ArticlePDF Available

Modern Technologies for Examination of Three-Dimensional (3-D) Ultra-Fine Structure and Visualization of Microorganisms

Authors:

Abstract

Outlined is a review of the literature data on the modern technologies for examination of the spatial (3-D) submicroscopic structural arrangement of biological objects with a high spatial resolution. Capacities of the instrumental visualization and analysis of a three-dimensional biological object significantly facilitate the overall characterization of its structural-functional properties.
МИКРОБИОЛОГИЯ
29
Развитие микроскопии уже произвело револю-
цию в мире клеточной и молекулярной биологии
и остается важнейшей предпосылкой ее будущих
открытий.
Применение электронной микроскопии в био-
логии существенно изменило и углубило прежние
представления о тонкой структуре клетки и ее вне-
клеточных компонентов, что способствовало до-
полнительному пониманию ее функциональных
особенностей.
Визуализация биологических объектов является,
по-видимому, наиболее сложной задачей для микро-
скопии любого типа. Это связано со специфически-
ми особенностями биообъекта: малыми размерами,
сложным рельефом поверхности, прозрачностью,
мягкостью и легкой повреждаемостью при иссле-
дованиях. Возможность проведения структурно-
функционального анализа клеток неразрывно связана
с изобретением и дальнейшим усовершенствованием
световых, электронных и зондовых микроскопов [1,
3–5, 15, 16]. Такая необходимость вызвана стремле-
нием ученых в более полном понимании механизмов
сложных пространственных процессов и происходя-
щих в клетке на ультраструктурном уровне (менее
100 нм). Более того, появилась возможность изучения
биообъектов в трехмерном – 3D изображении с высо-
ким пространственным разрешением (0,2–0,5 нм).
Получение объемной информации на ультра-
структурном уровне существенно расширяет воз-
можность традиционных подходов при изучении
микромира, а именно:
- позволяет получать новую информацию об
объекте исследования анализировать и хранить
информацию о форме, рельефе поверхности и про-
странственных параметрах клетки в ее трехмерной
субмикроскопической морфологии [2, 3, 6];
- осуществлять моделирование микрообъектов с
сохранением их истинных размеров и форм [2, 10];
- проводить компьютерную видовую диагности-
ку в трехмерном режиме [6, 12, 22, 29];
- накапливать информацию об их нативной ар-
хитектонике и биоразнообразии [8, 9, 14, 16] .
Наиболее часто применяются следующие типы
микроскопии, которые позволяют изучать и визуали-
зировать ультраструктуру биологических объектов в
трехмерном изображении с высоким пространствен-
ным разрешением:
- трансмиссионная (просвечивающая) электрон-
ная микроскопия – ТЭМ;
- растровая (сканирующая) электронная микро-
скопия – РЭМ;
- сканирующая зондовая микроскопия СЗМ,
включающая сканирующую туннельную микроско-
пию СТМ, атомно-силовую микроскопию АСМ,
сканирующую оптическую микроскопию ближнего
поля – СОМБП;
- лазерная сканирующая конфокальная микро-
скопия – ЛСКМ;
УДК 537.533.35
Н.П.Коннов, Ю.П.Волков, О.С.Кузнецов
СОВРЕМЕННЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИЗУЧЕНИЯ
ТРЕХМЕРНОЙ (3D) УЛЬТРАТОНКОЙ СТРУКТУРЫ
И ВИЗУАЛИЗАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Представлен обобщенный обзор литературных данных по современным приборным подходам изучения про-
странственной (3D) субмикроскопической организации биологических объектов с высоким пространственным
разрешением.
Возможности приборной визуализации и анализа трехмерного биообъекта в значительной мере способствуют
более полной характеристике его структурно-функциональных свойств.
Ключевые слова: трансмиссионная, растровая электронная микроскопия, сканирующая зондовая, конфокаль-
ная микроскопия, рентгеновская, цифровая голографическая микроскопия.
N.P.Konnov, Yu.P.Volkov, O.S.Kuznetsov
Modern Technologies for Examination of Three-Dimensional (3-D) Ultra-Fine Structure
and Visualization of Microorganisms
Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”, Saratov
Outlined is a review of the literature data on the modern technologies for examination of the spatial (3-D) submicroscopic struc-
tural arrangement of biological objects with a high spatial resolution.
Capacities of the instrumental visualization and analysis of a three-dimensional biological object signicantly facilitate the overall
characterization of its structural-functional properties.
Key words: transmission, raster electronic microscopy, scanning probe, confocal microscopy, X-ray, digital holographic
microscopy.
Проблемы особо опасных инфекций, вып. 112, 2012
30
- рентгеновская микроскопия – РМ;
- цифровая голографическая микроскопия –
ЦГМ.
Каждый из указанных выше микроскопов имеет
как преимущества, так и определенные недостатки.
Трансмиссионная электронная микроскопия
Этот вид микроскопии более известен, чем дру-
гие. В общих чертах ТЭМ очень напоминает свето-
вой микроскоп (рис. 1, А).
Источником освещения в ТЭМ является нить
катода, излучающего электроны. Для формирова-
ния когерентного пучка электронов между катодом
и анодом прикладывается ускоряющее напряжение
(порядка 50–150 кВ) в условиях высокого вакуума. В
качестве линз используются электромагниты, кото-
рые фокусируют электронный луч. Изучаемый объ-
ект через воздушный шлюз помещают в вакуум, где
он попадает под сфокусированный пучок электро-
нов. Часть электронов, которые проходят через об-
разец, рассеиваются (в зависимости от плотности ве-
щества в данном месте), а остальные фокусируются
и образуют изображения, которые просматриваются
на флуоресцентном экране и фиксируются на фото-
пленке (рис. 1, Б).
С помощью ТЭМ можно получать сведения о
трехмерной структуре клеток. Известно, что в ТЭМ
изображения представляют собой проекцию на пло-
скость структуры заметной толщины. Проекции и
сечения этих структур описываются двумерными
функциями оптической плотности. Дальнейший путь
исследования может состоять в анализе изображе-
ния, ограничивающемся плоскими представлениями
о пространственной структуре, либо в определении
некоторых количественных характеристик трехмер-
ной структуры по имеющемуся в наличии набору
плоских картин [2, 3, 22, 32, 34]. Набрав достаточное
количество таких изображений клеточной структу-
ры, строят ее объемную пространственную модель с
помощью компьютерных программ [6, 20 ,22, 32].
Разрешающая способность ТЭМ для биологиче-
ских объектов составляет 0,5–1 нм. Основной недо-
статок – наличие высокого вакуума и тепловое воз-
действие пучка электронов на объект.
Растровая (сканирующая) электронная ми-
кроскопия
РЭМ является прибором, позволяющим полу-
чать обширную информацию от изображения, созда-
ваемого взаимодействием между исследуемым образ-
цом и электронным зондом [9, 12, 21, 30]. Растровый
электронный микроскоп основан на использовании
предварительно сформированного тонкого электрон-
ного луча (зонда), положением которого управляют с
помощью электромагнитных полей. Это управление
(сканирование) во многом аналогично процессу раз-
вертки в телевизионных кинескопах. Исследуемый
образец, в условиях высокого вакуума, сканирует-
ся сфокусированным электронным пучком средних
энергий (рис. 1, В). В зависимости от механизма ре-
гистрирования сигнала различают несколько режи-
мов работы РЭМ: отраженных электронов, вторич-
ных электронов, катодолюминесценции, рентгенов-
ского излучения и др. Разработанные методики по-
зволяют исследовать не только свойства поверхности
образца, но получать и визуализировать информацию
о поверхностных структурах и, по мере надобности,
проводить элементный анализ на микроучастке ис-
следуемого объекта [5, 7, 12].
Одним из основных преимуществ растрового
электронного микроскопа является большая глубина
резкости.
При подготовке биологических препаратов для
РЭМ требуются определенные методические прие-
мы – образец должен быть токопроводящим. Для это-
го в условиях высокого вакуума (в вакуумном посту)
образец оттеняется (напыляется) высокоочищенны-
ми тяжелыми металлами (золото, платина, палладий
и их сплавы). В результате изучаемые объекты, по-
казанные с помощью РЭМ, выглядят трехмерными.
При этом разрешающаяся способность для биологи-
ческих объектов составляет от 10 до 20 нм.
Рис. 1. Схема основных узлов
светового микроскопа (А)
и электронных микроскопов:
просвечивающего (Б) и сканирующего (В)
МИКРОБИОЛОГИЯ
31
Растровая электронная микроскопия признана
классическим методом изучения пространственных
объектов биологической природы и прекрасно себя
зарекомендовала на практике.
Сканирующая зондовая (туннельная, атомно-
силовая, оптическая ближнего поля) микроскопия
Принципиально новые возможности открылись
благодаря созданию в начале 1980-х годов различных
сканирующих зондовых микроскопов, к основным
типам которых относятся: сканирующий туннельный
микроскоп (СТМ), позволяющий исследовать прово-
дящие объекты [11, 13, 18], сканирующий силовой
микроскоп (ССМ или АСМ), исследующий как про-
водящие, так и диэлектрические объекты [1], и ска-
нирующий оптический микроскоп ближнего поля
(СОМБП), исследующий тонкие и преимущественно
прозрачные объекты [1, 11, 13]. Зондовые микро-
скопы являются уникальными наноэлектронными
приборами, сочетающими свойства микроскопа ато-
марного разрешения (около 0,2 нм в плоскости ис-
следуемого объекта) и технологического устройства,
с помощью которого могут создаваться наноразмер-
ные элементы с программируемыми свойствами, на-
пример, микрочипы.
С возникновением и развитием СЗМ связаны
значительные надежды на существенное повышение
разрешения структур биологических объектов и воз-
можность проведения исследования живых клеток в
условиях, близких к нативным. В настоящее время
биологические приложения СЗМ находятся в началь-
ной стадии: отрабатываются методики приготовления
объектов, учитывающие специфику зондовой микро-
скопии, устанавливаются особенности артефактов,
свойственных СЗМ, совершенствуются алгоритмы
отслеживания рельефа поверхности биологических
объектов и др. В настоящее время наиболее широкое
применение в медико-биологических исследованиях
нашла атомно-си ло вая микроскопия [28].
В АСМ в качестве чувствительного элемента
служит микрозонд, представляющий собой тонкую
пластинку-консоль (кантилевер, от английского сло-
ва «cantilever» – консоль, балка).
На конце кантилевера расположен острый шип
(радиус закругления от 1 до 10 нм). При перемеще-
нии микрозонда вдоль поверхности образца острие
шипа приподнимается и опускается, очерчивая ми-
крорельеф поверхности подобно тому, как скользит
по грампластинке патефонная игла. На выступаю-
щем конце кантилевера (над шипом) расположена
зеркальная площадка, на которую падает и от кото-
рой отражается луч лазера. Когда шип опускается
или поднимается на неровностях поверхности, от-
раженный луч отклоняется, и это отклонение реги-
стрируется фотодетектором. Данные фотодетектора
используются в системе обратной связи, которая обе-
спечивает постоянную силу давления острия на об-
разец. Пьезоэлектрический преобразователь может
регистрировать изменение рельефа образца в режи-
ме реального времени (рис. 2, А).
Разрешающая способность метода составля-
ет примерно 0,1–1 нм по горизонтали и 0,01 нм по
вертикали. Однако при исследовании биологических
объектов разрешающая способность АСМ ограни-
чивается 10–20 нм, что обусловлено углублением
острия кантилевера в биообъект, в результате чего
рельеф исследуемой поверхности усредняется по
площади контакта. Современные АСМ воздействуют
на исследуемый объект с силой около 10–9 Н в кон-
тактном режиме и примерно на порядок, меньший
в полуконтактном. Дальнейшему снижению силы
взаимодействия в полуконтактных режимах препят-
ствуют силы поверхностного натяжения пленки воды
Рис. 2. Схема работы атомно-силового
микроскопа [29] (А); возможные
конфигурации ближнепольного
оптического микроскопа [11]:
исследование образцов на отражение (Б)
и на просвет (В)
Проблемы особо опасных инфекций, вып. 112, 2012
32
(образующейся на исследуемых объектах при их изу-
чении на воздухе), которое прижимает острие канти-
левера к исследуемому объекту. Переход на бескон-
тактную (резонансную) силовую микроскопию, в ко-
торой острие отделено от поверхности расстоянием
в несколько десятков нанометров позволяет снизить
силу взаимодействия до 10–15 Н, при этом снижается
локальность исследования поверхности до 10–20 нм.
Таким образом, для дальнейшего повышения раз-
решения необходимо либо уменьшить силу взаимо-
действия острия с поверхностью путем перехода на
другие схемы устройств кантилеверов (например,
использование крутильных кантилеверов [10, 11]),
либо повысить жесткость исследуемого объекта (на-
пример, путем его заморозки в глубоком вакууме для
препятствия образования пленок льда) [15].
Что касается сканирующего оптического ми-
кроскопа ближнего поля, то на практике использу-
ются несколько конструктивных схем (рис. 2, Б, В).
Наиболее часто реализуется схема, в которой оптиче-
ское излучение лазера локализуется в пространстве с
помощью волоконного зонда. Такая схема позволяет
получить максимальную мощность излучения в об-
ласти субволнового отверстия и проводить исследо-
вание образцов как на отражение (рис. 2, Б), так и на
просвет (рис. 2, В). Для увеличения чувствительно-
сти излучение, отраженное от образца или прошед-
шее сквозь образец, собирается на фотоприемнике с
помощью фокусирующего зеркала или линзы.
Конфокальная лазерная микроскопия
Оптическая микроскопия уже более 300 лет на-
ходит все более разнообразное и широкое примене-
ние. Наиболее простым, но весьма информативным,
является метод изучения окрашенных срезов тканей
и клеток в проходящем белом свете. Применение
оптической микроскопии и сегодня остается неот-
ъемлемой частью клинических и медико-лабо ра тор-
ных исследований. Данный подход основан на ис-
пользовании различий в интенсивности и цвете есте-
ственной или искусственной окраски определенных
веществ в клетках и тканях, в комбинации с анали-
зом морфологических признаков [14, 31]. Разработка
оптических систем для реализации методов темного
поля, фазового и дифференциального интерференци-
онного контраста открыла исследователям возмож-
ность наблюдения и исследования микроструктур в
неокрашенных и слабоконтрастных биологических
объектах, таких как живые клетки. Создание флуо-
ресцентных микроскопов позволило на фоне огром-
ного числа разнообразных молекул избирательно на-
блюдать флуоресцирующие объекты и стимулирова-
ло развитие новых методов для изучения структуры
и функции клеток [16].
Изобретение конфокальной системы регистра-
ции сигнала обеспечило измерение флуоресцентных
сигналов с трехмерным субмикронным разрешением
и существенно расширило возможности неразруша-
ющего анализа прозрачных образцов.
В настоящее время наибольшее распространение
получила лазерная сканирующая конфокальная ми-
кроскопия (ЛСКМ). Объемное изображение в ЛКСМ
получается при помощи регистрации флуоресцен-
ции в фокусе лазерного луча (рис. 3). Излучаемые
фотоны фокусируются объективом на небольшом
(«pinhole», ~50 µm) отверстии, которое ослабляет
флуоресцентный сигнал от участков, находящихся
не в фокусе. Получаемые с их помощью трехмерные
изображения позволяют заглянуть в микромир, по
информативности они несопоставимы с обычными
двухмерными картинками. Благодаря своему высо-
кому разрешению и контрасту наиболее часто встре-
чающейся задачей в изучении структуры клеток и
их органоидов является исследование цитоскелета
клеток, ядра, хромосом, или даже локализации в них
отдельных генов [15, 31].
Исследуется также колокализация в клетке двух и
более веществ, например белков [31]. Предварительно
белки метятся антителами разными флуорохромами.
При обычной микроскопии трудно разобрать, нахо-
дятся они рядом или один под другим. Конфокальная
микроскопия позволяет определить их местонахож-
дение. Записав в памяти компьютера серию срезов,
можно провести объемную реконструкцию объекта и
получить его трехмерное изображение, не используя
трудоемкую методику изготовления и фотографиро-
вания серийных гистологических срезов.
Еще одна задача решается этими приборами
исследования динамических процессов, происходя-
щих в живых клетках [31]. Например, движение че-
рез клеточные мембраны ионов кальция или других
веществ. Однако для этого нужен высокоскоростной
конфокальный микроскоп.
Новыми перспективными направлениями конфо-
Рис. 3. Оптическая схема конфокальной
сканирующей системы [31]
МИКРОБИОЛОГИЯ
33
кальной микроскопии являются методики FRAP –
Fluorescence Recovery After Photobleaching (Вос-
становление флуоресценции после фотовыжигания)
и FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
(передача энергии посредством флуоресцентного ре-
зонанса).
FRAP применяется для исследования подвиж-
ности биоорганических молекул посредством ини-
циации фотохимического разложения флуорохрома в
зоне облучения и последующего его рассоединения с
молекулами. После выжигания молекулы с флуорох-
ромом из необлученной зоны движутся (вследствие
диффузии) в облученную зону образца. По времени
нарастания в ней флуоресценции можно судить о
подвижности молекул.
FRET используется при определении располо-
жения, взаимодействия и расстояния между мо-
лекулами разных типов. В этом случае молекулы
метятся двумя флуорохромами, один со спектром
испускания (донор), второй со спектром поглоще-
ния (акцептор). В результате резонанса между энер-
гетическими уровнями молекул, энергия от донора
передается к акцептору. Далее энергия, излучаемая
акцептором в видимой области спектра, регистри-
руется микроскопом.
Как и у любого метода, у ЛКСМ имеется ряд не-
достатков, одним из которых является относительно
невысокое разрешение, по сравнению с другими ви-
дами трехмерной микроскопии (см. выше). Предел
разрешающей способности конфокальной микроско-
пии составляет 150–300 нм. Тем не менее, конфокаль-
ный микроскоп дает две неоценимые возможности:
он позволяет исследовать ткани на клеточном уровне
в состоянии физиологической жизнедеятельности, а
также оценивать результаты исследования (т.е. кле-
точной активности) в четырех измерениях – высота,
ширина, глубина и время.
Рентгеновская микроскопия
Известно, что рентгеновское излучение, имея
малую длину волны (менее 10 нм), потенциально
способно создавать 3D изображения объекта с вы-
соким разрешением (до половины длины волны). В
настоящее время в силу многих технических причин
разрешение, получаемое с помощью лабораторных
рентгеновских микроскопов, не превышает 200 нм.
Исключение составляют микроскопы на основе син-
хротронного излучения или рентгеновских лазеров,
дающие атомарное разрешение [26]. Однако имея
большие технические сложности и высокую стои-
мость, данные приборы не нашли широкого приме-
нения в медико-биологических приложениях.
Цифровая голографическая микроскопия
Еще одним способом получения трехмерного
изображения биологических объектов является лазер-
ная голографическая микроскопия. Это интенсивно
развивающаяся методика позволяет проводить ис-
следование неокрашенных живых клеток в реальном
масштабе времени, получая при этом данные о вну-
тренней структуре с глубиной резкости несколько
миллиметров [27]. Принцип работы голографическо-
го микроскопа основан на регистрации исследуемого
объекта, в котором лазерное излучение, проходя по
двум путям (через объект и минуя его), объединяется,
строя его голограмму. С помощью фотоматрицы высо-
кого разрешения голограмма регистрируется компью-
тером. Для последующего восстановления изображе-
ния используются различные алгоритмы математиче-
ской обработки. Микроскопы подобного рода серийно
не выпускаются, разработаны только прототипы не-
скольких вариантов конструкций, имеющих различ-
ные ограничения по скорости и разрешению.
В заключение следует отметить, что представ-
ленные выше материалы следует рассматривать как
предельно сжатое обобщение о возможности изуче-
ния биологического микромира, где важным услови-
ем развития работ по использованию вышеприведен-
ных приборов является особое внимание к подготов-
ке объекта для изучения, от которой в значительной
мере зависят возможности метода. В соответствии
с целями и задачами исследования методика такой
подготовки может быть различной.
В настоящее время в РосНИПЧИ «Микроб» про-
водятся работы по изучению тонкой структуры и ви-
зуализации в трехмерном измерении с высоким про-
странственным разрешением бактерий чумы, холеры
и сибирской язвы, применяя при этом три типа микро-
скопии: ТЭМ, СЭМ, АСМ [1, 8, 9]. Такие исследования
способствуют получению более полной информации
по ультраструктурно-функцио наль ной организации
вышеуказанных возбудителей и тонкому пониманию
взаимодействия макро- и микроорганизмов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Байбурин В.Б., Волков Ю.П., Коннов Н.П. Много функ-
циональный комплекс сканирующей зондовой микроскопии и
его применение. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та; 1998. 120 с.
2. Вайнштейн Б.К., Орлов С.С. К теории восстановления
функций по их проекциям. Кристаллография. 1972; 17:253–6.
3. Вайнштейн Б.К. Трехмерная электронная микроскопия
биологических макромолекул. Усп. физ. наук. 1973; 109:454–40.
4. Вайнштейн Б.К. Электронная микроскопия атомного
разрешения. Усп. физ. наук. 1987; 152:75–122.
5. Володин А.П. Новое в сканирующей микроскопии.
Приборы и техника эксперимента. 1998; 6:3–42.
6. Иваницкий Г.Р., Кринский В.И., Сельков Е.Е.
Математическая биофизика клетки. М.: Наука; 1978. 309 с.
7. Карупу В.Я. Электронная микроскопия. Киев: Вища шко-
ла; 1984. 137 с.
8. Коннов Н.П., Волков Ю.П., Кузнецов О.С., Якименко Р.Д.,
Новикова О.В., Микшис Н.И. Трехмерная микроскопия бакте-
риальных клеток с высоким пространственным разрешением.
Пробл. особо опасных инф. 2002; 1(13):86–90.
9. Кутырев В.В., Коннов Н.П., Волков Ю.П. Возбудитель
чумы: ультраструктура и локализация в переносчике. М.:
Медицина; 2007. 222 с.
10. Миронов А.А., Комиссарчик Я.Ю., Миронов В.А. Методы
электронной микроскопии в биологии и медицине. СПб.: Наука;
1994. 400 с.
11. Миронов В.Л. Основы сканирующей зондовой микро-
скопии. М.: Техносфера; 2005. 144 с.
12. Растровая электронная микроскопия и рентгеновский
микроанализ. М.: Мир; 1984. Т. 1. 303 с.
13. Суслов А.А., Чижик С.А. Сканирующие зондовые ми-
кроскопы (обзор). Материалы, Технологии, Инструменты. 1997;
2(3):78–89.
14. Феофанов А.В. Конфокальная микроскопия в биологи-
ческих исследованиях. Усп. биол. химии. 2007; 47:371–410.
15. Чандлер Д., Роберсон Р. Оптическая и электронная ми-
кроскопия в медицине и биологии. М.: Интеллект; 2009. 234 с.
16. Ченцов Ю.С. Введение в клеточную биологию. М.:
Проблемы особо опасных инфекций, вып. 112, 2012
34
МГУ; 2004. 495 с.
17. Вaker T.S., Olson N.H., Fuller D. Adding the third dimen-
sion of virus life cycle: three-dimensional reconstruction of viruses
from cryo-electron micrographs. Microbiology and molecular biol-
ogy reviews. 1999; 63(4):862–922.
18. Binnig G., Rohrer H. Scanning tunneling microscopy IBM.
J. Res. Develop. 1986; 30(9):930–3.
19. Bron C., Gremillet P. 3D reconstruction by image-process-
ing of serial section in electron microscopy. In: Kriete A., editor.
Visualisation in biomedical microscopies, 3D imaging and computer
applications. Weinheim: VCH Verlagsgellschaft; 1992. P. 75–104.
20. Cabado R., Machado-Santelli G.M. Image Analysis and 3D
Reconstruction: An Innovating Methodology in Microscopy. Acta
Microscopica. 2003; 12:55–8.
21. Engel A., Schonenberger C.A., Muller D.J. High resolution
imaging of native biological sample surfaces using scanning probe
microscopy. Curr. Opin. Struct. Biology. 1997; 7:279–84.
22. Fiala J.C. Reconstruct: a free editor for serial section mi-
croscopy. J. Microscopy. 2005; 218:52–61.
23. Frank J., Radermacher M., Penczek P., Zhu J., Li Y.,
Ladjadj M., Leith A. SPIDER and WEB: Processing and visualization
of images in 3D electron microscopy and related elds. J. Structural
Biology. 1996; 116:190–9.
24. Frank J. Three-Dimensional Electron Microscopy of
Macromolecular Assemblies. San Diego: Academic Press; 1996.
340 p.
25. Giessibl F. Advances in Atomic Force Microscopy. Reviews
of Modern Physics. 2003; 75(3):949–83.
26. Guehrs E., Gunther C., Konnecke R., Pfau B., Elisebitt S.
Holographic soft X-ray omni-microscopy of biological specimens.
Optics express. 2009; 17(8):6710–20.
27. Kemper B., Langehanenberg P., von Bally G. Digital
Holographic Microscopy: A new Method for surface Analysis and
Marker-Free Dynamic Life cell imaging. Optik & Photonik. 2007;
2(2):41–4.
28. Morris V.J., Kirby A.R., Gunning A.P. Atomic Force
Microscopy for Biologists. USA: Imperial College Press; 1999.
220 р.
29. Moss V.A. Acquisition and visualisation of serial section im-
ages. In: Kriete A., editor. Visualisation in biomedical microscopies,
3D imaging and computer applications. Weinheim: Verlagsgellschaft;
1992. P. 19–44.
30. Mullard A. Microscopy: Eukaryotic cell, now showing in
3D. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2007; 8:272–3.
31. Murray J.M. Confocal microscopy, deconvolution and
structured illumination methods. In: Goldman R.D., Spector D.L. edi-
tors. Live cell imaging. Laboratory Manual. New York: Cold Spring
Harbor Laboratory Press; 2005. P. 239–79.
32. Verbeek F.J., Huijsmans D.P., Baeten R.W.A.M., Schoutsen
N.C.J., Lamers W.H. Design and Implementation of a database and
a program for 3D-reconstruction from serial sections: A data driven
approach. Microscopy Res. Tech. 1995; 30:1–17.
33. Verbeek F.J. 3D reconstruction from serial sections, appli-
cations and limitations Microscopy and Analysis (UK version). 1996;
56:33–5.
34. Verbeek F.J. Theory and Practice of 3D-reconstructions
from serial sections. In: Baldock R.A., Graham J., editors. Image
Processing, а Practical Approach. Oxford: Oxford University Press;
1999. P. 153–95.
References (Presented are the Russian sources in the order of citation
in the original article)
1. Baiburin V.B., Volkov Yu.P., Konnov N.P. [Multifunctional Complex
for Scanning Probe Microscopy and its Application]. Saratov: Izd. Sar. Univ;
1998. 120 p.
2. Vainshtein B.K., Orlov S.S. [Regarding the theory of functions recov-
ery based on their projections]. Kristallograya. 1972; 17:253–6.
3. Vainshtein B.K. [Three-dimensional electronic microscopy of bio-
logical molecules]. Usp. Fiz. Nauk. 1973; 109:454–60.
4. Vainshtein B.K. [Atomic-resolution electronic microscopy]. Usp.
Fiz. Nauk. 1987; 152:75–122.
5. Volodin A.P. [New trends in the sphere of scanning microscopy.
Equipment and experimental procedure]. 1998; 6:3–42.
6. Ivanitsky G.R., Krinsky V.I., Sel’kov E.E. [Mathematical Biophysics
of the Cell]. M.: Nauka; 1978. 309 p.
7. Karupu V.Ya. [Electronic microscopy]. Kiev; 1984. 137 p.
8. Konnov N.P., Volkov Yu.P., Kuznetsov O.S., Yakimenko R.D., Novikova
O.V., Mikshis N.I. [Three-dimensional microscopy of bacterial cells with high
spatial resolution]. Probl. Osobo. Opasn. Infek. 2002; 83:86–90.
9. Kutyrev V.V., Konnov N.P., Volkov Yu.P. [Plague Agent: Ultra-
Structure and Localization in the Vector]. M.: Meditsina; 2007. 222 p.
10. Mironov A.A., Komissarchik Ya.Yu., Mironov V.A. [Methods of
Electronic Microscopy in Biology and Medicine]. St. Petersburg: Nauka;
1994. 400 .
11. Mironov V.L. [Fundamentals of Scanning Probe Microscopy]. M.:
Tekhnosfera; 2005. 144 p.
12. [Raster Electronic Microscopy and X-ray Microanalysis]. M.: Mir;
1984. Vol. 1. 303 p.
13. Suslov A.A., Chizhik S.A. [Scanning Probe Microscopes (Review)].
Materialy Tekhnol. Instrum. 1997; 2(3):78–89.
14. Feofanov A.V. [Confocal microscopy in biological investigations].
Usp. Biol. Khimii. 2007; 47:371–410.
15. Chandler D, Roberson R. [Visible-Light and Electronic Microscopy
in Medicine and Biology]. M.: Intellekt; 2009. 234 p.
16. Chentsov Yu.S. [Introduction to Cellular Biology]. M.: MSU; 2004.
495 p.
Authors:
Konnov N.P., Volkov Yu.P., Kuznetsov O.S. Russian Research Anti-
Plague Institute “Microbe”. 46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russia.
E-mail: rusrapi@microbe.ru
Об авторах:
Коннов Н.П., Волков Ю.П., Кузнецов О.С. Рос сийский научно-
исследовательский противочумный институт «Микроб». 410005,
Саратов, ул. Универ си тет ская, 46. E-mail: rusrapi@microbe.ru
Поступила 01.04.11.
ResearchGate has not been able to resolve any citations for this publication.
Book
Full-text available
В книге рассмотрены математическое моделирование ферментативных реакций и полиферментных систем, модели возбудимых мембран и тканей, моделирование и реконструкция различных внутриклеточных структур. Содержится теоретический и экспериментальный материал, основанный на методах электронной микроскопии, когерентной оптики, электрофизиологии, а также на качественных методах анализа в приложении к проблемам формальной химической кинетики, ионных токов мембран, распространения волн возбуждения, сокращения сердечной мышцы, машинного анализа биоструктур. Предназначена для широкого круга специалистов - математиков, физиков, физиологов и медицинских работников.
Chapter
A wide range of books on image processing and analysis provide comprehensive descriptions of mathematics and algorithms for image processing practitioners, or introductory material for engineering students. This volume is different in addressing the topic from the point of view of the "user". Standard algorithms, procedures and rules of thumb are explained in the context of successful application to biological or medical images. Early chapters cover the basic topics of image acquisition, processing, analysis and pattern recognition. Much of the explanation is in the form of protocols, which should equip the user in the biological or earth sciences with the background for informed use of image processing software, and sufficient knowledge to write their own programmes if they feel moved to do so. More advanced techniques in the use of explicit models and analysis of 3D images are covered in later chapters, also with reference to specific applications. The coverage of these is not exhaustive, but may inspire the reader to consider applying image analysis to problems beyond those tackled by commercial packages.
Article
The problem is treated of reconstructing the spatial structure of biological macromolecules and their aggregates (e.g., in viruses and crystals) from electron micrographs, which are two-dimensional projections of these three-dimensional objects. Potentialities of the physical methods (optical diffraction, filtering, and holography) in interpreting electron micrographs are described. The fundamentals are given of the mathematical theory of three-dimensional reconstruction from projections: the Fourier method, the algebraic methods, and the analytical methods. Applications are reviewed of the three-dimensional reconstruction methods in studying a number of objects: protein crystals, helical structures made of globular proteins, bacteriophages, and spherical viruses.
Article
This chapter explains the formation of a three-dimensional (3D) image of a macromolecule in its entirety, at the highest possible resolution. Specimen preparation methods perform the seemingly impossible task of stabilizing the initially hydrated molecule so that it can be placed and observed in the vacuum. The contrast generated by the molecule itself is normally inadequate for direct observation in the electron microscope. Various contrasting methods have been developed. Negative staining with heavy metal salts such as uranyl acetate produces a high contrast and prevents the molecule from collapsing. Instead of the molecule, with its interior density variations, only a cast of the exterior surface of the molecule is imaged and only its shape can be reconstructed. To some extent, a stain may penetrate into crevices, but this does not change the fact that only the boundary of the molecule is visualized. As sophisticated averaging methods were developed, it became possible to make sense of the faint images produced by the molecule itself, but biologically relevant information could be obtained only after methods were found to sustain the molecule in a medium that closely approximates the aqueous environment; these methods are embedment in glucose, tannic acid, and vitreous ice. The chapter also describes gold-labeling techniques that are crucial in 3D electron microscopy.
Article
When a thick specimen is viewed through a conventional microscope, one sees the sum of a sharp image of an in-focus region plus blurred images of all of the out-of-focus regions. High background, scattering, and aberrations are all problems when viewing thick specimens. Several methods are available to deal with these problems in living samples. These methods can be grouped into three classes: primarily optical (e.g., confocal microscopy, multiphoton microscopy), primarily computational (e.g., deconvolution techniques), and mixed (e.g., structured illumination) approaches. This article describes these techniques, which make it possible to see details within thick specimens (e.g., the interiors of cells within living tissue) by optical sectioning, without the artifacts associated with physically sectioning the specimen.