Content uploaded by Daniela Jaikel-Víquez
Author content
All content in this area was uploaded by Daniela Jaikel-Víquez on Dec 04, 2018
Content may be subject to copyright.
Artículo Original
Tipificación molecular y susceptibilidad in vitro frente a fluconazol de aislamientos
clínicos costarricenses del complejo Cryptococcus neoformans/Cryptococcus gattii
Daniela Jaikel-Víquez,1,2,* Lorena Uribe-Lorío,3 Norma T. Gross.1,2
1Sección de Micología Médica, Departamento de Microbiología, Facultad de Microbiología, Universidad de Costa Rica, San Pedro, Costa
Rica.
2Centro de Investigación en Enfermedades Tropicales (CIET), Facultad de Microbiología, Universidad de Costa Rica, San Pedro, Costa
Rica.
3Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular (CIBCM), Universidad de Costa Rica, San Pedro, Costa Rica.
Rev Panam Enf Inf 2018; 1(1):12-20.
Received 30 October 2017 - Accepted 30 August 2018.
Copyright © 2018 Jaikel-Víquez et al. This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted
use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Resumen
Introducción: La criptococosis es una infección micótica oportunista causada por el complejo Cryptococcus neoformans/Cryptococcus gattii. El objetivo del
trabajo fue determinar los patrones moleculares del complejo C. neoformans/C. gattii de aislamientos clínicos y su susceptibilidad in vitro al fluconazol (FL).
Métodos: Se analizaron los expedientes clínicos de 74 pacientes diagnosticados con criptococosis, entre el 2011 y el 2014. Los aislamientos obtenidos fueron
caracterizados: (i) fenotípicamente mediante el sistema automatizado Vitek® (BioMérieux, Francia), la prueba de la ureasa, la prueba de la fenil oxidasa y la
inoculación en medio canavanina-glicina y azul de bromotimol (ii) genéticamente mediante la restricción enzimática del gen URA5 con las enzimas Sau96I y
HhaI y (iii) de acuerdo a su patrón de susceptibilidad in vitro al FL mediante la técnica de microdilución en medio líquido. Resultados: Se encontró que la
mayoría de los pacientes eran de sexo masculino (86.5 %), con una edad promedio de 43.5 años, VIH positivos (75.7 %) y que ingresaron al centro médico con
un cuadro de meningitis criptococóccica. Con respecto a la caracterización fenotípica y genotípica se encontró que el 93.2 % de los aislamientos pertenecían al
genotipo VNI, el 5.4 % al VNII y el 1.4 % a la especie Cryptococcus laurentii. Además, todas las levaduras analizadas fueron sensibles al FL. Conclusiones: Se
demostró por primera vez en Costa Rica el predominio de C. neoformans var. grubii VNI, en aislamientos clínicos, y que la resistencia no constituye un problema
entre los aislamientos estudiados.
Palabras Clave: Criptococosis, Cryptococcus neoformans, Crytococcus gattii, fluconazol, meningitis.
Molecular typing and in vitro susceptibility to fluconazole of Costa Rican isolates of the Cryptococcus
neoformans/Cryptococcus gattii species complex
Abstract
Introduction: Cryptococcosis is a life-threatening fungal infection caused by the Cryptococcus neoformans/Cryptococcus gattii species complex. Our aim was
to determine the molecular epidemiology and the antimicrobial susceptibility to fluconazole (FL) of clinical isolates of Cryptococcus spp. Methods: Seventy-
four patients with cryptococcosis were studied, from 2011 to 2014. Demographic data, risk factors and outcome of each patient were obtained from the medical
records. The isolates were identified by standard methods, such as india ink preparation, uresase test, growth on L-dopa and canavanine-glycine-bromothymol
blue agar. The biochemical profile was identified by the automated system Vitek® (BioMérieux, France). The molecular types were assigned by RFLP-URA5
analysis and the minimal inhibitory concentration (MIC) of FL was determined with the broth micro-dilution technique. Results: Cryptococcosis was more
prevalent in HIV-positive male patients with a mean age of 43.5 years old. The majority of the isolates (98.6 %) were identified as C. neoformans var. grubii
(93.2 % VNI and 5.4 % VNII) and 1.4 % as Cryptococcus laurentii. The MIC values of all isolates tested were ≤ 8 µg/mL. Conclusion: The most prevalent
molecular type of the clinical C. neoformans/C. gattii species complex in Costa Rica is VNI. Additionally, FL was effective against the isolates tested.
Key words: Cryptococcosis, Cryptococcus neoformans, Crytococcus gattii, fluconazole, meningitis.
Introducción
La criptococosis es una infección micótica
oportunista causada por levaduras del complejo
Cryptococcus neoformans/Cryptococcus gattii.
Mediante serotipaje y técnicas moleculares se ha logrado
establecer que el complejo está conformado por cinco
serotipos y nueve patrones moleculares (1). La especie C.
neoformans está compuesta por: C. neoformans var.
grubii, serotipo A, patrones moleculares VNI, VNII y
VNB; C. neoformans var. neoformans, serotipo D, VNIV
y por un híbrido AD, VNIII. Por otro lado, la especie C.
gattii se divide en cuatro patrones moleculares VGI-
VGIV y en los serotipos B y C. Esta patología presenta
una distribución mundial; sin embargo, los distintos
Jaikel-Víquez et al – Tipificación molecular y susceptibilidad frente a fluconazol del complejo
Cryptococcus neoformans/Cryptococcus gattii
13
Rev Panam Enf Inf 2018; 1(1):12-20.
agentes etiológicos, aislados a partir de muestras
ambientales, clínicas humanas y veterinarias, tienen una
distribución geográfica delimitada. Por ejemplo, el
genotipo VNI posee distribución mundial; el VNB
solamente se ha aislado en África, el VNIV prevalece en
Europa, el VGI es principalmente aislado en Oceanía y
la mayoría de los aislamientos del VGII provienen de
América (1), siendo este último el genotipo causante del
brote de criptococosis en la isla de Vancouver, Canadá
(2). Esta infección se desarrolla, por lo general, en
pacientes VIH positivos en fase SIDA. Sin embargo,
también se han reportado en portadores del virus de
Hepatitis B, pacientes con enfermedades neoplásicas,
diabetes mellitus descompensada, cirrosis hepática,
enfermedades hematológicas (3) y según la Red de
Vigilancia de Infecciones Asociadas a Trasplantes en el
1 - 2 % de los pacientes receptores de trasplante de
órgano sólido (4). Otros pacientes susceptibles son los que
reciben terapia con corticosteroides (5), quimioterapia
citotóxica o inhibidores de la TNF-α (6). Los genotipos
VNI - VNIV y VGIII - VGIV son los responsables de
causar meningoencefalitis en estos pacientes (7-9). Por
otro lado, entre un 17 y un 22 % de los casos de
criptococosis se presentan en personas
inmunocompetentes o que no presentan ningún factor de
riesgo conocido (6) y son causados, en su mayoría, por los
genotipos VGI y VGII (10,11).
La infección por Cryptococcus se adquiere a través
de la inhalación de levaduras, por lo que el cuadro
comienza como una afección pulmonar. En pacientes
inmunocompetentes, el hongo suele permanecer a este
nivel formando granulomas (criptococomas); sin
embargo, en inmunosupresos puede diseminar hacia
otros órganos, especialmente al sistema nervioso central
(12). La fungemia ha sido reportada en un 47 - 71 % de los
pacientes VIH positivos en fase SIDA, pero solo en el 27
% de los pacientes que no han sido infectados por este
virus (13). Además, posee una alta mortalidad; por
ejemplo, en los países desarrollados se reporta hasta un
30 % y en África es de más del 60 % (14,15). Sin embargo,
puede llegar hasta el 100 % en pacientes que no han
recibido tratamiento antimicótico (14).
El tratamiento de elección consiste en la
administración de anfotericina B, 5-fluorocitosina y
fluconazol (FL), pero las fallas terapéuticas y las recaídas
son frecuentes (15). Una de las posibles causas asociada a
estas fallas terapéuticas es el uso extensivo de FL como
tratamiento profiláctico contra la candidiasis, en los
pacientes infectados con el virus de inmunodeficiencia
humana (VIH). La dosis recomendada para evitar una
infección por Candida spp. es de 200 mg por día,
mientras que la recomendada contra Cryptococcus es de
400 mg por día, por lo que estas dosis menores favorecen
la selección de cepas con sensibilidad disminuida (16).
Además, se ha demostrado que los pacientes infectados
con cepas que presentan concentraciones mínimas
inhibitorias (CMI) menores a 8 µg/mL responden mejor
al tratamiento que pacientes infectados con levaduras con
CMIs mayores a 16 µg/mL (17). También, se ha observado
que C. gattii VGII y otras especies como Cryptococcus
laurentii, Cryptococcus albidus y Cryptococcus
humicola presentan una resistencia mayor al tratamiento
que los aislamientos de C. neoformans (18,19). Por lo tanto,
el presente estudio propone dar a conocer la variabilidad
fenotípica y genética de algunos aislamientos clínicos
costarricenses del complejo C. neoformans/C. gattii y su
susceptibilidad in vitro al FL con el fin de aportar
información que pueda contribuir a mejorar el
tratamiento de la enfermedad.
Métodos
Perfiles demográficos de los pacientes con
criptococosis
Se analizaron aislamientos de Cryptococcus
obtenidos a partir de muestras clínicas de 74 pacientes
con criptococosis provenientes de tres hospitales
públicos del Área Metropolitana de la provincia de San
José, capital de Costa Rica: Hospital México (HM),
Hospital Rafael Ángel Calderón Guardia (HCG) y
Hospital San Juan de Dios (HSJD) (Figura 1), entre el
2011 y el 2014. Todos los datos obtenidos fueron
analizados y presentados de forma tal que en todos los
casos; sin excepción, se salvaguardó la identidad de cada
paciente. Se obtuvo la siguiente información: i) sexo,
edad y lugar de residencia del paciente, ii) condición al
egreso, iii) factores de riesgo, iv) fecha del diagnóstico
de la criptococosis, v) tipo de muestra de donde se aisló
el cultivo, vi) anormalidades radiológicas, vii)
manifestaciones clínicas y viii) tratamiento. El protocolo
de investigación fue aprobado por el Comité Local de
Bioética del Hospital San Juan de Dios, número de
protocolo CLOBI-HSJD-21-2014.
Caracterización fenotípica de los aislamientos de
Cryptococcus
La identificación fenotípica se realizó con las
siguientes pruebas: examen de la morfología
microscópica con tinta china, producción de ureasa en
agar urea de Christensen, producción de fenil oxidasas
en agar L-Dopa, identificación con el sistema
automatizado Vitek® (BioMérieux, Francia) e
Jaikel-Víquez et al – Tipificación molecular y susceptibilidad frente a fluconazol del complejo
Cryptococcus neoformans/Cryptococcus gattii
14
Rev Panam Enf Inf 2018; 1(1):12-20.
inoculación en agar canavanina glicina azul de
bromotimol (CGB) (20).
Figura 1. Mapa de Costa Rica. Área de atracción de los
hospitales México, Rafael Ángel Calderón Guardia y San
Juan de Dios. Los tres hospitales pertenecen al tercer
nivel de atención de la Caja Costarricense del Seguro
Social de Costa Rica.
Caracterización genotípica de los aislamientos de
Cryptococcus
Se realizó una extracción de ADN genómico
mediante la técnica de choque térmico (21). La tipificación
se realizó mediante la técnica de RFLP del gen URA5,
con las enzimas Sau96I y HhaI, utilizando el protocolo
de Escandón y colaboradores (2006) (7). La amplificación
se realizó con los imprimadores URA5 (5’ ATG TCC
TCC CAA GCC CTC GAC TCC 3’) y SJ01 (5’ TTA
AGA CCT CTG AAC ACC GTA CTC 3’) (7). Las
condiciones de la mezcla para el PCR con un volumen
final de 50 µL fueron: 50 ng de ADN, 1X de
amortiguador de la DreamTaq (KCl, (NH4)2SO4 y 20
mM MgCl2), 0.2 mM de la mezcla de nucleótidos, 50 ng
de cada imprimador y 1.5 U de la DreamTaq polimerasa
(Thermo Scientific, Estados Unidos). Se llevó a cabo en
35 ciclos de amplificación: desnaturalización inicial 91
°C por 3 minutos, desnaturalización a 94 °C por 45
segundos, alineamiento a 62 °C por 1 minuto, extensión
a 72 °C por 2 minutos y un ciclo de extensión final a 72
°C por 10 minutos. 17 µL del producto de PCR fueron
digeridos con las enzimas Sau96I (10 U/µL) y HhaI (20
U/µL). La restricción se realizó a 37 °C durante 3 horas.
Las digestiones se corrieron en geles de agarosa al 2.5 %
con buffer TAE a 80 V durante 3.5 horas. Los geles se
tiñeron con GelRed (Biotium) y se visualizaron
utilizando un transiluminador de luz ultravioleta (7).
Como controles positivos se utilizaron las cepas de
Cryptococcus WM 148 (VNI), WM 626 (VNII), WM
628 (VNII), 629 (VNIV), WM 179 (VGI), WM 178
(VGII), WM 161 (VGIII) and WM 779 (VGIV), del
Westmead Institute for Medical Research, Sydney,
Australia.
Determinación de la susceptibilidad in vitro al
fluconazol
Los patrones de susceptibilidad se determinaron
mediante el método de microdilución en medio líquido
según las directrices del documento M27-A3 del CLSI
(del inglés Clinical Laboratory Standard Institute) (22).
Para ello, se preparó una solución madre de FL (Pfizer,
Reino Unido) a 1280 µg/mL utilizando dimetil sulfóxido
(DMSO) (Sigma-Aldrich, Estados Unidos) como
diluente. Las concentraciones finales del antifúngico en
la placa fueron de 0.25 a 128 µg/Ml. Los controles que
se utilizaron fueron Candida krusei ATCC 6258 y
Candida parapsilosis ATCC 22019.
Análisis estadístico
Para analizar los resultados obtenidos se utilizó el
programa SPSS para Windows, versión 19 (SPSS Inc.,
Chicago, Ill, EEUU). Se realizaron pruebas de Xi2 y t-
student, con un 95 % de confianza, para determinar si
existía asociación entre las variables demográficas y
clínicas de los pacientes. Además, se determinó la media
geométrica y el rango para las CMIs de cada genotipo y
la CMI50 y la CMI90.
Resultados
Se analizaron un total de 74 expedientes clínicos de
pacientes con criptococosis. De estos, el 13.5 % eran de
sexo femenino y el 86.5 % de sexo masculino. El
promedio de edad fue de 43.5 años con un rango de 18 a
87 años. En la Figura 2 se muestra la distribución etaria
de los pacientes. Es importante mencionar que no se
encontraron diferencias estadísticamente significativas
entre las medias de edad de los pacientes según sexo (t =
1.087, gl = 72, p = 0.281). Con respecto al lugar de
residencia, el 66.2 % de los pacientes provenían de la
provincia de San José. No se encontró relación
estadísticamente significativa entre esta variable y el
estar infectado con VIH (X2 = 8.477; gl = 6; p = 0.205),
sin embargo, el 39.3 % de los pacientes VIH positivos
infectados con Cryptococcus provenían de los cantones
de Desamparados y Central, de la provincia de San José
(cantones pertenecientes al área de atracción del Hospital
San Juan de Dios).
En la Tabla 1 se presentan los distintos factores de
riesgo que presentaban los pacientes con criptococosis.
El 75.7 % de los pacientes estaban infectados con VIH.
Se encontró asociación estadísticamente significativa
entre la infección por este virus y el sexo del paciente (X2
Jaikel-Víquez et al – Tipificación molecular y susceptibilidad frente a fluconazol del complejo
Cryptococcus neoformans/Cryptococcus gattii
15
Rev Panam Enf Inf 2018; 1(1):12-20.
= 7.995, gl = 1, p = 0.011) porque la proporción de
hombres VIH positivos era mayor que la proporción de
mujeres VIH positivas; la mayoría de las mujeres de este
estudio habían sido sometidas a trasplante renal o tenían
lupus eritematoso sistémico (LES). En promedio, el
conteo de linfocitos CD4+ en los pacientes VIH/SIDA
fue de 60.6 células/µL (rango de 2 a 396 células/µL), a
la fecha del diagnóstico de la criptococosis y sus cargas
virales de 4 108 a más de 1 000 000 copias/mL. Cabe
resaltar que el médico tratante diagnosticó en fase SIDA
al 58.9 % de los pacientes VIH positivos, luego de la
infección con este hongo.
Figura 2. Distribución etaria de los pacientes diagnosticados con
criptococosis en Costa Rica, según sexo.
El resto de los pacientes VIH positivos, ya habían
sido diagnosticados en fase SIDA porque estaban
infectados previamente con alguna(s) de las siguientes
enfermedades: sífilis (n = 9), tuberculosis (n =7),
bacteremia por Pseudomonas aeruginosa (n = 1),
infección con Neisseria en líquido cefalorraquídeo
(LCR) (n = 1), pneumocistosis (n = 2), candidiasis
vaginal y oral (n = 4), histoplasmosis (n = 1),
toxoplasmosis (n = 3), tricomoniasis (n = 1), infección
con Virus Herpes (n = 3), Citomegalovirus (n = 5), Virus
de Hepatitis B (n = 4), Virus de Papiloma Humano en el
recto (n = 1) y estrongiloidiasis (n = 2).
En la Figura 3 se muestra la distribución de las
formas clínicas de criptococosis presentadas por los
pacientes analizados. La principal presentación clínica
de la enfermedad fue la meningitis. Se encontró que las
manifestaciones clínicas sufridas por cada paciente eran
dependientes de su enfermedad de fondo (X2 = 12.013, gl
= 5, p = 0.035), ya que la proporción de pacientes VIH
positivos con cuadros de meningitis (0.75) fue mayor que
la de los pacientes VIH negativos (0.39). Además, los
pacientes VIH positivos con meningitis fueron más
propensos a padecer de dolores de cabeza, náuseas,
pérdida de peso y signos meníngeos de Kernig y
Brudzinski. Por otro lado, la proporción de pacientes
VIH negativos que desarrollaron complicaciones
pulmonares (0.22) fue mayor que la de los pacientes VIH
positivos (0.02).
Tabla 1. Factores de riesgo asociados a la infección con levaduras del
género Cryptococcus (n = 74).
*Drogas (cocaína, cannabis, benzodiacepinas), etilismo y tabaquismo.
**Colitis ulcerosa crónica inespecífica y lupus eritematoso sistémico.
Figura 3. Presentación clínica de la criptococosis de los pacientes
VIH positivos y VIH negativos. DMO = Diseminación a médula ósea.
En la Tabla 2 se presentan los tipos de muestras
clínicas de las cuales se aislaron las cepas de
Cryptococcus. Los aislamientos fueron analizados tanto
mediante pruebas bioquímicas como mediante pruebas
moleculares. Según las pruebas fenotípicas, todos los
aislamientos presentaron cápsula, hidrolizaron la urea y
tenían lacasas. Sólo un aislamiento logró crecer en
presencia de la canavanina y metabolizar la glicina; este
aislamiento se obtuvo a partir de una biopsia de médula
ósea y fue identificado por el equipo automatizado
Vitek® como Cryptococcus laurentii, con un porcentaje
de certeza del 95 %. El resto de los hongos fueron
identificados como C. neoformans, al utilizar las técnicas
bioquímicas.
Jaikel-Víquez et al – Tipificación molecular y susceptibilidad frente a fluconazol del complejo
Cryptococcus neoformans/Cryptococcus gattii
16
Rev Panam Enf Inf 2018; 1(1):12-20.
El estudio molecular agrupó a los aislamientos
identificados, por bioquímica, como C. neoformans en
dos de los ocho patrones moleculares mayoritarios, 69
(93.24 %) eran del tipo molecular VNI y cuatro VNII
(5.41 %) (Figura 4). Los pacientes VIH positivos estaban
infectados con los genotipos VNI y VNII y con C.
laurentii. Por otro lado, los pacientes VIH negativos sólo
estaban infectados con levaduras del genotipo VNI.
Tabla 2. Tipos de muestras clínicas positivas por Cryptococcus spp.
(n = 74).
*LBA = lavado broncoalveolar. **úlcera nasal. ***úlcera rectal.
Todos los aislamientos analizados fueron
clasificados como sensibles al fluconazol ya que
presentaron CMIs ≤ 8 µg/mL (Tabla 3).
Tabla 3. Patrones de susceptibilidad in vitro al fluconazol de los
aislamientos de Cryptococcus spp.
*NA = No aplica. **MG = media geométrica.
Discusión
En el presente trabajo se determinaron los patrones
moleculares del complejo C. neoformans/C. gattii y el
patrón de susceptibilidad in vitro al FL de aislamientos
clínicos costarricenses. Primeramente, se revisaron los
expedientes clínicos para obtener información sobre la
situación de esta enfermedad en la población estudiada.
Al analizar el perfil demográfico de los pacientes
encontramos que la mayoría eran hombres, adultos y que
estaban infectados con VIH. Esto concuerda con la
literatura mundial ya que la criptococosis es una
infección oportunista y el número de casos aumentó
exponencialmente a partir de la década de 1980, luego de
la epidemia del SIDA (23-27).
Figura 4. Ejemplos de los genotipos del complejo C. neoformans/C.
gattii detectados según la técnica de restricción enzimática del gen
URA5. WM = Hospital Westmead; HCG = Hospital Rafael Ángel
Calderón Guardia; HSJD = Hospital San Juan de Dios; VG = variante
gattii; VN = variante neoformans. Marcador de peso molecular
(GeneRuler 50 pb DNA Ladder, Thermo Scientific®)
A su vez, la mayoría de los pacientes que estaban
infectados con este virus vivían en los cantones Central
y Desamparados de la provincia de San José. Esto es
congruente con el informe del Ministerio de Salud de
Costa Rica donde se menciona que para el 2014 los tres
cantones con el mayor número de casos diagnosticados
con VIH eran: Central de San José con 151 (45.6 casos
por cada 100 000 habitantes), Central de Alajuela con 63
(21.8 casos por cada 100 000 habitantes) y
Desamparados con 53 (23 casos por cada 100 000
habitantes) y los tres cantones con el mayor número de
pacientes que entraron en fase SIDA eran: Central de San
José con 24 (7.3 casos por cada 100 000 habitantes),
Central de Heredia con 8 (6 casos por cada 100 000
habitantes) y Desamparados con 4 (1.7 por cada 100 000
habitantes) (28). Además, es importante destacar que, en
Latinoamérica, entre el 55 y el 76 % de los pacientes VIH
positivos son diagnosticados de forma tardía (29).
Nuestro país no es la excepción, ya que en un estudio
realizado entre los años 2003 y 2009 que incluyó a 282
Jaikel-Víquez et al – Tipificación molecular y susceptibilidad frente a fluconazol del complejo
Cryptococcus neoformans/Cryptococcus gattii
17
Rev Panam Enf Inf 2018; 1(1):12-20.
pacientes de la Clínica de Atención al Paciente con VIH
del HSJD, se reportó que un 46.8 % de los pacientes
fueron diagnosticados cuando ya presentaban conteos de
linfocitos CD4+ menores de 200 células/µL. Esto indica
que estos pacientes, según la evolución natural de la
enfermedad, han sido portadores de la infección entre
ocho y diez años, convirtiéndose en potenciales
transmisores del virus, debido al desconocimiento y que
están en riesgo de contraer distintas enfermedades
oportunistas (30), entre ellas la criptococosis. Por ejemplo,
en este estudio a una paciente se le aisló C. neoformans
partir de una úlcera que tenía en la nariz y luego del
diagnóstico de la micosis se le realizaron exámenes para
buscarle posibles causas de inmunosupresión,
encontrándose que era VIH positivo en fase SIDA.
Existen dos teorías, complementarias entre sí, que
tratan de explicar el por qué la mayoría de los casos de
criptococosis son diagnosticados en pacientes
masculinos. La primera se basa en que el principal factor
de riesgo para contraer esta enfermedad es el estar
infectado con VIH y la mayoría de los pacientes VIH
positivos son de sexo masculino (31). En Costa Rica; por
ejemplo, la razón promedio de hombres a mujeres
infectados con este virus es de 4.9 y de pacientes en fase
SIDA de 4.8, entre los años 2011 y 2014 (28).
Por otro lado, en la época pre-SIDA, también se
reportaba una mayor cantidad de pacientes masculinos
con criptococosis; por lo tanto, la segunda teoría trata de
explicar este fenómeno basándose en las diferencias que
existen en la respuesta inmune de los pacientes
masculinos y femeninos. McClelland y colaboradores
analizaron el efecto de las hormonas sexuales sobre los
factores de virulencia de Cryptococcus y encontraron que
la testosterona induce la producción de cápsula, pero el
17-β-estradiol no ejerce efecto sobre su producción (32).
Esto podría sugerir que los hombres se enferman tanto al
inhalar levaduras que producen mucha cápsula como al
inhalar levaduras que producen poca cápsula, porque su
testosterona induce la producción de glucoroxilomanano
(GXM), componente mayoritario de la misma. Por el
contrario, las mujeres solo se enferman cuando inhalan
levaduras que producen mucho GXM, porque cuando se
infectan con hongos que producen cápsulas pequeñas,
éstos son fácilmente opsonizados por las proteínas A y D
del surfactante (33,34) y por el C3b (35), facilitando así su
fagocitosis.
Como se mencionó anteriormente, la criptococosis
es una infección oportunista y por lo tanto, se manifiesta
en pacientes que tengan alguna condición
inmunosupresora. Los otros factores de riesgo
encontrados en el estudio fueron uso de corticosteroides,
cáncer, diabetes mellitus, consumo de sustancias nocivas
como cocaína y marihuana, cirrosis, mieloma múltiple,
enfermedades autoinmunes y trasplantes de órgano
sólido. Es importante resaltar que la criptococosis es la
tercera micosis desarrollada por los receptores de
trasplante de órgano sólido, manifestándose entre el 2 y
el 8 % de estos pacientes (36). Estas enfermedades de
fondo concuerdan con las reportadas en otros estudios
epidemiológicos (27,37,38) y con los reportes de casos
clínicos de pacientes costarricenses a lo largo de la
historia. El primer caso clínico confirmado de
criptococosis en Costa Rica fue reportado en 1960 por
Hidalgo y colaboradores. A partir de este momento se
han publicado varios casos en los cuales se describen
distintos factores de riesgo, a saber: etilismo, tabaquismo
(39,40), consumo de cocaína y marihuana (40,41), diabetes
mellitus, desnutrición (42), uso de prednisona, LES (23,43) y
por supuesto, VIH/SIDA (41,42).
Por otro lado, el desarrollo de esta infección es poco
frecuente en pacientes inmunocompetentes. En nuestro
estudio tres (4 %) de los pacientes no presentaron ningún
factor de riesgo conocido que favoreciera el desarrollo de
la criptococosis. Estos pacientes estaban infectados con
levaduras de los genotipos VNI. En otros países también
se han reportado casos de pacientes inmunocompetentes
enfermos. En Tailandia; por ejemplo, se reportó un
porcentaje muy similar al encontrado en nuestro estudio
(4.2 %) (27) y en Colombia de un 7.6 % (44). El problema
más grande es que la mortalidad suele ser mayor en estos
pacientes, ya que cuando ingresan al centro médico no se
sospecha que tengan una criptococosis y por ende, el
diagnóstico se realiza de forma tardía. El diagnóstico e
inicio de tratamiento tardío conllevan a la aparición de
secuelas neurológicas, hidrocefalia y ceguera, afectando
su calidad de vida (31).
Con respecto a las distintas formas clínicas de la
criptococosis, encontramos que los pacientes VIH/SIDA
presentaban manifestaciones clínicas diferentes a las de
los pacientes VIH negativos. Esto ha sido ampliamente
documentado en la literatura mundial. La
neurocriptococosis está principalmente descrita en
personas VIH positivos (27,44). Estos pacientes sufren de
dolor de cabeza, fiebre, signos meníngeos de Kernig y
Brudzinski, estado mental alterado, confusión,
problemas neurológicos focalizados, aumento de la
presión intracraneana y rigidez nucal (25). En estos
pacientes con neurocriptococosis también se ha
reportado diseminación a piel (44,45). Las lesiones
cutáneas pueden ser máculas, pápulas tipo molusco
contagioso, pústulas, lesiones similares a Herpes Zóster,
equimosis, púrpuras palpables, lesiones similares a
Jaikel-Víquez et al – Tipificación molecular y susceptibilidad frente a fluconazol del complejo
Cryptococcus neoformans/Cryptococcus gattii
18
Rev Panam Enf Inf 2018; 1(1):12-20.
sarcoma de Kaposi, nódulos subcutáneos, úlceras tipo
pioderma gangrenoso, gomas, abscesos, lesiones pseudo
tumorales y celulitis (31). En este estudio, una de las
pacientes analizadas presentó lesiones cutáneas de tipo
ulcerativo secundarias al foco primario pulmonar. En
cambio, la presentación pulmonar es más frecuente en los
pacientes VIH negativos (44), lo cual fue observado
también en el presente trabajo.
El análisis genético de los aislamientos obtenidos a
partir de los pacientes con criptococosis reveló que el
98.5 % de los aislamientos se agruparon en dos de los
genotipos mayoritarios del complejo C. neoformans/C.
gattii. El principal genotipo determinado en este estudio
fue el VNI. Diversos estudios epidemiológicos que se
han llevado a cabo a nivel mundial también han
reportado que el VNI es el principal causante de
criptococosis (1,45,46). Por ejemplo, en Suramérica se ha
reportado en un 63 - 64 % de los aislamientos de
pacientes adultos (46) y en el 85.3 % de los pacientes
pediátricos (43), en África en un 68 - 72.6 % (1,32,46) en Asia
en un 74 - 81 % (1,45,46). En el caso de Centroamérica, los
estudios moleculares evidencian una prevalencia del
VNI de 78 - 88 %; sin embargo, no se especifica si las
muestras analizadas eran clínicas o ambientales (1,46). El
otro genotipo identificado fue el VNII. Este genotipo es
menos frecuente ya que se ha reportado en un 0.2 – 13 %
de los aislamientos (1,25,46,).
Por otro lado, uno de los pacientes estaba infectado
con C. laurentii. Esto llama la atención porque las
infecciones por levaduras que no pertenecen al complejo
son muy poco frecuentes (31). El caso del presente estudio
corresponde a un paciente masculino de 34 años que en
su historial clínico presentaba infección con VIH, baja
adherencia a los antiretrovirales, drogadicción,
pancitopenia, conteo de linfocitos CD4+ de 29
células/µL y una carga viral de 103 171 copias/mL. El
paciente ingresó con un cuadro febril, confusión, mareos
y baja respuesta a los estímulos y falleció cuatro días
después de que se le aislara C. laurentii de médula ósea.
En el presente estudio, ninguno de los pacientes
estaba infectado con C. gattii. Esta especie es la más
frecuentemente aislada de pacientes australianos (1) y fue
la responsable del brote de Vancouver, Canadá (10). Sin
embargo, los resultados obtenidos no descartan la
presencia de esta levadura en nuestro país, ya que en un
estudio previo en el que se analizaron 2 755 aislamientos
recolectados globalmente, Meyer y Trilles identificaron
una cepa de VGII proveniente de Costa Rica (46), pero no
se menciona si la cepa fue aislada a partir de una muestra
clínica o ambiental.
Una vez identificadas las cepas, se procedió a
determinarles el perfil de susceptibilidad in vitro al FL,
ya que éste es el principal antifúngico empleado para el
tratamiento de la criptococosis en Costa Rica. Como
resultado principal, encontramos que todos los
aislamientos analizados eran sensibles a este
antimicótico y al igual que en un estudio publicado por
Pedroso y colaboradores (2010) (48). Esto es congruente
con lo reportado por otros estudios, porque se estima que
alrededor del 99 % de los aislamientos de C. neoformans
a nivel mundial son sensibles (45). La alta sensibilidad
encontrada se podría deber a una baja presión selectiva,
ya que la mayoría de los pacientes no recibieron
tratamiento antimicótico profiláctico porque ingresaron
al hospital cuando ya la criptococosis estaba muy
avanzada.
A pesar de que la mayoría de los aislamientos, a nivel
mundial, son sensibles, se considera que el amplio uso
del fluconazol, especialmente en los pacientes VIH
positivos, podría generar una presión selectiva en el
surgimiento de cepas menos susceptibles a este
tratamiento. En la literatura sí se han reportado casos de
aislamientos del complejo C. neoformans/C. gattii
resistentes a este antifúngico, pero son poco frecuentes y
en su mayoría corresponden a la especie C. gattii (26). El
tratamiento para una criptococosis causada por C. gattii
es el mismo que para una causada por C. neoformans,
pero la respuesta es más lenta porque presentan MICs
más altas y hay poca penetración del antimicótico en los
criptococomas (45).
En conclusión, en el presente estudio se demostró
por primera vez en Costa Rica el predominio de C.
neoformans var. grubii VNI y que la resistencia no
constituye un problema entre los aislamientos
estudiados. Sin embargo, es fundamental realizar una
vigilancia epidemiológica constante de los aislamientos
autóctonos para así monitorear su comportamiento ante
los antimicóticos y poder determinar de forma objetiva
los lineamientos terapéuticos a seguir, con miras a
mejorar la calidad de vida de las personas afectadas por
esta micosis.
Agradecimientos
Le agradecemos al Dr. Wieland Meyer y a la Dra.
Elizabeth Castañeda, por facilitarnos las cepas control
del Complejo Cryptococcus neoformans/C. gattii.
También a la Dra. Nury Mora Brenes del Hospital San
Juan de Dios, a la Dra. Lilliana Sandoval del Hospital
México y a las Dras. Cristina García y Yensie Robbinson
del Hospital Rafael Ángel Calderón Guardia, por todo su
apoyo y por la donación de los aislamientos clínicos.
Jaikel-Víquez et al – Tipificación molecular y susceptibilidad frente a fluconazol del complejo
Cryptococcus neoformans/Cryptococcus gattii
19
Rev Panam Enf Inf 2018; 1(1):12-20.
Financiamiento
El proyecto fue financiado por los proyectos 803-B3-001
y 803-B6-119 de la Vicerrectoría de Investigación de la
Universidad de Costa Rica.
Referencias
1. Cogliati M. Global Molecular Epidemiology of Cryptococcus
neoformans and Cryptococcus gattii: An Atlas of the Molecular
Types. Scientifica 2013. 2013:1-23.
2. Kidd SE, Hagen F. A rare genotype of Cryptococcus gattii
caused the cryptococcosis outbreak on Vancouver Island (British
Columbia, Canada). Proc Natl Acad Sci 2004; 101:17258-63.
3. Tseng HK, Liu CP, Ho MW, Lu PL, Lo HJ, Lin H, et al.
Microbiological, epidemiological, and clinical characteristics
and outcomes of patients with cryptococcosis in Taiwan, 1997-
2010. PLoS ONE 2013; 8(4): e61921.
doi:10.1371/journal.pone.0061921.
4. Pappas PG. Cryptococcal infections in non-HIV-infected
patients. Trans Am Clin Climatol Association 2013; 124: 61-79.
5. Wilson TS, Fleming WA, Robinson FLJ, Nicholl B.
Cryptococcal meningitis associated with steroid therapy. J Clin
Path 1970; 23: 657-63.
6. Brizendine KD, Baddley JW, Pappas PG. Predictors of mortality
and differences in clinical features among patients with
cryptococcosis according to immune status. PLoS ONE 2013;
8(3): e60431. doi:10.1371/journal.pone.0060431.
7. Escandón P, Sánchez A, Martínez M, Meyer W, Castañeda E.
Molecular epidemiology of clinical and environmental isolates
of the Cryptococcus neoformans species complex reveals a high
diversity and the presence of the molecular type VGII mating
type in Colombia. FEMS Yeast Res 2006; 6:625−35.
8. Desnos-Ollivier M, Patel S, Spaulding AR, Charlier C, Garcia-
Hermoso D, Nielsen K, et al. Mixed infections and in vivo
evolution in the human fungal pathogen Cryptococcus
neoformans. mBio 2010; 1: 1−9. doi:10.1128/mBio.00091-169
10.
9. Mijara T, Izumikawa K, Kakeya H, Ngamskulrungro P,
Umeyama T, Takazono T, et al. Multilocus sequence typing of
Cryptococcus neoformans in non-HIV associated cryptococcosis
in Nagasaki, Japan Med Mycol 2013; 51: 252-60.
10. Hoang LMN, Maguie JA, Doyle P, Murray F, Roscoe DL.
Cryptococcus neoformans infections at Vancouver Hospital and
Health Sciences Centre (1997-2002): epidemiology,
microbiology and histopathology. J Med Microbiol 2004; 53:
935-40.
11. Chowdhary A, Prakash A, Randhawa HS, Kathuria S, Hagen F,
Klaassen CH, et al. First environmental isolation of
Cryptococcus gattii, genotype AFLP5, from India and a global
review. Mycoses 2013; 56: 222-8.
12. Rippon J. Micología Médica: Hongos y Actinomicetes
Patógenos. 1 st ed. Medellín: Interamericana; 1990.
13. Antinori S. New insights into HIV/AIDS-associated
cryptococcosis. Hindawi Pub Co. 2013: Article ID 471363.
14. Bicanic T, Harrison T. Cryptococcal meningitis. Br Med Bull
2005; 72: 99-118.
15. Park BJ, Wannemuehler KA, Marston BJ, Govender N, Pappas
PG, Chiller TM. Estimation of the current global burden of
cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS.
AIDS 2009; 23: 525-30.
16. Govender NP, Patel J, van Wyk M, Chiller TM, Lockhart SR,
GERMS-SA. Trend in antifungal drug susceptibility of
Cryptococcus neoformans isolates obtained through population-
based surveillance in South Africa in 2002-2003 and 2007-2008.
Antimicrob Agents Chemother 2011; 55(6): 2606-11.
17. Aller AL, Martin-Mazuelos E, Lozano F, Gomez-Mateos J,
Steele-Moore L, Holloway WJ, et al. Correlation of fluconazole
MICs with clinical outcome in cryptococccal infection.
Antimicrob Agents Chemother 2000; 44: 1544-48.
18. Khan ZU, Randhawa HS, Chehadeh W, Chowdhary A, Kowshik
T, Chandy R. Cryptococcus neoformans serotype A and
Cryptococcus gattii serotype B isolates differ in their
susceptibility to fluconazole and voriconazole. Int J Antimicrob
Agents 2009; 33: 559-63.
19. Lockhart SR, Iqbal N, Bolden CB, DeBess C, De Bess E,
Marsden-Haug N, et al. Epidemiologic cutoff values for triazole
drugs in Cryptococcus gattii: correlation of molecular type and
in vitro susceptibility. Diagn Microbiol Infect Dis 2012; 73: 144-
8.
20. Gross N, Salas I. Métodos Diagnóstico en Micología Médica. 1st
ed. San José: Editorial UCR; 2012.
21. Sosa MA, Rojas F, Mangiaterra M, Giusiano G. Prevalencia de
especies de Malassezia asociadas a lesiones de dermatitis
seborreica en pacientes de Argentina. Rev Iberoam Micol 2013;
30: 239-42.
22. Cantón E, Martín E, Espinel-Ingroff A. Capítulo 15 Métodos
estandarizados por el CLSI para el estudio de la sensibilidad a
los antifúngicos (documentos M27-A3, M38-A y M44-A). En:
Pemán J, Martín-Mazuelos E, Rubio-Calvo MC, editores. Guía
Práctica de Identificación y Diagnóstico en Micología Clínica.
Bilbao, 2007; ISBN:978-84-611-8776-8. Disponible en:
http://www.guia.reviberoammicol.com/Capitulo15.pdf
23. Díaz JF, Alpízar R. 1994. Criptococosis del sistema nervioso
central en diez pacientes con lupus eritematosos sistémico. Rev
Clin Esp 1994; 195: 12-5.
24. Arechavala AI, Ochiuzzi ME, Borgnia MD, Santiso GM.
Fluconazole and amphotericin B susceptibility testing
Cryptococcus neoformans: Results of minimal inhibitory
concentrations against 265 isolates from HIV-positive patients
before and after two or more months of antifungal therapy. Rev
Iberoam Micol 2009; 26(3): 194-7.
25. Rothe C, Sloan DJ, Goodson P, Chikafa J, Mukaka M, Denis B,
et al. A Prospective Longitudinal Study of the Clinical Outcomes
from Cryptococcal Meningitis following Treatment Induction
with 800 mg Oral Fluconazole in Blantyre, Malawi. PLoS ONE
2013; 8(6): e67311.doi:10.1371/journal.pone.0067311.
26. Ilnait- Zaragozí MT, Gerardus JF, Martínez GF, Breuker IC,
Fernández-Andreu CM, Perurena-Lancha MR. Susceptibilidad
in vitro frente a fluconazole y voriconazol de cepas de
Cryptococcus aisladas en Cuba. Rev Cubana Med Trop 2009;
61(1): 70-4.
27. Chayakulkeeree M, Wangchinda P. Clinical Characteristics and
Outcomes of Patients with Cryptococcal Meningoencephalitis in
a Resource-Limited Setting. J Med Assoc Thai 2014; 97(3): 26-
34.
28. Ministerio de Salud de Costa Rica. Costa Rica 2002-2014.
Estadísticas de VIH, Sida y mortalidad por Sida. 2015.Tomado
de www.ministeriodesalud.go.cr
29. Vidal JE, Penalva AC, Dauar RF, Boulware DR. Strategies to
reduce mortality and morbidity due to AISA-related
Jaikel-Víquez et al – Tipificación molecular y susceptibilidad frente a fluconazol del complejo
Cryptococcus neoformans/Cryptococcus gattii
20
Rev Panam Enf Inf 2018; 1(1):12-20.
cryptococcal meningitis in Latin America. Braz J Infect Dis
2013; 17(3): 353-62.
30. Vargas C, Boza R. Condición inmunológica de los pacientes
portadores de VIH/SIDA en el momento de su diagnóstico en el
Hospital San Juan de Dios. Acta Med Costarric 2012; 54(3):
159-64.
31. Tello M, Gutiérrez E, Béjar V, Galarza C, Ramos W, Ortega-
Loayza A. Criptococosis. Rev Méd Risaralda 2013; 19(2): 147-
53.
32. McClelland EE, Hobbs LM, Rivera J, Casadevall A, Potts WK,
Smith JM, et al. The role of host gender in the pathogenesis of
Cryptococcus neoformans infections. PLoS ONE 2013;
8(5):e63632.doi:10.1371/journal.pone.0063632.
33. Ellerbroek P, Vecchiarelli A, Hoepelman A, Coenjaerts F.
Chapter 17. Immunology of infections with Cryptoccuus
neoformans. In: Brown GD, Netea MG. Immunology of Fungal
Infections. New York: Springer; 2007. p. 383-407.
34. Pastva AM, Wright JR, Williams KL. Immunomodulatory roles
of surfactant proteins A and D implications in lung disease. Proc
Am Thorac Soc 2007; 4(3): 252-7.
35. Voelz K, May R. Cryptococcal interactions with the host
immune system. Eukaryot Cell 2010; 9(6): 835-46.
36. Khan A, El-Charabaty E, El-Sayegh S. Fungal infections in renal
transplant patients. J Clin Med Res 2015; 7(6): 371-8.
37. Trpković A, Pekmezović M, Barać A, Crnĉević L, Arsić V. In
vitro antifungal activities of amphotericin B, 5-fluorocytosine,
fluconazole and itraconazole against Cryptococcus neoformans
isolates from cerebrospinal fluid and blood from patients in
Serbia. J Mycol Med 2012; 22: 243-8.
38. Zhong YH, Tan F, Li M, Liu J, Wang X, Yuan Y, Zhong XF,
Peng FH. Comparisons of presentations and outcomes of
cryptococcal meningitis between patients with and without
hepatitis B virus infection. Inter J Infect Dis 2014; 20: 31-6.
39. Alice E. Criptococosis. Rev Med Costa Rica. 1979; 46(467): 71-
2.
40. Campbell D. Meningitis por Cryptococcus neoformans, reporte
de un caso. Rev Col Microbiol Costa Rica. 2007; 13(1): 16-7.
41. Brizuela S, Montero N. Criptococosis asociado a VIH/SIDA (A
propósito de un paciente). Rev Med Costa Rica 2013; 70(605):
43-7.
42. Mora JF, Solano A, Rodríguez G, Artiñano M, Palma O, Chacón
R, Sánchez T. Tratamiento con fluconazol de la candidiasis
sistémica y la meningitis por Cryptococcus. Rev Cost Cienc Med
1989; 10(4): 61-9.
43. Villalobos MA. Enfermedades infecciosas en pacientes con
lupus eritematoso sistémico en el Hospital Calderón Guardia:
Caracterización, incidencia, profilaxis y factores asociados. Rev
Clin Escuela Med UCR-HSJD 2012; 22(4): 21-33.
44. Escandón P, de Bedout C, Lizarazo J, Agudelo CI, Tobón A,
Bello S, et al. Cryptococcosis in Colombia: Results of the
national surveillance program for the years 2006-2010.
Biomédica 2012; 32: 386-98.
45. Li M, Liao Y, Chen M, Pan W, Weng L. Antifungal
susceptibilities of Cryptococcus species complex isolates from
AIDS and non-AIDS patients in Southeast China. Braz J Infect
Dis 2012; 16(2): 175-9.
46. Meyer W, Trilles L. Genotyping of the Cryptococcus
neoformnas/ C. gattii Species Complex. Australian Biochemist
2010; 41(1): 12-6.
47. Lizarazo J, Escandón P, Agudelo CI, Castañeda E.
Cryptococcosis in Colombian children and literature review.
Mem Inst Oswaldo Cruz 2014; 109(6): 797-804.
48. Pedroso R, Lavrador M, Ferreira J, Candido R, Maffei C.
Cryptococcus neoformans var. grubii- Pathogenicity of
environmental isolates correlated to virulence factors,
susceptibility to fluconazole and molecular profile. Mem Inst
Oswaldo Cruz 2010; 105(8): 993-1000.
49. Sloan D, Parris V. Cryptococcal meningitis: epidemiology and
therapeutic options. Clin Epi 2014; 6: 169-82.
Autor Corresponsal: Daniela Jaikel Víquez. Universidad de
Costa Rica, San Pedro, Costa Rica. Apartado postal: 905-3000,
Heredia, Costa Rica. Teléfono (506) 8832-9008/ (506) 2511-
8624. Email: daniela.jaikelviquez@ucr.ac.cr
Conflict of interest: No conflict of interest is declared.