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Sistemas microfisiológicos compostos por organoides humanos em dispositivos microfluídicos: avanços e desafios

Authors:
  • UNICAMP - Universidade Estadual de Campinas

Abstract and Figures

Introduction: Models with higher predictive capacity and able to produce results at lower costs and in shorter times are needed for drug development. The microphysiological systems (MPS) that cultivate human tissues in three-dimensional histoarchitecture (3D) are promising alternatives for these objectives. Objective: This review work aims to address the state of the art of SMF development and illustrate the initial Brazilian experience with this technology. Method: The research and data collection covering the theme “Microphysiological Systems”, and the subtopics “Microfluidic Devices” and “3D Culture of Human Cells”, was based on electronic search in Capes Journals Portal, scientific databases Scopus, PubMed and Science Direct and with the Google Scholar search tool. Results: Among the existing microphysiological systems, those that are characterized by the culture of human tissues organized in three - dimensional histoarchitecture in microfluidic devices were recently introduced, as being the most promising ones. In addition, between the years 2000-2017, we recorded approximately increases of 12, 985 and 380 times in the number of academic publications related to the areas of Microfluidics, Organ-on-a-Chip and MPS respectively, illustrating the impact of this technology today. Conclusions: This relatively recent technology has high potential to overcome the limitations of current in vitro experimental models.
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REVISÃO
https://doi.org/10.22239/2317-269x.01053
Sistemas microsiológicos compostos por organoides
humanos em dispositivos microuídicos: avanços e desaos
Microphysiological systems composed of human organoids in
microuidic devices: advances and challenges
Talita Miguel Marin*
Eduardo Pagani
Centro Nacional de Pesquisa em
Energia e Materiais (CNPEM),
Campinas, SP, Brasil
*E-mail: talita.marin@lnbio.cnpem.br
Recebido: 30 set 2017
Aprovado: 25 abr 2018
RESUMO
Introdução: Modelos com maior capacidade preditiva e que produzam resultados
a custos mais baixos e em prazos menores são necessários para o desenvolvimento
de fármacos. Os sistemas microsiológicos (SMF) que cultivam tecidos humanos em
histoarquitetura tridimensional (3D) apresentam-se como alternativas promissoras para
esses objetivos. Objetivo: Este trabalho de revisão tem por objetivo abordar o estado
da arte mundial do desenvolvimento dos SMF e ilustrar a experiência brasileira inicial
com essa tecnologia. Métodos: A pesquisa e coleta de dados abrangendo a temática
“Sistemas Microsiológicos”, e os subtemas “Dispositivos Microuídicos” e “Cultura 3D
de Células Humanas”, foi baseada em busca eletrônica no Portal de Periódicos Capes,
nas bases de dados cientícas Scopus, PubMed e Science Direct e utilizando a ferramenta
de busca Google Scholar. Resultados: Dentre os sistemas microsiológicos existentes, os
que são caracterizados pelo cultivo de tecidos humanos organizados em histoarquitetura
tridimensional em dispositivos microuídicos foram recentemente introduzidos, como
sendo os mais promissores. Além disso, entre os anos 2000–2017, registramos aumentos de
aproximadamente 12, 985 e 380 vezes no número de publicações acadêmicas relacionadas
às áreas de Microuídica, Organ-on-a-Chip e SMF respectivamente, ilustrando o impacto
dessa tecnologia atualmente. Conclusões: Essa tecnologia relativamente recente tem
alto potencial para superar as limitações dos modelos experimentais in vitro atuais.
PALAVRAS-CHAVE: Human-On-a-Chip; Organoides; Disease-on-a-Chip; iPSC; Sistemas
Microsiológicos
ABSTRACT
Introduction: Models with higher predictive capacity and able to produce results at lower
costs and in shorter times are needed for drug development. The microphysiological systems
(MPS) that cultivate human tissues in three-dimensional histoarchitecture (3D) are promising
alternatives for these objectives. Objective: This review work aims to address the state of
the art of SMF development and illustrate the initial Brazilian experience with this technology.
Method: The research and data collection covering the theme “Microphysiological Systems”,
and the subtopics “Microuidic Devices” and “3D Culture of Human Cells”, was based on
electronic search in Capes Journals Portal, scientic databases Scopus, PubMed and Science
Direct and with the Google Scholar search tool. Results: Among the existing microphysiological
systems, those that are characterized by the culture of human tissues organized in three -
dimensional histoarchitecture in microuidic devices were recently introduced, as being the
most promising ones. In addition, between the years 2000-2017, we recorded approximately
increases of 12, 985 and 380 times in the number of academic publications related to the
areas of Microuidics, Organ-on-a-Chip and MPS respectively, illustrating the impact of
this technology today. Conclusions: This relatively recent technology has high potential to
overcome the limitations of current in vitro experimental models
KEYWORDS: Human-on-a-Chip; Organoids; Disease-on-a-chip; iPSC; Microphysiological Systems
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INTRODUÇÃO
Os testes pré-clínicos na pesquisa médica/biológica e no desenvol-
vimento de fármacos frequentemente não predizem com acurácia
as respostas observadas em seres humanos, levando a altas taxas
de atrito1. A agência federal americana Food and Drug Adminis-
tration (FDA) estima que 92% dos medicamentos aprovados em
testes com animais falham em seres humanos. Os modelos animais
garantem acesso à siologia sistêmica incluindo a distribuição e
metabolização em vários tecidos, à resposta do sistema imune, à
inuência dos microambientes e das barreiras e interações órgão-
-órgão, bem como às respostas comportamentais. No entanto,
foi demonstrado que a distância logenética entre humanos
e animais (por exemplo: ilustrada por alterações ou diferenças
proteômicas) diminuem seu poder preditivo2,3,4,5,6. Portanto, é
clara a necessidade de modelos com maior capacidade preditiva
e que também reduzam o tempo e os custos do desenvolvimento
de substâncias ou produtos pertencentes a diversos setores indus-
triais tais como fármacos, produtos alimentícios, cosméticos,
sanitizantes e produtos agropecuários para citar alguns exemplos.
Atualmente, a quase totalidade dos testes de segurança exigidos
pelas autoridades regulatórias para fármacos é realizada em ani-
mais. As poucas exceções não são sucientes ao cumprimento da
regulamentação exigida7,8. Os métodos in silico (simulações compu-
tacionais) já estão disponíveis no Brasil com o apoio da Rede Nacio-
nal de Métodos Alternativos9 (RENAMA). Esses métodos são úteis
para a avaliação de viabilidade, mas insucientes para o desenvol-
vimento e registro de produtos inovadores, exigindo métodos expe-
rimentais in vivo ou o desenvolvimento de alternativas in vitro. Os
dispositivos microuídicos ou chips, que combinam tecidos huma-
nos em um arranjo tridimensional e condições estáveis de homeos-
tase, podem se tornar a solução para esse problema10. Na maioria
das vezes, células humanas cultivadas em duas dimensões não con-
seguem recapitular de forma adequada e nem abranger todos os
aspectos funcionais dos tecidos, bem como das interfaces tecido-
-tecido e da dinâmica dos órgãos do corpo humano11,12,13,14,15. Tecidos
modelados a partir de células humanas em microdispositivos podem
melhorar a acurácia preditiva de estudos pré-clínicos de ecácia e
segurança de medicamentos, cosméticos e outras substâncias ou
produtos relacionados ao uso em humanos11,12,15,16.
O princípio dos 3Rs (Replacement, Reduction and Renement)
foi desenvolvido em 1959 por Russell e Burch17, propiciando
a consolidação dos métodos alternativos. O termo “métodos
alternativos” pode ser denido como abordagens que tenham
um ou mais dos seguintes desfechos: 1) métodos que induzam a
redução do número de animais experimentais usados em deter-
minado procedimento ou redução para o mínimo necessário. 2)
renamento da metodologia que culmine com a redução signi-
cativa da dor ou desconforto sofrido pelos animais. 3) métodos
que não utilizem animais – substituição completa de animais em
determinado procedimento ou avaliação18.
A crescente pressão ética e política sobre a implementação de
ações que objetivassem a substituição do uso de animais de
experimentação deu origem à adoção, em 2009, pela União
Europeia, do requisito regulamentar que prevê a avaliação de
segurança de ingredientes cosméticos através de testes que não
usem animais19. Em 2013, a União Europeia baniu ocialmente o
uso de animais para pesquisas de desenvolvimento de cosméticos
– ingredientes e produtos acabados – comercializados no bloco20.
Essas ações representaram um grande incentivo ao desenvolvi-
mento e à adoção de métodos alternativos no mundo e no Bra-
sil. O empenho e compromisso brasileiros com a promoção, a
implementação, o desenvolvimento e a validação de métodos
alternativos ao uso de animais propiciou a criação da RENAMA, em
julho de 2012 pelo Ministério da Ciência, Tecnologia e Inovação
(MCTI) e em setembro de 2012, do Centro Brasileiro de Validação
de Métodos Alternativos (BraCVAM), uma parceria entre a Agên-
cia Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) e o Instituto Nacional
de Controle de Qualidade em Saúde da Fundação Oswaldo Cruz
(INCQS/Fiocruz). Estas foram as primeiras parcerias na América
Latina com o intuito de coordenar ações que pudessem propiciar a
redução, renamento ou substituição do uso de animais de expe-
rimentação no Brasil21. Neste sentido, o Laboratório Nacional de
Biociências (LNBio), um dos três Laboratórios Centrais da RENAMA
(LNBio, Instituto Nacional de Metrologia Qualidade e Tecnologia
[Inmetro] e INCQs) iniciou em 2015 o projeto Human-on-a-Chip
visando a implementação e nacionalização da tecnologia baseada
em sistemas microsiológicos (SMF), com perspectivas de futuros
desdobramentos que possam vir ao encontro do princípio dos 3Rs.
Este trabalho de revisão aborda o estado da arte mundial do
desenvolvimento dos SMF, com ênfase nos que cultivem organoi-
des humanos sob microuídica, e ilustra a experiência brasileira
inicial com essa tecnologia.
MÉTODO
A pesquisa e coleta de dados que abrangeu o tema “Sistemas Micro-
siológicos”, bem como os subtemas “Dispositivos Microuídicos” e
“Cultura 3D de Células Humanas” (3D = tridimensionais), foi rea-
lizada eletronicamente no Portal de Periódicos Capes, nas bases
de dados cientícas Scopus, PubMed e Science Direct e de forma
auxiliar com a ferramenta de busca Google Scholar. Este artigo
objetivou revisar e reunir de forma crítica as principais informa-
ções e atualizações sobre os tópicos previamente citados. A busca
e a coleta abrangeram publicações realizadas a partir de 2003,
ano em que o desenvolvimento e os estudos na área de engenharia
tecidual e microuídica tornaram-se mais robustos, até os princi-
pais trabalhos publicados recentemente na área de SMF. As buscas
também compreenderam o uso de palavras-chave ou termos, tais
quais: “métodos alternativos ao uso de animais em laboratório”,
“poder preditivo de métodos in vitro para testes de substâncias”,
Human-on-a-Chip, Body-on-a-Chip, Organ-on-a Chip, iPSC (induced
Pluripotent Stem Cells), organoides humanos, Disease-on-a-Chip,
sistemas microsiológicos e microuídica. Adicionalmente, essa
revisão foi complementada com um breve relato, que visa ilustrar
a experiência do LNBio até o momento, no desenvolvimento, pro-
ciência e implementação da tecnologia de SMF no Brasil em parce-
ria com a empresa alemã TissUse. A plataforma é operada por uma
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unidade controladora acoplada a uma bomba de vácuo, e combina
um sistema de canais de microuídica, com dois compartimentos
de cultura de tecidos, cada um do tamanho do poço das placas de
96 poços (fígado) ou de 24 poços (intestino), como demonstrado na
Figura 1. O modelo construtivo do dispositivo microuídico do 2-OC
(Two-Organ-Chip) da TissUse possui dois compartimentos distintos
por circuito de cocultivo celular (Figura 1). Os 2-OC foram fabrica-
dos aplicando litograa suave padrão e moldagem de réplicas de
polidimetilsiloxano (PDMS) (Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI,
USA). Esse dispositivo consiste de uma lâmina de PDMS, contendo
as disposições dos canais, das microbombas e as aberturas para os
compartimentos de cultivo celulares, permanentemente ligada a
uma lâmina de vidro (75 x 25 mm) para microscopia, por oxidação
de plasma de baixa pressão (Femto – Diener eletronic, Ebhausen,
Germany). Essa ligação permanente dá origem a uma única peça
que possui microcanais com altura de 100 mm. As três bombas
peristálticas on-a-chip (construídas na lâmina de PDMS) têm a espes-
sura de 500 mm. Esse microdispositivo para dois organoides (2-OC)
proporciona duas características que melhoram sua funcionalidade:
acoplamento mecânico e comunicação “humoral” entre os tecidos22.
O volume para cultivar dois tecidos (fígado e intestino por exemplo)
é de 900 µl por circuito. O volume extracelular total é de cerca de
1000 µl por circuito. A microbomba propicia um uxo pulsátil estável
do uído ou meio de cultura. As superfícies superior e inferior das
placas são transparentes e permitem a visualização e a caracteriza-
ção morfológica dos organoides em tempo real. O sentido do uxo
perfusor dentro dos compartimentos do chip, bem como a frequên-
cia do uxo, são determinados de acordo com os tipos de tecidos e
experimentos. No caso do 2-OC Intestino + Fígado, o sentido do uxo
foi do intestino para o fígado (emulando a absorção intestinal e o
direcionamento do que foi absorvido ao fígado pelo sistema porta) e
a frequência estabelecida foi a de 0,8 Hz22.
A) Desenho esquemático do modelo construtivo do dispositivo microuídico TissUse. B) Vista de um corte longitudinal do 2-OC mostrando os
compartimentos de cultivo de equivalentes de intestino e fígado. C) Vista inferior do 2-OC com destaque para os canais microuídicos que
interconectam os compartimentos de cultivo tecidual. D) Plataforma 2-OC instalada e em operação no LNBio – Unidade controladora (bomba
peristáltica) conectada ao 2-OC.
Fonte: Adaptado de https://www.tissuse.com/en/products/2-organ-chip/ e de Maschmeyer et al. (2015).
Figura 1. Plataforma Two-Organ-Chip da empresa TissUse.
Canais microfluídicos
On-chip microbomba
Suporte externo para
controle de temperatura
Lâmina de vidro
Camada de PDMS
(formato de uma lâmina
para microscopia)
Placa adaptadora
Compartimento de
cultivo tecidual
Tampas
Conectores da
bomba peristáltica
Equivalente de fígadoEquivalente de intestino
Compartimento tecidual
A B
C
D
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RESULTADOS E DISCUSSÃO
Organoides humanos
A emulação da histoarquitetura existente in vivo é essencial para
a obtenção de respostas de relevância siológica dos modelos
de órgãos humanos in vitro. A tridimensionalidade e a comu-
nicação intercelular são características fundamentais à plena
expressão fenotípica e funcional da maioria dos tecidos23. Não
menos importante é o contato entre diferentes tipos celulares.
O microambiente complexo tridimensional no qual as células se
organizam in vivo possibilita a interação entre diferentes tipos
celulares e entre as células e a matriz extracelular (MEC)24,25,26.
Organoides são estruturas articiais, que representam fragmen-
tos funcionais de órgãos, criadas para estudos in vitro capazes de
exercer as funções primordiais in vivo do órgão correspondente27.
Sua concepção conceitual parte das unidades morfofuncionais dos
respectivos órgãos. Por exemplo, os lóbulos hepáticos represen-
tam as unidades morfofuncionais do fígado, que possui cerca de 1
milhão de lóbulos. Cada lóbulo contém cerca de 1 milhão de célu-
las de 20 diferentes tipos, principalmente hepatócitos. O formato
do lóbulo é aproximadamente hexagonal com a veia hepática no
centro e as tríades hepáticas (veia porta, artéria hepática e duto
biliar) nos vértices. Uma rede complexa de vasos sanguíneos (sinu-
soide) as irriga28. Unidades morfofuncionais similares podem ser
identicadas em cada órgão do corpo humano29.
Normalmente, os organoides são estruturas tridimensionais constituí-
dos por diferentes tipos celulares organizados em um arranjo deter-
minado (microestrutura). Um tipo de microestrutura muito popular
é o esferoide. A confecção de organoides esferoidais possui vários
aspectos benécos que os tornam um modelo atrativo: são fáceis de
produzir e manusear, seu tamanho e composição podem ser contro-
lados de forma relativa (pois as células continuam a proliferar após a
formação da esfera) e não necessitam de molde para a sua formação.
Esta última característica permite que as células se arranjem de forma
espontânea durante o processo de agregação, aumentando as chances
de apresentarem um fenótipo organotípico30,31, além do fato de esta-
rem livres da necessidade de aderência a qualquer tipo de superfície
não siológica. Ainda, a possibilidade da utilização de diferentes tipos
celulares no mesmo organoide esferoidal permite o surgimento de
contatos intercelulares heterotípicos, conferindo avanço adicional nos
aspectos de funcionalidade e diferenciação teciduais23,27.
Outros modelos teciduais tridimensionais confeccionados in vitro,
também muito convenientes e utilizados, são os organoides de
barreira, dos quais pode-se citar a barreira intestinal, barreira
renal constituída de células epiteliais do túbulo proximal ou por
podócitos glomerulares, córnea, pele, barreira hematoencefálica.
Dispositivos microuídicos
Apesar de haver uma grande diversidade de SMF, a maioria deles
é baseada em dispositivos microuídicos que buscam mimetizar o
ambiente celular de um ou mais órgãos humanos32. O termo micro-
uídica diz respeito ao uxo de líquidos em canais de dimensões
micrométricas, ou seja, menores do que 1 mm em pelo menos
uma dimensão33. Dispositivos microuídicos são formados por con-
juntos de microcanais interconectados que podem ser divididos
em duas categorias: 1) sistema microuídico passivo com uxo
determinado pela força da gravidade e 2) sistema microuídico
ativo com uxo determinado pela ação de uma bomba que pode
ou não ser parte de uma unidade controladora. A rede de micro-
canais entalhados no chip pode ser acessada através de aberturas
(entradas e saídas) que conectam o interior ao exterior. É através
desses orifícios que os tecidos humanos, substâncias e meio de
cultura são integrados ou retirados do dispositivo microuídico,
com o uso de tubos, adaptadores de seringas, pipeta etc. Também
por essas aberturas os chips são conectados aos sistemas ativos
externos (controle de pressão, seringa ou bomba peristáltica) ou
formas passivas (por exemplo, pressão hidrostática).
Ao se projetar um SMF é essencial estabelecer o regime de uxo
a ser adotado no dispositivo microuídico.
A escolha dos materiais para a construção dos dispositivos micro-
uídicos deve levar em conta seus possíveis impactos no cultivo
celular e também as propriedades das substâncias a serem testa-
das. Diversos materiais são atualmente usados, tais como: polí-
mero (PDMS), silicone, cerâmica, vidro e metais. A construção
de cada um envolve processos especícos: deposição eletrônica,
corrosão, moldagem por injeção, gravação em relevo e litogra-
a suave em PDMS. Os sistemas mais complexos são geralmente
confeccionados com mais de um tipo de material.
O polímero PDMS é provavelmente o material mais utilizado para
a confecção dos dispositivos, pois é muito conveniente para o
cultivo celular. Trata-se de um elastômero transparente, perme-
ável a gases, biocompatível, de baixo custo e fácil manipulação.
Porém, o PDMS tem a desvantagem de poder adsorver e absorver
pequenas moléculas com propriedades hidrofóbicas34,35,36, fato
que impacta de forma signicativa na acurácia de predições
envolvendo o uso de tais substâncias. Como alternativa pode-
-se fazer uso de polímeros termoplásticos como o policarbonato
(PC), polimetilmetacrilato (PMMA) e copolímero oleno cíclico
(COC) que não adsorvem pequenas moléculas23.
Sistemas Microsiológicos: Organ-on-a-Chip e Human-on-a-
Chip (Body-on-a-Chip)
Diferentes, as Plataformas Microuídicas de Cultivo Celular ou
SMF são atualmente uma tecnologia que se encontra em fase de
desenvolvimento, demandando ainda considerável avanço em bio-
engenharia. Os avanços realizados na última década na criação de
modelos in vitro de culturas biomiméticas, baseadas em microtec-
nologia, fomentaram um interesse mundial crescente no desen-
volvimento de plataformas que combinem tecidos humanos com
microuídica, dando origem ao termo Organ-on-a-Chip. Neste
caso, a palavra chip deriva do inglês e refere-se a um dispositivo
no e de pequenas dimensões (podendo ou não conter elementos
eletrônicos). Dependendo do número de órgãos e do desenvol-
vimento de diferentes microambientes celulares, pode-se ainda
utilizar os termos Human-on-a-Chip ou Body-on-a-Chip. Com essa
tecnologia, espera-se mimetizar in vitro a funcionalidade de
órgãos humanos in vivo, com intuito de prever melhor os efeitos
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de substâncias no corpo humano. O estímulo de cisalhamento con-
ferido pelo uxo é importante para diversos aspectos funcionais
dos tecidos cultivados. Por isso, garantir o uxo siológico e ade-
quado a cada caso é crítico para o estabelecimento dos SMF.
Os projetos de SMF devem ser balizados na otimização dos pro-
cessos de confecção e cultivo dos tecidos humanos, de maneira
que a ação do sistema microuídico ou do sistema de perfusão
propicie estímulo mecânico de cisalhamento em níveis capilar e
intersticial dentro de parâmetros siológicos. Além de permitir a
remoção de substâncias secretadas ou metabólitos e possibilitar
a interação de células localizadas em compartimentos ou tecidos
diferentes, promove a criação de microambientes com gradien-
tes biomoleculares e presença de shear stress controlado23.
Tendo em vista que há uma grande diversidade de tipos de SMF
(baseados em cultura 2D ou 3D, em organoides parenquimatosos ou
de barreira, em uxo passivo ou ativo, contendo ou não elemen-
tos eletrônicos, tais quais sensores, eletrodos etc.) e que, como
já mencionado, o microambiente tridimensional in vivo no qual
as células apresentam relações entre si, com diferentes tecidos e
com a MEC, impactam diretamente na diferenciação e função de
cada órgão, consideramos que os SMF constituídos de dispositivos
microuídicos para cultivo de tecidos humanos 3D in vitro em um
ambiente controlado de estímulos mecânicos e eletrosiológicos
proporcionam as melhores condições possíveis de emulação23.
Organ-on-a-Chip
O termo Organs-on-Chips são sistemas microengenheirados biomimé-
ticos que contêm canais microuídicos que veiculam meio de cultura
com nutrientes e extraem catabólitos dos tecidos em cultivo. Podem
ser denidos alternativamente como modelos de órgãos humanos em
microescala (de 10−6 até 10−4 em relação ao tamanho original)37,38.
Os sistemas Organ-on-a-Chip buscam produzir níveis de funcio-
nalidade de tecidos e/ou organoides não alcançados pelo cul-
tivo celular estático, além de também possibilitar a análise em
tempo real de parâmetros bioquímicos e metabólicos15,29, tais
como albumina, lactato desidrogenase (LDH), glicose, O2, con-
centração de Glutationa (GSH), estado funcional de mitocôn-
drias, estrutura e morfologia do núcleo celular, estado redox,
concentração de ATP etc. Esses parâmetros são monitorados por
meio de biossensores internos ou externos, através de imagens
microscópicas e análises do uído coletado do sistema39,40,41.
Os modelos Organ-on-a-Chip equipados com acessórios de moni-
toramento e de detecção (biosensores) podem conferir vantagens
importantes relacionadas à economia de tempo e melhora da
reprodutibilidade dos dados produzidos. Além do mais, a possibi-
lidade de monitoramento contínuo in situ de respostas biológicas
induzidas por fármacos durante um longo intervalo de tempo é
crucial para adequada investigação dos parâmetros farmacoló-
gicos e, por consequência, para o aumento do poder preditivo
dos SMF. A empresa Emulate, Inc., do Wyss Institute, alocado na
Universidade de Harvard, desenvolveu microdispositivos que pos-
suem eletrodos embutidos para mensuração de Resistência Elé-
trica Transepitelial (TEER), com intuito de monitorar de forma não
invasiva a formação e a integridade de diferentes modelos in vitro
de órgãos de barreira, tais como o pulmão ou intestino42.
Outro exemplo vem do Centro de Pesquisa e Inovação em Biomate-
riais da Escola de Medicina da Universidade de Harvard, que desen-
volveu todo um sistema de monitoramento contínuo e automatizado,
em uma plataforma modular, integrada e equipada com multi-bios-
sensores com capacidade de detecção biofísica e bioquímica, inte-
grados a módulos de Organ-on-a-Chip. O sistema conta com uma
bomba peristáltica, um módulo de controle do uxo microuídico,
módulos contendo sensores biofísicos para O2, pH, temperatura e
contração de células cardíacas, módulo contendo sensores bioquími-
cos para proteínas hepáticas (por exemplo: Glutationa S-Transferase
alfa, albumina), proteínas cardíaca (Creatina quinase), um mini-mi-
croscópio para monitoramento da morfologia dos organoides, além
de um módulo de captura para bolhas do sistema43.
Assim esses SMF permitem emular de forma mais acurada as con-
dições do meio interno incluindo as condições de pressão e tem-
peratura, difusão de nutrientes (glicose, aminoácidos e lipídeos),
além de fatores humorais trócos e de crescimento10, bem como a
remoção mais ecaz de catabólitos. Os SMF possuem vias de difusão
microuídicas que permeiam os tecidos à semelhança dos capila-
res sanguíneos e permitem o cultivo tridimensional com contato
intercelular e tração mecânica ou shear stress, responsáveis em
parte pela morfologia tissular. Essas características proporcionam a
emulação das condições in vivo e supostamente levam a um padrão
de resposta da preparação mais semelhante ao de um organismo
vivo15,44,45,46 como já discutido anteriormente. Dessa maneira con-
clui-se que o advento da tecnologia Organ-on-a-Chip vem ao encon-
tro do reconhecimento de que a morfogênese celular, as interações
célula-célula, o ambiente biomecânico são tão importantes quanto
são as células em si47,48,49,50,51,52. Como exemplos podemos citar a
orientação topográca53, denição espacial da cultura44,54,55,56, o
estímulo de cisalhamento e outros tipos de estímulo mecânico (esti-
ramento, compressão etc.)57,58,59, e gradiente bioquímico60,61.
Essa tecnologia representa uma alternativa ao uso de animais em
aplicações farmacêuticas, químicas e ambientais15.
Outros importantes exemplos de Organ-on-Chip vem mais uma vez da
empresa Emulate. Os organoides humanos cultivados isoladamente
até o momento incluem: pulmão (células endoteliais microvasculares
pulmonares com interface com células epiteliais alveolares)62, vias
áreas inferiores (células humanas primárias diferenciadas em epité-
lio mucociliar)44,63, intestino (linhagem celular humana CaCo2)64, rim
(células epiteliais do túbulo proximal humanas)65, e medula óssea
(células de rato)66. A Figura 2 ilustra o modelo de Chip da Emulate.
Nessa tecnologia, cada organoides mimetiza as interfaces celulares
de seu respectivo órgão, assim como algumas de suas características
fundamentais, por exemplo o movimento peristáltico do intestino.
Em 2016 o Fórum Econômico Mundial selecionou especicamente
a tecnologia Organ-on-a-Chip como uma entre as dez mais emer-
gentes do mundo67. Neste sentido, o campo de estudos relacio-
nado a sistemas microuídicos, Organ-on-a-Chip e SMF experien-
ciou um grande salto no concernente ao número de publicações
acadêmicas relacionadas ao longo das últimas duas décadas. Entre
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Marin TM & Pagani E Sistemas microológicos humanos
os anos 2000–2014 houve um aumento de aproximadamente 12
vezes, 985 vezes e 380 vezes do número de publicações acadêmi-
cas relacionadas às áreas de microuídica, Organ-on-a-Chip e SMF
respectivamente (Gráco). O aumento das publicações exempli-
ca a atividade e o interesse crescentes nessa tecnologia.
As palavras-chave “microuídica” (microuidics em Inglês),
Organ-on-a-Chip” e sistemas microsiológicos (Microphysiological
systems em inglês) foram buscadas pelo Google Scholar. Os núme-
ros de publicações encontradas por essa busca para cada um dos
oito intervalos de dois anos e para o intervalo de três anos estão
representados no Gráco a partir do ano de 1998 até o ano de 2017.
Human-on-a-Chip
Os SMF baseados em cocultivo de dois ou mais órgãos interco-
nectados em um dispositivo de microuídico são comumente
chamados de Multi-Organ-Chips. Atualmente são as plataformas
precursoras das futuras Human-on-a-Chip ou Body-on-a-Chip
que estão em fase de desenvolvimento e projetam acima de dez
órgãos interconectados68 já para o ano de 2018.
Um bom exemplo ilustrativo desses tipos de SMF vem da empresa
alemã TissUse GmbH, uma empresa derivada do Instituto de Bio-
tecnologia da Universidade Technische de Berlim, na Alemanha.
Os primeiros protótipos consistiram de dispositivos para dois órgãos
interconectados sob um uxo regulável gerado por uma bomba
externa alojada dentro de uma unidade controladora computado-
rizada (Figura 1). Nestes dispositivos, chamados de 2-Organ-Chip
ou 2-OC, foram feitos estudos com duplas de organoides, tais quais
biópsia de pele humana e esferoides hepáticos22,69, pele humana e
folículo capilar70, barreira intestinal reconstruída in vitro e esfe-
roides hepáticos22, neuroesferas e esferoides hepáticos71.
Mais recentemente, foi incorporado o cultivo de células endo-
teliais que recobrem a área luminal dos canais microuídicos e
a área dos poços de cultivo tecidual, mimetizando a interface
vascular entre os tecidos e o uxo (circulação) dentro do dispo-
sitivo72. Também foi desenvolvido um modelo de medula óssea
construído sobre molde cerâmico de óxido de zircônio revestido
com hidroxiapatita Sponceram® 3D (Zellwerk GmbH, Alemanha),
que hospedou a cocultura de células mesenquimais estromais
(MSC) e células-tronco hematopoiéticas derivadas do sangue do
cordão umbilical (HSPC) viáveis por até 28 dias no 2-OC73.
Posteriormente, a TissUse também desenvolveu dispositivos para
quatro órgãos (4-Organ-Chip ou 4-OC) que deu origem à publi-
cação que mostra o cultivo e manutenção de equivalentes de
fígado, intestino, pele e rim interconectados neste dispositivo74.
Este novo dispositivo 4-OC possui dois compartimentos de micro-
uídica separados: um simula a circulação sanguínea e outro que
emula o circuito excretor, para a drenagem do uído (análogo à
urina) secretado pelo equivalente de rim.
Os SMF que contemplam dois ou mais órgãos têm grande poten-
cial de aplicação em estudos de farmacocinética os quais envol-
vem análises dos pers de absorção, distribuição, metaboliza-
ção, excreção e toxicidade (ADMETox) de uma substância ou de
fármaco, além de também poder simular doenças humanas in
vitro. O estudo das propriedades farmacocinéticas de uma subs-
tância ou candidato a fármaco é uma das aplicações possíveis
e promissoras dos SMF, sendo uma etapa crítica no processo de
descoberta e desenvolvimento de fármacos. Os modelos tradi-
cionais de células humanas reproduzem de maneira não satisfa-
tória as propriedades ADMETox observadas in vivo, apresentando
uma modicação do nível de exposição (quando comparado ao
vericado em humanos) e prejudicando, portanto, a avaliação
toxicológica pela razão da maioria das respostas celulares ava-
liadas dependerem justamente e diretamente do nível de expo-
sição do tecido à droga testada74,75,74,76,77,78,79,80,81.
Dessa maneira, um SMF que contemple a integração de mode-
los de intestino e fígado humanos in vitro, os dois órgãos críti-
cos para respostas de biodisponibilidade e exposição sistêmica,
Fonte: Adaptado de Emulate (https://emulatebio.com/).
Figura 2. Exemplo de sistema Organ-on-a-Chip da empresa Emulate.
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Marin TM & Pagani E Sistemas microológicos humanos
tem signicativa relevância82, e pode representar uma evolução
no concernente ao poder preditivo, em relação aos modelos de
cultura de células humanas estáticos e não integrados. Um exem-
plo de SMF para estudos farmacocinéticos foi o desenvolvido pelo
grupo de Murat Cirit do Departamento de Engenharia Biológica do
Instituto de Tecnologia de Massachusetts (MIT)82. O SMF consistiu
de uma plataforma microuídica (microdispositivo + bomba de
perfusão) na qual foram integrados modelos de intestino e fígado
humanos desenvolvidos in vitro, os quais foram mantidos sob
comunicação contínua para a investigação simultânea dos valores
de parâmetros farmacocinéticos tais como absorção e metaboliza-
ção, após a administração oral de um dado composto (no caso dos
SMF que contenham intestino e fígado, a emulação da administra-
ção oral é feita pela aplicação da substância teste no comparti-
mento intestinal, ao passo que a mimetização da administração
intravenosa é feita através da aplicação diretamente no compar-
timento hepático). Os autores demonstraram a possiblidade de
obtenção de parâmetros intrínsecos como permeabilidade e cle-
arance hepática, através da derivação dos dados obtidos no SMF
por modelagem mecanística. Também sugeriram neste estudo que
a comunicação entre os órgãos propiciada pelo SMF impactou posi-
tivamente na capacidade metabólica do modelo de fígado.
Outro exemplo de modelo de SMF otimizado para investigações far-
macocinéticas vem do Laboratório de Biomecânica e Bioengenha-
ria da Universidade de Tecnologia de Compiègne , em Picardia, na
França. O grupo desenvolveu um SMF contendo os modelos de intes-
tino e fígado humanos confeccionados in vitro e mantidos acoplados
sob uxo para a investigação do metabolismo intestinal e hepático
de primeira passagem do fármaco paracetamol83. Esta abordagem
foi também combinada a um modelo matemático visando estimar
parâmetros intrínsecos in vitro e possibilitar a extrapolação para
os processos in vivo. O trabalho também mostrou a identicação
de metabólitos como o sulfato de paracetamol que foi identicado
através da atividade sinérgica entre os modelos de intestino e fígado
ocorrida no SMF. Ambos os grupos armam nos estudos supracitados,
a importância e a grande potencialidade que pode ter a aplicação de
SMF em investigações farmacocinéticas, bem como a integração das
abordagens in silico e in vitro baseada em SMF.
Disease-on-a-Chip
Os modelos in vitro Disease-on-a-Chip são uma variação ou adap-
tação dos Multi-Organ-Chips destinados à emulação de condições
patológicas. Um dos exemplos ilustrativos é o modelo desenvolvido
Gráco. Evolução numérica do número de publicações.
1998-2000
28000 2000-2002 2002-2004
2004-2006 2006-2008 2008-2010
2010-2012 2012-2014 2014-2017
28000
27700
23900
19700
14700
9210
4890
2380
1970
444
138
35
21
19
13
5
2
Microfluídica Organ-on-a-Chip
383
60
10
7
6
5
4
3
1
SMF
2014-2017
2012-2014
2010-2012
2004-2006
2006-2008
2008-2010
1998-2000
2000-2002
2002-2004
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Marin TM & Pagani E Sistemas microológicos humanos
pelo grupo do Instituto Federal de Tecnologia de Zurique (ETH). O
modelo em questão utilizou o cultivo de tecido tumoral colorretal e
tecido hepático murino e permitiu avaliar a ecácia do tratamento
com ciclofosfamida com prévia bioativação em tecido hepático
murino, no tratamento do tumor colorretal in vitro84. Além de apre-
sentar um modelo bem-sucedido de Disease-on-a-Chip, este grupo
demonstrou a importância do cultivo simultâneo e integrado de
mais de um tecido propiciado pelo SMF. Foi observada inibição do
crescimento tumoral somente nos experimentos realizados em dis-
positivos microuídicos, ou seja, em presença de uxo. Não houve
efeito antitumoral com a ciclofosfamida em ensaios sem uxo, como
a transferência descontínua via pipetagem, de sobrenadante das
culturas estáticas de tecidos de fígado tratados com ciclofosfamida
para as culturas também estáticas de tecido tumoral colorretal84.
Neste trabalho ca explícito o impacto positivo da utilização de SMF
sobre a resposta obtida no teste, que foi completamente distinta da
resposta obtida na situação de ensaio realizada fora do SMF.
Outro grupo cultivou células de adenocarcinoma ductal pancreá-
tico em 3D sob uxo e mostrou resposta à cisplatina mais siológica
quando comparada aos modelos in vitro de cultivo tradicionais85. As
células tumorais, em geral, comportam-se diferentemente e apresen-
tam fenótipo distinto quando cultivadas fora do corpo humano em
2D, ou mesmo quando cultivadas em 3D. Os sistemas in vitro de cul-
tura celular 2D tradicionais ou sob insertos tipo Transwell®, bem como
modelos de esferoides por exemplo, usados na tentativa de mimetizar
o microambiente tumoral (MT), têm mostrado limitado poder predi-
tivo de ecácia terapêutica de várias drogas candidatas a fármaco86.
O MT exerce grande inuência no comportamento celular, principal-
mente no concernente à sobrevivência, proliferação, invasividade
e sensibilidade ao tratamento com compostos87,88.Tipicamente, os
tumores são formados por células cancerígenas e estromais (bro-
blastos e células imunes) nutridas pela rede vascular. O entendi-
mento dessa intrincada inter-relação dos diferentes tipos celulares,
bem como da inter-relação das células com componentes da matriz
extracelular, é crítico para o avanço das estratégias de tratamento
do câncer89. Nos casos de modelos de tumores in vitro tradicionais
isto é, não baseados em SMF, o desao é maior devido à ausência
da interação entre as células tumorais e a matriz extracelular e
diferenças nas condições de gradiente de pH intratumoral, oxigena-
ção e nutrição encontradas in vivo. Neste sentido, a aplicação dos
modelos de SMF na investigação do comportamento e respostas de
células tumorais pode ser vantajoso, na medida em que, ao propi-
ciar condições mais aproximadas de MT encontradas no organismo
humano, os SMF podem induzir nas células tumorais um padrão
de comportamento mais próximo das condições in vivo. Através
do avanço de técnicas de microfabricação, atualmente é possível
desenvolver dispositivos microuídicos cuja organização espacial
por compartimentalização das células e controle sobre a difusão
de fatores solúveis críticos às homeostases do sistema viabilizem a
reconstrução de modelos complexos de cultura celular que contem-
plem a necessária integração entre os diferentes tipos celulares e
entre células e componentes do microambiente90.
O trabalho de Albanese et al.91, baseado em modelo de tumor-on-
-a-chip, demonstrou a reprodução bem-sucedida in vitro do efeito
de permeabilidade e retenção (EPR). Vários tumores sólidos pos-
suem características estruturais que incluem hipervascularização,
arquitetura vascular defeituosa, e drenagem linfática prejudicada,
caracterizando o conhecido efeito de EPR, descrito para moléculas
especícas92,tipicamente compostos macromoleculares, lipossomos
e nanopartículas, que tendem a acumular muito mais no tecido
tumoral do que no tecido normal93. Alabnese et al. mostraram que
a penetração e a acumulação de nanopartículas em esferoides de
células tumorais integrados ao dispositivo microuídico foram sig-
nicativamente inuenciadas pela presença de uxo e de MEC no
entorno. O estudo vericou a importância da região de interface for-
mada pela MEC, uído e superfície do tecido; essa região de inter-
face emulada no SMF mostrou-se necessária à reprodução in vitro
do efeito EPR, comportando-se como um reservatório de interface
uido-tecido, no qual as nanopartículas se acumulam e difundem-se
progressivamente para o tecido. Esse transporte passivo, a partir do
reservatório de interface, impacta diretamente o número de par-
tículas a serem difundidas para o tecido e parece poder predizer a
extensão da acumulação de nanopartículas dentro do tumor in vivo.
O trabalho evidenciou a importância da mimetização do MT e o
potencial uso do tumor-on-a-chip no desenvolvimento e padroniza-
ção de carreadores medicamentosos, incrementando a investiga-
ção dos mecanismos de transporte de nanopartículas através de um
tecido sob condições de uxo siológico e acoplamento com MEC.
ainda outros exemplos de doenças emuladas nos SMF. O
modelo desenvolvido baseado em microcanais revestidos por
células endoteliais mimetizando a camada íntima de vasos san-
guíneos, também se mostrou bem-sucedido em mimetizar as
condições patológicas in vitro94. Neste, observou-se expressão do
fator de von Willebrand em resposta à estenose dos microcanais
emulando o efeito da placa de ateroma (formação composta de
gordura, cálcio e células inamatórias, localizada na parede das
artérias). A aplicação de SMF na investigação de doenças tem se
mostrado promissora. Já existem desenvolvimentos de SMF para
doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson95,
para doenças infecciosas ou potencial de infecção de determi-
nado tecido96, doenças vasculares como a trombose63,97, doenças
de vias aéreas62,63, entre outras.
A experiência brasileira
No LNBio, um dos quatro laboratórios nacionais alocados no Cen-
tro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (CNPEM), está
sob desenvolvimento o projeto “Human-on-a-Chip”. A primeira
etapa do projeto foi baseada no desenvolvimento de modelos de
organoides humanos cultivados nos dispositivos de microuídica,
fabricados e vendidos pela empresa TissUse GmbH, dispositivo
esse denominado de Two-Organ-Chip ou 2-OC (Figura 2).
Os microdispositivos fabricados pela TissUse são compostos por
três tipos de materiais: policarbonato que compõe a placa adapta-
dora, PDMS no qual estão as válvulas e canais microuídicos e uma
lâmina de vidro que recobre o PDMS (Figura 1A). O modelo de SMF
proposto pela TissUse oferece acesso aos poços de cultivo celu-
lar, ao mesmo tempo que mantém os microcanais isolados e pro-
tegidos, possibilitando a confecção e maturação dos organoides
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Marin TM & Pagani E Sistemas microológicos humanos
externamente, sua colocação nos chips e sua posterior retirada
para histologia. Também permite o uso de maior variedade de
tecidos humanos, como materiais de biópsias por exemplo.
No LNBio já acontece a confecção e o cultivo no 2-OC bem-suce-
didos de organoides de fígado, coração e intestino, além do rim
que está em fase de desenvolvimento.
Células e tecidos
Embora células primárias, provenientes de doadores vivos ou cadáve-
res, apresentem melhor funcionalidade, são de obtenção complicada
e incerta, podendo produzir resultados inconsistentes devido ao fato
de serem originadas de doadores diferentes na maioria dos casos. A
depender da origem do tecido e do doador, não apresentam sobre-
vida necessária para realização de testes de duração mais longa.
Por isso, optamos por células de linhagens expansíveis e/ou célu-
las iPSC. A funcionalidade destas é geralmente menor, mas pode-
mos controlar parâmetros importantes de maneira mais efetiva.
Equivalente barreira intestinal humana
Para produzir organoides que emulam a barreira intestinal, utiliza-
mos células da linhagem CaCo2 (ATCC HTB-37) (Figura 3A) associa-
das à linhagem HT29-MTX (ATCC HTB-38) (Figura 3B). Ambas são
linhagens epiteliais de adenocarcinoma de colo retal que possuem
a maioria das características morfológicas e funcionais de célu-
las absortivas do intestino delgado, incluindo enzimas digestivas
e receptores. As células da linhagem HT29-MTX também possuem
a capacidade de secretar mucina e outros compostos que formam
o muco intestinal que auxilia a capacidade absortiva98,99,100. A bar-
reira foi construída durante 21 dias em inserto Transwell® cuja
membrana microporosa recebeu a semeadura da cocultura das
duas linhagens intestinais supracitadas (Figura 3C).
O inserto, além de fazer as vezes de suporte para o cultivo celu-
lar, ainda teve a função de separar o organoide em dois compar-
timentos ou lados sicamente distintos mimetizando as regiões
intestinais intraluminal (compartimento superior ou lado apical)
e intersticial/corrente sanguínea (compartimento inferior ou
lado basolateral) (Figura 3D).
Equivalente fígado humano
Para os esferoides de fígado, utilizamos a linhagem de células
HPR101 diferenciada em HepaRG®, associada à linhagem HHS-
teC (Human Hepatic Stellate Cells #5300, Sciencell) (Figura 4).
A primeira provém de um doador portador de carcinoma hepa-
tocelular com concomitante infecção pelo vírus da Hepatite C.
As HepaRG® são células hepáticas progenitoras capazes de dar
origem a hepatócitos e colangiócitos adultos completamente dife-
renciados. Possuem níveis signicativos de funcionalidade hepática
como a expressão estável de enzimas da família da CYP450 e de
enzimas que atuam na conjugação de fármacos (fase 2) e de supor-
tar o ciclo completo replicativo do vírus da hepatite B101. A segunda
produz células do tecido conectivo intralobular que apresentam
fenótipo semelhante aos miobroblastos ou lipócitos. Estas células
participam da homeostase da matriz extracelular e dos processos de
reparo, regeneração e brose do fígado. A proliferação e migração
destas células, juntamente com a expressão de quimiocinas, estão
envolvidas na patogênese da inamação hepática e na brogênese.
De maneira geral a cultura de hepatócitos como esferoides tem
demonstrado resultados positivos com respeito à função hepá-
tica, devido ao estabelecimento dos contatos homo e hetero-
típicos célula-célula e a presença de componentes chaves de
MEC dentro e nos arredores dos agregados69. A Figura 3 mostra as
células hepáticas sob cultivo 2D (Figura 3E e 3F), e a respectiva
cocultura na histoarquitetura esferoidal (Figura 3G e 3I) integra-
das no 2-OC (Figura 3H). Os equivalentes de intestino e fígado
foram mantidos sob cocultivo no 2-OC por 14 dias.
Os cardiomiócitos humanos usados para confecção da cardioesfera
foram gerados a partir da reprogramação de células sanguíneas (eri-
troblastos) obtidas de um indivíduo saudável de 38 anos de idade, do
sexo masculino. As iPSC foram diferenciadas em cardiomiócitos adul-
tos. A empresa brasileira PluriCell Biotech forneceu os cardiomiócitos
já diferenciados, usados para a confecção dos organoides no LNBio.
Após formadas, as esferas (Figura 4C) foram integradas à plataforma
2-OC e cultivadas para realização de experimentos pilotos. Análises
baseadas em microscopia eletrônica de transmissão de cortes de
cardioesferas permitiram identicar estruturas celulares compatíveis
com uma célula cardíaca sadia, tais quais unidades sarcoméricas, GAP
junctions, mitocôndrias íntegras, depósitos de glicogênico, membra-
nas e compartimentos membranosos intactos (Figura 4 A e B).
Interessantemente, o trabalho de Luni et al. mostrou que o processo
de reprogramação de células somáticas humanas em iPSC é tremen-
damente inuenciado pelo ambiente microuídico (uma melhoria
de 50 vezes em relação à reprogramação mais eciente relatada
usando células humanas sem modicações genéticas), sendo pos-
sível a diferenciação direta em hepatócitos e cardiomiócitos fun-
cionais na mesma plataforma sem passo de expansão adicional102.
Perspectivas futuras e desaos
Apesar dos grandes avanços já obtidos, a engenharia de tecidos
humanos em três dimensões (3D) para confecção de equivalentes
de órgãos (em diferentes escalas e com diversos objetivos), bem
como os dispositivos microuídicos, estão em fase de desenvol-
vimento. Os avanços no manejo das células-tronco embrionárias
e iPSC já contribuíram bastante e podem acelerar ainda mais o
progresso deste campo, ao fornecerem acesso a diversas linha-
gens celulares para confecção de organoides.
Vastas perspectivas se encontram também no campo da medi-
cina personalizada com a possibilidade de culturas celulares
“paciente-especíca”103,104. As iPSC são obtidas a partir de célu-
las primárias do corpo humano, tais como, células sanguíneas
(por exemplo: eritroblasto), broblastos (obtidos de pele), célu-
las epiteliais do trato urinário (obtidas da urina), que passam por
processo de desdiferenciação e em teoria podem ser rediferen-
ciadas articialmente em qualquer tipo celular105.
Células de origem primária, apesar de apresentarem a funciona-
lidade superior, são desvantajosas em aspectos de logística de
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obtenção complexa, variabilidade genética (que pode ser bené-
ca somente em algumas situações) e instabilidade fenotípica/
siológica in vitro. As células provenientes de linhagens imor-
talizadas têm a vantagem do acesso e manuseio simples, mas
sua funcionalidade neste momento é menor que a das células
primárias. Apesar do fato de ser a adoção de boas práticas de
laboratório o fator mais crítico para assegurar que o cultivo celu-
lar seja livre de contaminantes diversos, as células de linhagens
apresentam maior risco de contaminação por Mycoplasma106 e/ou
contaminações inter e intraespécie e instabilidade genética107,108.
Por isso, a disponibilidade de tipos celulares, capacidade de
adaptação e a escolha mais adequada da fonte celular para a
confecção de organoides cada vez mais realísticos e estáveis nos
SMF são desaos encontrados para o estabelecimento da tecno-
logia Human-on-a-Chip.
A) Imagem microscópica das células CaCo2, com ampliação de 10 x. B) Imagem microscópica das células HT29-MTX, com ampliação de 10 x. C)
Cocultura das células CaCo2 e HT29-MTX, com ampliação de 10x. D) Desenho esquemático do modelo equivalente de barreira intestinal feito no
LNBio. E) Imagem de microscopia de luz de células HepaRG em 2D diferenciadas, com ampliação de 10 x. F) Imagem de microscopia de luz de células
estreladas humanas em cultivo 2D, com ampliação de 10 x. G) Fotograa de esferoides hepáticos formados e coletados. H) Esferoides hepáticos
integrados ao dispositivo 2-OC – TissUse GmbH. I) Imagem de microscopia de luz de um esferoide hepático, com ampliação de 4 x.
Figura 3. Organoides de intestino e de fígado humanos – equivalente à barreira intestinal humana.
Substância teste
CaCo2
Inserto tipo
Transwell
Meio de
cultivo celular
Lado basolateral
Membrana microporosa
Lado apical
Compartimento do chip
HT29 Barreira intestinal in vitro HHSteC- Células primárias
estreladas humanas
Hepa RG diferenciadas em
hepatócitos e colangiócitos
ABCE F
D
H
I
G
Esferoides hepáticos
A-B) Imagens de microscopia eletrônica de cortes histológicos cardioesferas ou equivalentes de coração humano. A) Destaque para a sequência de
unidades sarcoméricas, mitocôndrias e depósitos de glicogênio no sarcoplasma. B) Destaque para as junções tipo GAP. C) Imagem de microscopia de luz
de uma cardioesfera, com ampliação de 4X.
Figura 4. Organoide humano de coração – equivalente ao coração.
A
BC
Unidades sarcoméricas Junções GAP
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Adicionalmente, é importante considerar a necessidade do
desenvolvimento de um meio de cultura cuja formulação/com-
posição seja otimizada para atender às necessidades dos dife-
rentes tipos celulares cocultivados em SMF multiorgãos. A esco-
lha do meio é feita em função de cada tipo celular, com intuito
de melhorar a aderência à matriz extracelular, viabilidade pós-
-descongelamento, crescimento, replicação. Situações onde um
tipo celular sobrevive e cresce perfeitamente em um meio no
qual outro tipo celular não vai bem são muito comuns.
Esses fatores tornam a formulação do meio de cultura ade-
quada a diferentes tecidos muito desaadora. Isto posto,
importante para todos os tipos de cultivo celular (incluindo as
2D, sem uxo, sem acoplamento tecidual etc.), e muitas vezes
limitante para o cultivo integrados de dois ou mais tecidos,
é o desenvolvimento de uma formulação do meio de cultivo
universal um dos gargalos para o avanço da tecnologia dos SMF.
Trabalho de Oleaga et al., publicado em 2016, abriu uma pers-
pectiva bastante animadora ao demonstrar em SMF o cultivo
simultâneo, bem-sucedido por 14 dias, de modelos de fígado,
coração, músculo esquelético e tecido neuronal em um meio de
cultura circulante e livre de SFB75.
A variação que ocorre entre lotes de soros animais, principal-
mente de soro fetal bovino (SFB) é crítica e pode interferir em
testes de desenvolvimento de fármacos, por exemplo23. Fatores
tais como o desconhecimento da composição exata do SFB, a
ocorrência de variabilidade sazonal e geográca lote-a-lote109 e
interação não intencional com substâncias de teste110,111 podem
levar a resultados inconsistentes, preocupações em relação à
segurança do pessoal de laboratório em termos de risco à saúde
por contato acidental com endotoxinas, micoplasma e conta-
minantes virais ou proteínas priônicas112,113,114; escassez inespe-
rada na disponibilidade global115,116, bem como preocupações
éticas sobre o sofrimento fetal117. Neste sentido, pesam em
favor da substituição ou abolição do uso de SFB, os aspectos de
segurança, cientíca e ética, em outras palavras, a busca pela
otimização dos sistemas de teste in vitro, bem como o com-
prometimento com os princípios dos 3Rs são incentivos para o
desenvolvimento e adoção de formulações de meio de cultura
livres de SFB sejam eles quimicamente denidos ou com adoção
de componentes substitutivos118. Recentemente, lisados de pla-
quetas humanas demonstraram ser uma alternativa promissora
ao SFB116,119, 120, 121,122.
Outro aspecto importante a ser considerado, é que o estudo do
perl farmacocinético deve preceder estudos toxicológicos e far-
macodinâmicos. Isso porque em todos os casos, deve-se relacio-
nar a exposição ao efeito e a exposição somente será conhecida
por meio de estudos farmacocinéticos. Para isso, é fundamental
conhecer a partição de drogas nos órgãos, distâncias de difu-
são, taxas metabólicas com intuito de emular a comunicação
in vivo entre os órgãos123. Isto posto, um fator primordial para
se obter sucesso é o escalonamento proporcional dos diferen-
tes organoides de maneira a reetir a relação que ocorre no
corpo humano. A escolha e aplicação de um método apropriado
de escalonamento garantirá que um fármaco atinja os órgãos
em concentrações semelhantes à que se espera nos pacientes.
Por isso, determinar os princípios e as regras para o dimensiona-
mento dos diferentes SMF é um dos passos mais críticos para o
desenvolvimento dos SMF com grande impacto no uso futuro em
estudos de desenvolvimento de fármacos123,124. O correto esca-
lonamento também garantirá que fatores parácrinos alcancem
outros órgãos em concentrações siológicas mantendo a correta
razão de acoplamento órgão-órgão nos SMF.
Existem diversos tipos de escalonamento com diferentes focos
ou métodos dos quais podemos citar: o escalonamento alomé-
trico (a escala entre o organoides e seus homólogos humanos
e cada um com o outro), mais comumente usados125,126, o esca-
lonamento funcional127 e multifuncional128 (considera parâme-
tros como a compartimentação dos organoides em circuitos
uídicos, o uxo, as vias de administração/excreção) e ainda
o escalonamento baseado no volume do órgão e no tempo de
residência do uxo sanguíneo129. O problema é que abordagens
mais usadas para o dimensionamento como a miniaturização
direta e escalonamento alométrico são baseadas em tamanho
físico apenas128. Para um estudo mais aprofundado, estão dis-
poníveis revisões sobre métodos de escalonamento no contexto
Human-on-a-chip14,123,130,131,132,133.
Para cumprir o desao de cocultivar de forma bem-sucedida, dife-
rentes equivalentes de órgãos humanos in vitro interconectados
em uma situação de homeostase autônoma, se faz necessário
ultrapassar outros obstáculos como a ausência de sistemas linfá-
tico, nervoso, imunológico e vascular integrados sinergicamente.
A vascularização é especialmente importante; normalmente a
densidade volumétrica celular dos organoides em 3D não corres-
ponde à encontrada no órgão in vivo, devido à pseudo-histoarqui-
tetura e às limitações de entrega de oxigênio e nutrientes
A integração de um revestimento endotelial ao SMF é uma
medida crítica na direção da melhora da performance sioló-
gica destes. A presença de uma rede de vasos que consiga pene-
trar e perfundir adequadamente um esferoide de 300 µM por
exemplo, irá melhorar o suprimento de nutrientes, de oxigênio
e auxiliar na remoção de metabólitos. Outros benefícios incluem
a modulação da difusão de moléculas hidrofílicas para o interior
do organoide e de tensões não siológicas que poderiam alcançar
mais facilmente as células23. Além disso, as células endoteliais
possuem a capacidade de estabelecer um nicho vascular e propi-
ciar organogênese in vivo e in vitro.
A combinação de emulação robusta com a possibilidade de
realizar análises e obter dados eletrosiológicos por meio de
microeletrodos integrados ao SMF também abre grandes pers-
pectivas. Os tecidos cardíaco, músculo-esquelético ou neuronal
podem ser estudados dessa forma135,136. A aferição da TEER em
vericação de integridade da barreira em modelos de equiva-
lentes de intestino137, pele ou córnea também pode representar
mais um benefício desta funcionalidade.
Adicionalmente, impressoras 3D podem ser de grande valia para
a resolução de limitações dos atuais SMF. Ao propiciarem deposi-
ção precisa, ordenada e reprodutível de tipos celulares e mate-
riais diversos, abrem a perspectiva de confecção de organoides
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com complexa histoarquitetura. No caso dos rins ou do baço,
a impressão de tecidos humanos em 3D é bastante conve-
niente, visto que não podem ser recriados de forma plena com
a utilização das técnicas disponíveis atualmente138. A empresa
“Organovo” tem se destacado na área de impressão de tecidos
humanos em 3D, oferecendo modelos de fígado (ExVive™ 3D
Bioprinted Human Liver Tissue Model) e rim (ExVive™ Human
Kidney Tissue) humanos139. Além disso, as impressoras 3D abrem
a perspectiva de otimização do processo de desenvolvimento e
fabricação dos dispositivos microuídicos, que normalmente é
laborioso e complexo, por necessitar de grandes investimentos e
cuidados (sala limpa por exemplo e recursos humanos altamente
especializados). A tecnologia de impressão 3D atual avançou a
um ponto que permite a produção relativamente barata e rápida
de sosticados microdispositivos, congurando uma alternativa
promissora aos protocolos atualmente empregados140.
O uxograma da Figura 5 ilustra uma proposta de abordagem
para o desenvolvimento de SMF em centros de pesquisa, baseada
MEC: matriz extracelular; PDMS: polidimetilsiloxano; LDH: lactato desidrogenase; TEER: Resistência Elétrica Transepitelial; iPSC: induced Pluripotent Stem Cells.
Figura 5. Abordagem para o desenvolvimento e impacto dos Sistemas Microsiológicos.
Dilema de Pesquisa Biológica
Cultura de Células
Humano mas não Sistêmico Limitado Poder
de Predição
Animais de Laboratório
Sistêmico mas não humano
2D monocamadas
3D suporte externo/embebido em MEC
3D sem suporte externo (scaffold free)
Alternativa Promissora
Filogeneticamente Distante
Aspectos Éticos
Sistemas
Microfisiológicos
(SMF)
Modelos Construtivos
Materiais: PDMS, Cerâmica, Vidro,
Metal, termoplástico
Método de desenho: eletrônico deposição,
corrosão, moldagem por injeção, gravação
em relevo, litografia suave, impressão 3D
Regime de fluxo:
Passivo: force of gravity
Active: external pump
Fluxo intermitente
Fluxo contínuo
Sistema:
Aberto ou Fechado
Acessórios
Sensores: glicose, LDH, albumina, O2,
CO2, pH, temperatura, TEER,
sinais eletrofisiológicos.
Aplicação de Estímulo Mecânico:
estiramento, compressão etc.
Organoides – Cultura de Células 3D
Histoarquitetura
Esferoides
Barreira
Baseada em Scaffold: materiais
artificiais ou naturais: (policarbonato,
alginato, matrizes, colágeno)
Livre de Scaffolf: arranjo celular
espontâneo.
Outras histoarquiteturas
parenquimatosas.
Tecidos ex-vivo.
Fonte Celular
Linhagens celulares imortalizadas
Células primárias
iPSC
Dispositivo
Microfluídicos
Equivalentes
de Órgãos
Humanos
Método de Escalonamento Apropriado Meio de Cultivo Celular Comum e Otimizado
Organ-on-a-ChipHuman-on-a-ChipMulti-Organ-Chip
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nos dados e informações aqui reunidos e interpretados. Contem-
pla as razões que justicam o investimento na implementação
dos SMF e os passos e aspectos críticos a serem considerados e
ponderados nesse processo.
CONCLUSÕES
Apesar de todos os esforços e progressos realizados na direção do
desenvolvimento de modelos experimentais que se aproximem
o máximo possível da condição siológica humana, não é esse o
fator mais crítico na relação SMF x corpo humano. Não obrigato-
riamente os resultados ou dados obtidos dessas plataformas ou
SMF devam ser realisticamente siológicos. O mais importante é
que sejam comparáveis, transponíveis para o ser humano. Neste
sentido, possuir e formalizar princípios de extrapolação que
permitam transpor de forma acurada os dados obtidos a partir
dessas plataformas é tanto ou mais crítico do que a busca inces-
sante pela emulação da siologia do organismo humano in vitro.
O progresso obtido até hoje nos projetos dos SMF sugerem o
alto potencial dessa nova abordagem para superar as limitações
dos modelos experimentais utilizados atualmente. Poderão, em
prazo mais curto que se imagina, proporcionar a redução do
uso de animais de laboratório e oferecer modelos com maior
potencial preditivo aplicáveis à farmacologia, desenvolvimento
de fármacos, emulação de doenças, avanço da medicina perso-
nalizada bem como o incentivo do desenvolvimento de melhores
testes que contribuirão na melhoria de produtos e substâncias
valiosos a ramos industriais tais quais os alimentício, cosmético
e agropecuário.
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Esta publicação está sob a licença Creative Commons Atribuição 3.0 não Adaptada.
Para ver uma cópia desta licença, visite http://creativecommons.org/licenses/by/3.0/deed.pt_BR.
Agradecimentos
À Célia Maria Gaudêncio e à Roberta Francese Paiva, pelo auxílio técnico prestado na execução deste trabalho.
Conito de Interesse
Os autores informam não haver qualquer potencial conito de interesse com pares e instituições, políticos ou nanceiros deste estudo.
... [46] Furthermore, the possibility of using different cell types in the same organoid allows heterotypic intercellular contacts, providing additional advances in realistically representing tissue functionality and differentiation. [45,47] A summary of charac-teristics from monolayer, spheroids, and organoids are represented in ...
Article
Background An impressive percentage of biomedical advances were achieved through animal research and cell culture investigations. For drug testing and disease researches, both animal models and preclinical trials with cell cultures are extremely important, but present some limitations, such as ethical concern and inability of representing complex tissues and organs. 3D cell cultures arise providing a more realistic in vitro representation of tissues and organs. Environment and cell type in 3D cultures can represent in vivo conditions and thus provide accurate data on cell‐to‐cell interactions, and cultivation techniques are based on a scaffold, usually hydrogel or another polymeric material, or without scaffold, such as suspended microplates, magnetic levitation, and microplates for spheroids with ultra‐low fixation coating. Purpose and scope This review aims at presenting an updated summary of the most common 3D cell culture models available, as well as a historical background of their establishment and possible applications. Summary Even though 3D culturing is incapable of replacing other current research types, they will continue to substitute some unnecessary animal experimentation, as well as complement monolayer cultures. Conclusion In this aspect, 3D culture emerges as a valuable alternative to the investigation of functional, biochemical, and molecular aspects of human pathologies.
... [46] Furthermore, the possibility of using different cell types in the same organoid allows heterotypic intercellular contacts, providing additional advances in realistically representing tissue functionality and differentiation. [45,47] A summary of charac-teristics from monolayer, spheroids, and organoids are represented in ...
... Esses sistemas são capazes de biomimetizar a arquitetura e funções de órgãos e tecidos, tornando-se assim uma alternativa inovadora para a experimentação animal clássica em testes de segurança e eficácia. Cada chip pode ser processado a partir de um biomaterial flexível e translúcido, com dimensões de um cartão de memória, cuja estrutura apresenta canais microfluídicos revestidos por células humanas vivas [122][123][124][125] . Essas características possibilitam ao dispositivo visualizar o funcionamento interno de órgãos e estudo da fisiologia humana em um contexto específico, além de proporcionar o desenvolvimento de modelos in vitro para doenças e a substituição de modelos animais em testes in vivo. ...
Article
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Regenerative medicine has transformed conventional practises in medicine. It focuses on the repair and regeneration of cells, tissue, and genes. Regenerative medicine has led to new forms of regulation of biological inputs and required the upgrading of some state capacities at the public, private, national and supranational levels, as well as the inclusion of new social sectors in the governance of the area. However, there are still many matters of concern on diminishing risks and uncertainties that have not been completely resolved either globally or nationally. The aims of the present study are to analyse the specific manner in which innovation and regulation in regenerative medicine have developed in Brazil; which state capacities are facilitated or hindered and how different social groups participate in the sector. At the methodological level, the research consists of a bibliographical and documentary study that mainly uses secondary data to develop a qualitative analysis of information and a quantitative analysis of statistics. In addition, interviews were conducted with associated social actors, including representatives from patient organisations, on which content analysis of narratives was performed. Public policies present lacunae in the regulation of clinical trials, the inclusion of private capital, and the promotion of local patents, as well as a lack of coordination between public agencies. A set of state dynamic capacities have been developed gradually in Brazil over the last ten years, but mission-oriented public policy has been almost inexistent, state aims are unfocused, and the legitimation of state action is still under development.
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A medicina regenerativa tem transformado as práticas convencionais na medicina focando na reparação e regeneração das células e tecidos, utilizando diferentes tipos de células-tronco removidas dos corpos humanos e geralmente reproduzidas in vitro. Ela tem levado a novas formas de regulação de materiais biológicos e requerido o aprimoramento de alguns tipos de capacidades estatais, em nível público e privado, local e supranacional; sendo esse o objetivo de estudo deste artigo. Desenvolve-se um estudo bibliográfico e documental, que utiliza dados secundários, análise qualitativa de informações de entrevistas e quantitativa de dados estatísticos. Conclui-se que um conjunto de capacidades dinâmicas estatais vem se desenvolvendo nos últimos dez anos. Mas, ainda assim, a política pública orientada a missões tem sido quase inexistente, as metas estatais pouco direcionadas e a legitimidade das ações estatais encontra-se ainda em desenvolvimento.
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The supplementation of culture medium with fetal bovine serum (FBS, also referred to as 'fetal calf serum') is still common practice in cell culture applications. Due to a number of disadvantages in terms of quality and reproducibility of in vitro data, animal welfare concerns, and in light of recent cases of fraudulent marketing, the search for alternatives and the development of serum-free medium formulations gained global attention. Here, we report on the 3rd Workshop on FBS, Serum Alternatives and Serum-free Media, where (a) regulatory aspects, (b) the serum dilemma, (c) alternatives to FBS, (d) case-studies of serum-free in vitro applications, and (e) the establishment of serum-free databases, were discussed. The whole process of obtaining blood from a living calf fetus to using the FBS produced from it for scientific purposes is de facto not yet legally regulated, despite the existing EU-Directive 2010/63/EU on the use of animals for scientific purposes. Together with above mentioned challenges, several strategies have been developed to reduce or replace FBS in cell culture media in terms of the 3Rs (Refinement, Reduction, Replacement). Most recently, releasates of activated human donor thrombocytes (human platelet lysates) have been shown to be one of the most promising serum alternatives when chemically defined media are not yet an option. Additionally, new developments in cell-based assay techniques, advanced organ-on-chip and microphysiological systems are covered in this report. Chemically-defined serum-free media are shown to be the ultimate goal for the majority of culture systems, and examples are discussed.
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Investigation of the pharmacokinetics (PK) of a compound is of significant importance during the early stages of drug development, and therefore several in vitro systems are routinely employed for this purpose. However, the need for more physiologically realistic in vitro models has recently fueled the emerging field of tissue-engineered 3D cultures, also referred to as organs-on-chips, or microphysiological systems (MPSs). We have developed a novel fluidic platform that interconnects multiple MPSs, allowing PK studies in multi-organ in vitro systems along with the collection of high-content quantitative data. This platform was employed here to integrate a gut and a liver MPS together in continuous communication, and investigate simultaneously different PK processes taking place after oral drug administration in humans (e.g., intestinal permeability, hepatic metabolism). Measurement of tissue-specific phenotypic metrics indicated that gut and liver MPSs can be fluidically coupled with circulating common medium without compromising their functionality. The PK of diclofenac and hydrocortisone was investigated under different experimental perturbations, and results illustrate the robustness of this integrated system for quantitative PK studies. Mechanistic model-based analysis of the obtained data allowed the derivation of the intrinsic parameters (e.g., permeability, metabolic clearance) associated with the PK processes taking place in each MPS. Although these processes were not substantially affected by the gut-liver interaction, our results indicate that inter-MPS communication can have a modulating effect (hepatic metabolism upregulation). We envision that our integrative approach, which combines multi-cellular tissue models, multi-MPS platforms, and quantitative mechanistic modeling, will have broad applicability in pre-clinical drug development.
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Tumors develop in intricate microenvironments required for their sustained growth, invasion, and metastasis. The tumor microenvironment plays a critical role in the malignant or drug resistant nature of tumors, becoming a promising therapeutic target. Microengineered physiological systems capable of mimicking tumor environments are one emerging platform that allows for quantitative and reproducible characterization of tumor responses with pathophysiological relevance. This review highlights the recent advancements of engineered tumor microenvironment systems that enable the unprecedented mechanistic examination of cancer progression and metastasis. We discuss the progress and future perspective of these microengineered biomimetic approaches for anticancer drug prescreening applications.
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Pulmonary thrombosis is a significant cause of patient mortality, however, there are no effective in vitro models of thrombi formation in human lung microvessels, that could also assess therapeutics and toxicology of antithrombotic drugs. Here we show that a microfluidic lung alveolus-on-a-chip lined by human primary alveolar epithelium interfaced with endothelium, and cultured under flowing whole blood can be used to perform quantitative analysis of organ-level contributions to inflammation-induced thrombosis. This microfluidic chip recapitulates in vivo responses, including platelet-endothelial dynamics and revealed that lipopolysaccharide (LPS) endotoxin indirectly stimulates intravascular thrombosis by activating the alveolar epithelium, rather than acting directly on endothelium. This model is also used to analyze inhibition of endothelial activation and thrombosis due to a protease activated receptor-1 (PAR-1) antagonist, demonstrating its ability to dissect complex responses and identify antithrombotic therapeutics. Thus, this methodology offers a new approach to study human pathophysiology of pulmonary thrombosis and advance drug development. This article is protected by copyright. All rights reserved.
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The integration of microfluidics and cell biology has reached a significant milestone with the development of “organ-on-chips”, smart technological platforms that, once applied to the study of human diseases, such as cancer, might ultimately contribute to design personalised treatments and hence improve health outcomes. This paper reports that the combination of microfluidics and dielectrophoresis (DEP) allows to culture different pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) human cell lines into a cyclic olefin polymer (COP) chamber (HepaChip®), enriched by the extracellular matrix (ECM) protein collagen. We show that PDAC cells cultured into the HepaChip® (1) are vital and grow, provided they properly attach to collagen; (2) show morphological appearance and growth characteristics closer to those of cells grown as spheroids than as classical 2 dimensional (2D) in vitro cultures. Finally, preliminary experiments show that PDAC cells respond to high doses of Cisplatin perfused through the chip. Overall, the present microfluidic platform could be exploited in the future for a personalised approach to PDAC.
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Thought leader Michael Shuler introduces the Lab on a Chip organ, body and disease on a chip thematic collection.
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Multipotent hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) are the source for all blood cell types. The bone marrow stem cell niche in which the HSPCs are maintained is known to be vital for their maintenance. Unfortunately, to this date no in vitro model exists that truthfully mimics the aspects of the bone marrow niche and simultaneously allows the long-term culture of HSPCs. In this study, we present a novel 3D co-culture model, based on a hydroxyapatite coated zirconium oxide scaffold, comprising of human mesenchymal stromal cells (MSCs) and cord blood derived HSPCs, enabling successful HSPC culture for a time span of 28 days within the microfluidic Multi-Organ-Chip (MOC). The HSPCs were found to stay in their primitive state (CD34(+) CD38(-) ) and capable of GEMM colony formation. Furthermore, a microenvironment was formed bearing molecular and structural similarity to the in vivo bone marrow niche containing ECM and signaling molecules known to play an important role in HSPC homeostasis. Here, we present for the first time a novel human in vitro bone marrow model, capable of long-term culture of primitive HSPCs in a microfluidic environment. This article is protected by copyright. All rights reserved.
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To curb the high cost of drug development, there is an urgent need to develop more predictive tissue models using human cells to determine drug efficacy and safety in advance of clinical testing. Recent insights gained through fundamental biological studies have validated the importance of dynamic cell environments and cellular communication to the expression of high fidelity organ function. Building on this knowledge, emerging Organ-on-a-Chip technology is poised to fill the gaps in drug screening by offering predictive human tissue models with methods of sophisticated tissue assembly. Organ-on-a-Chip startups have begun to spawn from academic research to fill this commercial space and are attracting investment to transform the drug discovery industry. This review traces the history, examines the scientific foundation and envisages the prospect of these renowned Organ-on-a-Chip technologies. It serves as a guide for new members of this dynamic field to navigate the existing scientific and market space.
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Trans-Epithelial Electrical Resistance (TEER) is broadly used as an experimental readout and a quality control assay for measuring the integrity of epithelial monolayers cultured under static conditions in vitro, however, there is no standard methodology for its application to microfluidic Organ-on-a-Chip (Organ Chip) cultures. Here, we describe a new microfluidic Organ Chip design that contains embedded electrodes, and we demonstrate its utility for assessing formation and disruption of barrier function both within a human Lung Airway Chip lined by a fully differentiated mucociliary human airway epithelium and in a human Gut Chip lined by intestinal epithelial cells. These chips with integrated electrodes enable real-time, non-invasive monitoring of TEER and can be applied to measure barrier function in virtually any type of cultured cell.