ArticlePDF Available

The search for microRNAs potentially involved in the selfrenewal maintaining of laboratory rat pluripotent stem cells

Authors:
Article

The search for microRNAs potentially involved in the selfrenewal maintaining of laboratory rat pluripotent stem cells

Abstract

Self-renewal of cultured pluripotent stem cells is a complex process, which includes multiple functional and regulatory levels. Transcription factors, their target genes, chromatin modifiers, signaling pathways, and regulatory noncoding RNAs are involved in the maintaining of self-renewal. Studies of molecular and genetic bases of maintaining self-renewal and pluripotency in cultured mammalian cells are important to understand processes in preimplantation embryogenesis and to develop efficient techniques to obtain pluripotent stem cell lines for experimental biology and medicine. MicroRNAs (miRNAs) play an important role in pluripotency maintaining and reprogramming. However, involvement of this class of noncoding RNAs and functions of individual molecules are poorly studied. The goal of this study was the search for the miRNAs potentially involved in the pluripotency maintaining and reprogramming of Rattus norvegicus cells. We analyzed the expression of miRNAs in rat embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells and embryonic fibroblasts using bioinformatic methods and data obtained with next generation sequencing. The analysis of differential expression between groups of rat pluripotent cells and fibroblasts, and the analysis of experimentally confirmed target genes of differentially expressed known rat miRNAs revealed novel potential players of pluripotency maintaining and reprogramming processes. In addition, novel members of these processes were revealed among novel rat miRNAs. The use of bioinformatic and systems biology approaches is the first step, which is necessary for choosing candidates for the subsequent experimental studies. The results obtained substantially improve our understanding of the self-renewal regulation system of the laboratory rat, a popular biomedical object, and our knowledge about the system in mammals.
Клеточная и молекулярная биология
ОригинальнОе исследОвание / original article
The search for microRNAs
potentially involved in the self-
renewal maintaining oflaboratory
rat pluripotent stem cells
V.V. Sherstyuk1, 2, 3, 4 , S.P. Medvedev1, 2, 3, 4,
M.T.Ri5, 6, Y.V. Vyatkin1, 4, 5, 6, O.V. Saik1,
D.N.Shtokalo1, 5, 6, 7, S.M. Zakian1, 2, 3, 4
1 Institute of Cytology and Genetics SB RAS, Novosibirsk, Russia
2 E.N. Meshalkin National Medical Research Center, Ministry of
Health of Russian Federation, Novosibirsk, Russia
3 Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine
SBRAS, Novosibirsk, Russia
4 Novosibirsk State University, Novosibirsk, Russia
5 AcademGene LLC, Novosibirsk, Russia
6 St. Laurent Institute, Woburn, USA
7 A.P. Ershov Institute of Informatics Systems SB RAS, Novosibirsk,
Russia
Self-renewal of cultured pluripotent stem cells is acom-
plex process, which includes multiple functional and
regulatory levels. Transcription factors, their target
genes, chromatin modiers, signaling pathways, and
regulatory noncoding RNAs are involved in the main-
taining of self-renewal. Studies of molecular and genetic
bases of maintaining self-renewal and pluripotency in
cultured mammalian cells are important to understand
processes in preimplantation embryogenesis and to
develop ecient techniques to obtain pluripotent stem
cell lines for experimental biology and medicine. Micro-
RNAs (miRNAs) play an important role in pluripotency
maintaining and reprogramming. However, involvement
of this class of noncoding RNAs and functions of indivi-
dual molecules are poorly studied. The goal of this study
was the search for the miRNAs potentially involved in
the pluripotency maintaining and reprogramming of
Rattus norvegicus cells. We analyzed the expression of
miRNAs in rat embryonic stem cells, induced pluripotent
stem cells and embryonic broblasts using bioinforma-
tic methods and data obtained with next generation
sequencing. The analysis of dierential expression be-
tween groups of rat pluripotent cells and broblasts, and
the analysis of experimentally conrmed target genes
of dierentially expressed known rat miRNAs revealed
novel potential players of pluripotency maintaining and
Самообновление культивируемых плюрипотентных клеток –
сложный процесс, объединяющий множество функциональных
и регуляторных уровней. В поддержании самообновлениякле ток
принимают участие сеть транскрипционных факторов,ши рокий
спектр их генов-мишеней, включая ферменты, регулиру ющие
структуру хроматина, сигнальные каскады, а такжеконтур, содер-
жащий систему регуляторных некодирующих РНК.Изуче ние мо-
лекулярно-генетических основ поддержания самооб новления и
реализации свойства плюрипотентности культивируемыхкле ток
млекопитающих является крайне важной за да чей для понима-
ния процессов, происходящих в доимплантационном эмбриоге-
незе, а также для построения эффективных методик получения
линий плюрипотентных стволовых клеток в интересах экспери-
ментальной биологии и медицины. Микро РНК (миРНК) играют
важную роль в процессах поддержания плюрипотентного со-
стояния и репрограммирования клеток. Однако участие данного
класса некодирующих РНК в представленных процессах и функ-
ции отдельных миРНК изучены недостаточно. Целью настоящего
исследования был поиск миРНК, потенциально участвующих в
процессах поддержания плюрипотентного состояния и репро-
граммирования клеток крысы Rattus norvegicus. С использовани-
ем методов биоинформатики и данных, полученных в результате
секвенирования нового поколения, нами проанализирована
экспрессия миРНК в эмбриональных стволовых клетках, индуци-
рованных плюрипотентных стволовых клетках и эмбриональных
фибробластах крысы. Проведенный анализдиф ференциальной
экспрессии между группами плюрипотентных клеток и фибро-
бластов, а также анализ проверенных экспериментально генов-
мишеней дифференциально экспрессирующихся известных
миРНК крысы позволили выявить новых потенциальных участ-
ников процессов поддержания плюрипотентного состояния и
репрограммирования. Кроме того, новые потенциальные участ-
ники этих процессов обнаружены среди ранее не аннотирован-
ных миРНК крысы. Использование биоинформатических подхо-
дов и методов системной биологии – первый необходимый шаг
при выборе кандидатов для дальнейшего экспериментального
изучения. Полученные результаты существенно дополняют
представления осистеме регуляции самообновления у такого
модельного орга низма, как лабораторная крыса, и расширяют
знания о данной системе у млекопитающих в целом.
Ключевые слова: плюрипотентность; микроРНК; системная
биология.
e-mail: svv@bionet.nsc.ru
Поиск микроРНК, потенциально задействованных
в поддержании самообновления плюрипотентных
клеток лабораторной крысы
В.В. Шерстюк1, 2, 3, 4 , С.П. Медведев1, 2, 3, 4, М.Т. Ри5, 6, Ю.В. Вяткин1, 4, 5, 6, О.В. Сайк1, Д.Н. Штокало1, 5, 6, 7,
С.М. Закиян1, 2, 3, 4
1 Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск, Россия
2 Национальный медицинский исследовательский центр имени академика Е.Н. Мешалкина Министерства здравоохранения Российской Федерации,
Новосибирск, Россия
3 Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск, Россия
4 Новосибирский национальный исследовательский государственный университет, Новосибирск, Россия
5 ООО «АкадемДжин», Новосибирск, Россия
6 Институт Сен-Лорана, Вобурн, США
7 Институт систем информатики им. А.П. Ершова Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск, Россия
Received 18.10.2017
Accepted for publication 25.11.2017
© AUTHORS, 2018
Вавиловский журнал генетики и селекции. 2018;22(2):179-186
DOI 10.18699/VJ18.345
180 Cell and molecular biologyVavilov Journal of Genetics and Breeding • 2018 • 22 • 2
   :
Шерстюк В.В., Медведев С.П., Ри М.Т., Вяткин Ю.В., Сайк О.В., Штокало Д.Н., Закиян С.М. Поиск микроРНК, потенциально
задействованных в поддержании самообновления плюрипотентных клеток лабораторной крысы. Вавиловский журнал
генетики и селекции. 2018;22(2):179-186. DOI 10.18699/VJ18.345
HOW TO CITE THIS ARTICLE:
Sherstyuk V.V., Medvedev S.P., Ri M.T., Vyatkin Y.V., Saik O.V., Shtokalo D.N., Zakian S.M. The search for microRNAs potentially involved
in the self-renewal maintaining of laboratory rat pluripotent stem cells. Vavilovskii Zhurnal Genetiki i Selektsii = Vavilov Journal of
Genetics and Breeding. 2018;22(2):179-186. DOI 10.18699/VJ18.345 (in Russian)
reprogramming processes. In addition, novel members
of these processes were revealed among novel rat
miRNAs. The use of bioinformatic and systems biology
approaches is the rst step, which is necessary for
choosing candidates for the subsequent experimental
studies. The results obtained substantially improve our
understanding of the self-renewal regulation system
of the laboratory rat, a popular biomedical object, and
our knowledge about the system in mammals.
Key words: pluripotency; microRNA; system biology.
Плюрипотентные стволовые клетки (ПСК) могут быть
дифференцированы в производные всех трех за-
родышевых листков. Известно два типа ПСК: эмб
риональные стволовые клетки (ЭСК), получаемые из
внут ренней клеточной массы бластоцист, и индуцирован
ные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), получае
мые путем сверхэкспрессии факторов плюрипотентности
(Oct4, Sox2, Klf4 и cMyc) из соматических клеток (Evans,
Kaufman, 1981; Martin, 1981; Thomson et al., 1998; Taka-
hashi, Yamanaka, 2006). ПСК и их дифференцированные
производные нашли широкое применение для изучения
процессов, происходящих в раннем развитии, создания
моделей генетических заболеваний и тестирования ле-
карственных препаратов. Для успешного получения, куль-
тивирования и применения ПСК необходимо понимание
процессов и механизмов, участвующих в регуляции само-
обновления и поддержания плюрипотентного состояния, а
также его реализации в ходе дифференцировки. В настоя-
щее время известно множество факторов, участвующих в
регуляции этих процессов, в том числе транскрипционные
факторы, эпигенетические механизмы, сигнальные каска-
ды, некодирующие РНК (Васькова и др., 2013; Vaskova
et al., 2013; Hackett, Surani, 2014; Huang et al., 2015).
Среди некодирующих РНК особое внимание уделяется
микроРНК (миРНК) коротким молекулам длиной от
18 до 25 нуклеотидов, осуществляющим регуляцию экс-
прессии генов на посттранскрипционном уровне (Eulalio
et al., 2008; Filipowicz et al., 2008). Участие в поддержании
плюрипотентного состояния клеток мыши и человека
показано для ряда миРНК, среди которых наиболее из-
вестны миРНК, закодированные в кластерах miR 290295
(miR371373 у человека), miR302367, а также миРНК
семейства miR200 (Calabrese et al., 2007; Huang et al.,
2015; Yuan et al., 2017). МиРНК крысы, в отличие от мыши,
исследованы менее детально как в рамках процесса под-
держания плюрипотентности, так и в целом. Крыса Rattus
norvegicus – один из классических объектов эксперимен-
тальной биологии. Однако ЭСК крысы впервые получены
только в 2008 г. (Buehr et al., 2008; Li et al., 2008). ЭСК и
ИПСК крысы культивируют в условиях отсутствия бычьей
эмбриональной сыворотки с добавлением лейкемияин
гибирующего фактора и ингибиторов Mek1/2 и Gsk3 ки
наз. Ранее при сравнительном анализе транскриптома
ПСК и эмбриональных фибробластов крысы был выяв-
лен ряд видоспецифичных особенностей поддержания
плюрипотентного состояния (Vaskova et al., 2015). Таким
образом, поиск новых миРНК, задействованных в данном
процессе, необходим как для понимания уровня консер-
вативности тех или иных миРНК, так и для выявления
новых участников. В настоящей работе проведен поиск
новых участников процесса поддержа ния плюрипотент-
ного состояния среди миРНК на основании результатов
полного секвенирования малых РНК, полученных из
ЭСК, ИПСК и эмбриональных фибробластов крысы.
Материалы и методы
Анализ первичных данных секвенирования малых
РНК. Использованы данные, полученные ранее в ходе
секвенирования малых РНК ЭСК, ИПСК и эмбриональ-
ных фибробластов крысы и загруженные в базу данных
SRA (SRX395433395442). На первом этапе произведена
фильтрация прочтений по качеству и удалена последова-
тельность адаптера при помощи FASTX Toolkit v0.0.14.
Далее прочтения картировали на референсный геном
R. norvegicus (версия rn5) и на референс рибосомальных
РНК R. norvegicus из базы данных Silva с использованием
программного обеспечения BWA v0.7.10r806 (Gibbs et
al., 2004; Quast et al., 2013). Известно, что миРНК имеют
характерную длину от 18 до 25 нуклеотидов. Поэтому
прочтения длиной менее 18 и более 27 нуклеотидов были
удалены из дальнейшего анализа. Проведена фильтрация
прочтений от известных повторенных последовательно-
стей класса РНК. В результате обработки получен набор
«информативных прочтений». Подсчет уровня экспрес-
сии известных миРНК производили путем вычисления
количества информативных прочтений, пересекающихся
с координатами известных миРНК R. norvegicus из базы
данных miRbase v21 (GrifthsJones et al., 2006). Норми
рованный уровень экспрессии миРНК вычисляли по сле
дующей формуле:
x i
j = X  i
j · 106
(Количество информативных прочтений)i
,
где i образец, j миРНК; X  i
jколичество прочтений,
кар тированных на миРНК; x i
jнормализованный уровень
экспрессии (RPM, reads per million).
В.В. Шерстюк, С.П. Медведев, М.Т. Ри
Ю.В. Вяткин, О.В. Сайк, Д.Н. Штокало, С.М. Закиян
2018
22 • 2
181
Клеточная и молекулярная биология Вавиловский журнал генетики и селекции • 2018 • 22 • 2
Поиск микроРНК, участвующих в поддержании
самообновления плюрипотентных клеток крысы
Поиск новых миРНК крысы. Поиск новых миРНК
крысы проведен с использованием программного обеспе
чения miRanalyzer и miRDeep2. Для полученного набора
новых миРНК произведена фильтрация против извест-
ных миРНК крысы и повторенных последовательностей
класса РНК. Вторичные структуры премиРНК получены
с использованием программного обеспечения RNAFold
(Hofacker, 2003).
Анализ дифференциальной экспрессии миРНК меж-
ду группами плюрипотентных клеток и эмбриональ
ных фибробластов крысы выполнен с использованием
следующего подхода: произведен расчет уровня стати
стической значимости различий экспрессии миРНК меж ду
группами ПСК (ЭСК и ИПСК) и эмбриональных фи бро
бластов с помощью программного пакета edgeR (Ro binson
et al., 2010). Далее, для того чтобы повысить достовер-
ность данных, были введены критерии: 1) отношение
средних значений экспрессии в группах должно быть не
менее 3; 2) минимальное значение экспрессии миРНК в
одной из групп должно быть в два раза больше максималь-
ного значения в другой группе. МиРНК, соответствующие
данным критериям, считали дифференциально экспрес-
сирующимися.
Анализ проверенных экспериментально геновми
шеней дифференциально экспрессирующихся извест
ных миРНК. Проверенные экспериментально геными
шени миРНК человека, мыши и крысы загружены из
базы данных MiRTarBase (Hsu et al., 2011). Выявленные
генымишени прошли дополнительный отбор по измене-
нию уровня экспрессии относительно миРНК. Так, для
миРНК, уровень экспрессии которых повышен в ПСК
по сравнению с эмбриональными фибробластами, были
отобраны только те генымишени, которые имеют снижен-
ный уровень экспрессии в ПСК, и наоборот. Применение
этого подхода обусловлено основной функцией миРНК,
выраженной в негативной регуляции экспрессии мРНК
мишени. Использованные в нашей работе транскрип-
томные данные были получены ранее для тех же линий
клеток (Vaskova et al., 2015). Анализ участия полученных
геновмишеней и дифференциально экспрессирующих-
ся известных миРНК крысы в процессах поддержания
стволового состояния и мезенхимальноэпителиального
перехода проведен с использованием программного обе-
спечения ANDSystem (Ivanisenko et al., 2015).
Результаты
Поиск потенциальных участников процесса поддер
жания плюрипотентности путем анализа дифферен
циальной экспрессии. Современные технологии сек-
венирования позволяют находить огромные массивы
данных об экспрессии транскриптов. В нашей работе ис-
пользованы результаты, полученные при секвенировании
малых РНК ЭСК, ИПСК и эмбриональных фибробластов
крысы. Эти линии клеток получены и охарактеризованы
ранее в лаборатории эпигенетики развития Института
цитологии и генетики СО РАН (Vaskova et al., 2015). При
обработке данных выявлена экспрессия 674 миРНК в ЭСК,
ИПСК и эмбриональных фибробластах крысы. Одним
из основных подходов при анализе транскриптомных
данных является поиск генов, дифференциально экспрес-
сирующихся между типами клеток. В результате анализа
дифференциальной экспрессии миРНК между группами
ПСК и эмбриональных фибробластов обнаружено 219
дифференциальноэкспрессирующихся миРНК. При
этом повышенный уровень экспрессии имеют 77 миРНК
в ПСК и 142 – в эмбриональных фибробластах. На рис. 1
представлена выборка из дифференциальноэкспресси-
рующихся миРНК с наибольшим уровнем экспрессии
в ПСК крысы. Среди миРНК с повышенным уровнем
экспрессии в ПСК выявлены ранее известные молекулы,
участвующие в поддержании плюрипотентности клеток
мыши, такие как миРНК кластера miR290295 (miR290,
miR291a, miR291b, miR292, miR293, miR294, miR295)
и семейства miR200 (miR200a, miR200b, miR200c,
miR141, miR429). В настоящее время эти семейства
наиболее изучены в контексте поддержания плюрипотент-
ного состояния, а также процесса репрограммирования
к плюрипотентному состоянию (Calabrese et al., 2007;
Leonardo et al., 2012; Huang et al., 2014). Для ряда других
миРНК, например кластера miR18296183, ранее пока-
зана экспрессия в ПСК мыши, но не известны функции
и генымишени (Zhao et al., 2014). Экспрессия данного
кластера выявлена нами также в ПСК крысы. Кроме
того, обнаружено 14 миРНК, локализованных в участке
размером около 45 т. п. н. на длинном плече Ххромосомы
(Xq37): miR743a, miR743b, miR742, miR883, miR471,
miR3551, miR741, miR463, miR880, miR878, miR881,
miR871, miR3580, miR465. Высокий уровень экспрес-
сии в ПСК, а также его снижение при дифференцировке,
что было ранее показано для miR7413p и miR743a3p,
позволяют предположить участие данных миРНК в про-
цессе поддержания плюрипотентного состояния.
Поиск потенциальных участников процесса под-
держания плюрипотентности путем анализа генов
ми шеней миРНК. Известно, что миРНК осуществляют
репрессию генов путем связывания с мРНКмишенью
в комплексе RISC (RNAinduced silencing complex), что
приводит к деградации целевой мРНК или ингибирова-
нию процесса трансляции (Filipowicz et al., 2008). При
этом каждая отдельная миРНК может регулировать мно-
жество мРНК (Bartel, 2009). Важный этап при анализе
миРНК – поиск геновмишеней. В настоящее время раз-
работано множество программ для поиска потенциальных
геновмишеней миРНК. Среди наиболее известных –
TargetScan v7.0 (Agarwal et al., 2015), miRanda v3.3a (Betel
et al., 2008), TargetSpy v1.1 (Sturm et al., 2010). Основным
недостатком поиска потенциальных геновмишеней яв-
ляется высокая доля ложноположительных результатов
(Yue et al., 2009). Для того чтобы повысить достоверность
результатов, в анализе рассматривались только проверен-
ные экспериментально генымишени для списка миРНК.
Одна из наиболее полных баз данных проверенных экс-
периментально геновмишеней миРНК – MiRTarBase
(Hsu et al., 2011).
В нашей работе в результате поиска по базе данных
MiRTarBase выявлено 457 генов для миРНК, дифферен-
циальноэкспрессирующихся между группами ПСК и
эмбриональных фибробластов крысы. Чтобы выявить
миРНК, участвующие в процессе поддержания стволового
состояния, полученные списки генов и дифференци-
The search for microRNAs involved in the self-renewal
maintaining of laboratory rat pluripotent stem cells
V.V. Sherstyuk, S.P. Medvedev, M.T. Ri
Y.V. Vyatkin, O.V. Saik, D.N. Shtokalo, S.M. Zakian
182 Cell and molecular biologyVavilov Journal of Genetics and Breeding • 2018 • 22 • 2
альноэкспрессирующихся миРНК проанализировали с
использованием программного обеспечения ANDSystem
(Ivanisenko et al., 2015). Эта программа позволяет рекон-
струировать генные сети на основе информации о взаимо-
действиях между изучаемыми генами, белками, миРНК,
метаболитами и др. и их участии в различных процессах,
полученной из баз данных опубликованных научных ста-
тей и информационных ресурсов. В полученной генной
сети представлены известные маркеры плюрипотентного
состояния, такие как Nanog, Sox2, Esrrb, Nodal и Lin28a
(рис. 2, а) (Huang et al., 2015), в ней присутствуют также
миРНК miR429 и miR183 с повышенным уровнем экс-
прессии в ПСК. Можно предположить, что эти миРНК за-
действованы в процессе поддержания плюрипотентности
у крысы. Кроме того, в данной сети участвуют миРНК,
вовлеченные в процесс негативной регуляции плюрипо-
тентного состояния клеток мыши и человека, такие как,
например, miR145 и представители семейства let7 (Xu
et al., 2009; Rahkonen et al., 2016). В сети представлены
также миРНК семейства miR181, регулирующие Tcl1a и
Wnt3a. Ранее Tcl1a был использован в качестве одного из
факторов репрограммирования клеток человека (Picanço
Castro et al., 2011). Wnt3a участник сигнального пути
Wnt, активация которого необходима для поддержания
плюрипотентного состояния клеток крысы (Buehr et al.,
2008; Li et al., 2008).
Кроме того, дифференциальноэкспрессирующиеся
миРНК и их экспериментально подтвержденные гены
мишени проанализированы на участие в мезенхимально
эпителиальном переходе (МЭП), ключевом процессе на-
чального этапа репрограммирования соматических клеток
к плюрипотентному состоянию (рис. 2, б) (Samavarchi
Tehrani et al., 2010). Одним из основных генов, повыша-
ющих уровень экспрессии на начальных этапах репро-
граммирования, является Cdh1, кодирующий Ecadherin и
способствующий МЭП (An et al., 2017). Cdh1 представлен
в сети МЭП. В этой сети участвуют три миРНК, две из
которых имеют повышенный уровень экспрессии в ПСК
(miR182 и miR429), одна миРНК (miR615) имеет по-
вышенный уровень экспрессии в фибробластах. miR 429
относится к семейству miR200, которое способствует
начальным этапам репрограммирования фибробластов
мыши к плюрипотентному состоянию (SamavarchiTehrani
et al., 2010). miR182, как известно, повышает уровень
экспрессии при репрограммировании фибробластов мыши
(Chen et al., 2012). Участие miR182 в сети МЭП свиде-
тельствует о том, что эта миРНК может способствовать
репрограммированию путем активации данного процес
са. С другой стороны, miR615, экспрессия которой сни-
жается при переходе к состоянию плюрипотентности,
может являться потенциальным ингибитором процесса
репрограммирования. Таким образом, представленный
подход, основанный на методах системной биологии
и биоинформатики, позволил выявить потенциальных
участников процессов поддержания плюрипотентности
и репрограммирования для их дальнейшего эксперимен-
тального изучения.
Поиск потенциальных участников процесса поддер
жания плюрипотентности среди новых, ранее не анно
тированных миРНК крысы. Новые участники процесса
поддержания плюрипотентности могут быть выявлены
среди не только известных, но и ранее не аннотированных
миРНК. Последняя версия базы данных миРНК mirBase
v 21 (http://mirbase.org/) содержит 765 зрелых миРНК
крысы, в то время как количество известных зрелых
миРНК мыши и человека составляет 1 915 и 2 588 соот-
ветственно (GrifthsJones et al., 2006). Для поиска новых
миРНК существует ряд доступных программ, например
miRanalyzer (Hackenberg et al., 2011) и miRDeep2 (Fried-
lander et al., 2012). В результате поиска новых миРНК кры-
сы с использованием приведенных программ и анализа
дифференциальной экспрессии выявлено 10 новых зрелых
миРНК с повышенным уровнем экспрессии в ПСК, 4 из
10 миРНК не имеют известных гомологов. Причем 2 из
этих 4 миРНК представляют собой зрелые формы (5ʹ и
3ʹплечи) одной премиРНК. Остальные 6 миРНК имеют
известные гомологи у мыши и человека.
Среди новых миРНК крысы выявлены гомологи miR
302a и miR302b мыши (рис. 3, a и б). Известно, что дан
ные миРНК участвуют в регуляции плюрипотентного
состояния мыши и человека, однако не были обнаружены
ранее у крысы (Jouneau et al., 2012). Кроме того, в локусе
10 000
8 000
6 000
4 000
2 000
0
120 000
100 000
80 000
60 000
40 000
20 000
0
RPM
а b
miR-293-5p
miR-292-5p
miR-741-3p
miR-292-3p
miR-743a-3p
miR-291a-5p
miR-291a-3p
miR-871-3p
miR-290
miR-743b-3p
miR-295-3p
miR-295-3p
miR-182
miR-291b
miR-463-3p
miR-200b-3p
miR-183-5p
miR-200a-3p
miR-743b-5p
miR-465-3p
miR-881-3p
miR-210-3p
miR-878
miR-294
miR-200c-3p
miR-3580-3p
miR-471-3p
miR-471-5p
miR-871-5p
miR-743a-5p
miR-293-5p
miR-292-5p
miR-741-3p
miR-292-3p
miR-743a-3p
Fig. 1. Upregulated miRNAs in rat pluripotent stem cells compared to embryonic broblasts.
(a) Top 30 miRNAs with the highest expression levels in PSCs. (b) Top 5 miRNAs with the highest expression levels in PSCs.
В.В. Шерстюк, С.П. Медведев, М.Т. Ри
Ю.В. Вяткин, О.В. Сайк, Д.Н. Штокало, С.М. Закиян
2018
22 • 2
183
Клеточная и молекулярная биология Вавиловский журнал генетики и селекции • 2018 • 22 • 2
Поиск микроРНК, участвующих в поддержании
самообновления плюрипотентных клеток крысы
miR290295 выявлена новая миРНК, гомологичная miR
372 человека (см. рис. 3, в). Кластер miR290295 мыши и
гомологичный ему miR371373 человека играют значи-
тельную роль в поддержании плюрипотентного состояния
(Cao et al., 2015; Yuan et al., 2017). MiR147, гомолог кото-
рой найден нами у крысы, участвует в активации МЭП,
опосредованно активируя экспрессию CDH1 в клетках
рака толстой кишки и легких человека (Lee et al., 2014).
Предположительно, данная миРНК может действовать
по аналогичному механизму в ходе репрограммирования.
Найдена миРНК, гомологичная miR18b мыши. Известно,
что miR18b мыши и человека локализуется в кластере
miR106a363, экспрессия которого активируется в ходе
репрограммирования (Chen et al., 2012).
Среди новых миРНК крысы, не имеющих известных
гомологов у других видов, обнаружена миРНК, локали-
Fig. 2. Gene network that includes dierentially expressed miRNAs and their experimentally conrmed target genes involved:
аstem cell maintenance; б – mesenchyme-to-epithelium transition.
а
b
The search for microRNAs involved in the self-renewal
maintaining of laboratory rat pluripotent stem cells
V.V. Sherstyuk, S.P. Medvedev, M.T. Ri
Y.V. Vyatkin, O.V. Saik, D.N. Shtokalo, S.M. Zakian
184 Cell and molecular biologyVavilov Journal of Genetics and Breeding • 2018 • 22 • 2
зованная на Xхромосоме, с высоким уровнем экспрессии
в ПСК крысы (см. рис. 3, г). Повышенный уровень экс
прессии этой миРНК наблюдается как у 5ʹ, так и 3ʹплеча.
Однако уровень экспрессии 3ʹплеча гораздо выше чем у
5ʹплеча, это показывает, что генымишени следует искать
для 3ʹплеча данной миРНК. Таким образом, на основе
результатов тотального секвенирования малых РНК нами
выделены кандидаты для дальнейшего анализа среди но
вых, ранее не аннотированных миРНК крысы.
Обсуждение
Система регуляции плюрипотентного состояния пред
ставляет собой сложную сеть взаимодействий множества
факторов, среди которых значимую роль играют некоди
рующие РНК, и в частности миРНК. В настоящее время
аннотировано около двух тысяч зрелых миРНК в геноме
мыши и почти тысяча – в геноме крысы. Использование
подходов системной биологии и биоинформатики необ
ходимо для установления потенциальных участников про
цесса поддержания плюрипотентности. В представлен
ном нами подходе можно выделить несколько основных
эта пов: 1) анализ уровня экспрессии известных миРНК;
2) поиск новых, ранее не аннотированных миРНК; 3) уста
новление дифференциальноэкспрессирующихся миРНК
между группами плюрипотентных и соматических клеток;
4) поиск потенциальных и проверенных эксперименталь
но геновмишеней дифференциальноэкспрессирующихся
миРНК; 5) анализ потенциальных и проверенных экспери
ментально геновмишеней с использованием ANDSystem
(Ivanisenko et al., 2015).
Анализ геновмишеней является одним из ключевых
моментов при изучении функций конкретных молекул
миРНК. Однако при анализе проверенных эксперимен
тально геновмишеней следует отметить следующие про
блемы. Так, для различных пар миРНК–мРНК отлича ется
методика, применяемая для экспериментального под
тверждения. Наиболее достоверными считаются ме тод
с использованием люциферазных конструкций и ана
лиз количества белка с помощью вестернблоттинга при
трансфекции миРНК (Long, Lahiri, 2011). Менее строгие
дока зательства пары миРНК–мРНК получены при анализе
транскриптомных данных, путем сравнения уровней экс
прессии либо в различных типах клеток, либо при транс
фекции миРНК в клетки и анализе изменений в экспрессии
мРНК (Thomas et al., 2010). В таких случаях влияние
миРНК может быть опосредованным. Кроме того, гены
мишени миРНК, экспериментально подтвержденные для
определенного типа клеток, могут не регулироваться этой
миРНК в другом типе клеток.
В результате проведенного нами исследования сфор
мирован список миРНКкандидатов для дальнейшей экс
периментальной проверки, которая позволит подтвердить
или опровергнуть участие данных миРНК в процессе
поддержания плюрипотентности. Одним из способов
подтверждения участия миРНК в поддержании плюри
потентности является нокаут с дальнейшим анализом
состояния клеток и экспрессии маркеров плюрипотент
ности. Современные технологии редактирования генома
позволяют провести нокаут миРНК путем внесения мута
ций в район, необходимый для процессинга миРНК, что
вызывает нарушение созревания миРНК либо удаление
кодирующей последовательности из генома (Chang et al.,
2016; Liu et al., 2016). Применение системы CRISPR/ Cas9
с двумя направляющими РНК приводит к делеции участка
генома между сайтами внесения двуцепочечных разры
вов (Essletzbichler et al., 2014). Данный подход успешно
применяется для нокаута как миРНК, так и длинных
не кодирующих РНК (Ho et al., 2015; Zhu et al., 2016).
Реа лизация этого подхода станет следующим этапом
изу чения выбранных нами миРНКкандидатов в про
цессе поддержания плюрипотентного состояния клеток
крысы.
Fig. 3. Nucleotide alignments and secondary structures of novel rat miRNAs with known mouse and human homologs:
(a) miR-302a, (b) miR-302b, (c) miR-372. (d) Secondary structure of a novel rat miRNA, which is expressed at a high level in pluripotent stem cells.
UA
A
A
U
U
UGG
G
G
U
A
A
U
UU
UU
G
C
C
C
C
G
G
G
U
U
A
A
A
A
U
C
G
G
GG
U
U
U
G
C
C
G
A
A
A
A
A
U
U
U
G
G
C
G
U
U
U
U
U
U
U
A
A
A
A
G
G
G
G
C
C
C
C
U
U
U
U
U
U
U
A
A
A
A
G
G
G
G
G
GG
GC
C
C
U
U
U
U
U
UU
U
U
U
A
A
A
AA
A
G
G
G
G
G
G
G
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
G
G
G
G
G
A
A
A
A
A
A
A
A
U
U
U
U
U
U
U U
U U
C
C
C
G
G
G
G
GG
G G
A
A
A
A
A
A
U
U
U
U
U
U
U
U
C
A
A
U
U
CG
A
U
C
C
C
C
C
C
G
G
G
G
G
A
A
A
A
A
A
A
U
U
U
U
U
U
UU
C
C
C
C
C
G
G
G
G
G
G
G
AA
A
A
A
A
U
U
U
U
U
U
U
CA
A
A
U
а
c
b
d
В.В. Шерстюк, С.П. Медведев, М.Т. Ри
Ю.В. Вяткин, О.В. Сайк, Д.Н. Штокало, С.М. Закиян
2018
22 • 2
185
Клеточная и молекулярная биология Вавиловский журнал генетики и селекции • 2018 • 22 • 2
Поиск микроРНК, участвующих в поддержании
самообновления плюрипотентных клеток крысы
Acknowledgments
This work was supported by the Russian Science Foundation,
project 161410084.
Conict of interest
The authors declare no conict of interest.
References
Agarwal V., Bell G.W., Nam J.W., Bartel D.P. Predicting effective
microRNA target sites in mammalian mRNAs. Elife. 2015;4. DOI
10.7554/eLife.05005.
An J., Zheng Y., Dann C.T. Mesenchymal to epithelial transition medi-
ated by CDH1 promotes spontaneous reprogramming of male germ-
line stem cells to pluripotency. Stem Cell Reports. 2017;8(2):446
459. DOI 10.1016/j.stemcr.2016.12.006.
Bartel D.P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions.
Cell. 2009;136(2):215233. DOI 10.1016/j.cell.2009.01.002.
Betel D., Wilson M., Gabow A., Marks D.S., Sander C. The microRNA.
org resource: targets and expression. Nucleic Acids Res. 2008;36:
D149D153. DOI 10.1093/nar/gkm995.
Buehr M., Meek S., Blair K., Yang J., Ure J., Silva J., McLay R., Hall J.,
Ying Q.L., Smith A. Capture of authentic embryonic stem cells from
rat blastocysts. Cell. 2008;135(7):12871298. DOI 10.1016/j.cell.
2008.12.007.
Calabrese J.M., Seila A.C., Yeo G.W., Sharp P.A. RNA sequence analy-
sis denes Dicer’s role in mouse embryonic stem cells. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 2007;104(46):1809718102. DOI 10.1073/pnas.
0709193104.
Cao Y., Guo W.T., Tian S., He X., Wang X.W., Liu X., Gu K.L.,
Ma X., Huang D., Hu L., Cai Y., Zhang H., Wang Y., Gao P.
miR 290/371Mbd2Myc circuit regulates glycolytic metabo-
lism to promote pluripotency. EMBO J. 2015;34(5):609623. DOI
10.15252/embj.201490441.
Chang H., Yi B., Ma R., Zhang X., Zhao H., Xi Y. CRISPR/cas9, a
novel genomic tool to knock down microRNA in vitro and in vivo.
Sci. Rep. 2016;6:22312. DOI 10.1038/srep22312.
Chen J., Wang G., Lu C., Guo X., Hong W., Kang J., Wang J. Syner-
getic cooperation of microRNAs with transcription factors in iPS
cell generation. PLoS One. 2012;7(7):e40849. DOI 10.1371/journal.
pone.0040849.
Essletzbichler P., Konopka T., Santoro F., Chen D., Gapp B.V., Kra
lo vics R., Brummelkamp T.R., Nijman S.M., Burckstummer T.
Megabasescale deletion using CRISPR/Cas9 to generate a fully
haploid human cell line. Genome Res. 2014;24(12):20592065. DOI
10.1101/gr.177220.114.
Eulalio A., Huntzinger E., Izaurralde E. Getting to the root of miRNA
mediated gene silencing. Cell. 2008;132(1):914. DOI 10.1016/j.
cell.2007.12.024.
Evans M.J., Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential
cells from mouse embryos. Nature. 1981;292(5819):154156.
Filipowicz W., Bhattacharyya S.N., Sonenberg N. Mechanisms of post
transcriptional regulation by microRNAs: are the answers in sight?
Nat. Rev. Genet. 2008;9(2):102114. DOI 10.1038/nrg2290.
Friedlander M.R., Mackowiak S.D., Li N., Chen W., Rajewsky N.
miRDeep2 accurately identies known and hundreds of novel mi-
croRNA genes in seven animal clades. Nucleic Acids Res. 2012;
40(1):3752. DOI 10.1093/nar/gkr688.
Gibbs R.A., Weinstock G.M., Metzker M.L., Muzny D.M., Soder-
gren E.J., Scherer S., Scott G., Steffen D., Worley K.C., Burch P.E.,
Okwuonu G., Hines S., Lewis L., DeRamo C., Delgado O., Du-
ganRocha S., Miner G., Morgan M., Hawes A., Gill R., Celera,
Holt R.A., Adams M.D., Amanatides P.G., BadenTillson H., Barn-
stead M., Chin S., Evans C.A., Ferriera S., Fosler C., Glodek A.,
Gu Z., Jennings D., Kraft C.L., Nguyen T., Pfannkoch C.M., Sit-
ter C., Sutton G.G., Venter J.C., Woodage T., Smith D., Lee H.M.,
Gustafson E., Cahill P., Kana A., DoucetteStamm L., Weinstock K.,
Fechtel K., Weiss R.B., Dunn D.M., Green E.D., Blakesley R.W.,
Bouffard G.G., De Jong P.J., Osoegawa K., Zhu B., Marra M.,
Schein J., Bosdet I., Fjell C., Jones S., Krzywinski M., Mathewson C.,
Siddiqui A., Wye N., McPherson J., Zhao S., Fraser C.M., Shetty J.,
Shatsman S., Geer K., Chen Y., Abramzon S., Nierman W.C., Hav-
lak P.H., Chen R., Durbin K.J., Egan A., Ren Y., Song X.Z., Li B.,
Liu Y., Qin X., Cawley S., Worley K.C., Cooney A.J., D’Souza L.M.,
Martin K., Wu J.Q., GonzalezGaray M.L., Jackson A.R., Kala-
fus K.J., McLeod M.P., Milosavljevic A., Virk D., Volkov A., Whee
ler D.A., Zhang Z., Bailey J.A., Eichler E.E., Tuzun E., Birney E.,
Mongin E., UretaVidal A., Woodwark C., Zdobnov E., Bork P.,
Suyama M., Torrents D., Alexandersson M., Trask B.J., Young J.M.,
Huang H., Wang H., Xing H., Daniels S., Gietzen D., Schmidt J.,
Stevens K., Vitt U., Wingrove J., Camara F., Alba M.M., Abril J.F.,
Guigo R., Smit A., Dubchak I., Rubin E.M., Couronne O., Polia-
kov A., Hubner N., Ganten D., Goesele C., Hummel O., Kreitler T.,
Lee Y.A., Monti J., Schulz H., Zimdahl H., Himmelbauer H.,
Lehrach H., Jacob H.J., Bromberg S., GullingsHandley J., Jen-
senSeaman M.I., Kwitek A.E., Lazar J., Pasko D., Tonellato P.J.,
Twigger S., Ponting C.P., Duarte J.M., Rice S., Goodstadt L., Beat-
son S.A., Emes R.D., Winter E.E., Webber C., Brandt P., Nyaka-
tura G., Adetobi M., Chiaromonte F., Elnitski L., Eswara P., Hardi-
son R.C., Hou M., Kolbe D., Makova K., Miller W., Nekrutenko A.,
Riemer C., Schwartz S., Taylor J., Yang S., Zhang Y., Lindpaint-
ner K., Andrews T.D., Caccamo M., Clamp M., Clarke L., Cur wen V.,
Durbin R., Eyras E., Searle S.M., Cooper G.M., Batzoglou S., Brud-
no M., Sidow A., Stone E.A., Venter J.C., Payseur B.A., Bourque G.,
LopezOtin C., Puente X.S., Chakrabarti K., Chat terji S., Dewey C.,
Pachter L., Bray N., Yap V.B., Caspi A., Tesler G., Pevzner P.A.,
Haussler D., Roskin K.M., Baertsch R., Clawson H., Furey T.S.,
Hinrichs A.S., Karolchik D., Kent W.J., Rosenbloom K.R., Trumbo
wer H., Wei rauch M., Cooper D.N., Stenson P.D., Ma B., Brent M.,
Arumugam M., Shteynberg D., Copley R.R., Taylor M.S., Rieth-
man H., Mudunuri U., Peterson J., Guyer M., Felsenfeld A., Old S.,
Mockrin S., Collins F., Rat Genome Sequencing Pro ject C. Genome
sequence of the Brown Norway rat yields insights into mammalian
evolution. Nature. 2004;428(6982):493521. DOI 10.1038/nature
02426.
GrifthsJones S., Grocock R.J., van Dongen S., Bateman A., En-
right A.J. miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomen-
clature. Nucleic Acids Res. 2006;34(Database issue):D140D144.
DOI 10.1093/nar/gkj112.
Hackenberg M., RodriguezEzpeleta N., Aransay A.M. miRanalyzer: an
update on the detection and analysis of microRNAs in highthrough-
put sequencing experiments. Nucleic Acids Res. 2011;39:W132
W138. DOI 10.1093/nar/gkr247.
Hackett J.A., Surani M.A. Regulatory principles of pluripotency: from
the ground state up. Cell Stem Cell. 2014;15(4):416430. DOI
10.1016/j.stem.2014.09.015.
Ho T.T., Zhou N., Huang J., Koirala P., Xu M., Fung R., Wu F., Mo Y.Y.
Targeting noncoding RNAs with the CRISPR/Cas9 system in hu-
man cell lines. Nucleic Acids Res. 2015;43(3):e17. DOI 10.1093/
nar/gku1198.
Hofacker I.L. Vienna RNA secondary structure server. Nucleic Acids
Res. 2003;31(13):34293431.
Hsu S.D., Lin F.M., Wu W.Y., Liang C., Huang W.C., Chan W.L.,
Tsai W.T., Chen G.Z., Lee C.J., Chiu C.M., Chien C.H., Wu M.C.,
Huang C.Y., Tsou A.P., Huang H.D. miRTarBase: a database curates
experimentally validated microRNAtarget interactions. Nucleic
Acids Res. 2011;39:D163D169. DOI 10.1093/nar/gkq1107.
Huang G., Ye S., Zhou X., Liu D., Ying Q.L. Molecular basis of embry-
onic stem cell selfrenewal: from signaling pathways to pluripotency
network. Cell Mol. Life Sci. 2015;72(9):17411757. DOI 10.1007/
s0001801518332.
Huang H.N., Chen S.Y., Hwang S.M., Yu C.C., Su M.W., Mai W.,
Wang H.W., Cheng W.C., Schuyler S.C., Ma N., Lu F.L., Lu J.
The search for microRNAs involved in the self-renewal
maintaining of laboratory rat pluripotent stem cells
V.V. Sherstyuk, S.P. Medvedev, M.T. Ri
Y.V. Vyatkin, O.V. Saik, D.N. Shtokalo, S.M. Zakian
186 Cell and molecular biologyVavilov Journal of Genetics and Breeding • 2018 • 22 • 2
miR 200c and GATA binding protein 4 regulate human embryonic
stem cell renewal and differentiation. Stem Cell Res. 2014;12(2):338
353. DOI 10.1016/j.scr.2013.11.009.
Ivanisenko V.A., Saik O.V., Ivanisenko N.V., Tiys E.S., Ivanisenko T.V.,
Demenkov P.S., Kolchanov N.A. ANDSystem: an Associative Net-
work Discovery System for automated literature mining in the eld
of biology. BMC Syst. Biol. 2015;9(2):S2. DOI 10.1186/17520509
9S2S2.
Jouneau A., Ciaudo C., Sismeiro O., Brochard V., Jouneau L., Vandor-
maelPournin S., Coppee J.Y., Zhou Q., Heard E., Antoniewski C.,
CohenTannoudji M. Naive and primed murine pluripotent stem cells
have distinct miRNA expression proles. RNA. 2012;18(2):253
264. DOI 10.1261/rna.028878.111.
Lee C.G., McCarthy S., Gruidl M., Timme C., Yeatman T.J. Micro
RNA147 induces a mesenchymaltoepithelial transition (MET) and
reverses EGFR inhibitor resistance. PLoS One. 2014;9(1):e84597.
DOI 10.1371/journal.pone.0084597.
Leonardo T.R., Schultheisz H.L., Loring J.F., Laurent L.C. The func-
tions of microRNAs in pluripotency and reprogramming. Nat. Cell
Biol. 2012;14(11):11141121. DOI 10.1038/ncb2613.
Li P., Tong C., MehrianShai R., Jia L., Wu N., Yan Y., Maxson R.E.,
Schulze E.N., Song H., Hsieh C.L., Pera M.F., Ying Q.L. Germline
competent embryonic stem cells derived from rat blastocysts. Cell.
2008;135(7):12991310. DOI 10.1016/j.cell.2008.12.006.
Liu Z., Hui Y., Shi L., Chen Z., Xu X., Chi L., Fan B., Fang Y., Liu Y.,
Ma L., Wang Y., Xiao L., Zhang Q., Jin G., Liu L., Zhang X.
Efcient CRISPR/Cas9mediated versatile, predictable, and donor
free gene knockout in human pluripotent stem cells. Stem Cell Rep.
2016;7(3):496507. DOI 10.1016/j.stemcr.2016.07.021.
Long J.M., Lahiri D.K. MicroRNA101 downregulates Alzheimer’s
amyloidbeta precursor protein levels in human cell cultures and is
differentially expressed. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2011;
404(4):889895. DOI 10.1016/j.bbrc.2010.12.053.
Martin G.R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse em-
bryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem
cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981;78(12):76347638.
PicançoCastro V., RussoCarbolante E., Reis L.C., Fraga A.M.,
de Magalhães D.A., Orellana M.D., Panepucci R.A., Pereira L.V.,
Covas D.T. Pluripotent reprogramming of broblasts by lentiviral
mediated insertion of SOX2, CMYC, and TCL1A. Stem Cells Dev.
2011;20(1):169180. DOI 10.1089/scd.2009.0424.
Quast C., Pruesse E., Yilmaz P., Gerken J., Schweer T., Yarza P., Pep
lies J., Glockner F.O. The SILVA ribosomal RNA gene database
project: improved data processing and webbased tools. Nucleic Ac-
ids Res. 2013;41:D590D596. DOI 10.1093/nar/gks1219.
Rahkonen N., Stubb A., Malonzo M., Edelman S., Emani M.R.,
Närvä E., Lähdesmäki H., RuoholaBaker H., Lahesmaa R., Lund R.
Mature Let7 miRNAs ne tune expression of LIN28B in pluripo-
tent human embryonic stem cells. Stem Cell Res. 2016;17(3):498
503. DOI 10.1016/j.scr.2016.09.025.
Robinson M.D., McCarthy D.J., Smyth G.K. edgeR: a Bioconduc-
tor package for differential expression analysis of digital gene ex-
pression data. Bioinformatics. 2010;26(1):139140. DOI 10.1093/
bioinformatics/btp616.
SamavarchiTehrani P., Golipour A., David L., Sung H.K., Beyer T.A.,
Datti A., Woltjen K., Nagy A., Wrana J.L. Functional genomics re-
veals a BMPdriven mesenchymaltoepithelial transition in the ini-
tiation of somatic cell reprogramming. Cell Stem Cell. 2010;7(1):
6477. DOI 10.1016/j.stem.2010.04.015.
Sturm M., Hackenberg M., Langenberger D., Frishman D. TargetSpy:
a supervised machine learning approach for microRNA target pre-
diction. BMC Bioinformatics. 2010;11:292. DOI 10.1186/1471
210511292.
Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from
mouse embryonic and adult broblast cultures by dened factors.
Cell. 2006;126(4):663676. DOI 10.1016/j.cell.2006.07.024.
Thomas M., Lieberman J., Lal A. Desperately seeking microRNA tar-
gets. Nat. Struct. Mol. Biol. 2010;17(10):11691174. DOI 10.1038/
nsmb.1921.
Thomson J.A., ItskovitzEldor J., Shapiro S.S., Waknitz M.A., Swier-
giel J.J., Marshall V.S., Jones J.M. Embryonic stem cell lines derived
from human blastocysts. Science. 1998;282(5391):11451147.
Vaskova E.A., Medvedev S.P., Sorokina A.E., Nemudryy A.A., Elisa-
phenko E.A., Zakharova I.S., Shevchenko A.I., Kizilova E.A., Zhe-
lezova A.I., Evshin I.S., Sharipov R.N., Minina J.M., Zhdanova N.S.,
Khegay I.I., Kolpakov F.A., Sukhikh G.T., Pokushalov E.A., Karas-
kov A.M., Vlasov V.V., Ivanova L.N., Zakian S.M. Transcriptome
characteristics and Xchromosome inactivation status in cultured
rat pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 2015;24(24):29122924.
DOI 10.1089/scd.2015.0204.
Vaskova E.A., Stekleneva A.E., Medvedev S.P., Zakian S.M. “Epigen-
etic memory” phenomenon in induced pluripotent stem cells. Acta
Naturae. 2013;5(4):1521.
Xu N., Papagiannakopoulos T., Pan G., Thomson J.A., Kosik K.S. Mi-
croRNA145 regulates OCT4, SOX2, and KLF4 and represses pluri-
potency in human embryonic stem cells. Cell. 2009;137(4):647658.
DOI 10.1016/j.cell.2009.02.038.
Yuan K., Ai W.B., Wan L.Y., Tan X., Wu J.F. The miR290295 cluster
as multifaceted players in mouse embryonic stem cells. Cell Biosci.
2017;7:38. DOI 10.1186/s1357801701662.
Yue D., Liu H., Huang Y. Survey of computational algorithms for mi-
croRNA target prediction. Curr. Genomics. 2009;10(7):478492.
DOI 10.2174/138920209789208219.
Zhao B., Yang D., Jiang J., Li J., Fan C., Huang M., Fan Y., Jin Y., Jin Y.
Genomewide mapping of miRNAs expressed in embryonic stem
cells and pluripotent stem cells generated by different reprogram-
ming strategies. BMC Genomics. 2014;15:488. DOI 10.1186/1471
216415488.
Zhu S., Li W., Liu J., Chen C.H., Liao Q., Xu P., Xu H., Xiao T., Cao Z.,
Peng J., Yuan P., Brown M., Liu X.S., Wei W. Genomescale dele-
tion screening of human long noncoding RNAs using a pairedguide
RNA CRISPRCas9 library. Nat. Biotechnol. 2016;34(12):1279
1286. DOI 10.1038/nbt.3715.
ResearchGate has not been able to resolve any citations for this publication.
Article
Full-text available
Enhanced glycolysis is a main feature of pluripotent stem cells (PSCs) and is proposed to be important for the maintenance and induction of pluripotency. The molecular mechanism underlying enhanced glycolysis in PSCs is not clear. Using Dgcr8(-/-) mouse embryonic stem cells (ESCs) that lack mature miRNAs, we found that miR-290 cluster of miRNAs stimulates glycolysis by upregulating glycolytic enzymes Pkm2 and Ldha, which are also essential for the induction of pluripotency during reprogramming. Mechanistically, we identified Mbd2, a reader for methylated CpGs, as the target of miR-290 cluster that represses glycolysis and reprogramming. Furthermore, we discovered Myc as a key target of Mbd2 that controls metabolic switch in ESCs. Importantly, we demonstrated that miR-371 cluster, a human homolog of miR-290 cluster, stimulates glycolysis to promote the reprogramming of human fibroblasts. Hence, we identified a previously unappreciated mechanism by which miR-290/371 miRNAs orchestrate epigenetic, transcriptional and metabolic networks to promote pluripotency in PSCs and during reprogramming. © 2015 The Authors.
Article
Full-text available
The CRISPR/Cas has been recently shown to be a powerful genome-editing tool in a variety of organisms. However, these studies are mainly focused on protein-coding genes. The present study aims to determine whether this technology can be applied to non-coding genes. One of the challenges for knockout of non-coding genes is that a small deletion or insertion generated by the standard CRISPR/Cas system may not necessarily lead to functional loss of a given non-coding gene because of lacking an open reading frame, especially in polyploidy human cell lines. To overcome this challenge, we adopt a selection system that allows for marker genes to integrate into the genome through homologous recombination (HR). Moreover, we construct a dual guide RNA vector that can make two cuts simultaneously at designated sites such that a large fragment can be deleted. With these approaches, we are able to successfully generate knockouts for miR-21, miR-29a, lncRNA-21A, UCA1 and AK023948 in various human cell lines. Finally, we show that the HR-mediated targeting efficiency can be further improved by suppression of the non-homologous end joining pathway. Together, these results demonstrate the feasibility of knockout for non-coding genes by the CRISPR/Cas system in human cell lines. © The Author(s) 2014. Published by Oxford University Press on behalf of Nucleic Acids Research.
Article
Full-text available
To date biomedicine and pharmacology have required generating new and more consummate models. One of the most perspective trends in this field is using induced pluripotent stem cells (iPSCs). iPSC application requires careful high-throughput analysis at the molecular, epigenetic, and functional levels. The methods used have revealed that the expression pattern of genes and microRNA, DNA methylation, as well as the set and pattern of covalent histone modifications in iPSCs, are very similar to those in embryonic stem cells. Nevertheless, iPSCs have been shown to possess some specific features that can be acquired during the reprogramming process or are remnants of epigenomes and transcriptomes of the donor tissue. These residual signatures of epigenomes and transcriptomes of the somatic tissue of origin were termed "epigenetic memory." In this review, we discuss the "epigenetic memory" phenomenon in the context of the reprogramming process, its influence on iPSC properties, and the possibilities of its application in cell technologies.
Article
Full-text available
SILVA (from Latin silva, forest, http://www.arb-silva.de) is a comprehensive web resource for up to date, quality-controlled databases of aligned ribosomal RNA (rRNA) gene sequences from the Bacteria, Archaea and Eukaryota domains and supplementary online services. The referred database release 111 (July 2012) contains 3 194 778 small subunit and 288 717 large subunit rRNA gene sequences. Since the initial description of the project, substantial new features have been introduced, including advanced quality control procedures, an improved rRNA gene aligner, online tools for probe and primer evaluation and optimized browsing, searching and downloading on the website. Furthermore, the extensively curated SILVA taxonomy and the new non-redundant SILVA datasets provide an ideal reference for high-throughput classification of data from next-generation sequencing approaches.
Article
Full-text available
microRNAs (miRNAs) are a large class of small non-coding RNAs which post-transcriptionally regulate the expression of a large fraction of all animal genes and are important in a wide range of biological processes. Recent advances in high-throughput sequencing allow miRNA detection at unprecedented sensitivity, but the computational task of accurately identifying the miRNAs in the background of sequenced RNAs remains challenging. For this purpose, we have designed miRDeep2, a substantially improved algorithm which identifies canonical and non-canonical miRNAs such as those derived from transposable elements and informs on high-confidence candidates that are detected in multiple independent samples. Analyzing data from seven animal species representing the major animal clades, miRDeep2 identified miRNAs with an accuracy of 98.6–99.9% and reported hundreds of novel miRNAs. To test the accuracy of miRDeep2, we knocked down the miRNA biogenesis pathway in a human cell line and sequenced small RNAs before and after. The vast majority of the >100 novel miRNAs expressed in this cell line were indeed specifically downregulated, validating most miRDeep2 predictions. Last, a new miRNA expression profiling routine, low time and memory usage and user-friendly interactive graphic output can make miRDeep2 useful to a wide range of researchers.
Article
This report describes the establishment directly from normal preimplantation mouse embryos of a cell line that forms teratocarcinomas when injected into mice. The pluripotency of these embryonic stem cells was demonstrated conclusively by the observation that subclonal cultures, derived from isolated single cells, can differentiate into a wide variety of cell types. Such embryonic stem cells were isolated from inner cell masses of late blastocysts cultured in medium conditioned by an established teratocarcinoma stem cell line. This suggests that such conditioned medium might contain a growth factor that stimulates the proliferation or inhibits the differentiation of normal pluripotent embryonic cells, or both. This method of obtaining embryonic stem cells makes feasible the isolation of pluripotent cells lines from various types of noninbred embryo, including those carrying mutant genes. The availability of such cell lines should made possible new approaches to the study of early mammalian development.
Article
Summary: It is expected that emerging digital gene expression (DGE) technologies will overtake microarray technologies in the near future for many functional genomics applications. One of the fundamental data analysis tasks, especially for gene expression studies, involves determining whether there is evidence that counts for a transcript or exon are significantly different across experimental conditions. edgeR is a Bioconductor software package for examining differential expression of replicated count data. An overdispersed Poisson model is used to account for both biological and technical variability. Empirical Bayes methods are used to moderate the degree of overdispersion across transcripts, improving the reliability of inference. The methodology can be used even with the most minimal levels of replication, provided at least one phenotype or experimental condition is replicated. The software may have other applications beyond sequencing data, such as proteome peptide count data.Availability: The package is freely available under the LGPL licence from the Bioconductor web site (http://bioconductor.org).Contact: mrobinson@wehi.edu.au
Article
Embryonic stem cells (ESCs) can be maintained in culture indefinitely while retaining the capacity to generate any type of cell in the body, and therefore not only hold great promise for tissue repair and regeneration, but also provide a powerful tool for modeling human disease and understanding biological development. In order to fulfill the full potential of ESCs, it is critical to understand how ESC fate, whether to self-renew or to differentiate into specialized cells, is regulated. On the molecular level, ESC fate is controlled by the intracellular transcriptional regulatory networks that respond to various extrinsic signaling stimuli. In this review, we discuss and compare important signaling pathways in the self-renewal and differentiation of mouse, rat, and human ESCs with an emphasis on how these pathways integrate into ESC-specific transcription circuitries. This will be beneficial for understanding the common and conserved mechanisms that govern self-renewal, and for developing novel culture conditions that support ESC derivation and maintenance.