Available via license: CC BY
Content may be subject to copyright.
МИКРОБИОЛОГИЯ
29
Развитие микроскопии уже произвело револю-
цию в мире клеточной и молекулярной биологии
и остается важнейшей предпосылкой ее будущих
открытий.
Применение электронной микроскопии в био-
логии существенно изменило и углубило прежние
представления о тонкой структуре клетки и ее вне-
клеточных компонентов, что способствовало до-
полнительному пониманию ее функциональных
особенностей.
Визуализация биологических объектов является,
по-видимому, наиболее сложной задачей для микро-
скопии любого типа. Это связано со специфически-
ми особенностями биообъекта: малыми размерами,
сложным рельефом поверхности, прозрачностью,
мягкостью и легкой повреждаемостью при иссле-
дованиях. Возможность проведения структурно-
функционального анализа клеток неразрывно связана
с изобретением и дальнейшим усовершенствованием
световых, электронных и зондовых микроскопов [1,
3–5, 15, 16]. Такая необходимость вызвана стремле-
нием ученых в более полном понимании механизмов
сложных пространственных процессов и происходя-
щих в клетке на ультраструктурном уровне (менее
100 нм). Более того, появилась возможность изучения
биообъектов в трехмерном – 3D изображении с высо-
ким пространственным разрешением (0,2–0,5 нм).
Получение объемной информации на ультра-
структурном уровне существенно расширяет воз-
можность традиционных подходов при изучении
микромира, а именно:
- позволяет получать новую информацию об
объекте исследования – анализировать и хранить
информацию о форме, рельефе поверхности и про-
странственных параметрах клетки в ее трехмерной
субмикроскопической морфологии [2, 3, 6];
- осуществлять моделирование микрообъектов с
сохранением их истинных размеров и форм [2, 10];
- проводить компьютерную видовую диагности-
ку в трехмерном режиме [6, 12, 22, 29];
- накапливать информацию об их нативной ар-
хитектонике и биоразнообразии [8, 9, 14, 16] .
Наиболее часто применяются следующие типы
микроскопии, которые позволяют изучать и визуали-
зировать ультраструктуру биологических объектов в
трехмерном изображении с высоким пространствен-
ным разрешением:
- трансмиссионная (просвечивающая) электрон-
ная микроскопия – ТЭМ;
- растровая (сканирующая) электронная микро-
скопия – РЭМ;
- сканирующая зондовая микроскопия – СЗМ,
включающая сканирующую туннельную микроско-
пию – СТМ, атомно-силовую микроскопию – АСМ,
сканирующую оптическую микроскопию ближнего
поля – СОМБП;
- лазерная сканирующая конфокальная микро-
скопия – ЛСКМ;
УДК 537.533.35
Н.П.Коннов, Ю.П.Волков, О.С.Кузнецов
СОВРЕМЕННЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИЗУЧЕНИЯ
ТРЕХМЕРНОЙ (3D) УЛЬТРАТОНКОЙ СТРУКТУРЫ
И ВИЗУАЛИЗАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Представлен обобщенный обзор литературных данных по современным приборным подходам изучения про-
странственной (3D) субмикроскопической организации биологических объектов с высоким пространственным
разрешением.
Возможности приборной визуализации и анализа трехмерного биообъекта в значительной мере способствуют
более полной характеристике его структурно-функциональных свойств.
Ключевые слова: трансмиссионная, растровая электронная микроскопия, сканирующая зондовая, конфокаль-
ная микроскопия, рентгеновская, цифровая голографическая микроскопия.
N.P.Konnov, Yu.P.Volkov, O.S.Kuznetsov
Modern Technologies for Examination of Three-Dimensional (3-D) Ultra-Fine Structure
and Visualization of Microorganisms
Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”, Saratov
Outlined is a review of the literature data on the modern technologies for examination of the spatial (3-D) submicroscopic struc-
tural arrangement of biological objects with a high spatial resolution.
Capacities of the instrumental visualization and analysis of a three-dimensional biological object signicantly facilitate the overall
characterization of its structural-functional properties.
Key words: transmission, raster electronic microscopy, scanning probe, confocal microscopy, X-ray, digital holographic
microscopy.
Проблемы особо опасных инфекций, вып. 112, 2012
30
- рентгеновская микроскопия – РМ;
- цифровая голографическая микроскопия –
ЦГМ.
Каждый из указанных выше микроскопов имеет
как преимущества, так и определенные недостатки.
Трансмиссионная электронная микроскопия
Этот вид микроскопии более известен, чем дру-
гие. В общих чертах ТЭМ очень напоминает свето-
вой микроскоп (рис. 1, А).
Источником освещения в ТЭМ является нить
катода, излучающего электроны. Для формирова-
ния когерентного пучка электронов между катодом
и анодом прикладывается ускоряющее напряжение
(порядка 50–150 кВ) в условиях высокого вакуума. В
качестве линз используются электромагниты, кото-
рые фокусируют электронный луч. Изучаемый объ-
ект через воздушный шлюз помещают в вакуум, где
он попадает под сфокусированный пучок электро-
нов. Часть электронов, которые проходят через об-
разец, рассеиваются (в зависимости от плотности ве-
щества в данном месте), а остальные фокусируются
и образуют изображения, которые просматриваются
на флуоресцентном экране и фиксируются на фото-
пленке (рис. 1, Б).
С помощью ТЭМ можно получать сведения о
трехмерной структуре клеток. Известно, что в ТЭМ
изображения представляют собой проекцию на пло-
скость структуры заметной толщины. Проекции и
сечения этих структур описываются двумерными
функциями оптической плотности. Дальнейший путь
исследования может состоять в анализе изображе-
ния, ограничивающемся плоскими представлениями
о пространственной структуре, либо в определении
некоторых количественных характеристик трехмер-
ной структуры по имеющемуся в наличии набору
плоских картин [2, 3, 22, 32, 34]. Набрав достаточное
количество таких изображений клеточной структу-
ры, строят ее объемную пространственную модель с
помощью компьютерных программ [6, 20 ,22, 32].
Разрешающая способность ТЭМ для биологиче-
ских объектов составляет 0,5–1 нм. Основной недо-
статок – наличие высокого вакуума и тепловое воз-
действие пучка электронов на объект.
Растровая (сканирующая) электронная ми-
кроскопия
РЭМ является прибором, позволяющим полу-
чать обширную информацию от изображения, созда-
ваемого взаимодействием между исследуемым образ-
цом и электронным зондом [9, 12, 21, 30]. Растровый
электронный микроскоп основан на использовании
предварительно сформированного тонкого электрон-
ного луча (зонда), положением которого управляют с
помощью электромагнитных полей. Это управление
(сканирование) во многом аналогично процессу раз-
вертки в телевизионных кинескопах. Исследуемый
образец, в условиях высокого вакуума, сканирует-
ся сфокусированным электронным пучком средних
энергий (рис. 1, В). В зависимости от механизма ре-
гистрирования сигнала различают несколько режи-
мов работы РЭМ: отраженных электронов, вторич-
ных электронов, катодолюминесценции, рентгенов-
ского излучения и др. Разработанные методики по-
зволяют исследовать не только свойства поверхности
образца, но получать и визуализировать информацию
о поверхностных структурах и, по мере надобности,
проводить элементный анализ на микроучастке ис-
следуемого объекта [5, 7, 12].
Одним из основных преимуществ растрового
электронного микроскопа является большая глубина
резкости.
При подготовке биологических препаратов для
РЭМ требуются определенные методические прие-
мы – образец должен быть токопроводящим. Для это-
го в условиях высокого вакуума (в вакуумном посту)
образец оттеняется (напыляется) высокоочищенны-
ми тяжелыми металлами (золото, платина, палладий
и их сплавы). В результате изучаемые объекты, по-
казанные с помощью РЭМ, выглядят трехмерными.
При этом разрешающаяся способность для биологи-
ческих объектов составляет от 10 до 20 нм.
Рис. 1. Схема основных узлов
светового микроскопа (А)
и электронных микроскопов:
просвечивающего (Б) и сканирующего (В)
МИКРОБИОЛОГИЯ
31
Растровая электронная микроскопия признана
классическим методом изучения пространственных
объектов биологической природы и прекрасно себя
зарекомендовала на практике.
Сканирующая зондовая (туннельная, атомно-
силовая, оптическая ближнего поля) микроскопия
Принципиально новые возможности открылись
благодаря созданию в начале 1980-х годов различных
сканирующих зондовых микроскопов, к основным
типам которых относятся: сканирующий туннельный
микроскоп (СТМ), позволяющий исследовать прово-
дящие объекты [11, 13, 18], сканирующий силовой
микроскоп (ССМ или АСМ), исследующий как про-
водящие, так и диэлектрические объекты [1], и ска-
нирующий оптический микроскоп ближнего поля
(СОМБП), исследующий тонкие и преимущественно
прозрачные объекты [1, 11, 13]. Зондовые микро-
скопы являются уникальными наноэлектронными
приборами, сочетающими свойства микроскопа ато-
марного разрешения (около 0,2 нм в плоскости ис-
следуемого объекта) и технологического устройства,
с помощью которого могут создаваться наноразмер-
ные элементы с программируемыми свойствами, на-
пример, микрочипы.
С возникновением и развитием СЗМ связаны
значительные надежды на существенное повышение
разрешения структур биологических объектов и воз-
можность проведения исследования живых клеток в
условиях, близких к нативным. В настоящее время
биологические приложения СЗМ находятся в началь-
ной стадии: отрабатываются методики приготовления
объектов, учитывающие специфику зондовой микро-
скопии, устанавливаются особенности артефактов,
свойственных СЗМ, совершенствуются алгоритмы
отслеживания рельефа поверхности биологических
объектов и др. В настоящее время наиболее широкое
применение в медико-биологических исследованиях
нашла атомно-си ло вая микроскопия [28].
В АСМ в качестве чувствительного элемента
служит микрозонд, представляющий собой тонкую
пластинку-консоль (кантилевер, от английского сло-
ва «cantilever» – консоль, балка).
На конце кантилевера расположен острый шип
(радиус закругления от 1 до 10 нм). При перемеще-
нии микрозонда вдоль поверхности образца острие
шипа приподнимается и опускается, очерчивая ми-
крорельеф поверхности подобно тому, как скользит
по грампластинке патефонная игла. На выступаю-
щем конце кантилевера (над шипом) расположена
зеркальная площадка, на которую падает и от кото-
рой отражается луч лазера. Когда шип опускается
или поднимается на неровностях поверхности, от-
раженный луч отклоняется, и это отклонение реги-
стрируется фотодетектором. Данные фотодетектора
используются в системе обратной связи, которая обе-
спечивает постоянную силу давления острия на об-
разец. Пьезоэлектрический преобразователь может
регистрировать изменение рельефа образца в режи-
ме реального времени (рис. 2, А).
Разрешающая способность метода составля-
ет примерно 0,1–1 нм по горизонтали и 0,01 нм по
вертикали. Однако при исследовании биологических
объектов разрешающая способность АСМ ограни-
чивается 10–20 нм, что обусловлено углублением
острия кантилевера в биообъект, в результате чего
рельеф исследуемой поверхности усредняется по
площади контакта. Современные АСМ воздействуют
на исследуемый объект с силой около 10–9 Н в кон-
тактном режиме и примерно на порядок, меньший
в полуконтактном. Дальнейшему снижению силы
взаимодействия в полуконтактных режимах препят-
ствуют силы поверхностного натяжения пленки воды
Рис. 2. Схема работы атомно-силового
микроскопа [29] (А); возможные
конфигурации ближнепольного
оптического микроскопа [11]:
исследование образцов на отражение (Б)
и на просвет (В)
Проблемы особо опасных инфекций, вып. 112, 2012
32
(образующейся на исследуемых объектах при их изу-
чении на воздухе), которое прижимает острие канти-
левера к исследуемому объекту. Переход на бескон-
тактную (резонансную) силовую микроскопию, в ко-
торой острие отделено от поверхности расстоянием
в несколько десятков нанометров позволяет снизить
силу взаимодействия до 10–15 Н, при этом снижается
локальность исследования поверхности до 10–20 нм.
Таким образом, для дальнейшего повышения раз-
решения необходимо либо уменьшить силу взаимо-
действия острия с поверхностью путем перехода на
другие схемы устройств кантилеверов (например,
использование крутильных кантилеверов [10, 11]),
либо повысить жесткость исследуемого объекта (на-
пример, путем его заморозки в глубоком вакууме для
препятствия образования пленок льда) [15].
Что касается сканирующего оптического ми-
кроскопа ближнего поля, то на практике использу-
ются несколько конструктивных схем (рис. 2, Б, В).
Наиболее часто реализуется схема, в которой оптиче-
ское излучение лазера локализуется в пространстве с
помощью волоконного зонда. Такая схема позволяет
получить максимальную мощность излучения в об-
ласти субволнового отверстия и проводить исследо-
вание образцов как на отражение (рис. 2, Б), так и на
просвет (рис. 2, В). Для увеличения чувствительно-
сти излучение, отраженное от образца или прошед-
шее сквозь образец, собирается на фотоприемнике с
помощью фокусирующего зеркала или линзы.
Конфокальная лазерная микроскопия
Оптическая микроскопия уже более 300 лет на-
ходит все более разнообразное и широкое примене-
ние. Наиболее простым, но весьма информативным,
является метод изучения окрашенных срезов тканей
и клеток в проходящем белом свете. Применение
оптической микроскопии и сегодня остается неот-
ъемлемой частью клинических и медико-лабо ра тор-
ных исследований. Данный подход основан на ис-
пользовании различий в интенсивности и цвете есте-
ственной или искусственной окраски определенных
веществ в клетках и тканях, в комбинации с анали-
зом морфологических признаков [14, 31]. Разработка
оптических систем для реализации методов темного
поля, фазового и дифференциального интерференци-
онного контраста открыла исследователям возмож-
ность наблюдения и исследования микроструктур в
неокрашенных и слабоконтрастных биологических
объектах, таких как живые клетки. Создание флуо-
ресцентных микроскопов позволило на фоне огром-
ного числа разнообразных молекул избирательно на-
блюдать флуоресцирующие объекты и стимулирова-
ло развитие новых методов для изучения структуры
и функции клеток [16].
Изобретение конфокальной системы регистра-
ции сигнала обеспечило измерение флуоресцентных
сигналов с трехмерным субмикронным разрешением
и существенно расширило возможности неразруша-
ющего анализа прозрачных образцов.
В настоящее время наибольшее распространение
получила лазерная сканирующая конфокальная ми-
кроскопия (ЛСКМ). Объемное изображение в ЛКСМ
получается при помощи регистрации флуоресцен-
ции в фокусе лазерного луча (рис. 3). Излучаемые
фотоны фокусируются объективом на небольшом
(«pinhole», ~50 µm) отверстии, которое ослабляет
флуоресцентный сигнал от участков, находящихся
не в фокусе. Получаемые с их помощью трехмерные
изображения позволяют заглянуть в микромир, по
информативности они несопоставимы с обычными
двухмерными картинками. Благодаря своему высо-
кому разрешению и контрасту наиболее часто встре-
чающейся задачей в изучении структуры клеток и
их органоидов является исследование цитоскелета
клеток, ядра, хромосом, или даже локализации в них
отдельных генов [15, 31].
Исследуется также колокализация в клетке двух и
более веществ, например белков [31]. Предварительно
белки метятся антителами разными флуорохромами.
При обычной микроскопии трудно разобрать, нахо-
дятся они рядом или один под другим. Конфокальная
микроскопия позволяет определить их местонахож-
дение. Записав в памяти компьютера серию срезов,
можно провести объемную реконструкцию объекта и
получить его трехмерное изображение, не используя
трудоемкую методику изготовления и фотографиро-
вания серийных гистологических срезов.
Еще одна задача решается этими приборами –
исследования динамических процессов, происходя-
щих в живых клетках [31]. Например, движение че-
рез клеточные мембраны ионов кальция или других
веществ. Однако для этого нужен высокоскоростной
конфокальный микроскоп.
Новыми перспективными направлениями конфо-
Рис. 3. Оптическая схема конфокальной
сканирующей системы [31]
МИКРОБИОЛОГИЯ
33
кальной микроскопии являются методики FRAP –
Fluorescence Recovery After Photobleaching (Вос-
становление флуоресценции после фотовыжигания)
и FRET – Fluorescence Resonance Energy Transfer
(передача энергии посредством флуоресцентного ре-
зонанса).
FRAP применяется для исследования подвиж-
ности биоорганических молекул посредством ини-
циации фотохимического разложения флуорохрома в
зоне облучения и последующего его рассоединения с
молекулами. После выжигания молекулы с флуорох-
ромом из необлученной зоны движутся (вследствие
диффузии) в облученную зону образца. По времени
нарастания в ней флуоресценции можно судить о
подвижности молекул.
FRET используется при определении располо-
жения, взаимодействия и расстояния между мо-
лекулами разных типов. В этом случае молекулы
метятся двумя флуорохромами, один со спектром
испускания (донор), второй со спектром поглоще-
ния (акцептор). В результате резонанса между энер-
гетическими уровнями молекул, энергия от донора
передается к акцептору. Далее энергия, излучаемая
акцептором в видимой области спектра, регистри-
руется микроскопом.
Как и у любого метода, у ЛКСМ имеется ряд не-
достатков, одним из которых является относительно
невысокое разрешение, по сравнению с другими ви-
дами трехмерной микроскопии (см. выше). Предел
разрешающей способности конфокальной микроско-
пии составляет 150–300 нм. Тем не менее, конфокаль-
ный микроскоп дает две неоценимые возможности:
он позволяет исследовать ткани на клеточном уровне
в состоянии физиологической жизнедеятельности, а
также оценивать результаты исследования (т.е. кле-
точной активности) в четырех измерениях – высота,
ширина, глубина и время.
Рентгеновская микроскопия
Известно, что рентгеновское излучение, имея
малую длину волны (менее 10 нм), потенциально
способно создавать 3D изображения объекта с вы-
соким разрешением (до половины длины волны). В
настоящее время в силу многих технических причин
разрешение, получаемое с помощью лабораторных
рентгеновских микроскопов, не превышает 200 нм.
Исключение составляют микроскопы на основе син-
хротронного излучения или рентгеновских лазеров,
дающие атомарное разрешение [26]. Однако имея
большие технические сложности и высокую стои-
мость, данные приборы не нашли широкого приме-
нения в медико-биологических приложениях.
Цифровая голографическая микроскопия
Еще одним способом получения трехмерного
изображения биологических объектов является лазер-
ная голографическая микроскопия. Это интенсивно
развивающаяся методика позволяет проводить ис-
следование неокрашенных живых клеток в реальном
масштабе времени, получая при этом данные о вну-
тренней структуре с глубиной резкости несколько
миллиметров [27]. Принцип работы голографическо-
го микроскопа основан на регистрации исследуемого
объекта, в котором лазерное излучение, проходя по
двум путям (через объект и минуя его), объединяется,
строя его голограмму. С помощью фотоматрицы высо-
кого разрешения голограмма регистрируется компью-
тером. Для последующего восстановления изображе-
ния используются различные алгоритмы математиче-
ской обработки. Микроскопы подобного рода серийно
не выпускаются, разработаны только прототипы не-
скольких вариантов конструкций, имеющих различ-
ные ограничения по скорости и разрешению.
В заключение следует отметить, что представ-
ленные выше материалы следует рассматривать как
предельно сжатое обобщение о возможности изуче-
ния биологического микромира, где важным услови-
ем развития работ по использованию вышеприведен-
ных приборов является особое внимание к подготов-
ке объекта для изучения, от которой в значительной
мере зависят возможности метода. В соответствии
с целями и задачами исследования методика такой
подготовки может быть различной.
В настоящее время в РосНИПЧИ «Микроб» про-
водятся работы по изучению тонкой структуры и ви-
зуализации в трехмерном измерении с высоким про-
странственным разрешением бактерий чумы, холеры
и сибирской язвы, применяя при этом три типа микро-
скопии: ТЭМ, СЭМ, АСМ [1, 8, 9]. Такие исследования
способствуют получению более полной информации
по ультраструктурно-функцио наль ной организации
вышеуказанных возбудителей и тонкому пониманию
взаимодействия макро- и микроорганизмов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Байбурин В.Б., Волков Ю.П., Коннов Н.П. Много функ-
циональный комплекс сканирующей зондовой микроскопии и
его применение. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та; 1998. 120 с.
2. Вайнштейн Б.К., Орлов С.С. К теории восстановления
функций по их проекциям. Кристаллография. 1972; 17:253–6.
3. Вайнштейн Б.К. Трехмерная электронная микроскопия
биологических макромолекул. Усп. физ. наук. 1973; 109:454–40.
4. Вайнштейн Б.К. Электронная микроскопия атомного
разрешения. Усп. физ. наук. 1987; 152:75–122.
5. Володин А.П. Новое в сканирующей микроскопии.
Приборы и техника эксперимента. 1998; 6:3–42.
6. Иваницкий Г.Р., Кринский В.И., Сельков Е.Е.
Математическая биофизика клетки. М.: Наука; 1978. 309 с.
7. Карупу В.Я. Электронная микроскопия. Киев: Вища шко-
ла; 1984. 137 с.
8. Коннов Н.П., Волков Ю.П., Кузнецов О.С., Якименко Р.Д.,
Новикова О.В., Микшис Н.И. Трехмерная микроскопия бакте-
риальных клеток с высоким пространственным разрешением.
Пробл. особо опасных инф. 2002; 1(13):86–90.
9. Кутырев В.В., Коннов Н.П., Волков Ю.П. Возбудитель
чумы: ультраструктура и локализация в переносчике. М.:
Медицина; 2007. 222 с.
10. Миронов А.А., Комиссарчик Я.Ю., Миронов В.А. Методы
электронной микроскопии в биологии и медицине. СПб.: Наука;
1994. 400 с.
11. Миронов В.Л. Основы сканирующей зондовой микро-
скопии. М.: Техносфера; 2005. 144 с.
12. Растровая электронная микроскопия и рентгеновский
микроанализ. М.: Мир; 1984. Т. 1. 303 с.
13. Суслов А.А., Чижик С.А. Сканирующие зондовые ми-
кроскопы (обзор). Материалы, Технологии, Инструменты. 1997;
2(3):78–89.
14. Феофанов А.В. Конфокальная микроскопия в биологи-
ческих исследованиях. Усп. биол. химии. 2007; 47:371–410.
15. Чандлер Д., Роберсон Р. Оптическая и электронная ми-
кроскопия в медицине и биологии. М.: Интеллект; 2009. 234 с.
16. Ченцов Ю.С. Введение в клеточную биологию. М.:
Проблемы особо опасных инфекций, вып. 112, 2012
34
МГУ; 2004. 495 с.
17. Вaker T.S., Olson N.H., Fuller D. Adding the third dimen-
sion of virus life cycle: three-dimensional reconstruction of viruses
from cryo-electron micrographs. Microbiology and molecular biol-
ogy reviews. 1999; 63(4):862–922.
18. Binnig G., Rohrer H. Scanning tunneling microscopy IBM.
J. Res. Develop. 1986; 30(9):930–3.
19. Bron C., Gremillet P. 3D reconstruction by image-process-
ing of serial section in electron microscopy. In: Kriete A., editor.
Visualisation in biomedical microscopies, 3D imaging and computer
applications. Weinheim: VCH Verlagsgellschaft; 1992. P. 75–104.
20. Cabado R., Machado-Santelli G.M. Image Analysis and 3D
Reconstruction: An Innovating Methodology in Microscopy. Acta
Microscopica. 2003; 12:55–8.
21. Engel A., Schonenberger C.A., Muller D.J. High resolution
imaging of native biological sample surfaces using scanning probe
microscopy. Curr. Opin. Struct. Biology. 1997; 7:279–84.
22. Fiala J.C. Reconstruct: a free editor for serial section mi-
croscopy. J. Microscopy. 2005; 218:52–61.
23. Frank J., Radermacher M., Penczek P., Zhu J., Li Y.,
Ladjadj M., Leith A. SPIDER and WEB: Processing and visualization
of images in 3D electron microscopy and related elds. J. Structural
Biology. 1996; 116:190–9.
24. Frank J. Three-Dimensional Electron Microscopy of
Macromolecular Assemblies. San Diego: Academic Press; 1996.
340 p.
25. Giessibl F. Advances in Atomic Force Microscopy. Reviews
of Modern Physics. 2003; 75(3):949–83.
26. Guehrs E., Gunther C., Konnecke R., Pfau B., Elisebitt S.
Holographic soft X-ray omni-microscopy of biological specimens.
Optics express. 2009; 17(8):6710–20.
27. Kemper B., Langehanenberg P., von Bally G. Digital
Holographic Microscopy: A new Method for surface Analysis and
Marker-Free Dynamic Life cell imaging. Optik & Photonik. 2007;
2(2):41–4.
28. Morris V.J., Kirby A.R., Gunning A.P. Atomic Force
Microscopy for Biologists. USA: Imperial College Press; 1999.
220 р.
29. Moss V.A. Acquisition and visualisation of serial section im-
ages. In: Kriete A., editor. Visualisation in biomedical microscopies,
3D imaging and computer applications. Weinheim: Verlagsgellschaft;
1992. P. 19–44.
30. Mullard A. Microscopy: Eukaryotic cell, now showing in
3D. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2007; 8:272–3.
31. Murray J.M. Confocal microscopy, deconvolution and
structured illumination methods. In: Goldman R.D., Spector D.L. edi-
tors. Live cell imaging. Laboratory Manual. New York: Cold Spring
Harbor Laboratory Press; 2005. P. 239–79.
32. Verbeek F.J., Huijsmans D.P., Baeten R.W.A.M., Schoutsen
N.C.J., Lamers W.H. Design and Implementation of a database and
a program for 3D-reconstruction from serial sections: A data driven
approach. Microscopy Res. Tech. 1995; 30:1–17.
33. Verbeek F.J. 3D reconstruction from serial sections, appli-
cations and limitations Microscopy and Analysis (UK version). 1996;
56:33–5.
34. Verbeek F.J. Theory and Practice of 3D-reconstructions
from serial sections. In: Baldock R.A., Graham J., editors. Image
Processing, а Practical Approach. Oxford: Oxford University Press;
1999. P. 153–95.
References (Presented are the Russian sources in the order of citation
in the original article)
1. Baiburin V.B., Volkov Yu.P., Konnov N.P. [Multifunctional Complex
for Scanning Probe Microscopy and its Application]. Saratov: Izd. Sar. Univ;
1998. 120 p.
2. Vainshtein B.K., Orlov S.S. [Regarding the theory of functions recov-
ery based on their projections]. Kristallograya. 1972; 17:253–6.
3. Vainshtein B.K. [Three-dimensional electronic microscopy of bio-
logical molecules]. Usp. Fiz. Nauk. 1973; 109:454–60.
4. Vainshtein B.K. [Atomic-resolution electronic microscopy]. Usp.
Fiz. Nauk. 1987; 152:75–122.
5. Volodin A.P. [New trends in the sphere of scanning microscopy.
Equipment and experimental procedure]. 1998; 6:3–42.
6. Ivanitsky G.R., Krinsky V.I., Sel’kov E.E. [Mathematical Biophysics
of the Cell]. M.: Nauka; 1978. 309 p.
7. Karupu V.Ya. [Electronic microscopy]. Kiev; 1984. 137 p.
8. Konnov N.P., Volkov Yu.P., Kuznetsov O.S., Yakimenko R.D., Novikova
O.V., Mikshis N.I. [Three-dimensional microscopy of bacterial cells with high
spatial resolution]. Probl. Osobo. Opasn. Infek. 2002; 83:86–90.
9. Kutyrev V.V., Konnov N.P., Volkov Yu.P. [Plague Agent: Ultra-
Structure and Localization in the Vector]. M.: Meditsina; 2007. 222 p.
10. Mironov A.A., Komissarchik Ya.Yu., Mironov V.A. [Methods of
Electronic Microscopy in Biology and Medicine]. St. Petersburg: Nauka;
1994. 400 .
11. Mironov V.L. [Fundamentals of Scanning Probe Microscopy]. M.:
Tekhnosfera; 2005. 144 p.
12. [Raster Electronic Microscopy and X-ray Microanalysis]. M.: Mir;
1984. Vol. 1. 303 p.
13. Suslov A.A., Chizhik S.A. [Scanning Probe Microscopes (Review)].
Materialy Tekhnol. Instrum. 1997; 2(3):78–89.
14. Feofanov A.V. [Confocal microscopy in biological investigations].
Usp. Biol. Khimii. 2007; 47:371–410.
15. Chandler D, Roberson R. [Visible-Light and Electronic Microscopy
in Medicine and Biology]. M.: Intellekt; 2009. 234 p.
16. Chentsov Yu.S. [Introduction to Cellular Biology]. M.: MSU; 2004.
495 p.
Authors:
Konnov N.P., Volkov Yu.P., Kuznetsov O.S. Russian Research Anti-
Plague Institute “Microbe”. 46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russia.
E-mail: rusrapi@microbe.ru
Об авторах:
Коннов Н.П., Волков Ю.П., Кузнецов О.С. Рос сийский научно-
исследовательский противочумный институт «Микроб». 410005,
Саратов, ул. Универ си тет ская, 46. E-mail: rusrapi@microbe.ru
Поступила 01.04.11.