Relaciones evolutivas de los peces Prochilodus reticulatus y Prochilodus magdalenae (Characiformes: Prochilodontidae)

Abstract

A phylogenetic study was carried out between the species Prochilodus reticulatus (Valenciennes, 1850) and P. magdalenae (Steindachner, 1879) of great socioeconomic value in the country. Initially, the species were collected for DNA extraction and subsequent characterization by RAPD-PCR to establish their phylogenetic relationships using the Jaccard coefficient and the UPGMA method. The phylogenetic analysis of P. reticulatus and P. magdalenae showed a close genetic relationship, which suggests that the differences found between them may not be considered significant.

Full text

Volumen 21 No. 1, junio 2017 161
Evolutionary Relationships of the Fish Prochilodus reticulatus and
Prochilodus magdalenae (Characiformes: Prochilodontidae)
Abstract
A phylogenetic study was carried out between the species Prochilodus reticulatus
(Valenciennes, 1850) and P. magdalenae (Steindachner, 1879) of great socioeconomic value in the
country. Initially, the species were collected for DNA extraction and subsequent characterization
by RAPD-PCR to establish their phylogenetic relationships using the Jaccard coefcient and the
UPGMA method. The phylogenetic analysis of P. reticulatus and P. magdalenae showed a close
genetic relationship, which suggests that the differences found between them may not be considered
signicant.
Keywords: Prochilodus sp., RAPD, Phylogenetic analysis.
Relaciones evolutivas de los peces Prochilodus reticulatus y Prochilodus
magdalenae (Characiformes: Prochilodontidae)
Resumen
Se realizó un estudio logenético entre las especies Prochilodus reticulatus (Valenciennes,
1850) y P. magdalenae (Steindachner, 1879) de gran valor socioeconómico en el país. Inicialmente,
las especies fueron colectadas para la extracción del ADN y su posterior caracterización mediante
RAPD-PCR para establecer sus relaciones logenéticas empleando el coeciente de Jaccard y el
método UPGMA. El análisis logenético de P. reticulatus y P. magdalenae mostró una estrecha
relación genética, lo que sugiere que las diferencias encontradas entre ellas pueden considerarse no
signicativas.
Palabras clave: Prochilodus sp., RAPD, Análisis logenético.
Seir Antonio Salazar Mercado
Universidad Francisco de Paula Santander
Nelson Alfonso Vega Contreras
U n i v e r s i d a d F r a n c i s c o d e P a u l a S a n t a n d e r
Received: February 7, 2017 Accepted: June 29, 2017
Pag. 161-171
Facultad de Ciencias Naturales y Exactas
Universidad del Valle
Fabian Galvis
Universidad de Santander

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Revista de Ciencias N. Vega, F. Galvis y S. Salazar
1 Introducción
El departamento de Norte de Santander, Colombia, se encuentra rodeado por tres
grandes cuencas: río Magdalena, río Catatumbo y río Orinoco [1], que cuentan con una
variedad de especies icticas de impacto económico, siendo Prochilodus sp, las especies
más representativas a nivel comercial [2, 3, 4].
P. magdalenae (bocachico), especie endémica de la cuenca del rio Magdalena, [5],
se distribuye en las zonas bajas de los rios Magdalena, Sinú y Atrato, hasta los 1000
m.s.n.m., aproximadamente; y en el río Cauca alcanza a remontar a la cuenca alta hasta los
1500 m.s.n.m. debido a la pendiente suave [6]. En la década de los años 80 se estableció
que la población de bocachico estaba cercana a los límites de aprovechamiento sostenible
(tasa de explotación E=41%) [7]. Para la cuenca del Sinú, Valderrama y Solano 2004
[8], determinaron una disminución progresiva de la biomasa desovante durante el periodo
1997-2002, pasando de 279 ton a 32 ton, con mortalidades por pesca (F media anual
= 1,9 año-1) muy superiores al punto biológico de referencia (PBR) de mortalidad por
pesca al máximo rendimiento por recluta Fmax = 0,9 año-1, indicando altos niveles de
sobreexplotación. En razón a su gran importancia económica, P. magdalenae es la especie
íctica más investigada del país, no obstante, persisten vacíos de información sobre aspectos
reproductivos, genéticos poblacionales, dinámicas poblacional y migratoria en las cuencas
del Magdalena y Atrato. Para la cuenca del Sinú se conoce su dinámica migratoria y
estructura genética de las poblaciones [6].
P. reticulatu se encuentra en las cuencas de los ríos Catatumbo y Ranchería, distribuidas
en Colombia y Venezuela [10]. En el Catatumbo habita en toda la cuenca desde el Lago
de Maracaibo y ciénagas adyacentes de la parte baja, hasta los 1000 m.s.n.m. En época
de aguas bajas remonta el río Catatumbo y demás tributarios como los ríos, Tibú, Tarra,
San Miguel, río de Oro, Sardinata, Nuevo Presidente y Zulia, hasta aproximadamente los
1000 m.s.n.m. [11]. Para el Catatumbo, P. reticulatu era la especie de mayor contribución
a las capturas totales, según los monitoreos realizados entre 1989 y 1995 por la Asociación
Cravo Norte [14], sin embargo, en la actualidad su aporte ha disminuido.
Se ha observado que los ríos Catatumbo y Magdalena comparten muchas especies
de peces, lo que hace suponer un origen común [10]. Shultz, (1949) consideraba que
las cuencas de estos ríos debieron converger en algún momento; el levantamiento de la
serranía del Perija, durante el plioceno superior separo en dos, las cuencas del Magdalena y
Catatumbo con lo cual poblaciones de peces prácticamente idénticas quedaron aisladas de
lado y lado de esta serranía evolucionado por separado [11]. Los endemismos producidos
por esta separación no bastan para explicar las diferencias entre la fauna del Magdalena
y del Catatumbo [2]. La caracterización genética se convierte en una herramienta
importante que permite dar un nuevo enfoque más acorde a la relación logenética entre
estas especies [12, 13]. Las metodologías moleculares han revolucionado el análisis
genético permitiendo la identicación de especies implementando diversas técnicas

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moleculares. La técnica para detectar polimorsmo en el ADN amplicado al azar
(RAPD) en ictiología, es un método basado en la PCR, en el que se emplea un cebador
corto, generalmente de 10 bases, para amplicar secuencias arbitrarias de ADN [14].
Con esta técnica no se busca ningún fragmento de ADN especíco, ya que el cebador
se adhiere al ADN patrón en secuencias complementarias de ubicación desconocida. En
consecuencia, no se conocerá la naturaleza de los productos obtenidos. Los fragmentos
de ADN así generados se separan y se detectan mediante electroforesis, produciendo
polimorsmos que permiten una caracterización molecular de las especies en estudio.
Según Alberti (2011) su rapidez, sencillez y bajo costo son los marcadores elegidos para
numerosos estudios de diversidad, sobre todo en especies no modelo en las que no se
dispone de información previa de secuencia [15]. Silva et al. (2016) utilizaron de forma
exitosa los marcadores RAPD y ADN mitocondrial (mtADN) en el pez Atherinella
brasiliensis, determinando su diversidad genética, estructura de la población y el ujo de
genes [16]. En otra investigación, Mohapatra et al. (2013) evaluaron la variación genética
y la logenia molecular entre y dentro de dos poblaciones de Catla catla implementando
la técnica RAPD [17]. Según lo anterior y teniendo en cuenta los estudios de Bardakci y
Skibinski (1994) en especies de Tilápia, el empleo de marcadores RAPD pueden detectar
variaciones interpoblacionales e interespecícas en poblaciones de peces [18]. Diferentes
autores han evaluado la estructura genética de las poblaciones y han caracterizado una
gran variedad de peces, que han permitido conocer las relaciones evolutivas de un grupo
de especies utilizando los marcadores RAPD. [ 16, 17, 18, 19, 20]. Sin embargo, no se
han reportados estudios en donde se analicen las relaciones logenéticas entre las especies
P. magdalenae y P. reticulatus. Por tal motivo esta investigación busca caracterizar a
nivel molecular las especies P. reticulatus y P. magdalenae, utilizando la técnica RAPD.
Posteriormente, se realiza un análisis logenético utilizando el coeciente de Jaccard y el
método UPGMA para determinar la relación entre las especies trabajadas.
2 Materiales y métodos
Se recolectaron cuatro individuos de cada una de las siguientes poblaciones:
- P. magdalenae de la piscícola San Silvestre Barrancabermeja Santander – Colombia
(Figura 1A).
- P. reticulatus de la piscícola del parque eco turístico Paco Piedra Corponor Zulia
Norte de Santander- Colombia (Figura 1B).
- Prochilodus. mariae en el río Urivante Orinoco Venezolano. Utilizada como control
positivo.
- Anodus laticeps del parque eco turístico Paco Piedra Corponor Zulia Norte de
Santander - Colombia, como control negativo por ser una especie que no pertenece al
genero Prochilodus.

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Figura 1. Distribución geográca de P. magdalenae y P. reticulatus. A. localización de P. magdalenae. B.
localización de P. reticulatus. Fuente: Mojica et al. (2012).
2.1 Extracción de ADN
El ADN fue extraído a partir de la aleta dorsal de dieciséis individuos siguiendo el
protocolo de fenol cloroformo por maceración manual descrito por Sambrook et al., 1989
[21]. Posteriormente, se visualizó la cantidad y calidad del ADN en un gel de agarosa al
1%. Las muestras de ADN fueron almacenadas a 4 °C hasta su utilización.
2.2 Caracterización molecular mediante RAPD
Se utilizó la metodología propuestas por Hatanaka y Galetti (2003) [22] en la
estandarización de la mezcla de PCR, las temperaturas y los tiempos para la amplicación
arbitraria mediante RAPD de los ADN de P. magdalenae, P. reticulatus, P. mariae
y A. laticeps. Los cebadores utilizados fueron OPP-7 GTCCATGCCA, OPP-12
AAGGGCGAGT, A11 CAATCGCCGT y A02 TGCCGAGCTG [22 y 23].
La PCR se realizó con un paso inicial de desnaturalización a 94°C durante 5 minutos,
seguido de 45 repeticiones de 1 minuto a 94°C, 1 minuto a 36°C y 2 minutos a 72°C, con
un ciclo nal de extensión a 72°C por 15 minutos. Los productos de la PCR se analizaron
en geles de agarosa al 1.4%.
3 Estudio Filogenético
Para el estudio logenético de P. magdalenae y P. reticulatus se utilizaron matrices de
presencia y ausencia de bandas de los perles de ADN obtenidos por RAPD con cada uno
de los cebadores utilizados. Con ellos se hizo un análisis de agrupamiento con el n de

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identicar patrones de similitud entre P. magdalenae y P. reticulatus comparado con P.
mariae como control positivo y A. laticeps como control negativo. Los datos de perles
de bandas fueron ordenados de acuerdo a un sistema binario de 0 y 1, donde valores de 0
indican ausencia de una banda y 1 la presencia en una posición determinada. Los perles
de fragmentos de ADN obtenidos con los 4 diferentes cebadores fueron analizados con
el Software estadístico NTSYS 2.2. En este análisis se empleó la técnica de ligamiento
por el promedio ponderado o UPGMA. La matriz de similitud fue construida utilizando el
coeciente de Jaccard [24].
4 Resultados y discusión
En el aislamiento de ADN, utilizando el procedimiento propuesto por Sambrook et al
(1989), se obtuvo un ADN en adecuada de alta concentración y pureza en las especies P.
magdalenae, P. reticulatus, P. mariae y A. laticeps demostrando la ecacia en la extracción
de ADN. (Figura 2).
Figura 2. ADN aislado mediante el método de Fenol-Cloroformo con maceración manual. 1: P.
magdalenae; 2: P. reticulatus; 3: P. mariae; 4: A. laticeps; 5: Marcador de peso molecular Hyperladder II.
Para la caracterización molecular de P. magdalenae y P. reticulatus todas las
amplicaciones realizadas mostraron patrones de bandas denidas y reproducibles. El
perl de bandas que generó cada uno de los cebadores (Figura 3) fue analizado para cada
especie mediante el registro de la presencia («1») o ausencia («0») de bandas de ADN
de tamaño similar. El criterio utilizado para identicar una banda como polimórca fue
su presencia o ausencia en forma consistente en dos amplicaciones independientes,
demostrando la reproducibilidad de la técnica. Estos resultados permitieron construir una
matriz binaria que combinó todos los polimorsmos detectados en las especies utilizadas
en este estudio.

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Figura 3. Patrones de amplicación RAPD. A: cebador OPP7 (1: P. reticulatus; 2: P. mariae; 3: P.
Magdalenae; 4: A. Leptus). B. cebador OPP12 (1: Marcador de peso molecular 100bp DNA Ladder; 2: P.
reticulatus; 3: P. mariae; 4: P. Magdalenae; 5: A. laticeptus) C. cebador A02 (1: Marcador de peso molecular
100bp DNA Ladder; 2: P. reticulatus; 3: P. mariae; 4: P. Magdalenae; 5: A. laticeps. D. cebador A11 (1: P.
reticulatus; 2: P. mariae; 3: P. Magdalenae;4: A. Laticeps.
En el análisis logenético utilizando el cebador OPP7 se observó que el índice de
similitud de 0.93 obtenido entre P. reticulatus y P. magdalenae muestra una relación muy
estrecha, lo que demuestra que las diferencias a nivel molecular entre estas dos especies
son mínimas (Figura 4A). En un estudio realizado por Hatanaka y Galetti (2003) [22],
en donde establecen una caracterización molecular de P. marggravii distribuidas en
diferentes áreas geográcas, la amplicación con el cebador OPP7 mostró un alto grado
de polimorsmo, estableciendo una diferenciación genética en los individuos en sus
diferentes hábitats. También este cebador ha sido utilizado en estudios de caracterización
de algas, hongos, plantas y mamíferos, mostrando un alto grado de polimorsmo [25].

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Figura 4. Dendrogramas de similitud usando el coeciente de Jaccard y el método UPGMA.
(A) Cebador OPP-7. (B) Cebador OPP-12. (C) Cebador A11. (D) Cebador A02. (E) Análisis total.
Los cebadores OPP12 y A02 presentaron un porcentaje de similitud de 0.56 y 0.45,
respectivamente, entre P. reticulatus y P. magdalenae, mostrando una relación entre estas
dos especies. Establecen una diferencia de 0.45 para OPP12 y 0.31 para A02, con el control
P. mariae y una diferencia total con los dos cebadores con el control negativo A. laticeps
(Figura 4B y 4C). Estos cebadores también han sido utilizados mostrando amplicaciones
polimórcas en estudios de caracterización molecular en otros peces, como Piaractus
mesopotamicus y Leporinus elongatus [13], y en plantas, como Solanum tuberosum [26].
El análisis molecular con el cebador A11 mostro una diferencia con los cebadores
anteriores, agrupando al control negativo A. laticeps con P. magdalenae y P. mariae con
un coeciente de similaridad de 0.64. Además, establece una diferencia entre P. reticulatus
y las demás especies analizadas (Figura 4D). Este marcador molecular localiza regiones
altamente polimórcas no apropiadas para el estudio a nivel de género y especie en la
familia Curimatidae, sino probablemente permitiría caracterizar especies en categorías
taxonómicas superiores.

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Relacionando los cuatro cebadores utilizados mediante un análisis de similitud y
agrupamiento se observó la formación de 3 clusters entre las especies comparadas. Todas
presentaron un porcentaje de similitud de 0.14. P. mariae exhibe un coeciente de
similaridad de 0.38 con P. reticulatus y P. magdalenae. El porcentaje de agrupamiento
entre P. reticulatus y P. magdalenae fue de 0.64 (Figura 4E). Islam et al (2005) utilizaron
marcadores moleculares RAPD para analizar la diferenciación genética en las poblaciones
de C. catla en tres ríos de la india a partir de la combinación de cuatro cebadores aleatorios
(OPB03, OPB08, OPB09, OPB15) el coeciente de similitud varió De 0,025 a 0,052 en
las poblaciones de los ríos Halda (0.052) Jamuna y Padma (0.025), demostrando que
entre más distantes son geográcamente las poblaciones de C. catla, la distancia genética
va a ser mayor [20]. Otro estudio similar con cuatro poblaciones de C. catla, conrman
la importancia de los marcadores RAPD para discriminar ecazmente las diferencias
genéticas de las poblaciones [19]. Silva et al. (2016) implementaron los marcadores
RAPD y el ADN mitocondrial (mtADN) para brindar información sobre la diversidad, la
estructura y la historia de las poblaciones de A. brasiliensis a lo largo de la costa brasileña
[16]. Recientemente, se emplearon exitosamente los marcadores de mtADN para conocer
la estructura de las poblaciones y las relaciones logenéticas del pez Gymnocypris
dobula [27]. En otras investigaciones, Orozco et al. (2014) utilizaron los marcadores de
microsatélites para determinar la diversidad genética y la estructura poblacional de P.
magdalenae en la cuenca del río Magdalena en Colombia, constituyendo una herramienta
para una mejor comprensión del comportamiento y biología de esta especie, contribuyendo
a la gestión de la pesca y los programas de conservación de P. magdalenae.
El análisis logenético entre las especies P. reticulatus y P. magdalenae muestra una
estrecha relación genética entre estas dos especies. Esta uniformidad genética sugiere que
las diferencias encontradas entre P. reticulatus y P. magdalenae pueden considerarse no
signicativas. Sin embargo, se considera necesario realizar investigaciones en donde se
comparen otros marcadores para seguir estudiando la relación entre P. reticulatus y P.
magdalenae.
5 Conclusiones
Se caracterizó molecularmente P. reticulatus y P. magdalenae mediante RAPD
presentando una estrecha relación entre estas dos especies, con un coeciente de
similitud de 0.64. Sus diferencias fenotípicas pueden resultar no de cambios genéticos,
si no, probablemente, de la interacción genotipo y ambiente, que provocarían diferentes
manifestaciones del fenotipo, ya que estas especies son grupos de poblaciones naturales
con posibilidad de cruzamiento entre sí, pero conservando diferentes barreras en la
reproducción que impiden el intercambio genético [28].
Se plantea la posibilidad de realizar un estudio más detallado de la relación entre las
especies P. reticulatus y P. magdalenae en donde se puedan utilizar nuevos marcadores
moleculares como secuenciación y microsatelites que permitan medir la variación genética
y la logenia entre estas dos poblaciones de P. reticulatus y P. magdalenae, que permitirían
aportar una información más detallada.

Relaciones evolutivas de los peces Prochilodus reticulatus y Prochilodus
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Agradecimientos
A la Universidad Francisco de Paula Santander y Universidad de Santander por su valiosa
colaboración.
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Dirección de los autores
Nelson Alfonso Vega Contreras
Facultad de Ciencias Agrarias y del Medio Ambiente, Universidad Francisco de Paula
Santander, San José de Cúcuta - Colombia.
nealvec6@gmail.com
Nestor Fabian Galvis Serrano
Grupo de Investigación BIOGEN, Universidad de Santander, San José de Cúcuta - Colombia.
fgs999@hotmail.com
Seir Antonio Salazar Mercado
Facultad de Ciencias Agrarias y del Medio Ambiente, Universidad Francisco de Paula
Santander, San José de Cúcuta - Colombia.
salazar663@hotmail.com