A comparative study of the diagnosis of leptospirosis by PCR and MAT in northwestern Mexico

Abstract

The Polymerase Chain Reaction (PCR), compared to the serological reference technique for the detection
of Leptospira spp., was implemented to evaluate its application as a leptospirosis diagnosis method
in samples of symptomatic patients of recent infection from the health sector in northwestern México.
Samples of 34 patients were analyzed using the PCR and the microagglutination test (MAT). The results
obtained by the PCR showed complete concordance with the determinations of positive or indeterminate
patients obtained by the MAT. Out of 31 negative samples or not confirmed by the MAT, 7 (20%) were positive
by the PCR. The PCR technique implemented in this study showed to be a useful tool in the diagnosis
of the leptospirosis combined with the serological test MAT, emphasizing its usefulness for early detection of
this disease.

Full text

www.actauniversitaria.ugto.mx
doi: 10.15174/au.2018.1625 ǀ ISSN online: 2007-9621
50
Estudio comparavo del diagnósco de leptospirosis
mediante PCR y MAT en el noroeste de México
Edgar Sandoval Petris*, Magali Avilés Acosta**, Rosa Ma. Montesinos Cisneros***,
Maricela Montalvo Corral****, Armando Tejeda Mansir*º
* Departamento de Investigaciones Científicas y Tecnológicas, Universidad de Sonora, Blvd. Luis Encinas y Rosales s/n Col. Centro, C.P.
83000, Hermosillo, Sonora, México. Correo electrónico: atejeda@guayacan.uson.mx
** Laboratorio de Biología Molecular, Laboratorio Estatal de Salud Pública de Sonora.
*** Departamento de Matemáticas, Universidad de Sonora.
**** Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo.
° Autor de correspondencia.
Cómo citar:
Sandoval-Petris, E., Avilés Acosta, M., Mon-
tesinos Cisneros, R. M., Montalvo Corral, M.,
Tejeda Mansir, A. (2018). Estudio comparati-
vo del diagnóstico de leptospirosis mediante
PCR y MAT en el noroeste de México. Acta
Universitaria, 28(4), 50-55. doi: http://doi.
org/10.15174/au.2018.1625
Palabras Clave:
Leptospirosis; PCR; MAT.
Keywords:
Leptospirosis; PCR; MAT.
Recibido: 3 de octubre del 2016
Aceptado: 20 de marzo del 2018
Publicado: 13 de septiembre del 2018
Se empleó la técnica molecular de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés),
comparada con la técnica serológica de referencia para la detección de Leptospira spp., para evaluar
su aplicación como método de diagnóstico de leptospirosis en muestras de pacientes sintomáticos de
reciente infección, atendidos por el sector salud del noroeste de México. Se analizaron muestras de 34
pacientes tanto por PCR como por la técnica de microaglutinación (MAT, por sus siglas en inglés). Los
resultados obtenidos mediante PCR mostraron completa concordancia con las determinaciones de pa-
cientes positivos o indeterminados mediante MAT. De 31 muestras negativas o no confirmadas por MAT,
7 resultaron positivas mediante la prueba de PCR (20%). La técnica de PCR implementada en este estudio
mostró ser una herramienta útil en el diagnóstico de la enfermedad combinada con la prueba serológica
MAT, destacando su ventaja en la detección temprana de la leptospirosis.
The Polymerase Chain Reaction (PCR), compared to the serological reference technique for the detec-
tion of Leptospira spp., was implemented to evaluate its application as a leptospirosis diagnosis method
in samples of symptomatic patients of recent infection from the health sector in northwestern México.
Samples of 34 patients were analyzed using the PCR and the microagglutination test (MAT). The results
obtained by the PCR showed complete concordance with the determinations of positive or indeterminate
patients obtained by the MAT. Out of 31 negative samples or not confirmed by the MAT, 7 (20%) were posi-
tive by the PCR. The PCR technique implemented in this study showed to be a useful tool in the diagnosis
of the leptospirosis combined with the serological test MAT, emphasizing its usefulness for early detection of
this disease.
A comparave study of the diagnosis of leptospirosis by PCR
and MAT in northwestern Mexico
ABSTRACT
RESUMEN

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Estudio comparativo del diagnóstico de leptospirosis mediante PCR y MAT en el noroeste de México I
Edgar Sandoval Petris, Magali Avilés Acosta, Rosa Ma. Montesinos Cisneros, Maricela Montalvo Corral,
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INTRODUCCIÓN
La leptospirosis es un problema de salud pública tanto en
países subdesarrollados como en países desarrollados.
Según la Organización Mundial de la Salud (OMS) (WHO,
por sus siglas en inglés) cada año se presentan 14 nuevos
casos por cada 100 000 habitantes de leptospirosis en el
mundo (WHO, 2011). Sin embargo, se cree que la prevalen-
cia de la enfermedad está subestimada (Hartskeerl, 2006).
La incidencia promedio mundial de leptospirosis humana
endémica es de 5 casos por cada 100 000 habitantes según
la OMS, aclarando que existen zonas donde se alcanza-
ron hasta 975 casos por cada 100 000 habitantes. Para el
caso de América la estimación es de 12.5 casos por cada
100 000 habitantes (WHO, 2011). La situación epidemio-
lógica de leptospirosis en México en el 2010 presentaba
una tasa nacional de 0.45 casos por cada 100 000 habitan-
tes, y los estados que presentaron una incidencia ma-
yor son: Hidalgo, Sinaloa, Veracruz, Tabasco, Yucatán
y Sonora que oscilaban entre 0.22 a 9.80 casos por cada
100 000 habitantes (Secretaría de Salud, 2012). Según los
informes periódicos de la Secretaría de Salud (2017), el es-
tado de Sonora presenta anualmente casos confirmados
de enfermedades infecciosas como Dengue y Rickettsio-
sis, ambas con características clínicas muy similares a las
que presenta la leptospirosis (García-Ruíz et al., 2016; Le-
vett, 2001). Por tal motivo, a muchos de los pacientes que
presentan síndrome febril se les realiza la prueba diagnós-
tica para estas tres enfermedades.
Existen varias pruebas de laboratorio que se utilizan para
el diagnóstico de leptospirosis dentro de las que destacan:
cultivo bacteriano, Enzyme-Linked ImmunoSorbent As-
say (ELISA), detección de IgM y por la Técnica de Microa-
glutinación (MAT, por sus siglas en inglés). Esta última, es
considerada el estándar de oro del serodiagnóstico por su
insuperable especificidad diagnóstica (serovar/serogrupo)
en comparación con las otras pruebas disponibles actual-
mente (WHO, 2003). Sin embargo, en ocasiones puede
mostrar resultados poco concluyentes debido a la dificultad
de obtener segundas muestras serológicas del paciente que
permitan observar la seroconversión cuando en la primera
muestra se presentan resultados negativos o títulos bajos
(De Abreu et al., 2006; Levett & Branch, 2002). Por otra parte,
también se puede mencionar las restricciones de algunos la-
boratorios de disponer de un gran número de cepas de refe-
rencia de Leptospira spp., útiles para llevar a cabo la prueba.
Actualmente, es muy recomendable contar con méto-
dos de diagnostico de leptospirosis basados en las técni-
cas moleculares modernas, como la Reacción en Cadena
de la Polimerasa (PCR, de sus siglas en inglés) puesto que
ha resultado ser muy útil en la detección de diversos pa-
tógenos, presentando varias ventajas sobre las técnicas de
detección serológicas como mayor sensibilidad y rapidez
en la obtención de resultados (Branger et al., 2005; Kuri-
lung et al., 2017; Riediger et al., 2017).
Algunos protocolos de diagnóstico de leptospirosis
mediante PCR, se basan en la amplificación el gen LipL32
que codifica a una lipoproteína altamente conservada en la
membrana externa de las especies patógenas de leptospi-
ras, además es considerada importante en la patogénesis
de la enfermedad (Kumaran et al., 2017; Vivian et al., 2009).
El uso rutinario de la PCR para el diagnóstico de leptos-
pirosis podría ayudar a superar las limitaciones de la MAT
mencionadas anteriormente y permitir la detección du-
rante el periodo de días en el que la bacteria se encuentra
en sangre (fase septicémica) e inclusive en orina. Muchos
de los laboratorios oficiales que diagnostican leptospirosis
en México, no cuentan con esta técnica molecular inva-
luable para el diagnóstico y tratamiento temprano en los
casos sospechosos y positivos de leptospirosis.
El objetivo del presente trabajo fue comparar la aplica-
ción de la técnica de PCR y MAT para el diagnóstico de lep-
tospirosis en sueros de pacientes sintomáticos referidos al
Laboratorio Estatal de Salud Pública de Sonora (Lespson).
MATERIALES Y MÉTODOS
Muestras analizadas
El estudio fue descriptivo, retrospectivo con muestreo
no probabilístico, por conveniencia. Se emplearon n = 34
muestras de suero de pacientes sintomáticos colectadas
en centros de salud del estado de Sonora por personal de
la Secretaría de Salud y referidas al Lespson, en el periodo
de junio-diciembre del 2009. Dichas muestras se tomaron
durante los primeros 7 días de iniciados los síntomas. Los
pacientes cursaban con síndrome febril y otra signología
característica de leptospirosis y/o presentaban previa-
mente un resultado positivo mediante MAT. Las mues-
tras empleadas en este estudio habían sido previamente
procesadas por personal del Lespson para el diagnóstico
serológico de Leptospira. En algunas muestras donde el
diagnóstico presuntivo no era claro para leptospirosis, el
Lespson las analizó para el diagnóstico de Dengue y Ric-
kettsia. El tratamiento y manejo de las muestras se hizo
en apego a estricta confidencialidad. No se tuvo acceso a
los datos de identidad de las muestras, ni demográficos.
La información obtenida se limitó a los datos clínicos de
cuadro presuntivo por referencia epidemiológica y resul-
tados de prueba MAT.

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Cepas de referencia
Se usaron 6 cepas patógenas Leptospira spp., de referencia
nacional (serovariedades: canicola, icterohaemorrhagiae,
pyrogenes, automnalis, cynopteri y hardjo) proporciona-
das por el Lespson. Estas cepas se inocularon en tubos es-
tériles con 5 ml de medio Ellinghausen y Mcllough, modi-
ficado por Johnson y Harries (EMJH) (SIGMA) y se dejaron
incubando a 29 °C durante 7 días o hasta alcanzar una con-
centración de 1 x 108 leptospiras/mL (WHO, 2003).
Análisis MAT
Las muestras de suero de los pacientes se analizaron (de-
terminación realizada por personal de Lespson) mediante
el método de referencia de MAT en la que se emplearon
6 serovares de Leptospira spp., como antígenos vivos, de
acuerdo a lo recomendado por la WHO (2003). Se consi-
deraron casos positivos de infección reciente de leptospi-
rosis los sueros únicos con título de anticuerpos mayor o
igual a una dilución 1:800. Las muestras de sueros únicos
positivos con títulos menores a una dilución 1:800 se con-
sideraron casos positivos indeterminados, mientras que el
resto de los sueros se consideraron casos negativos o no
confirmados mediante MAT.
Análisis molecular por PCR
En este estudio se analizaron por PCR los ADN extraídos
de las muestras de suero y de las cepas de Leptospira spp.,
usadas como control, utilizando el kit QIAamp DNA Mini
(QIAGEN) bajo las instrucciones del fabricante. Las con-
diciones para el aislamiento de ADN genómico de las
muestras clínicas y cepas de referencia, se hicieron en el
Laboratorio de Agentes Patógenos del Lespson, en cam-
pana de bioseguridad nivel 3 (BSL-3).
Para las amplificaciones de ADN se utilizaron los oligo-
nucleótidos específicos para un fragmento del gen LipL32
(260 pb) y las condiciones de termociclado descritas por
Branger et al., (2005). Las amplificaciones se llevaron a
cabo en un termociclador Gene Cycler™ (BIORAD). Se
colocaron 40 µL de la mezcla de reactivos del kit Plati-
num PCR SuperMix High Fidelity (Invitrogen), 5 µL (1 ng
a 500 ng) del ADN purificado y 2.5 µL de cada iniciador
(20 µM) (Hap1FDx 5-GCAAGCATTACCGCTTGTGG-3 y
Hap1RDx 5- TGTTGGGGAAATCATACGAAC-3) a un volu-
men final de 50 µL. La mezcla de reactivos se incubó bajo
las siguientes condiciones: un ciclo a 94 °C por 5 min, se-
guido de 40 ciclos a 94 °C por 15 s, 60 °C por 35 s, 72 °C por
40 s y una extensión final a 72 °C por 10 min. Los productos
de PCR obtenidos fueron analizados por electroforesis en
gel de agarosa al 2%, teñidos con bromuro de etidio y vi-
sualizados con un fotodocumentador de UV Gel Logic 100
System (KODAK).
Análisis estadísco
Se realizó estadística descriptiva de los datos, se calcularon
los porcentajes de muestras positivas y negativas para cada
técnica, así como los datos de sensibilidad y especificidad.
RESULTADOS
Se establecieron las condiciones experimentales de la téc-
nica de PCR para la amplificación de un fragmento interno
del gen LipL32 (260 pb) utilizando 6 cepas de referencia de
Leptospira. La figura 1 muestra el perfil electroforético en
gel de agarosa de los productos de PCR de un fragmen-
to interno del gen LipL32 de Leptospira, de los serovares:
canicola, icterohemorragica, pyrogenes, automnalis, cy-
nopteri y hardjo respectivamente (260 pb). Los resultados
muestran la obtención del amplicón de tamaño esperado,
según lo descrito por Branger et al., (2005).
Perfil electroforético en gel de agarosa al 2% de los productos de PCR de un fragmento
interno del gen LipL32 de Leptospira spp. Línea 1 marcador de peso molecular; línea 2-7
serovares: canicola, icterohemorragica, pyrogenes, automnalis, cynopteri y hardjo respec-
tivamente (260pb); línea 8 control negativo (mezcla de reactivos para PCR más agua).
Fuente: Elaboración propia.
Figura 1

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Se analizaron 34 sueros de pacientes con sospecha de
leptospirosis mediante MAT y PCR, de los cuales se detec-
taron como positivos e indeterminados mediante MAT a 3
(9%) pacientes, mismos que resultaron positivos también
por PCR. De los 31 pacientes con resultado negativo o no
confirmado mediante MAT encontramos que 7 (20%) de
esos pacientes presentaron un resultado positivo a la téc-
nica de PCR (tabla 1), esto nos indica que la técnica de PCR
es más sensible que la de MAT para el diagnóstico de la
enfermedad en los primeros días de iniciados los sínto-
mas. La sensibilidad y especificidad de la técnica de PCR
fue de 100% y 77.4%, respectivamente. Adicionalmente, se
encontró que 2 casos positivos por PCR presentaron co-
infección con Dengue (MAT negativo) y Rickettsia (MAT
indeterminado) (tabla 1).
En cuanto a los síntomas clínicos más frecuentes re-
feridos por los pacientes confirmados o probables casos
de leptospirosis podemos mencionar: fiebre (100%), dolor
de cabeza (100%), dolor muscular (100%), artralgia (90%),
diarrea o dolor abdominal (50%), entre otros. Un dato re-
levante que encontramos en este trabajo fue el hecho de
encontrar un caso de defunción que presentó escape de
líquidos, signo clínico no presente en el resto de los pa-
cientes, que pudo haber agravado el estado de salud del
paciente. Cabe mencionar que este caso de defunción
tuvo un resultado positivo a leptospirosis mediante PCR y
negativo al MAT (tabla 2).
DISCUSIÓN
La leptospirosis es una enfermedad re-emergente de im-
portancia en salud pública. Sin embargo, no se ha siste-
matizado y ampliado su vigilancia epidemiológica, y existen
factores bioclimáticos que pueden favorecer su presencia en
diferentes regiones, por lo que los datos de prevalencia en el
país podrían estar subestimados (Sánchez-Montes, Es-
pinoza-Martínez, Ríos-Muñoz, Bersunza-Cruz & Becker,
2015). El éxito del control epidemiológico de la leptospi-
rosis depende de su prevención y diagnóstico oportuno.
Algunos trabajos han demostrado que los tratamientos
farmacológicos utilizados contra esta enfermedad son
más efectivos si se administran en las primeras etapas del
padecimiento (Koizumi & Watanabe, 2009). Las limitantes
del diagnóstico oportuno son la disponibilidad de méto-
dos directos o indirectos en los laboratorios oficiales. Por
ello, en el presente trabajo se utilizó una técnica de PCR
capaz de detectar la presencia de la bacteria Leptospira
spp., en cultivos de cepas de referencia y en muestras clí-
nicas de humanos. La PCR permitió identificar un mayor
porcentaje de muestras positivas (29%) con respecto al es-
tándar de referencia MAT (9%). El aumento en la sensibili-
dad de diagnóstico de técnicas moleculares con respecto Fuente: Elaboración propia.
Resultados de la PCR en los diferentes casos clínicos
de leptospirosis evaluados por la prueba MAT
Tabla 1
Caso MAT MAT PCR PCR Co-infección
( + ) ( - ) ( + ) ( - )
Positivo-infección
reciente (1 : 1280) 1 - 1 - 0
Positivo-indeterminado
(1 : 80 y 1 : 160) 2 - 2 - 1 (Rickettsia)
Negativo o
no confirmado - 31 7/31
(20%) 24 1 (Dengue)
Total de pacientes 3/34
(9%)
31/34
(91%)
10/34
(29%)
24/34
(71%) 2
(n = 34)
a las pruebas serológicas, también ha sido reportado por
otros autores (Mullan & Panwala, 2016; Woods et al., 2017).
Las diferencias encontradas entre las pruebas son atri-
buibles a la misma evolución natural de la enfermedad,
donde la bacteremia se observa en los primeros días de
infección, cuando es más factible que sea detectable por
pruebas moleculares pero no serológicas; posteriomente
baja la carga bacteriana y da paso a la aparición de anti-
cuerpos IgM, base del diagnóstico por MAT. Por lo que es
importante realizar más estudios sobre la concordancia y
complementariedad de las técnicas cuando se tiene solo
una muestra, para tener un tratamiento más oportuno de
los pacientes (Waggoner et al., 2015).
La co-infección observada de los pacientes PCR positi-
vos con Dengue y Rickettsia, respectivamente, también ha
sido observada en estudios previos (Levett, Branch & Ed-
wards, 2000; Navarrete-Espinosa et al., 2015). La mayoría
de los pacientes refieren una sintomatología clínica muy
característica de la enfermedad y además presentan una
similitud entre ellos en algunas manifestaciones, caracte-
rísticas observadas en otros trabajos (Ooteman et al., 2006).
Cabe mencionar que el periodo de septicemia puede
llegar a durar hasta diez días después de contraída la in-
fección, esta situación pone en mayor vulnerabilidad a
personas con problemas previos de salud (por ejemplo,
riñón, hígado y pulmón) pudiendo evolucionar de una
manera más agresiva e incluso provocar la muerte, como
pudo haber sido el caso del paciente fallecido.

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CONCLUSIONES
En el presente trabajo se demostró la utilidad y beneficios
que tiene la prueba de laboratorio PCR como comple-
mento al MAT para el diagnóstico de leptospirosis sobre
todo en los primeros días de la enfermedad y en aquellos
pacientes donde se carece de muestras pareadas. Imple-
mentarla de forma rutinaria permitiría un diagnóstico
más oportuno y preciso en la evolución de la enfermedad
y lograría reducir el índice de casos indeterminados y fal-
sos negativos que se presentan en muchos de los casos
donde solo se realiza el MAT, situación de suma importan-
cia desde el punto de vista de salud pública.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen el apoyo económico para la reali-
zación de este trabajo a la Universidad de Sonora, al Pro-
grama para el Desarrollo Profesional Docente (Prodep)
(proyecto 103.5/07/2362,) y al Laboratorio Estatal de Salud
Pública de Sonora, México. Se agradece el excelente traba-
jo del Q.B. Alberto Ramírez Cons en la determinación de
prueba MAT y cultivos de Leptospira.
# Casos positivos e indeterminados mediante MAT.
* Casos positivos mediante PCR y negativo mediante MAT.
** Otros signos o síntomas: prurito, faringitis, rinitis, alteración del gusto, tos.
*** Defunción.
Fuente: Elaboración propia.
Síntomas de los pacientes positivos a leptospirosis mediante MAT y PCR
Tabla 2
Casos positivos e
indeterminados
# (n = 3)
Casos probables
* (n = 7)
Total de casos
(n = 10)
nPorcentaje nPorcentaje nPorcentaje
Signos y síntomas
Fiebre 3 100 7 100 10 100
Dolor de cabeza 3 100 7 100 10 100
Dolor muscular 3 100 7 100 10 100
Artralgia 3 100 6 86 9 90
Diarrea o dolor abdominal 2 66 4 57 6 60
Problemas respiratorios 2 66 3 43 5 50
Otros ** 1 33 6 86 7 70
Nausea y vómitos 1 33 5 71 6 60
Dolor retro cular 1 33 5 71 6 60
Fotofobia 1 33 5 71 6 60
Conjuntivitis 1 33 4 57 5 50
Lesiones cutáneas y subcutáneas 1 33 3 43 4 40
Ictericia 1 33 0 0 1 10
Esplenomegalia 1 33 0 0 1 10
Hemorragia 0 0 2 29 2 20
Escape de líquidos *** 0 0 1 14 1 10

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