNA methylation in nonirradiated and
irradiated cells. It has been established that the
global DNA hypomethylation is a hallmark of
oncological transformation, which is associated
with activation of oncogenes and silencing, due to
locus specific hypermethylation, genes of sup
pressor tumors [10, 35]. However, according to
the data concerning astaxanthin properties, the
комет з високим рівнем ТМ, як по відношенню до
контролю, так і при додаванні астаксантину до не
опромінених лімфоцитів.
Відомо, що дія ІВ в дозі 1,0 Гр призводить до ви
никнення приблизно 1000 одноланцюгових та до 40
дволанцюгових розривів ДНК на клітину [34]. Спи
раючись на дані щодо збільшення ТМ після оп
ромінення [20] та враховуючи, що HpaII є дрібно
ріжучою рестриктазою, можемо дійти висновку, що
зсув розподілу ТМ після опромінення ЛПК вірогід
но пов’язаний саме зі зменшенням загального рівня
метилювання ДНК, що узгоджується з літературни
ми даними [16].
Обробка ЛПК астаксантином та подальше оп
ромінення призвело до зменшення чисельності ко
мет з ТМ від 20 до 80, натомість було зафіксовано
зростання частоти клітин, які формували комети з
ТМ від 80 до 160 (рис. 5). Розподіл за показником
ТМ вказує на статистично значуще збільшення пулу
опромінених клітин зі зниженим рівнем метилю
вання ДНК порівняно з даними, отриманими для
ЛПК, що зазнали дії радіації без додавання астак
сантину (p< 0,05).
Отримані результати дослідження свідчать, що ас
таксантин призводить до вірогідного зниження
рівня загального метилювання ДНК як в неоп
ромінених, так і в опромінених клітинах. Відомо,
що глобальне гіпометилювання ДНК є характер
ною ознакою онкологічної трансформації, що суп
роводжується активацією онкогенів і блокуванням,
за рахунок локусспецифічного гіперметилювання,
генів супресорів пухлин [10, 35]. Однак, при
дослідженні властивостей астаксантину, у кароти
ISSN 23048336. Проблеми радіаційної медицини та радіобіології = Problems of radiation medicine and radiobiology. 2018. Вип. 23.
Рисунок 4. Розподіл за показником ТМ після опромінення ЛПК в дозі 1,0 Гр та подальшої обробки
рестриктазою HpaII
Figure 4. The distribution of TM after PBL irradiation in a dose of 1.0 Gy and further digestion with HpaII

СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ
1. Weinhold B. Epigenetics: the science of change.
Environ. Health
Perspect.
2006. Vol. 114. P. 160–167.
2. Jin B., Li Ya., Robertson K. D. DNA methylation. Superior or subordinate
in the epigenetic hierarchy?
Genes Cancer.
2011. Vol. 2 (6). P. 607–617.
doi: 10.1177/1947601910393957
3. Moore L. D., Le T., Fan G. DNA methylation and its basic function.
Neuropsychopharmacology.
2013. Vol. 38. P. 23–38. doi: 10.1038/npp.
2012.112
REFERENCES
1. Weinhold B. Epigenetics: The Science of Change Environ Health
Perspect. 2006;114:160_7.
2. Jin B, Li Ya, Robertson KD. DNA methylation. Superior or sub_
ordinate in the epigenetic hierarchy? Genes Cancer. 2011;2(6):
607_17. doi: 10.1177/1947601910393957
3. Moore LD, Le T, Fan G. DNA methylation and its basic function.
Neuropsychopharmacology. 2013;38:23_38. doi: 10.1038/
npp.2012.112.
carcinogenic effect of the carotenoid was not
detected. On the contrary, astaxanthin heavily
inhibits proliferation and induces apoptosis in
cancer cells [36–39].
In view of apoptogenic properties of astaxanthin
against the cells with a sublethal level of genome
damage manifested when PBL cultures were irra
diated at the G0stage of the cell cycle [17] and the
absence of its carcinogenic action, it can be
assumed that astaxanthin ability to reduce the level
of DNA methylation is associated with additional
activation of genes that regulate processes of cell
division and cell death and are inactive due to
methylation. This assumption requires further
research.
CONCLUSION
Astaxanthin in concentration of 20.0 µg/ml reduced
the levels of global DNA methylation both in irradi
ated in vitro and native human lymphocytes. It sug
gests that astaxanthin has an effect on mechanisms
of epigenetic regulation of gene expression.
242
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ
ДОСЛІДЖЕННЯ
ноїду не було відмічено канцерогенної дії. Навпаки,
астаксантин активно інгібує проліферацію онкот
рансформованих клітин і активує в них процеси
апоптозу [36–39].
Зважаючи на апоптогенні властивості астаксанти
ну, які проявлялися при опроміненні культур ЛПК
на G0стадії клітинного циклу по відношенню до
клітин з сублетальним рівнем пошкоджень геному
[17], та відсутність у астаксантину канцерогенної дії,
можна припустити, що його здатність знижувати
рівень метилювання ДНК пов’язана з додатковою
активацію генів, які беруть участь в регуляції про
цесів клітинного поділу та клітинної загибелі і зна
ходяться в неактивному стані за рахунок метилюван
ня. Це припущення потребує подальшого вивчення.
ВИСНОВКИ
Астаксантин у концентрації 20,0 мкг/мл призводить
до зниження рівня глобального метилювання ДНК в
опромінених in vitro та неопромінених лімфоцитах
людини, що свідчить про його здатність впливати на
епігенетичні механізми контролю генної експресії.
ISSN 23048336. Проблеми радіаційної медицини та радіобіології = Problems of radiation medicine and radiobiology. 2018. Вип. 23.
Рисунок 5. Розподіл за показником TM після γ"опромінення ЛПК з попереднім додаванням астаксантину
та обробкою рестриктазою HpaII
Figure 5. The distribution of TM after γ"irradiation of PBL treated with astaxanthin and further digestion
with HpaII

243
EXPERIMENTAL
RESEARCH
ISSN 23048336. Проблеми радіаційної медицини та радіобіології = Problems of radiation medicine and radiobiology. 2018. Вип. 23.
4. DNA methylation of the first exon is tightly linked to transcriptional
silencing / F. Brenet, M. Moh, P. Funk et al.
PLoS One.
2011. Vol. 6(1).
P. e14524. doi: 10.1371/journal.pone.0014524.
5. Sharma S., Kelly T. K., Jones P. A. Epigenetics in cancer.
Carcinogenesis.
2010. Vol. 31. P. 27–36.
6. Li E., Beard C., Jaenisch R. Role for DNA methylation in genomic
imprinting.
Nature.
1993, Vol. 366. P. 362–365.
7. Zoghbi H. Y., Beaudet A. L. Epigenetics and human disease.
Cold
Spring Harb. Perspect. Biol.
2016. Vol. 8(2). P. a019497. doi: 10.1101/
cshperspect.a019497.
8. Epimutation and cancer: a new carcinogenic mechanism of Lynch syn_
drome (Review) / K. Banno, I. Kisu, M. Yanokura et al.
Int. J. Oncol.
2012. Vol. 41, no. 3. P. 793–797. doi:10.3892/ijo.2012.1528.
9. Novak K. Epigenetics changes in cancer cells: Highlights of the Ame_
rican Association for Cancer Research Special Conference on Chromatin,
Chromosomes, and Cancer Epigenetics, November 10_14, 2004;
Waikoloa, Hawaii.
Medscape General Medicine.
2004. Vol. 6(4). P. 17.
10. Simmons D. Epigenetic influences and disease.
Nature Education.
2008. Vol. 1(1). P. 6.
11. Obe G., Durante M. DNA double strand breaks and chromosomal
aberrations.
Cytogenet Genome Res.
2010. Vol. 28. P. 8–16. doi:
10.1159/000303328.
12. Turgeon M., Perry N., Poulogiannis G. DNA damage, repair, and can_
cer metabolism.
Front Oncol.
2018. Vol.8. P. 15. doi:10.3389/
fonc.2018.00015.
13. Lloyd D. C., Dolphin G. W. Radiation_induced chromosome damage
in human lymphocytes.
Br. J. Ind. Med.
1977. Vol. 34(4). P. 261_273.
14. Merrifield M., Kovalchuk O. Epigenetics in radiation biology: a new
research frontier.
Front. Genet.
2013; Vol. 4. P. a40. doi: 10.3389/
fgene.2013.00040.
15. Shah D. J., Sachs R. K., Wilson D. J. Radiation_induced cancer: a
modern view.
Br. J. Radiol.
2012. Vol. 1020. P. 1166–1173. doi:
10.1259/bjr/25026140.
16. Radiation_induced changes in DNA methylation and their relationship
to chromosome aberrations in nuclear power plant workers / Y. Lee, Y. J.
Kim, Y. J. Choi et al.
Int. J. Radiat. Biol.
2015. Vol. 91. P. 142–149.
17. Pilinska M. А., Кurinnyi D. А., Rushkovsky S. R., Dybska О. B.
Genoprotective properties of astaxanthin revealed by ionizing radiation
exposure in vitro on human peripheral blood lymphocytes.
Probl. Radiac.
Med. Radiobiol.
2016. Vol. 21. P. 141–148.
18. Kurinnyi D. А., Rushkovsky S. R., Dybska O. B., Dubrovina G. V.,
Pilinska M. А. Astaxanthin modifies clastogenic effects of ionizing radiation
in vitro in peripheral blood lymphocytes of the persons recovered from
acute radiation sickness.
Exp. Onc.
2016. Vol. 38, no. 4. P. 280–282.
19. Kurinnyi D. А., Rushkovsky S. R., Demchenko O. M., Pilinska M. А.
Study the impact of astaxanthin on developing of genomic instability in
human peripheral blood lymphocytes irradiated in vitro on G2 phase of
cell cycle.
Probl. Radiac. Med. Radiobiol.
2017. Vol. 22. P. 208–216.
20. Kurinnyi D. А., Rushkovsky S. R., Demchenko O. M., Pilinska M.
А. Peculiarities of modification by astaxanthin the radiation_induced
damages in the genome of human blood lymphocytes exposed in vitro
4. Brenet F, Moh M, Funk P, Feierstein E, Viale AJ, Socci ND,
Scandura JM. DNA methylation of the first exon is tightly linked to
transcriptional silencing. PLoS One. 2011;6(1):e14524. doi:
10.1371/journal.pone.0014524.
5. Sharma S, Kelly TK, Jones PA. Epigenetics in cancer.
Carcinogenesis 2010;31:27_36.
6. Li E, Beard C, Jaenisch R. Role for DNA methylation in genomic
imprinting. Nature. 1993;366:362_5.
7. Zoghbi HY, Beaudet AL. Epigenetics and human disease. Cold
Spring Harb Perspect Biol. 2016;8(2):a019497. doi: 10.1101/csh_
perspect.a019497.
8. Banno K, Kisu I, Yanokura M, Tsuji K, Masuda K, Ueki A, et al.
Epimutation and cancer: a new carcinogenic mechanism of Lynch
syndrome (Review). Int J Oncol. 2012;41(3):793_7. doi:10.3892/
ijo.2012.1528. PMC 3582986. PMID 22735547.
9. Novak K. Epigenetics changes in cancer cells: highlights of the
American Association for Cancer Research Special Conference on
Chromatin, Chromosomes, and Cancer Epigenetics. Medscape
General Medicine. 2004;6(4):17. doi:10.3892/ijo.2012.1528.
10. Simmons D. Epigenetic influences and disease. Nature
Education. 2008;1(1):6.
11. Obe G, Durante M. DNA double strand breaks and chromosomal
aberrations. Cytogenet Genome Res. 2010;28:8_16. doi: 10.1159/
000303328.
12. Turgeon M, Perry N, Poulogiannis G. DNA damage, repair, and
cancer metabolism. Front Oncol. 2018;8:15. doi:10.3389/
fonc.2018.00015.
13. Lloyd DC, Dolphin G. W. Radiation_induced chromosome dam_
age in human lymphocytes. Br J Ind Med. 1977;34(4):261_73.
14. Merrifield M., Kovalchuk O. Epigenetics in radiation biology: a
new research frontier. Front Genet. 2013;4:a 40. doi: 10.3389/
fgene.2013.00040.
15. Shah DJ, Sachs RK, Wilson DJ. Radiation_induced cancer: a
modern view. Br J Radiol. 2012;1020:1166_73. doi: 10.1259/
bjr/25026140.
16. Lee Y, Kim YJ, Choi YJ, Lee JW, Lee S, Cho YH, et al. Radiation_
induced changes in DNA methylation and their relationship to chro_
mosome aberrations in nuclear power plant workers. Int J Radiat
Biol. 2015;91:142_9. doi: 10.3389/fgene.2013.00040.
17. Pilinska MА, Кurinnyi DА, Rushkovsky SR, Dybska ОB.
Genoprotective properties of astaxanthin revealed by ionizing radia_
tion exposure in vitro on human peripheral blood lymphocytes. Probl
Radiac Med Radiobiol. 2016;21:141_8.
18. Kurinnyi DА, Rushkovsky SR, Dybska OB, Dubrovina GV, Pilinska
MА. Astaxanthin modifies clastogenic effects of ionizing radiation in
vitro in peripheral blood lymphocytes of the persons recovered from
acute radiation sickness. Exp Onc. 2016;38(4):280_2.
19. Kurinnyi DА, Rushkovsky SR, Demchenko OM, Pilinska MА.
Study the impact of astaxanthin on developing of genomic instability
in human peripheral blood lymphocytes irradiated in vitro on G2
phase of cell cycle. Probl Radiac Med Radiobiol. 2017;22:208_16.

20. Kurinnyi DА, Rushkovsky SR, Demchenko OM, Pilinska MА.
Peculiarities of modification by astaxanthin the radiation_induced
damages in the genome of human blood lymphocytes exposed in
vitro on different stages of the mitotic cycle. Cytol Genet.
2018;52(1):40_5.
21. Ambati RR, Phang SM, Ravi S, Aswathanarayana RG.
Astaxanthin: sources, extraction, stability, biological activities and
its commercial applications. Mar Drugs. 2014;12(1):128_52. doi:
10.3390/md12010128.
22. Hama S, Uenishi S, Yamada A, Ohgita T, Tsuchiya H,
Yamashita E, et al. Scavenging of hydroxyl radicals in aqueous
solution by astaxanthin encapsulated in liposomes. Biol Pharm
Bull. 2012;35:2238_42.
23. Stewart J, Lignell A, Pettersson A, Elfving E, Soni G. Safety
assessment of astaxanthin _ rich microalgae biomass: Acute and
subchronic toxicity studies in rats. Food Chem Toxicol.
2008;46(9):3030_6. doi: 10.1016/j.fct.2008.05.038.
24. Tago Y, Fujii T, Wada J, Kato M, Wei M, Wanibuchi H, et al.
Genotoxicity and subacute toxicity studies of a new astaxanthin_
containing Phaffia rhodozyma extract. J Toxicol Sci.
2014;39(3):373_82.
25. Kurinnyi DА, Kostikov IYu. Co_cultivation of unicellular green
algae (Chlorophyta, Chlorophyceae) and human peripheral blood
lymphocytes as a test system for radiobiological studies. Int J
Algae. 2017, Vol. 19,no. 2, P. 163_172. doi.org/10.15407/
alg27.02.215.
26. Кurinnyi DА, Rushkovsky SR, Demchenko OM, Pilinska MА.
Radioprotective properties of astaxanthin: The Impact on radiation
induced chromosomal aberrations and DNA breaks in human lym_
phocytes in vitro. In: Reeve T., editor. Ionizing radiation. Advances
in research and applications. NY: Nova science publishers; 2018.
p. 221_40.
27. Lewies A, Van Dyk E, Wentzel JF, Pretorius PJ. Using a medi_
um_throughput comet assay to evaluate the global DNA methyla_
tion status of single cells. Front Genet. 2014;5(215):1_6. doi:
10.3389/fgene.2014.00215.
28. Olive PL, Banath JP. Heterogeneity in radiation_induced DNA
damage and repair in tumor and normal cells measured using the
«comet» assay. Radiat Res. 2012;178:35_42.
29. Gyori BM, Venkatachalam G, Thiagarajan PS, Hsu D, Clement
M. OpenComet: An automated tool for comet assay image analy_
sis. Redox Biology. 2014;2:457_65.
30. Lee E, Oh E, Lee J, Sul D, Lee J. Use of the tail moment of the
lymphocytes to evaluate DNA damage in human biomonitoring
studies. Toxicol Sci. 2004;81:121_32.
31. Azqueta A, Langie S, Collins A, editors. 30 years of the Comet
Assay: an overview with some new insights. Frontiers; 2007. 560 р.
32. Rosner B. Fundamentals of biostatistics. 8th ed. Cengage
Learning; 2015. 962 p.
33. Ehrlich M, Gama Sosa MA, Huang L_H, Midgett RM, Kuo KC,
McCune RA, Gehrke C. Amount and distribution of 5_methylcyto_
on different stages of the mitotic cycle.
Cytol. Genet.
2018. Vol. 52, no. 1.
P. 40–45.
21. Ambati R. R., Phang S. M., Ravi S., Aswathanarayana R. G. Astaxanthin:
sources, extraction, stability, biological activities and its commercial appli_
cations.
Mar. Drugs.
2014. Vol. 12, no. 1. P. 128–152. doi: 10.3390/
md12010128.
22. Scavenging of hydroxyl radicals in aqueous solution by astaxanthin
encapsulated in liposomes / S. Hama, S. Uenishi, A. Yamada et al.
Biol.
Pharm. Bull.
2012. Vol. 35. P. 2238–2242.
23. Safety assessment of astaxanthin _ rich microalgae biomass: Acute and
subchronic toxicity studies in rats / J. Stewart, A. Lignell, A. Pettersson et
al.
Food Chem. Toxicol.
2008. Vol. 46, no. 9. P. 3030–3036. doi: 10.1016/
j.fct.2008.05.038.
24. Genotoxicity and subacute toxicity studies of a new astaxanthin_contain_
ing Phaffia rhodozyma extract / Y. Tago, T. Fujii, J. Wada et al.
J. Toxicol.
Sci.
2014. Vol. 39, no. 3. P. 373–382.
25. Kurinnyi D. А, Kostikov I. Yu. Co_cultivation of unicellular green algae
(Chlorophyta, Chlorophyceae) and human peripheral blood lymphocytes as
a test system for radiobiological studies.
Int. J. Algae.
2017. Vol. 19, no. 2.
P. 163–172. doi.org/10.15407/alg27.02.215.
26. Кurinnyi D. А., Rushkovsky S. R., Demchenko O. M., Pilinska M. А.
Radioprotective properties of astaxanthin: The Impact on radiation induced
chromosomal aberrations and DNA breaks in human lymphocytes in vitro.
Ionizing radiation. Advances in research and applications/ ed. by T. Reeve.
NY : Nova science publishers, 2018. P. 221–240.
27. Lewies A., Van Dyk E., Wentzel J. F., Pretorius P. J. Using a medium_
throughput comet assay to evaluate the global DNA methylation status of
single cells.
Front. Genet.
2014. Vol. 5, no. 215. P. 1–6. doi:
10.3389/fgene.2014.00215.
28. Olive P. L., Banath J. P. Heterogeneity in radiation_induced DNA dam_
age and repair in tumor and normal cells measured using the «comet»
assay.
Radiat. Res.
2012. Vol. 178. P. 35–42.
29. Open Comet: An automated tool for comet assay image analysis / B. M.
Gyori, G. Venkatachalam, P. S. Thiagarajanet al.
Redox Biology.
2014. Vol.
2. P. 457–465.
30. Use of the tail moment of the lymphocytes to evaluate DNA damage in
human biomonitoring studies / E. Lee, E. Oh, J. Lee et al.
Toxicol Sci.
2004.
Vol. 81. P. 121–132.
31. 30 years of the Comet Assay: an overview with some new insights / ed.
by A. Azqueta, S. Langie, A. Collins. Frontiers, 2007. 560 р.
32. Rosner B. Fundamentals of biostatistics. 8th ed. Cengage Learning,
2015. 962 p.
33. Amount and distribution of 5_methylcytosine in human DNA from differ_
ent types of tissues or cells / M. Ehrlich, M.A. Gama Sosa, L._H. Huang et
al.
Nucleic Acids Res.
1982. Vol. 10. P. 2709–2721. doi:10.1093/nar/
10.8.2709.
34. Human DNA methylomes at base resolution show widespread epige_
nomic differences / R. Lister, M. Pelizzola, R. Dowen et al.
Nature.
2009.
Vol. 462, no. 7271. P. 315–322. doi: 10.1038/nature08514. PMC 2857523.
35. Ahnstrom G., Erixon K. Measurement of strand breaks by alkaline
denaturation and hydroxyapatite chromatography, in DNA Repair. A labora_
244
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ
ДОСЛІДЖЕННЯ ISSN 23048336. Проблеми радіаційної медицини та радіобіології = Problems of radiation medicine and radiobiology. 2018. Вип. 23.

245
EXPERIMENTAL
RESEARCH
ISSN 23048336. Проблеми радіаційної медицини та радіобіології = Problems of radiation medicine and radiobiology. 2018. Вип. 23.
Стаття надійшла до редакції 16.07.2018 Received: 16.07.2018
sine in human DNA from different types of tissues or cells. Nucleic
Acids Res. 1982;10:2709_21. doi:10.1093/nar/10.8.2709.PMC
320645.
34. Lister R, Pelizzola M, Dowen R, Hawkins RD, Hon Gary, Tonti_
Filippini J, et al. Human DNA methylomes at base resolution show
widespread epigenomic differences. Nature. 2009;462(7271):
315_22. doi:10.1038/nature08514.
35. Ahnstrom G, Erixon K. Measurement of strand breaks by alka_
line denaturation and hydroxyapatite chromatography, in DNA
Repair. In: Friedberg EC, Hanawalt PC, editors. A laboratory man_
ual of research procedures. New York, NY: Marcel Dekker; 1981.
p. 403_18.
36. Kulis M, Esteller M. DNA methylation and cancer. Adv Genet.
2010;70:27_56. doi: 10.1016/B978_0_12_380866_0.60002_2.
37. Zhang L, Wang H. Multiple mechanisms of anti_cancer effects
exerted by astaxanthin. Mar Drugs. 2015;13:4310_30.
doi:10.3390/md13074310.
38. Glasauer A, Chandel NS. Targeting antioxidants for cancer
therapy. Biochem Pharmacol. 2014;92:90_101.
39. Zhang X, Zhao WE, Hu L, Zhao L, Huang J. Carotenoids inhib_
it proliferation and regulate expression of peroxisome proliferators_
activated receptor gamma (PPARgamma) in K562 cancer cells.
Arch Biochem Biophys. 2011;512:96_106.
40. Kowshik J, Baba AB, Giri H, Deepak RG, Dixit M, Nagini S.
Astaxanthin inhibits JAK/STAT_3 signaling to abrogate cell prolifer_
ation, invasion and angiogenesis in a hamster model of oral can_
cer. PLoS One. 2014;9:e109114. doi: 10.1371/journal.pone.
0109114. eCollection 2014.
tory manual of research procedures / ed. by E. C. Friedberg, P. C.
Hanawalt. New York, NY : Marcel Dekker. 1981. P. 403_418.
36. Kulis M., Esteller M. DNA methylation and cancer.
Adv. Genet.
2010.
Vol. 70. P. 27–56. doi: 10.1016/B978_0_12_380866_0.60002_2.
37. Zhang L., Wang H. Multiple mechanisms of anti_cancer effects exerted
by astaxanthin.
Mar. Drugs.
2015. Vol. 13. P. 4310–4330. doi:10.3390/
md13074310.
38. Glasauer A., Chandel N. S. Targeting antioxidants for cancer therapy.
Biochem. Pharmacol.
2014. Vol. 92. P. 90–101.
39. Carotenoids inhibit proliferation and regulate expression of peroxisome
proliferators_activated receptor gamma (PPARgamma) in K562 cancer cells
/ X. Zhang, W. E. Zhao, L. Hu et al.
Arch. Biochem. Biophys.
2011. Vol.
512. P. 96–106.
40. Astaxanthin inhibits JAK/STAT_3 signaling to abrogate cell proliferation,
invasion and angiogenesis in a hamster model of oral cancer / J. Kowshik,
A. B. Baba, H. Giri et al.
PLoS One.
2014. Vol. 9. P. e109114. doi:
10.1371/journal.pone.0109114. eCollection 2014.