ArticlePDF Available

Obtaining of Doubled Haploid Lines for Selection of Glutinous Rice

Authors:

Abstract and Figures

A screening of zoned in the Republic of Kazakhstan rice varieties for the amylose content has been carried out. The allele state identification of the waxy gene using a marker of Glu-23 showed that all the studied varieties contain a medium amount of amylose as compared to the standard Japanese varieties. A hybridization of the Bakanasskii and Akdala Kazashstan varieties with the glutinous variety of Viola was performed to obtain low-amylose rice forms. A capacity of knotting hybrid grains in greenhouses was shown; those grains were sown in the greenhouse to obtain doubled haploids in the anthers culture. PCR was used to identify the alleles of the Wx and Alk genes in the varieties and haploid lines using the Glu-23, SNP3, SNP4, Wx_E6, Wx_E10 and dCAPS markers. Therefore, promising lines of glutinous rice with economically valuable properties to be transferred to State Trials were created using the method of routine selection and following haploid technique. © 2018 State Research Institute for Genetics and Selection of Industrial Microorganisms.
Content may be subject to copyright.
26
Биотехнология, 2018, Т. 34, № 2, С. 26–36
В государственный реестр селекционных до-
стижений Республики Казахстан внесены 28 со-
ртов риса. Среди них отсутствуют глютинозные
сорта. Глютинозный (клейкий) рис представля-
ет собой разновидность данной крупы, которая
вследствие особых свойств крахмала образует
при варке клейкую массу. Мука из глютинозно-
го риса может использоваться как компонент про-
дуктов детского питания. Клейкая рисовая каша
защищает слизистую оболочку желудка от раз-
дражения химическими факторами, поэтому она
рекомендуется и как диетический продукт для
больных с нарушениями функции желудочно-ки-
шечного тракта [1, 2].
Клейкий рис из-за его полезных свойств ста-
новится все более популярным на мировом рын-
ке. В странах Азии глютинозный рис возделыва-
ется уже давно. В Казахстане целенаправленные
селекционные работы по созданию глютинозных
сортов риса ранее не проводились.
УДК: 633/635:631.52; 633.1
Получение дигаплоидных линий для селекции
глютинозного риса
© 2018 И.А. САРТБАЕВА1, Б.Н.УСЕНБЕКОВ2, А.Б. РЫСБЕКОВА2,3,*, Ж.М. МУХИНА4,
Д.Т. КАЗКЕЕВ5, К.Ж. ЖАМБАКИН2, Е.А. ЖАНБЫРБАЕВ4, Х.А. БЕРКИМБАЙ2,
Д.Ш. АХМЕТОВА2, А.А. МЕЛДЕБЕКОВА1
1Казахский национальный университет им. Аль-Фараби, Алматы, 050040, Казахстан
2Институт биологии и биотехнологии растений (ИБРР), Алматы, 050040, Казахстан
3Казахский агротехнический университет им. С. Сейфуллина, Астана, 010000, Казахстан
4Всероссийский научно-исследовательский институт риса (ВНИИ риса), Краснодар, п/о Белозерный, 350921
5Казахский национальный аграрный университет, Алматы, 050010, Казахстан
е-mail: bakdaulet7@yandex.ru, aiman_rb@mail.ru*
Поступила 01.11.2017 г.
Принята в печать 15.11.2017 г.
Проведен скрининг районированных сортов риса Республики Казахстан на содержание амилозы.
Определение аллельного состояния гена waxy с помощью маркера Glu-23 показало, что все
исследованные сорта в сравнении со стандартными японскими сортами содержат среднее количество
амилозы. Проведена гибридизация казахстанских сортов Баканасский и Акдала с глютинозным
сортом Виола для получения низкоамилозных форм риса. Показана способность завязывания
гибридных зерновок в условиях оранжереи; эти зерновки были посеяны в оранжерейных условиях
для получения дигаплоидов в культуре пыльников. Методом ПЦР-анализа была проведена
идентификации аллелей генов Wx и Alk у сортов и дигаплоидных линий с использованием
следующих маркеров: Glu-23; SNP3; SNP4; WxE6; WxE10; dCAPS. Методом традиционной
селекции с последующим применением гаплоидной технологии созданы перспективные линии
глютинозного риса, обладающие хозяйственно ценными признаками (скороспелость, урожайность,
низкое содержание амилозы), для передачи на государственные сортоиспытания.
Ключевые слова: дигаплоиды, глютинозный сорт, культура пыльников риса, содержание амилозы,
ген waxy.
doi: 10.21519/0234-2758-2018-34-1-26-36
Список сокращений: БАП – 6-бензиламинопурин; 2,4-Д – 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота; ДГ – дигаплоиды; ИУК – ин-
долил-3-уксусная кислота; КазНИИ риса – Казахский научно-исследовательский институт риса им. И. Жахаева; КазНИИЗиР –
Казахский научно-исследовательский институт земледелия и растениеводства; среда МС – среда Мурасиге–Скуга; УзНИИ
риса – Узбекский научно-исследовательский институт риса; dCAPS (Cleaved Amplied Polymorphous Sequences) – расщеплен-
ные амплифицированные полиморфные последовательности; GBSS (Granule-Bound Starch Syntase) – синтаза гранулирован-
ного крахмала.
27Биотехнология, 2018, Т. 34, № 2
ПОЛУЧЕНИЕ ДИГАПЛОИДНЫХ ЛИНИЙ ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ ГЛЮТИНОЗНОГО РИСА
В настоящее время в селекции риса широко
используют биотехнологические методы, позво-
ляющие повысить результативность селекцион-
ного процесса. Одним из таких методов являет-
ся гаплоидная биотехнология, применяя которую
можно получить генетически стабильные гомози-
готные растения за одну генерацию. Гаплоидный
набор хромосом микроспор злаковых, таких как
ячмень, пшеница и рис, спонтанно удваивается в
условиях in vitro [3]. Гомозиготные растения ис-
пользуются в селекции растений для анализа ко-
личественных признаков, изучения взаимодей-
ствия и экспрессии генов, а также выявления
рецессивных мутаций. Гаплоидные клетки при-
меняют в генетической инженерии и клеточной
селекции. В данное время многими эксперимен-
тальными примерами подтверждена примени-
мость и эффективность гаплоидной биотехноло-
гии в селекции зерновых культур [4, 5].
Одним из важнейших факторов, влияющих на
пищевые и технологические качества приготов-
ленного риса, являются свойства присутствующе-
го в нем крахмала. Углеводы в зернах злаков пред-
ставляют собой С6-сахара, полимеризованные в
гранулы крахмала, которые находятся в основном
в эндосперме. Различают два типа продуктов по-
лимеризации: амилоза (молекулы с прямыми це-
пями и α-1,4-гликозидными связами) и амилопек-
тин (сложноразветвленные молекулы цепей сахара
с α-1,4- и α-1,6-связами) [6]. По содержанию ами-
лозы рис классифицируется на пять групп: глю-
тинозный (0–2%), очень низкоамилозный (3–9%),
низкоамилозный (10–19%), среднеамилозный
(20–24%) и высокоамилозный (>24%) [7]. Содер-
жание амилозы в эндосперме зерновки зависит от
количества продукта экспрессии Waxy-гена, ко-
дирующего синтазу гранулированного крахмала
(GBSS = Wx-protein), который расположен на 6-й
хромосоме. Waxy-ген амилозосодержащих сортов
имеет два аллеля Wxa и Wxb. Аллель Wxa контро-
лирует синтез амилозы у сортов Indica с более вы-
соким ее содержанием (≥ 25%), Wxb у сортов
Japonica с более низким содержанием амилозы
(≤ 20%) [1, 2]. Для выяснения G/T-полиморфизма
среди глютинозных сортов был разработан прай-
мер dCAPS, который распознает локацию сайта
рестрикции [8]. Это позволило выявить филоге-
нетическое происхождение глютинозного риса с
помощью успешной детекции единичных нукле-
отидных вариантов (SNP).
Наряду с этим у сортов глютинозного риса, у
которых амилоза не содержится в крахмале эн-
досперма, выявлена вставка из 23 нуклеотидов
во 2-м экзоне Waxy-гена, что приводит к образо-
ванию стоп-кодона в данном экзоне на позиции
172-го нуклеотида. Прекращение транскрипции
Waxy-гена в точке стоп-кодона приводит к невоз-
можности продукции фермента GBSS и дальней-
шего синтеза амилозы [9, 10].
Описана связь между содержанием амилозы
и полиморфизмом по одному нуклеотиду (SNP) у
Wx-гена риса в сайтах доноров сплайсинга первого
интрона (G-T) и у экзонов 6 (A/C) и 10 (C/T) [11, 12].
Одним из важнейших параметров, влияющих
на кулинарные и вкусовые качеств риса, является
конечная температура клейстеризации, при кото-
рой более 90% гранул крахмала необратимо набу-
хают в горячей воде и теряют свойство двойного
лучепреломления. Температура клейстеризации
влияет на продолжительность варки обработанно-
го риса: чем выше эта температура, тем дольше
время варки. Зерна восковидного и невосковидно-
го крахмала имеют одинаковую величину и оди-
наковую температуру клейстеризации [13]. Крах-
мал большинства разновидностей сорта Japonica
имеет более низкую температуру клейстеризации,
чем линии, полученные от скрещивания сортов
Indica и Japonica [14]. Сортовые различия в дли-
не боковых цепей амилопектина регулируются
функциональными изменениями крахмал-синта-
зы IIa (SSIIa). Ген SSIIa идентичен гену alk, распо-
ложенному на 6-й хромосоме, который отвечает за
щелочной распад амилопектина риса [6]. Темпе-
ратурные условия в период формирования зерна
влияют на температуру клейстеризации крахмала.
Целью исследования было получение дига-
плоидных линий глютинозного риса и изучение
Wx- и Alk-гаплотипов у отобранных дигаплоидов
для ускорения селекции и создания казахстанских
глютинозных сортов растения. Настоящая работа
является первой попыткой создания в Казахста-
не исходных линий глютинозного риса с приме-
нением гаплоидной технологии и молекулярных
маркеров для последующего использования этих
линий в селекции новых ценных сортов данного
сельскохозяйственного растения.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Селекционный материал
Объектами исследования являлись сорта риса
отечественной и зарубежной селекции и гибриды
селекции ИББР. Для гибридизации в оранжерее
ИББР в вегетационных сосудах выращивали глю-
тинозные и амилозные сорта риса (эксперимент
проводили в трех повторностях) с интервалом
28
САРТБАЕВА и др.
Biotechnology, 2018, V. 34, No. 2
в сроках посева 10 сут для совмещения времени
цветения одних сортов риса с разными периодами
вегетации других сортов. Для элиминации муж-
ских генеративных органов обрезали цветковые
чешуи, пыльники удаляли с помощью 3-каналь-
ного компрессора (пневмокастрация) и метелку
опыляли ТВЕЛЛ-методом [15].
Культура изолированных пыльников риса в
условиях in vitro
В эксперименте по культивированию изолиро-
ванных пыльников in vitro использовали гибрид-
ные комбинации F1: Виола×Акдала и Виола×Ба-
канасский. Выращивание и доведение донорных
растений до стадии трубкования проводили в
оранжерее ИББР. Метелки отбирали в фазе труб-
кования, помещали в сосуды с водой и подверга-
ли действию низкой положительной температу-
ры (4 °С) в течение 5–7 сут. Для индукции кал-
лусогенеза использовали питательную среду № 6
(CHU (N6), Titan Biotech Ltd, India) с добавлением
2,4-Д (Sigma, США) в концентрации 2 мг/л [16].
По достижении диаметра более 3 мм каллусы пе-
реносили на регенерационную среду МС (Sigma)
с добавлением следующих компонентов, мг/л:
гормонов БАП – 5 и ИУК 1, а также глутами-
на – 500 и гидролизата казеина – 500 (Sigma) [17].
На 20–30 сутки наблюдали появление зеленых
проростков. Часть регенерантов, лишенных кор-
ней или имевших слабо развитую корневую си-
стему, культивировали для стимуляции ризогенеза
на среде МС1/2, состоящей из половинного набо-
ра микро- и макроэлементов среды MS, Fe-хелата,
1 мг/л ИУК и 30 г/л сахарозы (Sigma) [3]. Далее
растения-регенеранты с хорошо развитой корне-
вой системой отмывали от питательной среды и
помещали в сосуды с водопроводной водой для
адаптации к смене условий культивирования с
in vitro на in vivo. После этого растения переноси-
ли в вегетационные сосуды с почвенно-торфяной
смесью («Садовый центр», Алматы) и выращива-
ли в оранжерее при температуре 28 ºС и относи-
тельной атмосферной влажности 48%.
Определение содержания амилозы
Содержание амилозы в зерновках определяли
с помощью аутоанализатора II (Bran+Luebbe Co.
Ltd., Norderstedt, Германия) согласно методике [18].
Электрофорез запасных белков риса
Экстракцию запасных белков проводили
трис-HCl- и фосфатным буфером, pH 6,8, содер-
жащими додецилсульфат натрия, меркаптоэта-
нол, глицерин и краситель бромфеноловый синий
(Sigma). Разделение проводили в 7,5%-ном поли-
акриламидном геле (Sigma) модифицированным
методом Лэммли [19].
Выделение ДНК и ПЦР-анализ
Для выделения ДНК использовали бесхлоро-
филльные 7-дневные проростки, полученные пу-
тем инкубации на увлажненной фильтровальной
бумаге в темноте при температуре 25–27 оС. Экс-
тракцию ДНК из проростков проводили модифи-
цированным методом СТАВ [20]. Электрофоре-
тическое разделение продуктов ПЦР проводили в
8%-ном полиакриламидном геле.
Для идентификации гена Wx проводили ПЦР с
использованием праймера Glu 23 [10]. При выяв-
лении Wxа- и Wxb-типов гена изучаемые образцы
подвергали анализу с помощью маркера dCAPS.
Для рестрикции по этому маркеру использова-
ли фермент EcoT141 (Thermo Scientic), в при-
сутствии которого продукты ПЦР инкубировали
при 37 оС. Состав смеси для обработки эндону-
клеазой рестрикции был следующий, мкл: про-
дукты ПЦР – 10; вода, свободная от ДНКазы и
РНКазы – 18; 10-кратный буфер для EcoT141 – 2;
фермент EcoT141 – 1,5.
Для определения аллельного состояния
Wxb-локуса между высоким и средним содержа-
нием амилозы использовали маркеры WxEx-6 и
WxE-10 [21]. Идентификацию гена Alk осущест-
вляли с помощью маркеров SNP3 и SNP4 [22].
Нуклеотидные последовательности праймеров,
использованные в работе, приведены в табл. 1.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Идентификация гена waxy у районированных
сортов риса в Казахстане
На территории Республики Казахстан возде-
лываются в основном отечественные сорта (полу-
ченные в КазНИИ риса) и сорта, происходящие из
ближнего зарубежья зНИИ риса, ВНИИ риса).
Так как содержание амилозы является одним из
важных показателей для оценки качества зерна,
проведен биохимический скрининг на содержание
амилозы у районированных сортов риса (табл. 2).
Результаты анализа свидетельствуют, что сор-
та риса, возделываемые в рисосеющих регионах
республики, в основном относятся к низко- и сред-
неамилозным (содержание амилозы 13–21,7%).
Проведенная ПЦР-идентификация аллельно-
го состояния гена waxy с использованием мар-
кера Glu-23 показала, что все районированные
29Биотехнология, 2018, Т. 34, № 2
ПОЛУЧЕНИЕ ДИГАПЛОИДНЫХ ЛИНИЙ ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ ГЛЮТИНОЗНОГО РИСА
Таблица 1
Структура использованных в работе праймеров
Structures of used primers
Праймер Нуклеотидная последовательность Источник
Wx-CAPS
Wx-B
F-5'-TGTTGTTCATCAGGAAGAACATCTCCAAG-3'
R-5'TTAATTTCCAGCCCAACACC-3' [8]
SSIIa_SNP4(C)
SSIIa_SNP4(T)
SSIIa SNP-L2
F-5'-GAG AGC TGG AGG GGG C-3'
F-5'-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAGAGCTGGAGGGGTT-3'
R-5'-CACACAAACCGGAAGCTAAT-3'
[6]
Glu-23F
Glu-23R
5'-TGCAGAGATCTTCCACAGCA-3'
5'-GCTGGTCGTCACGCTGAG-3' [10]
Wx_E6-F-C
Wx_E6-F-A
Wx_E6-R
5'-CAACCCATACTTCAAAGGAACATC-3'
5'-AACAACCCATACTTCAAAGGAACTTA-3'
5'-AGTCGTTGCAGACGAACACAAC-3'
[12]
Wx_E10-R-C
Wx_E10-R-T
Wx_E10-F
5'-GCGGCCATGACGTCTGG-3'
5'-GGCGGCCATGACGTCAGA-3'
5'-TCAGGCAATCGAGGCGAAG-3'
То же
Таблица 2
Характеристика районированных сортов риса Республики Казахстан
Characteristics of rice varieties zoned in the Republic of Kazakhstan
Сорт Год
допуска Оригинатор Вегетационный
период, сут
Масса
1000 зерен, г Амилоза, %
Авангард 1985 УзНИИ риса 117–125 32–33 15,9
Лазурный 1990 То же 122–126 29-30 15,7
УзРос 7-13 1968 »» 135–140 31–32 16,5
Алтынай 1999 ИББР 108–110 29–31 15,9
Баканасский 2008 То же 100–105 30–31 20,2
Заря 2008 »» 124–125 30–31 16,0
Мадина 2007 »» 110–112 40–42 16,0
КазНИИР-5 2012 То же 105–110 32–33 13,0
Арал 202 2006 »» 110–112 33–34 13,0
Ару 2008 »» 90–95 30–32 20,0
Маржан 1987 »» 110–115 33–34 21,7
Тогускен 2009 »» 112–115 32–34 16,0
КазЕр 6 2015 »» 105–107 31–32 20,0
Кубань-3 1963 ВНИИ риса 105–110 30–32 18,0
Лидер 2010 То же 120–125 30–31 15,0
Лиман 2007 »» 115–117 28–30 15,2
Новатор 2010 »» 100–105 29–31 15,0
Солнечный 1982 »» 110–120 30–32 20,3
Фишт 2012 »» 116–118 32–35 14,5
Янтарь 2009 »» 114–117 32–33 15,5
Анаит 2012 »» 100–106 37–39 17,9
Суаг 2009 КазНИИЗиР 120–122 30–31 20,0
Опытное 2006 То же 118–120 29–31 18,0
Пак-Ли 2004 »» 112–115 30–31 20,0
30
САРТБАЕВА и др.
Biotechnology, 2018, V. 34, No. 2
сорта республики являются среднеамилозными.
Для сравнения были взяты японские стандартные
сорта с различным содержанием амилозы (рис. 1).
Результаты ПЦР-анализа с помощью прай-
мера Glu-23 показали наличие двух продук-
тов: 1) продукт размером 173 пн характерен для
средне- и высокоамилозных сортов; 2) продукт
размером 196 пн является признаком глютиноз-
ного сорта.
Применение гаплоидной технологии для
получения предселекционного материала
глютинозного риса
После биохимического и молекулярного ана-
лиза районированных сортов риса была проведе-
на гибридизация местных амилозных сортов Ба-
канасский и Акдала, имеющих стекловидный
эндосперм (отцовская форма), с российским глю-
тинозным сортом Виола (материнская форма) для
получения предселекционного материала глюти-
нозного риса [23]. При этом количество получен-
ных гибридных зерновок в комбинации Виола ×
Баканасский составило 16 шт. (завязываемость
13–24%), у Виола × Акдала – 43 шт. (завязывае-
мость 20–80%).
Гибридные зерновки подвергали электрофо-
ретическому анализу для точной идентификации
истинности гибридного происхождения генера-
ции F1, а также для установления сходства и(или)
различия с их родительскими формами по спек-
трам запасных белков (рис. 2).
В спектре запасных белков семян F1 Виола ×
Баканасский отмечается появление интенсивных
белковых полос отцовской формы, к примеру,
компонента с молекулярной массой 60 кДа, что
является подтверждением гибридного происхож-
дения данной линии.
Полученные гибридные зерновки были посея-
ны в оранжерейных условиях для получения дига-
плоидов в культуре пыльников. В фазе трубкова-
ния пыльники, отобранные из гибридных комби-
наций F1 Виола × Баканасский и Виола × Акдала,
культивировали на твердой питательной среде
№ 6 с добавлением 2 мг/л 2,4-Д (1740 и 440 пыль-
ников, соответственно). Индуцированные каллу-
сы (123 образца) пассировали на регенерационной
среде МС с БАП (5 мг/л) и ИУК (1 мг/л). В резуль-
тате регенерации из гибрида F1 Виола × Баканас-
ский получено 79 зеленых и 30 альбиносных рас-
тений (72,5% и 27,5% соответственно) (рис. 3).
Из комбинации F1 Виола×Акдала in vitro по-
лучено 20 каллусов. Из этих каллусов регенери-
ровано четыре зеленых растения и два альбинос-
ных (табл. 3).
Растения-регенеранты с хорошо развитой
корневой системой извлекали из пробирок, от-
мывали от питательной среды и помещали в со-
суды с водопроводной водой для адаптации из
in vitro в in vivo. После двух суток адаптации
растения-регенеранты пересаживали в сосуды с
почвенно-торфяной смесью и культивировали в
оранжерее до полного созревания.
М М1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 2712 13
196 пн
173 пн
Рис. 1. Идентификация гена waxy у районированных сортов риса Казахстана: дорожки 1 – Авангард; 2Алтынай;
3 – Анаит; 4Арал 202; 5 – Ару; 6 – Баканасский; 7 – Заря; 8КазНИИР-5; 9 – Кубань-3; 10 – Лазурный; 11 – Лидер;
12 – Лиман; 13 – Мадина; 14Маржан; 15 – Новатор; 16 – Опытное; 17 – Пак-Ли; 18 – Солнечный, 19 – Суаг; 20
УзРос7-13; 21 – Фишт; 22 – Янтарь; 23 – Тогускен; 24 – КазЕр. В качестве стандартных использованы сорта: 25Ki-
tamizuho (содержание амилозы 26,9%); 26Yukigozon (19,56%,) и 27 – Hakucho-mochi (0,15%). М – маркеры молеку-
лярной массы (Applied Biosystems, Великобритания)
Fig. 1. Identication of waxy gene in rice varieties regionalized in Kazakhstan: lane 1, Avangard; 2, Altynay; 3, Anait; 4,
Aral 202; 5, Aru; 6, Bakanasskii; 7, Zaria; 8, KazNIIR-5; 9, Kuban’-3; 10, Lazurnyi; 11, Leader; 12, Liman; 13, Madina; 14,
Marzhan; 15, Novator; 16, Opytnoye; 17, Pak-Li; 18, Solnechnyi; 19, Suag; 20, UzRos7-13; 21, Fisht; 22, Yantar’; 23, To-
gusken; 24, KazEr. Following varieties were used as reference: 25, Kitamizuho (amylase content of 26.9%); 26, Yukigozon
(19.56%,) and 27, Hakucho-mochi (0.15%). М, MM markers (Applied Biosystems, GB)
31Биотехнология, 2018, Т. 34, № 2
ПОЛУЧЕНИЕ ДИГАПЛОИДНЫХ ЛИНИЙ ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ ГЛЮТИНОЗНОГО РИСА
Рис. 2. Электрофорез (a) и денситограмма (b) запасных белков гибрида F1 Виола×Баканасский в сравнении с роди-
тельскими формами. a: дорожки 1, 2 – Виола; дорожки 3, 4 – Баканасский; дорожки 5, 6 – F1 Виола×Баканасский; до-
рожка 7 – маркеры молекулярной массы (Thermo Scienti c, Литва); b: ♀ – Виола; ♂ – Баканасский; Гибрид – F1 Вио-
ла × Баканасский. Стрелки указывают фрагмент размером 60 кДа отцовской формы
Fig. 2. Electrophoresis (a) and densitogram (b) of rice spare proteins of F1 hybrid Viola×Bakanasskii as compared to parental
forms. (a): lanes 1 and 2,Viola; lanes 3 and 4, Bakanasskii; lanes 5 and 6, F1 Viola×Bakanasskii; lane 7, MM markers (Ther-
mo Scienti c, Lithuania); (b): ♀, Viola; ♂, Bakanasskii; Гибрид, F1 Viola×Bakanasskii. Arrows show 60-kDa fragment from
paternal form
1 2 3 4 5 6 7 Гибрид
ab
17
28
36
55
72
95
130
кДа
250
1 2 3 4 5 6 7 8 9
кДа ММ
waxy 60 кДа
250
130
100
70
55
35
25
15
Рис. 3. Электрофорез запасных белков дигаплоид-
ных линий риса (дорожки 3–7 – линии ДГ2-1, ДГ2-2,
ДГ2-3, ДГ2-4, ДГ2-5, соответственно; 9 – ДГ2-6) в
сравнении с родительскими сортами (дорожка 1
Виола; дорожка 2 – Баканасский; дорожка 8 – Акда-
ла). МM – маркеры молекулярной массы (Fermentas)
Fig. 3. Electrophoresis of spare proteins from rice dou-
bled haploid lines (lanes 3–7, lines DH2-1, DH2-2,
DH2-3, DH2-4, DH2-5, respectively; lane 9, DH2-6) in
comparison with parental varieties (lane 1, Viola; lane
2, Bakanasskii; and lane 8, Akdala). MM, mar kers
from Fermentas
Таблица 3
Частота регенерации пыльников из глютинозных гибридов
Frequency of anthers regeneration from glutinous hybrids
Растительный материал
F1
Виола × Баканасский Виола × Акдала
шт. %ш т. %
Высаженные пыльники 1740 440
Образовавшиеся каллусы 123 7,0 20 4,5
Зеленые растения 79 72,5 466,6
Альбиносные растения 30 27,5 233,3
Гаплоидные растения 45,1 3 75,0
Дигаплоидные растения 75 94,9 1 25,0
32
САРТБАЕВА и др.
Biotechnology, 2018, V. 34, No. 2
В комбинации F1 Виола × Баканасский 75 рас-
тений из 79 (94,9%) были спонтанно удвоенными
дигаплоидами, в то время как у гибрида F1
Виола ×
× Акдала получен один спонтанно удвоен ный ди-
гаплоид из четырех зеленых регенерантов (25%)
(см. табл. 3).
Полученные дигаплоидные линии были раз-
множены в полевых условиях Алматинской обл.
Среди дигаплоидов был проведен индивидуаль-
ный отбор по хозяйственно ценным признакам.
В результате отбора из комбинации F1 Виола×Ба-
канасский отобрано пять наиболее перспектив-
ных глютинозных дигаплоидных линий (( ДГ2-1)–
(ДГ2-5)). Отобранные линии были оценены по
биохимическим показателям (содержание амило-
зы, наличие Waxy-белка) (табл. 4).
Содержание амилозы у глютинозного сорта
риса Виола составило 1,85%, тогда как у амилоз-
ных сортов Баканасский и Акдала – 20,2 и 18,2%,
соответственно. У полученных дигаплоидных ли-
ний ((ДГ2-1)–(ДГ2-6)) содержание амилозы варьи-
ровало на уровне 0,3–1,66%.
С целью выявления связи интенсивности про-
дукции Wx-белка с содержанием амилозы был
проведен качественный анализ электрофорети-
ческих спектров запасных белков семян у роди-
тельских сортов и дигаплоидов риса. Что касается
компонента с массой 60 кДа, отмеченного стрел-
ками на рис. 2 у генотипов отечественных сортов
Баканасский и Акдала, глютинозные семена Ви-
олы и дигаплоидные линии характеризовались
меньшей интенсивностью соответствующих по-
лос Waxy-белка (см. рис. 3).
В ходе работы Waxy-белок использовали в ка-
честве белкового маркера амилозных линий риса
в отличие от глютинозных в популяции дигаплои-
дов. Выявлено, что все отобранные дигаплоидные
линии обеих комбинаций Виола×Баканасский и
Виола×Акдала были глютинозными.
В дальнейшем зерновки дигаплоидов анали-
зировали с помощью ПЦР, используя маркеры
Glu-23, SNP3, SNP4, WxE6, WxE10 и dCAPS для
идентификации аллелей Wx и Alk (табл. 5).
ПЦР-анализ c использованием праймера
Glu-23 подтвердил, что этот специфический прай-
мер фланкирует фрагмент размером 173 пн у ами-
лозных сортов Баканасский и Акдала (делеция
23 нуклеотидов), тогда как у глютинозного сорта
Виола и дигаплоидных линий данный праймер
способствует амплификации ПЦР-продукта дли-
ной 196 пн (23-нуклеотидная вставка).
Таблица 4
Содержание амилозы и белка Waxy в зерновках
дигаплоидных и родительских линий
Contents of amylose and Waxy protein in caryopsis
of doubled haploid and parental lines
Образцы Амилоза, %
Сорт Виола 1,85
Баканасский 20,20*
Акдала 18,20*
Дигаплоид ДГ2-1 0,31
ДГ2-2 0,80
ДГ2-3 1,44
ДГ2-4 0,78
ДГ2-5 1,17
ДГ2-6 1,66
Примечание: здесь и в табл.5 (ДГ2-1)–(ДГ2-5) – дигаплоиды
из комбинации F1 Виола × Баканасский, ДГ2-6 – дигаплоид из
комбинации F1 Виола × Акдала.
*Отмечено присутствие белка Waxy (60 кДа).
Таблица 5
Идентификация аллелей Wx и Alk у родительских сортов и дигаплоидных линий
Identication of Wx и Alk alleles in parental varieties and doubled haploid lines
Сорт и дигаплоид Glu-23 SSIIa_SNP3 A/G SSIIa_SNP4 TT/GC Wx_E6(A/C) Wx_E10 (С/Т) Wx_dCAPS
Виола GA GC C C TT
Баканасский A GGC C C CC
Акдала A GGC C C CC
ДГ2-1 GA GC C C TT
ДГ2-2 G A GC C C TT
ДГ2-3 GA GC C C TT
ДГ2-4 G A GC C C TT
ДГ2-5 GA GC C C TT
ДГ2-6 G A GC C C TT
33Биотехнология, 2018, Т. 34, № 2
ПОЛУЧЕНИЕ ДИГАПЛОИДНЫХ ЛИНИЙ ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ ГЛЮТИНОЗНОГО РИСА
С помощью dCAPS-праймера установлены
различия в Wxa- и Wxb-гаплотипах. Ген Wx, кото-
рый содержат обе амилозные родительские фор-
мы, относится в W-типу, а гены wx глютиноз-
ных генотипов относятся к Wxb-типу. Результаты
ПЦР WxE_6 и WxE_10 с использованием ал-
лель-специфических праймеров показывают, что
все изученные образцы имеют ‘С-С’ SNP-аллели
и, следовательно, Wxa-аллель амилозных родите-
лей относится к среднеамилозным гаплотипам,
тогда как Wxb-ген у материнских форм и дигапло-
идных линий относится к wx-типу. SNP-анализ
гена Alk показал, что глютинозный сорт Виола и
все дигаплоидные линии имеют последователь-
ность ‘A’ в SNP3 и ‘GC’ в SNP4, а значит, их га-
плотипы не содержат функциональный ген alk.
В то же время амилозные родители имели после-
довательность ‘G’ в SNP3 и ‘GC’ в SNP4 и, таким
образом, они имеют функциональный Alk-ген.
В результате проведенных работ получен пер-
спективный селекционный материал дигаплоид-
ных линий глютинозного риса из гибридов F1 Ви-
ола × Баканасский и Виола × Акдала, характери-
зующийся низким содержанием амилозы. Анализ
структуры урожая показал целесообразность ис-
пользования полученных дигаплоидов для даль-
нейшей селекции. Выделенные глютинозные ли-
нии дигаплоидов F1 Виола × Баканасский №148
и №149 превосходят стандартные родительские
формы по урожайности, а также способны созре-
вать в условиях Алматинской обл. По агроклима-
тическим показателям данная область относит-
ся к I зоне рисосеяния, где продолжительность
периода с температурой выше 15 ºС составля-
ет 130–145 дней, тогда как для Кызылордин-
ской (II зона) и Южно-Казахстанской (III зона)
областей этот показатель равен 145–160 и более
160 дней, соответственно [24].
Данные линии предварительно описаны по
морфологическим признакам на отличимость, од-
нородность и стабильность (DUS test), утверж-
денным Международным союзом по охране но-
вых сортов растений (UPOV), для последующей
передачи на Государственное сортоиспытание.
Как уже было сказано выше, одной из важ-
ных характеристик сортов риса является качество
зерна, включающее комплекс различных призна-
ков, в том числе компонентный состав крахмала.
От содержания амилозы зависят кулинарные до-
стоинства крупы риса (коэффициент привара и во-
допоглощения, консистенция и вкус блюда), что
в конечном счете влияет на процесс ценообразо-
вания на рынке продукта. Известно, что зернов-
ки наиболее качественных, глютинозных, сортов
риса содержат пониженное количество амилозы.
Поэтому был проведен скрининг содержания ами-
лозы в зерне районированных сортов, возделывае-
мых в рисосеющих хозяйствах республики. По по-
лученным данным, изученные сорта риса можно
разделить на две группы: низкоамилозные – 17 со-
ртов из 24 (70,83%) и среднеамилозные – 7 из 24
(29,17%). Глютинозные сорта среди районирован-
ных сортов Республики Казахстан отсутствуют,
что обусловило необходимость их селекции.
У вышеуказанных сортов риса проведена
идентификация аллельного состояния гена Wx
с помощью ПЦР и с использованием праймера
Glu 23. В результате ПЦР-анализа выявлено, что
все изученные сорта являются амилозными: с по-
мощью указанного праймера был амплифициро-
ван продукт размером 173 пн, в то время как для
глютинозного образца (Hakucho-mochi) характе-
рен ПЦР-продукт величиной 196 пн.
Таким образом, результаты анализа состоя-
ния гена Wx также указывают на принадлежность
всех изученных районированных сортов респуб-
лики к низко- и среднеамилозным.
На рис. 1 видно, что специфический праймер
Glu-23 фланкирует фрагмент размером 173 пн у
всех районированных сортов (образцы 1–24), тог-
да как у японского глютинозного стандартного
образца Hakucho-mochi (образец 27) с помощью
данного праймера амплифицирован ПЦР-продукт
длиной 196 пн. Таким образом, показано, что низ-
кое содержание амилозы коррелирует с наличием
указанного ПЦР-продукта.
Российский глютинозный сорт Виола исполь-
зовали в качестве материнской формы при созда-
нии глютинозных линий. Отцовской формой слу-
жили местные, адаптированные к почвенно-кли-
матическим условиям рисосеющих регионов сорта
казахстанской селекции (Баканасский и Акдала).
Количество полученных гибридных зерновок из
комбинации Виола × Баканасский составило 16
(завязываемость 13–24%), тогда как из комбинации
Виола × Акдала получены 43 полноценных зернов-
ки (завязываемость 20–80%). Необходимо учесть,
что завязываемость гибридных зерновок анализи-
ровали в нерегулируемых оранжерейных условиях.
Высокая воспроизводимость результатов элек-
трофоретического анализа позволяет использо-
вать его для точной идентификации родительских
форм, контроля этапов гибридизации, интрогрес-
сии генетического материала, а также при изуче-
нии всех типов изменчивости, включая геномную.
Известно, что запасные белки зерновых, в том
34
САРТБАЕВА и др.
Biotechnology, 2018, V. 34, No. 2
числе и риса, наследуются кодоминантно и соот-
ветствующие гены проявляются в спектре гетеро-
зиготного генотипа в зависимости от дозы генов
в триплоидном эндосперме (две дозы генов мате-
ринского и одна доза отцовского генома). Поэтому
когда при электрофорезе запасных белков семян
F1 Виола × Баканасский отмечается проявление
интенсивных белковых полос отцовской формы,
например, компонента с молекулярной массой
60 кДа, это является весомым подтверждением ги-
бридного происхождения данной линии. Получен-
ные гибриды были использованы для ускоренно-
го создания стабильных глютинозных форм риса
с помощью гаплоидной технологии. Для быстрой
стабилизации признака пониженного содержания
амилозы у перспективных глютинозных гибридов
F1 Виола × Баканасский и F1 Виола × Акдала при-
менен метод культуры пыльников.
В опытах отмечена высокая скорость спон-
танного удвоения числа хромосом в комбинации
F1 Виола×Баканасский (94,9%), тогда как у F1 Ви-
ола × Акдала этот показатель составил всего 25%,
что говорит о генотипической зависимости данно-
го показателя (см. табл. 3).
В результате настоящего исследования из
75 дигаплоидов гибрида F2 комбинации Вио-
ла × Баканасский выделено пять растений с полез-
ными признаками и низким содержанием амило-
зы. Для установления сходства и(или) различия с
родительскими формами был проведен электро-
форетический анализ запасных белков семян у
родительских форм сортов, гибридов и дигапло-
идов риса. Дигаплоиды были глютинозными и
не содержали компонент с молекулярной массой
60 кДа (так называемый Waxy-белок), уровень ко-
торого коррелирует с содержанием амилозы.
Доля амилозы в зерновке риса в основном
контролируется локусом Wx, который включает
аллели Wxа, Wxb, Wx оp, Wx in и wx. В данной ра-
боте показано, что ген wx амилозных сортов при-
надлежит к Wxа типу, а глютинозные образцы – к
Wxb типу. Содержание амилозы и амилопектина
определяют пищевое качество риса [1, 2]. Доми-
нантный ген SSIIa (Alk) способствует более твер-
дой и менее липкой консистенции по сравнению с
рецессивным геном alk [8]. При повышенном со-
держании амилозы (≥ 25%), обусловленном гена-
ми Wxa и Wxb, сохраняется форма и целостность
ядер риса при кулинарной обработке. Результаты
анализа SNP-маркеров показали, что амилозные
сорта имеют функциональный доминантный Alk-
ген, а глютинозные сорта – нефункциональный
рецессивный alk-ген.
Таким образом, по результатам исследований
выделены перспективные предселекционные об-
разцы, которые будут использованы в получении
новых казахстанских сортов глютинозного риса.
Авторы выражают глубокую признательность
коллективу ВНИИ риса и лично доктору сельско-
хозяйственных наук проф. Г.Л. Зеленскому за лю-
безно предоставленный для селекции исходный
материал, теоретические и практические консуль-
тации и рекомендации. Мы благодарим также со-
трудников лаборатории Crop Breeding Research
Division Сельскохозяйственного исследователь-
ского центра Японии (NARO, Hokkaido Agricultur-
al Research Center) Drs. Norio Iriki и T. Umemoto за
помощь при проведении молекулярно-генетиче-
ских исследований и за консультации.
Данная работа финансировалась в рамках
Проекта грантового финансирования 2168/ГФ4
КН МОН РК.
ЛИТЕРАТУРА
1. Sano Y. Dierential regulation of waxy gene expres-
sion in rice endosperm. Theor. Appl. Genet., 1984, 68,
467–473.
2. Sano Y., Katsumata M., Amano E. Correlation between
the amount of amylose and Wx protein in rice endo-
sperm. SABRAO J., 1985, 17, 121–127.
3. Chen C.C., Tsay H.S., Huang C.R. Factors aecting an-
drogenesis in rice (O. sativa L.). Biotechnology in ag-
riculture and forestry rice [Ed Bajaj, Y.P.S.]. 1991, 14,
193–215. Berlin, Heidelberg, Springer-Verlag 1986.
4. Ming Y. Zheng Microspore culture in wheat (Triticum
aestivum) – doubled haploid production via induced em-
bryogenesis. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2003,
73(3), 213–230.
5. Гончарова Ю.К. Использование метода культуры
пыльников в селекции риса. Краснодар: ВНИИ риса.
2012, 91.
6. Umemoto T., Horibata T., Aoki N., et al. Rice starch prop-
erties and eating quality of cooked rice aected by starch
synthase variations, Plant Prod. Sci., 2008, 11, 472–480.
7. Juliano B.O. A simplied assay for milled rice amylose.
Cereal Sci. Today, 1971, 16, 334–340.
8. Yamanaka S., Nakamura I., Watanabe K.N., et al. Iden-
tication of SNPs in the waxy gene among glutinous
rice cultivars and their evolutionary signicance during
the domestication processes of rice, Theor. Appl. Genet.,
2004, 108, 1200–1204.
9. Cai X.L., Wang Z.Y., Xing Y.Y., et al. Aberrant splicing
of intron 1 leads to the heterogeneous 5′ UTR and de-
creased expression of waxy gene in rice cultivars of in-
termediate amylose content. Plant J., 1998, 14, 459–465.
35Биотехнология, 2018, Т. 34, № 2
ПОЛУЧЕНИЕ ДИГАПЛОИДНЫХ ЛИНИЙ ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ ГЛЮТИНОЗНОГО РИСА
10. Wanchana S., Toojinda Th., Tragoonrung S., et al. Du-
plicated coding sequence in the waxy allele of tropical
glutinous rice (Oryza sativa L.). Plant Sci., 2003, 165,
1193–1199.
11. Larkin P.D., Park W.D. Association of waxy gene sin-
gle nucleotide polymorphisms with starch characteris-
tics in rice (Oryza sativa L.). Mol. Breed., 2003, 12,
335–339.
12. Chen M.H., Fjellstrom R.G., Christensen E.F., et al. De-
velopment of three allele-specic codominant rice Waxy
gene PCR markers suitable for marker-assisted selection
of amylose content and paste viscosity, Mol. Breeding,
2010, 26, 513–523.
13. Larkin P.D., Park W.D. Transcript accumulation and uti-
lization of alternate and non-consensus splice sites in rice
granule bound starch synthase are temperature-sensitive
and controlled by a single-nucleotide polymorphism.
Plant Mol. Biol., 1999, 40, 719–727.
14. Козьмина Е.П. Рис и его качество. М.: Колос, 1976,
34–46.
15. Лось Г.Д. Перспективный способ гибридизации риса.
Сельхозбиология, 1987, 12,107–109.
16. Chu C.C. The N6 medium and its application to anther
culture of cereal crops. In Proc. Symp. On plant tissue
culture. Bejing, China: Science Press, 1978, 43–50.
17. Murashige T., Scoog F. A revised medium for rapid
growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physi-
ol. Plant., 1962, 15(13), 473–497.
18. Ando T., Takeuchi Y. Genetic analysis of the low-amy-
lose characteristics of rice cultivars Oborozuki and Hok-
kai-PL9. Breed. Sci., 2010, 60, 187–194.
19. Булатова К.М. Изучение компонентного состава глю-
тенина пшеницы. Вестник с.-х. науки Казахстана,
1985, 4, 37–39.
20. Murray M.G. Rapid isolation of high molecular
weight plant DNA. Nucleic Acids Research, 1980, 10,
4321–4325.
21. Tran Th., Hiroaki M., Yoshiko T., et al. Inuence of sin-
gle-nucleotide polymorphisms in the gene encoding gran-
ule-bound starch synthase I on amylose content in Viet-
namese rice cultivars. Breed. Sci., 2014, 64, 142–148.
doi: 10.1270×jsbbs.64.142
22. Hiratsuka M., Umemoto T., Aoki N., et al. Development
of SNP markers of starch synthase IIa (alk) and haplo-
type distribution in Rice Core Collections. Rice Genetic
Newsletter, 2009, 25, 80–82.
23. Зеленский Г.Л., Туманьян Н.Г., Лоточникова Т.Н., и
др. Эксклюзивные сорта в селекции ВНИИ риса. Ри-
соводство, 2004, 4, 20–23.
24. Коваленко В.И., Дуденко В.П. Культура риса в Казах-
стане. Алма-Ата: «Кайнар», 1974, 16.
Obtaining of Doubled Haploid Lines for Selection
of Glutinous Rice
I.A. SARTBAEVA1, B.N. USENBEKOV2, A.B. RYSBEKOVA2,3,*, Zh.M. MUKHINA4,
D.T. KAZKEEV5, K.Zh. ZHAMBAKIN2, E.A. ZHANBYRBAEV4, Kh.A. BERKIMBAI2,
D.Sh. AKHMETOVA2, and A.A. MELDEBEKOVA1
1The Al-Farabi Kazakh National University, 050040, Almaty Kazakhstan
2The Institute for Plant Biology and Biotechnology (IBRR), 050040, Almaty Kazakhstan
3The Seifullin Kazakh University of Agrotechnics, 010000, Astana Kazakhstan
4The All-Russian Rice Research Institute (ARRRI), 350921, p/o Belozernyi, Krasnodar Russia
5The Kazakh National Agrarian University, 050010, Almaty Kazakhstan
е-mail: bakdaulet7@yandex.ru, aiman_rb@mail.ru*
Received 11 January, 2017
Accepted November 15, 2017
Abstract–A screening of zoned in the Republic of Kazakhstan rice varieties for the amylose content has
been carried out. The allele state identication of the waxy gene using a marker of Glu-23 showed that all
the studied varieties contain a medium amount of amylose as compared to the standard Japanese varieties.
A hybridization of the Bakanasskii and Akdala Kazashstan varieties with the glutinous variety of Viola
was performed to obtain low-amylose rice forms. A capacity of knotting hybrid grains in greenhouses was
shown; those grains were sown in the greenhouse to obtain doubled haploids in the anthers culture. PCR
36
САРТБАЕВА и др.
Biotechnology, 2018, V. 34, No. 2
was used to identify the alleles of the Wx and Alk genes in the varieties and haploid lines using the Glu-23,
SNP3, SNP4, Wx_E6, Wx_E10 and dCAPS markers. Therefore, promising lines of glutinous rice with
economically valuable properties to be transferred to State Trials were created using the method of routine
selection and following haploid technique.
Key words: doubled haploids, glutinous variety, rice anthers culture, amylose content, waxy gene.
Acknowledgements–The authors are deeply acknowledged to the sta of the All-Russian Rice Research
Institute and personally to Prof. G.L. Zelenskii, PhD Agric. Sci., for kindly provided material for selection,
and theoretical and practical consulting. We are also acknowledged to Drs. Norio Iriki and T. Umemoto,
employees of the Crop Breeding Research Division of the National Agricultural Research Center (NARO,
Hokkaido), for the assistance in molecular genetic studies and consulting.
The work was supported by the Science Committee of the Ministry of Education and Science of the
Republic of Kazakhstan within the framework of Grant Financing (Project 2168/GF 4 SC MES RK).
doi: 10.21519/0234-2758-2018-34-1-26-36
ResearchGate has not been able to resolve any citations for this publication.
Article
Full-text available
Amylose content is one of the most important factors influencing the physical and chemical properties of starch in rice. Analysis of 352 Vietnamese rice cultivars revealed a wide range of variation in apparent amylose content and the expression level of granule-bound starch synthase. On the basis of single-nucleotide polymorphisms (SNP) at the splicing donor site of the first intron and in the coding region of the granule-bound starch synthase I gene, Waxy gene, alleles can be classified into seven groups that reflect differences in apparent amylose content. The very low and low apparent amylose content levels were tightly associated with a G to T in the first intron whereas intermediate and high amylose was associated with a T genotype at SNP in exon 10. The correlation between the combination of T genotype at SNP in the first intron, C in exon 6, or C in exon 10 was predominant among low amylose rice varieties. Our analysis confirmed the existence of Wx (op) allele in Vietnamese rice germplasm. The results of this study suggest that the low amylose properties of Vietnamese local rice germplasm are attributable to spontaneous mutations at exons, and not at the splicing donor site.
Article
A method is presented for the rapid isolation of high molecular weight plant DNA (50,000 base pairs or more in length) which is free of contaminants which interfere with complete digestion by restriction endonucleases. The procedure yields total cellular DNA (i.e. nuclear, chloroplast, and mitochondrial DNA). The technique is ideal for the rapid isolation of small amounts of DNA from many different species and is also useful for large scale isolations.
Article
The frequency of the induction of androgenesis in cultured anthers is in general rather low. In order to utilize anther culture in crop breeding programs, it is essential that the haploids are produced in large numbers. In this chapter various factors responsible for enhancing androgenesis in rice are discussed.
Article
Control of the amylose content is a major strategy for breeding rice with improved eating quality. To identify the low-amylose gene of the low-amylose rice cultivar Oborozuki, quantitative trait loci (QTL) and sequence analyses were conducted on 90 progeny obtained by crossing the two japonica cultivars Hokka287 (a donor parent of Oborozuki) and Hokkai-PL9. One QTL for low amylose content was detected on the WX1 locus on the short arm of chromosome 6. This gene was designated Wx1-1 for the Hokkai287 allele, and is a novel allelic gene for the WX1 locus with a 37-bp deletion in intron 10. Homozygote genotype for Wx1-1 decreased the amylose content by 7.8%. Primer sets Wx-U1L3 designed to amplify the genome region containing the deletion clearly differentiated cultivars containing Wx1-1 from others. This DNA marker is useful for breeding cultivars with low amylose contents. Another QTL, qAC9.3, was detected on the short arm of chromosome 9. Hokkai-PL9-homozygote allele for qAC9.3 decreased the amylose content by 2.6%. QTL analyses showed that Wx1-1 and the Hokkai-PL9 allele of qAC9.3 have an additive effect in decreasing the amylose content. The two genes are useful tools in marker-assisted selection when breeding rice with a controlled amylose content for improved eating quality.
Article
In order to examine the effects of different alleles on the gene expression at the waxy locus, the Wx gene product which controls the synthesis of amylose was isolated from endosperm starch of rice plants and analysed by electrophoretic techniques. The major protein bound to starch granules was absent in most of waxy strains and increased with the number of Wx alleles in triploid endosperms, suggesting that the major protein is the Wx gene product. In addition to wx alleles which result in the absence or drastic reduction of the Wx gene product and amylose, differentiation of Wx alleles seemed to have occurred among nonwaxy rice strains. At least two Wx alleles with different efficiencies in the production of the major protein as well as amylose were detected. These alleles are discussed in relation to regulation of the gene expression.
Article
We evaluated the effects of functional variation in three starch synthases in rice (Oryza sativa L.)-granule-bound starch synthase I (GBSSI, wx), starch synthase I (SSI, SSI), and starch synthase IIa (SSIIa, alk)-between indica cultivar Kasalath and japonica cultivar Nipponbare on starch properties and eating quality. We used three near-isogenic lines-NIL(Wxa), NIL(SSIk), and NIL(Alk)-containing chromosomal segments of Kasalath on a Nipponbare genetic background. The Wxa allele explained most of the difference in amylose content between the two cultivars, and decreased the peak viscosity and breakdown to less than half of those of Nipponbare. These changes reduced the quality of cooked rice both just after cooking and after storage at 5°C. The variation in SSIIa also affected the eating quality after storage of cooked rice at 5°C : NIL(Alk) became harder and less sticky than Nipponbare, although the rices were comparable just after cooking. Differential scanning calorimetry revealed faster retrogradation of the once-gelatinized starch in NIL(Alk). The variation in SSI alleles hardly affected these properties.