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Tipificación molecular y susceptibilidad in vitro frente a fluconazol de aislamientos clínicos costarricenses del complejo Cryptococcus neoformans/Cryptococcus gattii

Authors:

Abstract and Figures

Introduction: Cryptococcosis is a life-threatening fungal infection caused by the Cryptococcus neoformans/Cryptococcus gattii species complex. Our aim was to determine the molecular epidemiology and the antimicrobial susceptibility to fluconazole (FL) of clinical isolates of Cryptococcus spp. Methods: Seventyfour patients with cryptococcosis were studied, from 2011 to 2014. Demographic data, risk factors and outcome of each patient were obtained from the medical records. The isolates were identified by standard methods, such as india ink preparation, uresase test, growth on L-dopa and canavanine-glycine-bromothymol blue agar. The biochemical profile was identified by the automated system Vitek® (BioMérieux, France). The molecular types were assigned by RFLP-URA5 analysis and the minimal inhibitory concentration (MIC) of FL was determined with the broth micro-dilution technique. Results: Cryptococcosis was more prevalent in HIV-positive male patients with a mean age of 43.5 years old. The majority of the isolates (98.6 %) were identified as C. neoformans var. grubii (93.2 % VNI and 5.4 % VNII) and 1.4 % as Cryptococcus laurentii. The MIC values of all isolates tested were ≤ 8 µg/mL. Conclusion: The most prevalent molecular type of the clinical C. neoformans/C. gattii species complex in Costa Rica is VNI. Additionally, FL was effective against the isolates tested.
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Artículo Original
Tipificación molecular y susceptibilidad in vitro frente a fluconazol de aislamientos
clínicos costarricenses del complejo Cryptococcus neoformans/Cryptococcus gattii
Daniela Jaikel-Víquez,1,2,* Lorena Uribe-Lorío,3 Norma T. Gross.1,2
1Sección de Micología Médica, Departamento de Microbiología, Facultad de Microbiología, Universidad de Costa Rica, San Pedro, Costa
Rica.
2Centro de Investigación en Enfermedades Tropicales (CIET), Facultad de Microbiología, Universidad de Costa Rica, San Pedro, Costa
Rica.
3Centro de Investigación en Biología Celular y Molecular (CIBCM), Universidad de Costa Rica, San Pedro, Costa Rica.
Rev Panam Enf Inf 2018; 1(1):12-20.
Received 30 October 2017 - Accepted 30 August 2018.
Copyright © 2018 Jaikel-Víquez et al. This is an open access article distributed under the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted
use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Resumen
Introducción: La criptococosis es una infección micótica oportunista causada por el complejo Cryptococcus neoformans/Cryptococcus gattii. El objetivo del
trabajo fue determinar los patrones moleculares del complejo C. neoformans/C. gattii de aislamientos clínicos y su susceptibilidad in vitro al fluconazol (FL).
Métodos: Se analizaron los expedientes clínicos de 74 pacientes diagnosticados con criptococosis, entre el 2011 y el 2014. Los aislamientos obtenidos fueron
caracterizados: (i) fenotípicamente mediante el sistema automatizado Vitek® (BioMérieux, Francia), la prueba de la ureasa, la prueba de la fenil oxidasa y la
inoculación en medio canavanina-glicina y azul de bromotimol (ii) genéticamente mediante la restricción enzimática del gen URA5 con las enzimas Sau96I y
HhaI y (iii) de acuerdo a su patrón de susceptibilidad in vitro al FL mediante la técnica de microdilución en medio líquido. Resultados: Se encontró que la
mayoría de los pacientes eran de sexo masculino (86.5 %), con una edad promedio de 43.5 años, VIH positivos (75.7 %) y que ingresaron al centro médico con
un cuadro de meningitis criptococóccica. Con respecto a la caracterización fenotípica y genotípica se encontró que el 93.2 % de los aislamientos pertenecían al
genotipo VNI, el 5.4 % al VNII y el 1.4 % a la especie Cryptococcus laurentii. Además, todas las levaduras analizadas fueron sensibles al FL. Conclusiones: Se
demostró por primera vez en Costa Rica el predominio de C. neoformans var. grubii VNI, en aislamientos clínicos, y que la resistencia no constituye un problema
entre los aislamientos estudiados.
Palabras Clave: Criptococosis, Cryptococcus neoformans, Crytococcus gattii, fluconazol, meningitis.
Molecular typing and in vitro susceptibility to fluconazole of Costa Rican isolates of the Cryptococcus
neoformans/Cryptococcus gattii species complex
Abstract
Introduction: Cryptococcosis is a life-threatening fungal infection caused by the Cryptococcus neoformans/Cryptococcus gattii species complex. Our aim was
to determine the molecular epidemiology and the antimicrobial susceptibility to fluconazole (FL) of clinical isolates of Cryptococcus spp. Methods: Seventy-
four patients with cryptococcosis were studied, from 2011 to 2014. Demographic data, risk factors and outcome of each patient were obtained from the medical
records. The isolates were identified by standard methods, such as india ink preparation, uresase test, growth on L-dopa and canavanine-glycine-bromothymol
blue agar. The biochemical profile was identified by the automated system Vitek® (BioMérieux, France). The molecular types were assigned by RFLP-URA5
analysis and the minimal inhibitory concentration (MIC) of FL was determined with the broth micro-dilution technique. Results: Cryptococcosis was more
prevalent in HIV-positive male patients with a mean age of 43.5 years old. The majority of the isolates (98.6 %) were identified as C. neoformans var. grubii
(93.2 % VNI and 5.4 % VNII) and 1.4 % as Cryptococcus laurentii. The MIC values of all isolates tested were ≤ 8 µg/mL. Conclusion: The most prevalent
molecular type of the clinical C. neoformans/C. gattii species complex in Costa Rica is VNI. Additionally, FL was effective against the isolates tested.
Key words: Cryptococcosis, Cryptococcus neoformans, Crytococcus gattii, fluconazole, meningitis.
Introducción
La criptococosis es una infección micótica
oportunista causada por levaduras del complejo
Cryptococcus neoformans/Cryptococcus gattii.
Mediante serotipaje y técnicas moleculares se ha logrado
establecer que el complejo está conformado por cinco
serotipos y nueve patrones moleculares (1). La especie C.
neoformans está compuesta por: C. neoformans var.
grubii, serotipo A, patrones moleculares VNI, VNII y
VNB; C. neoformans var. neoformans, serotipo D, VNIV
y por un híbrido AD, VNIII. Por otro lado, la especie C.
gattii se divide en cuatro patrones moleculares VGI-
VGIV y en los serotipos B y C. Esta patología presenta
una distribución mundial; sin embargo, los distintos
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agentes etiológicos, aislados a partir de muestras
ambientales, clínicas humanas y veterinarias, tienen una
distribución geográfica delimitada. Por ejemplo, el
genotipo VNI posee distribución mundial; el VNB
solamente se ha aislado en África, el VNIV prevalece en
Europa, el VGI es principalmente aislado en Oceanía y
la mayoría de los aislamientos del VGII provienen de
América (1), siendo este último el genotipo causante del
brote de criptococosis en la isla de Vancouver, Canadá
(2). Esta infección se desarrolla, por lo general, en
pacientes VIH positivos en fase SIDA. Sin embargo,
también se han reportado en portadores del virus de
Hepatitis B, pacientes con enfermedades neoplásicas,
diabetes mellitus descompensada, cirrosis hepática,
enfermedades hematológicas (3) y según la Red de
Vigilancia de Infecciones Asociadas a Trasplantes en el
1 - 2 % de los pacientes receptores de trasplante de
órgano sólido (4). Otros pacientes susceptibles son los que
reciben terapia con corticosteroides (5), quimioterapia
citotóxica o inhibidores de la TNF-α (6). Los genotipos
VNI - VNIV y VGIII - VGIV son los responsables de
causar meningoencefalitis en estos pacientes (7-9). Por
otro lado, entre un 17 y un 22 % de los casos de
criptococosis se presentan en personas
inmunocompetentes o que no presentan ningún factor de
riesgo conocido (6) y son causados, en su mayoría, por los
genotipos VGI y VGII (10,11).
La infección por Cryptococcus se adquiere a través
de la inhalación de levaduras, por lo que el cuadro
comienza como una afección pulmonar. En pacientes
inmunocompetentes, el hongo suele permanecer a este
nivel formando granulomas (criptococomas); sin
embargo, en inmunosupresos puede diseminar hacia
otros órganos, especialmente al sistema nervioso central
(12). La fungemia ha sido reportada en un 47 - 71 % de los
pacientes VIH positivos en fase SIDA, pero solo en el 27
% de los pacientes que no han sido infectados por este
virus (13). Además, posee una alta mortalidad; por
ejemplo, en los países desarrollados se reporta hasta un
30 % y en África es de más del 60 % (14,15). Sin embargo,
puede llegar hasta el 100 % en pacientes que no han
recibido tratamiento antimicótico (14).
El tratamiento de elección consiste en la
administración de anfotericina B, 5-fluorocitosina y
fluconazol (FL), pero las fallas terapéuticas y las recaídas
son frecuentes (15). Una de las posibles causas asociada a
estas fallas terapéuticas es el uso extensivo de FL como
tratamiento profiláctico contra la candidiasis, en los
pacientes infectados con el virus de inmunodeficiencia
humana (VIH). La dosis recomendada para evitar una
infección por Candida spp. es de 200 mg por día,
mientras que la recomendada contra Cryptococcus es de
400 mg por día, por lo que estas dosis menores favorecen
la selección de cepas con sensibilidad disminuida (16).
Además, se ha demostrado que los pacientes infectados
con cepas que presentan concentraciones mínimas
inhibitorias (CMI) menores a 8 µg/mL responden mejor
al tratamiento que pacientes infectados con levaduras con
CMIs mayores a 16 µg/mL (17). También, se ha observado
que C. gattii VGII y otras especies como Cryptococcus
laurentii, Cryptococcus albidus y Cryptococcus
humicola presentan una resistencia mayor al tratamiento
que los aislamientos de C. neoformans (18,19). Por lo tanto,
el presente estudio propone dar a conocer la variabilidad
fenotípica y genética de algunos aislamientos clínicos
costarricenses del complejo C. neoformans/C. gattii y su
susceptibilidad in vitro al FL con el fin de aportar
información que pueda contribuir a mejorar el
tratamiento de la enfermedad.
Métodos
Perfiles demográficos de los pacientes con
criptococosis
Se analizaron aislamientos de Cryptococcus
obtenidos a partir de muestras clínicas de 74 pacientes
con criptococosis provenientes de tres hospitales
públicos del Área Metropolitana de la provincia de San
José, capital de Costa Rica: Hospital México (HM),
Hospital Rafael Ángel Calderón Guardia (HCG) y
Hospital San Juan de Dios (HSJD) (Figura 1), entre el
2011 y el 2014. Todos los datos obtenidos fueron
analizados y presentados de forma tal que en todos los
casos; sin excepción, se salvaguardó la identidad de cada
paciente. Se obtuvo la siguiente información: i) sexo,
edad y lugar de residencia del paciente, ii) condición al
egreso, iii) factores de riesgo, iv) fecha del diagnóstico
de la criptococosis, v) tipo de muestra de donde se aisló
el cultivo, vi) anormalidades radiológicas, vii)
manifestaciones clínicas y viii) tratamiento. El protocolo
de investigación fue aprobado por el Comité Local de
Bioética del Hospital San Juan de Dios, número de
protocolo CLOBI-HSJD-21-2014.
Caracterización fenotípica de los aislamientos de
Cryptococcus
La identificación fenotípica se realizó con las
siguientes pruebas: examen de la morfología
microscópica con tinta china, producción de ureasa en
agar urea de Christensen, producción de fenil oxidasas
en agar L-Dopa, identificación con el sistema
automatizado Vitek® (BioMérieux, Francia) e
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inoculación en agar canavanina glicina azul de
bromotimol (CGB) (20).
Figura 1. Mapa de Costa Rica. Área de atracción de los
hospitales México, Rafael Ángel Calderón Guardia y San
Juan de Dios. Los tres hospitales pertenecen al tercer
nivel de atención de la Caja Costarricense del Seguro
Social de Costa Rica.
Caracterización genotípica de los aislamientos de
Cryptococcus
Se realizó una extracción de ADN genómico
mediante la técnica de choque térmico (21). La tipificación
se realizó mediante la técnica de RFLP del gen URA5,
con las enzimas Sau96I y HhaI, utilizando el protocolo
de Escandón y colaboradores (2006) (7). La amplificación
se realizó con los imprimadores URA5 (5’ ATG TCC
TCC CAA GCC CTC GAC TCC 3’) y SJ01 (5’ TTA
AGA CCT CTG AAC ACC GTA CTC 3’) (7). Las
condiciones de la mezcla para el PCR con un volumen
final de 50 µL fueron: 50 ng de ADN, 1X de
amortiguador de la DreamTaq (KCl, (NH4)2SO4 y 20
mM MgCl2), 0.2 mM de la mezcla de nucleótidos, 50 ng
de cada imprimador y 1.5 U de la DreamTaq polimerasa
(Thermo Scientific, Estados Unidos). Se llevó a cabo en
35 ciclos de amplificación: desnaturalización inicial 91
°C por 3 minutos, desnaturalización a 94 °C por 45
segundos, alineamiento a 62 °C por 1 minuto, extensión
a 72 °C por 2 minutos y un ciclo de extensión final a 72
°C por 10 minutos. 17 µL del producto de PCR fueron
digeridos con las enzimas Sau96I (10 U/µL) y HhaI (20
U/µL). La restricción se realizó a 37 °C durante 3 horas.
Las digestiones se corrieron en geles de agarosa al 2.5 %
con buffer TAE a 80 V durante 3.5 horas. Los geles se
tiñeron con GelRed (Biotium) y se visualizaron
utilizando un transiluminador de luz ultravioleta (7).
Como controles positivos se utilizaron las cepas de
Cryptococcus WM 148 (VNI), WM 626 (VNII), WM
628 (VNII), 629 (VNIV), WM 179 (VGI), WM 178
(VGII), WM 161 (VGIII) and WM 779 (VGIV), del
Westmead Institute for Medical Research, Sydney,
Australia.
Determinación de la susceptibilidad in vitro al
fluconazol
Los patrones de susceptibilidad se determinaron
mediante el método de microdilución en medio líquido
según las directrices del documento M27-A3 del CLSI
(del inglés Clinical Laboratory Standard Institute) (22).
Para ello, se preparó una solución madre de FL (Pfizer,
Reino Unido) a 1280 µg/mL utilizando dimetil sulfóxido
(DMSO) (Sigma-Aldrich, Estados Unidos) como
diluente. Las concentraciones finales del antifúngico en
la placa fueron de 0.25 a 128 µg/Ml. Los controles que
se utilizaron fueron Candida krusei ATCC 6258 y
Candida parapsilosis ATCC 22019.
Análisis estadístico
Para analizar los resultados obtenidos se utilizó el
programa SPSS para Windows, versión 19 (SPSS Inc.,
Chicago, Ill, EEUU). Se realizaron pruebas de Xi2 y t-
student, con un 95 % de confianza, para determinar si
existía asociación entre las variables demográficas y
clínicas de los pacientes. Además, se determinó la media
geométrica y el rango para las CMIs de cada genotipo y
la CMI50 y la CMI90.
Resultados
Se analizaron un total de 74 expedientes clínicos de
pacientes con criptococosis. De estos, el 13.5 % eran de
sexo femenino y el 86.5 % de sexo masculino. El
promedio de edad fue de 43.5 años con un rango de 18 a
87 años. En la Figura 2 se muestra la distribución etaria
de los pacientes. Es importante mencionar que no se
encontraron diferencias estadísticamente significativas
entre las medias de edad de los pacientes según sexo (t =
1.087, gl = 72, p = 0.281). Con respecto al lugar de
residencia, el 66.2 % de los pacientes provenían de la
provincia de San José. No se encontró relación
estadísticamente significativa entre esta variable y el
estar infectado con VIH (X2 = 8.477; gl = 6; p = 0.205),
sin embargo, el 39.3 % de los pacientes VIH positivos
infectados con Cryptococcus provenían de los cantones
de Desamparados y Central, de la provincia de San José
(cantones pertenecientes al área de atracción del Hospital
San Juan de Dios).
En la Tabla 1 se presentan los distintos factores de
riesgo que presentaban los pacientes con criptococosis.
El 75.7 % de los pacientes estaban infectados con VIH.
Se encontró asociación estadísticamente significativa
entre la infección por este virus y el sexo del paciente (X2
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= 7.995, gl = 1, p = 0.011) porque la proporción de
hombres VIH positivos era mayor que la proporción de
mujeres VIH positivas; la mayoría de las mujeres de este
estudio habían sido sometidas a trasplante renal o tenían
lupus eritematoso sistémico (LES). En promedio, el
conteo de linfocitos CD4+ en los pacientes VIH/SIDA
fue de 60.6 células/µL (rango de 2 a 396 células/µL), a
la fecha del diagnóstico de la criptococosis y sus cargas
virales de 4 108 a más de 1 000 000 copias/mL. Cabe
resaltar que el médico tratante diagnosticó en fase SIDA
al 58.9 % de los pacientes VIH positivos, luego de la
infección con este hongo.
Figura 2. Distribución etaria de los pacientes diagnosticados con
criptococosis en Costa Rica, según sexo.
El resto de los pacientes VIH positivos, ya habían
sido diagnosticados en fase SIDA porque estaban
infectados previamente con alguna(s) de las siguientes
enfermedades: sífilis (n = 9), tuberculosis (n =7),
bacteremia por Pseudomonas aeruginosa (n = 1),
infección con Neisseria en líquido cefalorraquídeo
(LCR) (n = 1), pneumocistosis (n = 2), candidiasis
vaginal y oral (n = 4), histoplasmosis (n = 1),
toxoplasmosis (n = 3), tricomoniasis (n = 1), infección
con Virus Herpes (n = 3), Citomegalovirus (n = 5), Virus
de Hepatitis B (n = 4), Virus de Papiloma Humano en el
recto (n = 1) y estrongiloidiasis (n = 2).
En la Figura 3 se muestra la distribución de las
formas clínicas de criptococosis presentadas por los
pacientes analizados. La principal presentación clínica
de la enfermedad fue la meningitis. Se encontró que las
manifestaciones clínicas sufridas por cada paciente eran
dependientes de su enfermedad de fondo (X2 = 12.013, gl
= 5, p = 0.035), ya que la proporción de pacientes VIH
positivos con cuadros de meningitis (0.75) fue mayor que
la de los pacientes VIH negativos (0.39). Además, los
pacientes VIH positivos con meningitis fueron más
propensos a padecer de dolores de cabeza, náuseas,
pérdida de peso y signos meníngeos de Kernig y
Brudzinski. Por otro lado, la proporción de pacientes
VIH negativos que desarrollaron complicaciones
pulmonares (0.22) fue mayor que la de los pacientes VIH
positivos (0.02).
Tabla 1. Factores de riesgo asociados a la infección con levaduras del
género Cryptococcus (n = 74).
*Drogas (cocaína, cannabis, benzodiacepinas), etilismo y tabaquismo.
**Colitis ulcerosa crónica inespecífica y lupus eritematoso sistémico.
Figura 3. Presentación clínica de la criptococosis de los pacientes
VIH positivos y VIH negativos. DMO = Diseminación a médula ósea.
En la Tabla 2 se presentan los tipos de muestras
clínicas de las cuales se aislaron las cepas de
Cryptococcus. Los aislamientos fueron analizados tanto
mediante pruebas bioquímicas como mediante pruebas
moleculares. Según las pruebas fenotípicas, todos los
aislamientos presentaron cápsula, hidrolizaron la urea y
tenían lacasas. Sólo un aislamiento logró crecer en
presencia de la canavanina y metabolizar la glicina; este
aislamiento se obtuvo a partir de una biopsia de médula
ósea y fue identificado por el equipo automatizado
Vitek® como Cryptococcus laurentii, con un porcentaje
de certeza del 95 %. El resto de los hongos fueron
identificados como C. neoformans, al utilizar las técnicas
bioquímicas.
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El estudio molecular agrupó a los aislamientos
identificados, por bioquímica, como C. neoformans en
dos de los ocho patrones moleculares mayoritarios, 69
(93.24 %) eran del tipo molecular VNI y cuatro VNII
(5.41 %) (Figura 4). Los pacientes VIH positivos estaban
infectados con los genotipos VNI y VNII y con C.
laurentii. Por otro lado, los pacientes VIH negativos sólo
estaban infectados con levaduras del genotipo VNI.
Tabla 2. Tipos de muestras clínicas positivas por Cryptococcus spp.
(n = 74).
*LBA = lavado broncoalveolar. **úlcera nasal. ***úlcera rectal.
Todos los aislamientos analizados fueron
clasificados como sensibles al fluconazol ya que
presentaron CMIs ≤ 8 µg/mL (Tabla 3).
Tabla 3. Patrones de susceptibilidad in vitro al fluconazol de los
aislamientos de Cryptococcus spp.
*NA = No aplica. **MG = media geométrica.
Discusión
En el presente trabajo se determinaron los patrones
moleculares del complejo C. neoformans/C. gattii y el
patrón de susceptibilidad in vitro al FL de aislamientos
clínicos costarricenses. Primeramente, se revisaron los
expedientes clínicos para obtener información sobre la
situación de esta enfermedad en la población estudiada.
Al analizar el perfil demográfico de los pacientes
encontramos que la mayoría eran hombres, adultos y que
estaban infectados con VIH. Esto concuerda con la
literatura mundial ya que la criptococosis es una
infección oportunista y el número de casos aumentó
exponencialmente a partir de la década de 1980, luego de
la epidemia del SIDA (23-27).
Figura 4. Ejemplos de los genotipos del complejo C. neoformans/C.
gattii detectados según la técnica de restricción enzimática del gen
URA5. WM = Hospital Westmead; HCG = Hospital Rafael Ángel
Calderón Guardia; HSJD = Hospital San Juan de Dios; VG = variante
gattii; VN = variante neoformans. Marcador de peso molecular
(GeneRuler 50 pb DNA Ladder, Thermo Scientific®)
A su vez, la mayoría de los pacientes que estaban
infectados con este virus vivían en los cantones Central
y Desamparados de la provincia de San José. Esto es
congruente con el informe del Ministerio de Salud de
Costa Rica donde se menciona que para el 2014 los tres
cantones con el mayor número de casos diagnosticados
con VIH eran: Central de San José con 151 (45.6 casos
por cada 100 000 habitantes), Central de Alajuela con 63
(21.8 casos por cada 100 000 habitantes) y
Desamparados con 53 (23 casos por cada 100 000
habitantes) y los tres cantones con el mayor número de
pacientes que entraron en fase SIDA eran: Central de San
José con 24 (7.3 casos por cada 100 000 habitantes),
Central de Heredia con 8 (6 casos por cada 100 000
habitantes) y Desamparados con 4 (1.7 por cada 100 000
habitantes) (28). Además, es importante destacar que, en
Latinoamérica, entre el 55 y el 76 % de los pacientes VIH
positivos son diagnosticados de forma tardía (29).
Nuestro país no es la excepción, ya que en un estudio
realizado entre los años 2003 y 2009 que incluyó a 282
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pacientes de la Clínica de Atención al Paciente con VIH
del HSJD, se reportó que un 46.8 % de los pacientes
fueron diagnosticados cuando ya presentaban conteos de
linfocitos CD4+ menores de 200 células/µL. Esto indica
que estos pacientes, según la evolución natural de la
enfermedad, han sido portadores de la infección entre
ocho y diez años, convirtiéndose en potenciales
transmisores del virus, debido al desconocimiento y que
están en riesgo de contraer distintas enfermedades
oportunistas (30), entre ellas la criptococosis. Por ejemplo,
en este estudio a una paciente se le aisló C. neoformans
partir de una úlcera que tenía en la nariz y luego del
diagnóstico de la micosis se le realizaron exámenes para
buscarle posibles causas de inmunosupresión,
encontrándose que era VIH positivo en fase SIDA.
Existen dos teorías, complementarias entre sí, que
tratan de explicar el por qué la mayoría de los casos de
criptococosis son diagnosticados en pacientes
masculinos. La primera se basa en que el principal factor
de riesgo para contraer esta enfermedad es el estar
infectado con VIH y la mayoría de los pacientes VIH
positivos son de sexo masculino (31). En Costa Rica; por
ejemplo, la razón promedio de hombres a mujeres
infectados con este virus es de 4.9 y de pacientes en fase
SIDA de 4.8, entre los años 2011 y 2014 (28).
Por otro lado, en la época pre-SIDA, también se
reportaba una mayor cantidad de pacientes masculinos
con criptococosis; por lo tanto, la segunda teoría trata de
explicar este fenómeno basándose en las diferencias que
existen en la respuesta inmune de los pacientes
masculinos y femeninos. McClelland y colaboradores
analizaron el efecto de las hormonas sexuales sobre los
factores de virulencia de Cryptococcus y encontraron que
la testosterona induce la producción de cápsula, pero el
17-β-estradiol no ejerce efecto sobre su producción (32).
Esto podría sugerir que los hombres se enferman tanto al
inhalar levaduras que producen mucha cápsula como al
inhalar levaduras que producen poca cápsula, porque su
testosterona induce la producción de glucoroxilomanano
(GXM), componente mayoritario de la misma. Por el
contrario, las mujeres solo se enferman cuando inhalan
levaduras que producen mucho GXM, porque cuando se
infectan con hongos que producen cápsulas pequeñas,
éstos son fácilmente opsonizados por las proteínas A y D
del surfactante (33,34) y por el C3b (35), facilitando así su
fagocitosis.
Como se mencionó anteriormente, la criptococosis
es una infección oportunista y por lo tanto, se manifiesta
en pacientes que tengan alguna condición
inmunosupresora. Los otros factores de riesgo
encontrados en el estudio fueron uso de corticosteroides,
cáncer, diabetes mellitus, consumo de sustancias nocivas
como cocaína y marihuana, cirrosis, mieloma múltiple,
enfermedades autoinmunes y trasplantes de órgano
sólido. Es importante resaltar que la criptococosis es la
tercera micosis desarrollada por los receptores de
trasplante de órgano sólido, manifestándose entre el 2 y
el 8 % de estos pacientes (36). Estas enfermedades de
fondo concuerdan con las reportadas en otros estudios
epidemiológicos (27,37,38) y con los reportes de casos
clínicos de pacientes costarricenses a lo largo de la
historia. El primer caso clínico confirmado de
criptococosis en Costa Rica fue reportado en 1960 por
Hidalgo y colaboradores. A partir de este momento se
han publicado varios casos en los cuales se describen
distintos factores de riesgo, a saber: etilismo, tabaquismo
(39,40), consumo de cocaína y marihuana (40,41), diabetes
mellitus, desnutrición (42), uso de prednisona, LES (23,43) y
por supuesto, VIH/SIDA (41,42).
Por otro lado, el desarrollo de esta infección es poco
frecuente en pacientes inmunocompetentes. En nuestro
estudio tres (4 %) de los pacientes no presentaron ningún
factor de riesgo conocido que favoreciera el desarrollo de
la criptococosis. Estos pacientes estaban infectados con
levaduras de los genotipos VNI. En otros países también
se han reportado casos de pacientes inmunocompetentes
enfermos. En Tailandia; por ejemplo, se reportó un
porcentaje muy similar al encontrado en nuestro estudio
(4.2 %) (27) y en Colombia de un 7.6 % (44). El problema
más grande es que la mortalidad suele ser mayor en estos
pacientes, ya que cuando ingresan al centro médico no se
sospecha que tengan una criptococosis y por ende, el
diagnóstico se realiza de forma tardía. El diagnóstico e
inicio de tratamiento tardío conllevan a la aparición de
secuelas neurológicas, hidrocefalia y ceguera, afectando
su calidad de vida (31).
Con respecto a las distintas formas clínicas de la
criptococosis, encontramos que los pacientes VIH/SIDA
presentaban manifestaciones clínicas diferentes a las de
los pacientes VIH negativos. Esto ha sido ampliamente
documentado en la literatura mundial. La
neurocriptococosis está principalmente descrita en
personas VIH positivos (27,44). Estos pacientes sufren de
dolor de cabeza, fiebre, signos meníngeos de Kernig y
Brudzinski, estado mental alterado, confusión,
problemas neurológicos focalizados, aumento de la
presión intracraneana y rigidez nucal (25). En estos
pacientes con neurocriptococosis también se ha
reportado diseminación a piel (44,45). Las lesiones
cutáneas pueden ser máculas, pápulas tipo molusco
contagioso, pústulas, lesiones similares a Herpes Zóster,
equimosis, púrpuras palpables, lesiones similares a
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sarcoma de Kaposi, nódulos subcutáneos, úlceras tipo
pioderma gangrenoso, gomas, abscesos, lesiones pseudo
tumorales y celulitis (31). En este estudio, una de las
pacientes analizadas presentó lesiones cutáneas de tipo
ulcerativo secundarias al foco primario pulmonar. En
cambio, la presentación pulmonar es más frecuente en los
pacientes VIH negativos (44), lo cual fue observado
también en el presente trabajo.
El análisis genético de los aislamientos obtenidos a
partir de los pacientes con criptococosis reveló que el
98.5 % de los aislamientos se agruparon en dos de los
genotipos mayoritarios del complejo C. neoformans/C.
gattii. El principal genotipo determinado en este estudio
fue el VNI. Diversos estudios epidemiológicos que se
han llevado a cabo a nivel mundial también han
reportado que el VNI es el principal causante de
criptococosis (1,45,46). Por ejemplo, en Suramérica se ha
reportado en un 63 - 64 % de los aislamientos de
pacientes adultos (46) y en el 85.3 % de los pacientes
pediátricos (43), en África en un 68 - 72.6 % (1,32,46) en Asia
en un 74 - 81 % (1,45,46). En el caso de Centroamérica, los
estudios moleculares evidencian una prevalencia del
VNI de 78 - 88 %; sin embargo, no se especifica si las
muestras analizadas eran clínicas o ambientales (1,46). El
otro genotipo identificado fue el VNII. Este genotipo es
menos frecuente ya que se ha reportado en un 0.2 13 %
de los aislamientos (1,25,46,).
Por otro lado, uno de los pacientes estaba infectado
con C. laurentii. Esto llama la atención porque las
infecciones por levaduras que no pertenecen al complejo
son muy poco frecuentes (31). El caso del presente estudio
corresponde a un paciente masculino de 34 años que en
su historial clínico presentaba infección con VIH, baja
adherencia a los antiretrovirales, drogadicción,
pancitopenia, conteo de linfocitos CD4+ de 29
células/µL y una carga viral de 103 171 copias/mL. El
paciente ingresó con un cuadro febril, confusión, mareos
y baja respuesta a los estímulos y falleció cuatro días
después de que se le aislara C. laurentii de médula ósea.
En el presente estudio, ninguno de los pacientes
estaba infectado con C. gattii. Esta especie es la más
frecuentemente aislada de pacientes australianos (1) y fue
la responsable del brote de Vancouver, Canadá (10). Sin
embargo, los resultados obtenidos no descartan la
presencia de esta levadura en nuestro país, ya que en un
estudio previo en el que se analizaron 2 755 aislamientos
recolectados globalmente, Meyer y Trilles identificaron
una cepa de VGII proveniente de Costa Rica (46), pero no
se menciona si la cepa fue aislada a partir de una muestra
clínica o ambiental.
Una vez identificadas las cepas, se procedió a
determinarles el perfil de susceptibilidad in vitro al FL,
ya que éste es el principal antifúngico empleado para el
tratamiento de la criptococosis en Costa Rica. Como
resultado principal, encontramos que todos los
aislamientos analizados eran sensibles a este
antimicótico y al igual que en un estudio publicado por
Pedroso y colaboradores (2010) (48). Esto es congruente
con lo reportado por otros estudios, porque se estima que
alrededor del 99 % de los aislamientos de C. neoformans
a nivel mundial son sensibles (45). La alta sensibilidad
encontrada se podría deber a una baja presión selectiva,
ya que la mayoría de los pacientes no recibieron
tratamiento antimicótico profiláctico porque ingresaron
al hospital cuando ya la criptococosis estaba muy
avanzada.
A pesar de que la mayoría de los aislamientos, a nivel
mundial, son sensibles, se considera que el amplio uso
del fluconazol, especialmente en los pacientes VIH
positivos, podría generar una presión selectiva en el
surgimiento de cepas menos susceptibles a este
tratamiento. En la literatura sí se han reportado casos de
aislamientos del complejo C. neoformans/C. gattii
resistentes a este antifúngico, pero son poco frecuentes y
en su mayoría corresponden a la especie C. gattii (26). El
tratamiento para una criptococosis causada por C. gattii
es el mismo que para una causada por C. neoformans,
pero la respuesta es más lenta porque presentan MICs
más altas y hay poca penetración del antimicótico en los
criptococomas (45).
En conclusión, en el presente estudio se demostró
por primera vez en Costa Rica el predominio de C.
neoformans var. grubii VNI y que la resistencia no
constituye un problema entre los aislamientos
estudiados. Sin embargo, es fundamental realizar una
vigilancia epidemiológica constante de los aislamientos
autóctonos para así monitorear su comportamiento ante
los antimicóticos y poder determinar de forma objetiva
los lineamientos terapéuticos a seguir, con miras a
mejorar la calidad de vida de las personas afectadas por
esta micosis.
Agradecimientos
Le agradecemos al Dr. Wieland Meyer y a la Dra.
Elizabeth Castañeda, por facilitarnos las cepas control
del Complejo Cryptococcus neoformans/C. gattii.
También a la Dra. Nury Mora Brenes del Hospital San
Juan de Dios, a la Dra. Lilliana Sandoval del Hospital
xico y a las Dras. Cristina García y Yensie Robbinson
del Hospital Rafael Ángel Calderón Guardia, por todo su
apoyo y por la donación de los aislamientos clínicos.
Jaikel-Víquez et al Tipificación molecular y susceptibilidad frente a fluconazol del complejo
Cryptococcus neoformans/Cryptococcus gattii
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Financiamiento
El proyecto fue financiado por los proyectos 803-B3-001
y 803-B6-119 de la Vicerrectoría de Investigación de la
Universidad de Costa Rica.
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Autor Corresponsal: Daniela Jaikel Víquez. Universidad de
Costa Rica, San Pedro, Costa Rica. Apartado postal: 905-3000,
Heredia, Costa Rica. Teléfono (506) 8832-9008/ (506) 2511-
8624. Email: daniela.jaikelviquez@ucr.ac.cr
Conflict of interest: No conflict of interest is declared.
... Prior to this work, Costa Rican studies focused only on the morphological identification of the etiological agents of chromoblastomycosis [8,13,14], where those fungi that presented dematiaceous, Species-level identification is related to the pathology they cause, with F. pedrosoi and F. nubica been exclusive agents of chromoblastomycosis, and F. monophora and F. multimorphosa causing cerebral phaeohyphomycosis in immunocompetent patients and felines, respectively [17,19,27]. On the other hand, fungal infections at the brain level caused by hyaline fungi such as Cryptococcus spp., Aspergillus spp., Fusarium and Mucorales are mostly associated with immunosuppressive patients [28][29][30]. F. pedrosoi is the most frequently isolated species from chromoblastomycosis lesions worldwide [10,11,17,31,32], so it is not surprising that 60% of the isolates from this study were identified as this species. On the other hand, Yaguchi., et al. (2007) [17], reclassified a clinical isolate from Costa Rica from F. pedrosoi to F. monophora (GenBank access code AB117978 by ITS and AB253501 by cytochrome b sequencing), evidencing its presence in the country; data which was corroborated in this study. ...
Article
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Objetivo: El objetivo de este estudio fue aislar levaduras pertenecientes al complejo de especies Cryptococcus neoformans de los excrementos de paloma de Castilla (Columba livia) recolectados de plazas y parques públicos de El Salvador. Métodos: Las muestras se sembraron en medios de cultivos convencionales y a las colonias confirmadas se les efectuó una tipificación mediante la técnica de restricción enzimática del gen URA5. Resultados: De un total de 66 muestras analizadas, tres estaban positivas por levaduras pertenecientes al complejo de especies Cryptococcus neoformans. El estudio molecular agrupó los aislamientos en los tipos moleculares VNI y VNII; ambos corresponden a la especie Cryptococcus neoformans sensu stricto. Conclusión: En los sitios estudiados, la presencia de esta levadura es muy reducida, probablemente debido a factores ambientales. Se presenta el primer reporte de Cryptococcus neoformans sensu stricto, genotipos VNI y VNII en El Salvador, esta especie es de relevancia en salud pública por el ser el responsable de más del 90% de los casos de criptococosis a nivel mundial.
Article
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The aim of this study was to investigate the epidemiological relationships of clinical and environmental isolates of the Cryptococcus neoformans species complex in Colombia. The current study reflects data from 1987 to 2004. In Colombia serotypes A and B are most frequently recovered from patients and the environment. Of the 178 clinical isolates studied, 91.1% were of serotype A, 8.4% serotype B and 0.5% serotype C. Of the 247 environmental isolates, 44.2% were of serotype A, 42.6% serotype B and 13.2% serotype C. No serotype D isolates were isolated. Serotype AD has not been recovered in Colombia. PCR fingerprinting with the primers M13, (GACA) 4 and (GTG) 5 and URA5 gene restriction fragment length polymorphism analysis grouped the majority of clinical serotype A and environmental serotype B isolates into the molecular types VNI (98.1%) and VGII (100%), respectively. Mating type a was determined in 99.3% of serotype A isolates, but 96.6% of serotype B isolates were of mating type a. Similar profiles between clinical and environmental isolates suggest that the patients may have acquired the infection from the environment. The data presented form part of the Colombian contribution to the ongoing global survey of the C. neoformans species complex.
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Cryptococcus spp. are common causes of mycoses in immunocompromised patients. To determine the drug susceptibilities of clinical Cryptococcus spp. isolates, the characteristics of 61 clinical Cryptococcus spp. complex isolates and their antifungal susceptibilities were investigated, including 52 C. neoformans and 9 C. gattii isolates collected at Shanghai between 1993 and 2009. Antifungal susceptibility of clinical isolates to amphotericin B, fluconazole, itraconazole, and flucytosine were determined by the microdilution method M27-A2 and the ATB FUNGUS 3 kit. The 90% minimum inhibitory concentration (MIC90) and susceptibility ranges were as follows: 1 (0.0625-1) µg/mL for amphotericin B, 4 (0.125-16) µg/ mL for fluconazole, 0.25 (0.0313-4) µg/mL for itraconazole, and 4 (0.125-8) µg/mL for flucytosine. Fluconazole, itraconazole, and flucytosine have excellent in vitro activity against all tested clinical Cryptococcus spp., and we also found a high rate of tolerance to amphotericin B (MICs ranging from 0.55-1 µg/mL). Furthermore, C. neoformans isolates from acquired immune deficiency syndrome (AIDS) patients were less susceptible to fluconazole and flucytosine than those from non-AIDS patients. These data suggest that use of amphotericin B may lead to tolerance or resistance of the pathogen over time. There were also no significant associations between species, genotypes, and in vitro susceptibilities of these clinical isolates.
Article
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Introduction: A survey on cryptococcosis is being conducted regularly in Colombia since 1997. We present hereby the results corresponding to patients diagnosed from 2006 to 2010. Objective: To analyze the data obtained during this period. Materials and methods: Retrospective analysis of the corresponding surveys. Results: A total of 526 surveys originating from 72% of the Colombian political divisions were received during the 5-year period. Most patients (76.6%) were males and 74.9% were 21-50 years old. The most prevalent risk factor was HIV infection (83.5%) with cryptococcosis defining AIDS in 23% of the cases. In the general population the estimated mean annual incidence rate for cryptococcosis was 2.4 x 106 inhabitants while in AIDS patients this rate rose to 3.3 x 103. In 474 surveys stating clinical features, most frequent complaints were headache 84.5%, fever 63.4%, nausea and vomiting 57.5%, mental alterations 46.3%, meningeal signs 33.0%, cough 26.4% and visual alterations 24.5%. Neurocryptococcosis was recorded in 81.8% of the cases. Laboratory diagnosis was based on direct examination, culture and latex in 29.3% cases. From 413 Cryptococcus isolates analyzed, 95.6% were identified as C. neoformans var. grubii, 1% C. neoformans var. neoformans, and 3.4% C. gattii. Treatment was reported for 71.6% of the cases with amphotericin B alone or in combination with fluconazole prescribed in 28%. Conclusions: Surveys done through passive surveillance continue to be sentinel markers for HIV infection and represent a systematic approach to the study of opportunistic problems regularly afflicting AIDS patients since cryptococcosis requires no compulsory notification in Colombia.
Article
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Organ transplantation has always been considered to be the standard therapeutic interventions in patients with end-stage organ failure. In 2008, more than 29,000 organ transplants were performed in US. Survival rates among transplant recipients have greatly improved due to better understanding of transplant biology and more effective immunosuppressive agents. After transplant, the extent of the immune response is influenced by the amount of interleukin 2 (IL-2) being produced by the T-helper cells. Transplant immunosuppressive therapy primarily targets T cell-mediated graft rejection. Calcineurin inhibitor, which includes cyclosporine, pimecrolimus and tacrolimus, impairs calcineurin-induced up-regulation of IL-2 expression, resulting in increased susceptibility to invasive fungal diseases. This immunosuppressive state allows infectious complication, leading to a high mortality rate. Currently, overall mortality due to invasive fungal infections (IFIs) in solid organ transplant recipients ranges between 25% and 80%. The risk of IFI following renal transplant is associated with the dosage of immunosuppressive agents given, environmental factors and post-transplant duration. Most fungal infections occur in the first 6 months after transplant because of the use of numerous immunosuppressors. Candida spp. and Cryptococcus spp. are the yeasts most frequently isolated, while most frequent filamentous fungi (molds) isolated are Aspergillus spp. The symptoms of systemic fungal infections are non-specific and early detection of fungal infections and proper therapy are important in improving survival and reducing mortality. This article will provide an insight on the risk factors and clinical presentation, compare variation in treatment of IFIs in renal transplant patients, and evaluate the role of prophylactic therapy in this group of patients. We also report the course and management of two renal transplant recipients admitted to Staten Island University Hospital, both of whom developed pulmonary complications secondary to Aspergillus infection.
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Cryptococcosis is reported in adults and is often acquired immune deficiency syndrome (AIDS)-associated; however, its frequency in children is low. Based on the National Survey on Cryptococcosis conducted in Colombia, an epidemiological and clinical analysis was performed on cases of the disease observed in children less than 16 years old between 1993-2010. We found 41 affected children (2.6% prevalence) from the 1,578 surveys received. The country mean annual incidence rate was 0.017 cases/100,000 children under 16 years, while in Norte de Santander the incidence rate was 0.122 cases/100,000 (p < 0.0001). The average age of infected children was 8.4 and 58.5% were male. In 46.3% of cases, a risk factor was not identified, while 24.4% had AIDS. The most frequent clinical manifestations were headache (78.1%), fever (68.8%), nausea and vomiting (65.6%), confusion (50%) and meningeal signs (37.5%). Meningitis was the most frequent clinical presentation (87.8%). Amphotericin B was given to 93.5% of patients as an initial treatment. Positive microbiological identification was accomplished by India ink (94.7%), latex in cerebrospinal fluid (100%) and culture (89.5%). Out of 34 isolates studied, Cryptococcus neoformans var. grubii (VNI 85.3%, VNII 8.8%) was isolated in 94.1% of cases and Cryptococcus gattii (VGII) was isolated in 5.9% of cases. These data are complemented by a literature review, which overall suggests that cryptococcosis in children is an unusual event worldwide.
Article
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Cryptococcal meningitis causes morbidity and mortality worldwide. The burden of disease is greatest in middle- and low-income countries with a high incidence of human immunodeficiency virus (HIV) infection. Patients taking immunosuppressive drugs and some immunocompetent hosts are also at risk. Treatment of cryptococcal meningitis consists of three phases: induction, consolidation, and maintenance. Effective induction therapy requires potent fungicidal drugs (amphotericin B and flucytosine), which are often unavailable in low-resource, high-endemicity settings. As a consequence, mortality is unacceptably high. Wider access to effective treatment is urgently required to improve outcomes. For human immunodeficiency virus-infected patients, judicious management of asymptomatic cryptococcal antigenemia and appropriately timed introduction of antiretroviral therapy are important.
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INTRODUCTION: invasive fungal infections have increased as a result of medical advances in the sphere of transplantation, cancer treatment, autoimmune diseases and AIDS fundamentally. Cryptococcus disease, infrequent before, holds the third place in the incidence of severe mycosis in AIDS patients and it is also the most lethal. Up to the present, there exist few reports on the development of Cryptococcus resistance to antifungal products, however, it is foreseen that wide use of fluconazole might encourage the emergence of less susceptible strains. OBJECTIVES: given the importance of surveillance of antifungal susceptibility and of the evaluation of new therapeutical options, in vitro action of fluconazole and voriconazole on a high number of isolated Cryptococcus strains was determined through Etest method on clinical and environmental samples. METHODS: in vitro susceptibility to fluconazole and voriconazole of 159 Cryptococcus strains (117 from clinical samples and 42 from environmental sources of Central and Western regions in Cuba) was determined through Etest method. RESULTS: the studied isolates showed low MIC values, mainly susceptibility to voriconazole. Ranges, geometric means and modes were 0.031-128, 4.631 y 3 mg/mL for fluconazole and 0.003-8, 0.02 y 0.016 mg/mL for voriconazole, respectively. Although MIC values were generally higher than those of environmental isolates, there were no statistically significant differences (p= 0.05) among strains according to their origin (clinical/environmental) or to their geographical location. CONCLUSIONS: this paper points out the importance of continuing this type of study for the detection of resistance to the most used drugs in anticryptococcus disease therapy as well as in the search of new strategies to treat this infection.
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Background Infectious diseases are very im-portant in Systemic Lupus Erythematous (SLE)because they represent the first cause of morbidi-ty and mortality in this group. Scientific evidenceis scarce, but suggests that endogenous bacterialflora is the first cause of infection. Also, opportunistic infections due to effective immunosuppresant therapy and local microbiologic variationmust be considered. The purpose of this study isto determine etiology, site of infection, mortalityand factors related to infections in SLE patientsattended in Hospital Calderon Guardia, CostaRica. Methods An observational and retrospectivestudy based on 242 medical files of SLE patientsfrom Hospital Calderon Guardia, between October 1997 and October 2007, was made. Caseswere divided into two groups: patients withoutprevious SLErelated infectious and with previous SLE-related infections who needed medicalattention. Results Sixty percent of patients had at leastone infection. Over 60% of infected patientsreported hospital stays longer than 12 days, compared with 35% of SLE non-infected patients.Fortyone percent of patients were diagnosed with SLE between ages 20 and 29. Only 1.7%had used prophylactic antibiotics. Most of infected SLE-patients used prednisone in doses over7.5mg per day and 50% of non-infected patientsused hydroxicloroquine compared with 34% ofinfected patients. Most common organisms iso-lated were Candida spp, Escherichia coli,Staphylococcus aureus, Toxoplasma gondii and human papilloma virus. In 52.4% of infectedpatients, there was no identified agent. Mostcommon site of infection was skin and mucousmembranes, followed by urinary tract and lung.Among clinical variables, only fever had a positive correlation with infections; and of laboratoryparameters, only acute phase reactants. Discussion A high incidence of infections wasfound. The time of first infection was, in average, seven years after diagnosis was made. In allgroups with comorbidities, infection rate washigher, particularly in patients with renal transplant. Predisone doses higher than 7.5mg per daywas associated with infectious events. It is suggested that hydrochloroquine use has a protectiveeffect on infection development, probably because of its immunomodulatory and antibioticproperties. Etiologic agents correlated withinfections reported on literature, but a high incidence of toxoplasmosis and HPV infection asnoted. A nymphal pentastomiasis case was reported.
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Objetivo: comparar el estado inmunológico al momento del diagnóstico durante 3 años, de los pacientes con VIH/Sida atendidos en el Hospital San Juan de Dios. Materiales y métodos: estudio retrospectivo, descriptivo de los casos nuevos diagnosticados con VIH/Sida, mayores de 14 años, en 2003, 2006 y 2009, en la Clínica de Atención al Paciente con VIH del Hospital San Juan de Dios, Costa Rica, según los datos en los expedientes clínicos. Para evaluar el estado inmunológico se utilizó el recuento de linfocitos T CD4+ al momento del diagnóstico del VIH, estableciéndose como diagnóstico tardío