Detección de una proteína asociada a la enfermedad de la necrosis hepatopancreatica aguda (AHPND) en Litopenaeus vannamei bajo cultivo semi-intensivo en Ecuador

Abstract

La presente investigación tuvo como objetivo detectar una proteína asociada a la necrosis hepatopancreática aguda (AHPND), en cultivos semi-intensivos en Ecuador. Se recolectaron camarones enfermos de tres camaroneras en la zona de Bellavista, provincia El Oro. Los hepatopáncreas fueron macerados y cultivados en medio TCBS y subcultivos en TSA y caldo LB. De las cepas bacterianas obtenidas, se extrajo las proteínas usando un kit comercial y se separaron mediante migración en gel SDS-PAGE. Estas fueron analizadas con un espectrómetro de masas MALDI TOF/TOF. La confirmación de las cepas se realizó mediante PCR utilizando cebadores TUMSAT-Vp3, que son específicos para detectar AHPND. Una de las cepas tuvo secuencias peptídicas similares a la de la proteína PirvpB, causante de AHPND, y fue identificada como perteneciente a Vibrio parahaemolyticus y portadora del gen que codifica PirvpB, por tanto, positiva para AHPND. Los resultados mostraron que es posible usar la espectrometría de masas MALDI TOF/TOF en la detección de proteínas asociadas a AHPND en el cultivo de camarón.

Full text

328
Rev Inv Vet Perú 2018; 29(1): 328-338
http://dx.doi.org/10.15381/rivep.v29i1.14194
1 Facultad de Ingeniería Pesquera y Ciencias del Mar, Universidad Nacional de Tumbes, Puerto Pizarro,
Tumbes, Perú
2 E-mail: aordinolaz@untumbes.edu.pe
Recibido: 15 de junio de 2017
Aceptado para publicación: 3 de noviembre de 2017
Detección de una proteína asociada a la enfermedad de la
necrosis hepatopancreática aguda (AHPND) en Litopenaeus
vannamei bajo cultivo semi-intensivo en Ecuador
DETECTION OF A PROTEIN ASSOCIATED WITH ACUTE HEPATOPANCREATIC NECROSIS DISEASE
(AHPND) IN Litopenaeus vannamei UNDER SEMI-INTENSIVE
FARMING IN ECUADOR
Katherine Yuliana Saavedra-Olivos1, Tessy Peralta-Ortiz1,
Alberto Ordinola-Zapata1,2, John Estuardo Sandoval-Ramayoni1,
Enedia Graciela Vieyra-Peña1, Marco Antonio Zapata-Cruz1,
Auberto Hidalgo-Mogollón1, Braulio Morán-Ávila1,
Oscar Augusto Mendoza-Neyra1, Magno Ego Mendoza-Dioses1,
Sigrid Yamile Campoverde-Peña1
RESUMEN
La presente investigación tuvo como objetivo detectar una proteína asociada a la
necrosis hepatopancreática aguda (AHPND), en cultivos semi-intensivos en Ecuador.
Se recolectaron camarones enfermos de tres camaroneras en la zona de Bellavista, pro-
vincia El Oro. Los hepatopáncreas fueron macerados y cultivados en medio TCBS y
subcultivos en TSA y caldo LB. De las cepas bacterianas obtenidas, se extrajo las
proteínas usando un kit comercial y se separaron mediante migración en gel SDS-PAGE.
Estas fueron analizadas con un espectrómetro de masas MALDI TOF/TOF. La confirma-
ción de las cepas se realizó mediante PCR utilizando cebadores TUMSAT-Vp3, que son
específicos para detectar AHPND. Una de las cepas tuvo secuencias peptídicas simila-
res a la de la proteína PirvpB, causante de AHPND, y fue identificada como perteneciente
a Vibrio parahaemolyticus y portadora del gen que codifica PirvpB. Los resultados
mostraron que es posible usar la espectrometría de masas MALDI TOF/TOF en la detec-
ción de proteínas asociadas a AHPND en el cultivo de camarón.
Palabras clave: camarón; AHPND; Litopenaeus vannamei; síndrome de mortalidad
precoz; Vibrio parahaemolyticus; PirvpB

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Detección de una proteína asociada a AHPND en cultivo de L. vannamei en Ecuador
ABSTRACT
The present study aimed to detect a protein associated with acute hepatopancreatic
necrosis (AHPND) by mass spectrometry, reared under semi-intensive farming in Ecua-
dor. Sick shrimps from three farms were collected in the Bellavista area in the El Oro
province. The hepatopancreas were macerated and cultured in TCBS medium and
subcultured in TSA and LB broth. In the bacterial strains obtained, the proteins were
extracted using a commercial kit and separated by SDS-PAGE gel migration. These were
analyzed with a MALDI TOF/TOF mass spectrometer. The confirmation of the strains
was performed by PCR using TUMSAT-Vp3 primers, which are specific for detecting
AHPND. One of the strains had peptide sequences similar to that of the PirvpB protein
causing AHPND, and was identified as belonging to Vibrio parahaemolyticus and
carrying the gene coding for PirvpB. The results showed that it is possible to use MALDI
TOF/TOF mass spectrometry in the detection of AHPND-associated proteins in shrimp
culture.
Key words: shrimp; AHPND; Litopenaus vannamei; early mortality syndrome; Vibrio
parahaemolitycus; PirvpB
INTRODUCCIÓN
La necrosis hepatopancreática aguda
(AHPND), llamada también síndrome de
mortalidad precoz (EMS), es una enferme-
dad que ocasiona grandes pérdidas económi-
cas en el cultivo de camarones; tanto del ca-
marón blanco (Litopenaeus vannamei)
como del camarón tigre (Penaeus monodon)
(De la Peña et al., 2015). Esta enfermedad
es atribuida a una cepa de Vibrio parahae-
molyticus que alberga el plásmido pVPA3-1
o pVA1 de 70 kpb (Lee et al., 2015), que
contiene genes codificantes de toxinas
binarias tipo Photorhabdus insect related
(Pir): PirvpA y PirvpB, que inducen la muerte
celular (Otta et al., 2014; Soto-Rodríguez et
al., 2015).
La AHPND se caracteriza por una se-
vera atrofia del hepatopáncreas, que se mues-
tra de un color pálido o blanco con manchas
o rayas negras, desprendimiento masivo de
células epiteliales de los túbulos; así como
letargia, exoesqueleto blando, crecimiento len-
to, estómago e intestino semi vacío (Flegel,
2012; Tran et al., 2013; Otta et al., 2014;
Hong et al., 2016).
La enfermedad afecta principalmente en
los estanques de cultivo a las pos-larvas de
camarones en los primeros 30 días después
de la siembra (Flegel, 2012; Otta et al., 2014).
Los primeros episodios de mortalidad causa-
dos por AHPND fueron reportados en China
en 2009, pasando a Vietnam (2010), Malasia
(2011), Tailandia y Filipinas (2012), llegando
a América en 2013, afectando cultivos en
México (Nunan et al., 2014; De la Peña et
al., 2015; Arunrut et al., 2016; Thitamadee
et al., 2016). No existen reportes de AHPND
en Ecuador ni en Sudamérica, pero se sospe-
cha que puede estar presente en varios paí-
ses de Asia, Latinoamérica y El Caribe en
los que aún no ha sido reportado (Bondad-
Reantaso, 2016).
Existen diversas técnicas para la detec-
ción de la AHPND, tales como el análisis
histopatológico, la hibridación in situ y la re-
acción de la cadena de la polimerasa (PCR),
dirigida esta última a los genes que codifican
a las toxinas PirvpA y Pirvp B de Vibrio
parahaemolyticus (Tinwongger et al., 2014;
Han et al., 2015; Lee et al., 2015; Sirikharin
et al., 2015).

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K. Saavedra et al.
Una herramienta que podría ser utiliza-
da para la detección de esta enfermedad es
la espectrometría de masas que permite el
análisis de proteínas características del pa-
tógeno. Esta técnica tiene la ventaja de po-
der detectar cantidades muy pequeñas de
péptidos, incluso al nivel de attomoles
(Hillenkamp et al., 1991; Vorm et al., 1994;
Singhal et al., 2015). Entre las técnicas de
espectrometría de masas (MS), la ionización/
desorción láser asistida por matriz en tiempo
de vuelo (MALDI TOF) ha mostrado mayo-
res ventajas dada su alta sensibilidad, tole-
rancia a buffers y rápida adquisición de da-
tos, además de una instrumentación sencilla
(Vorm et al., 1994); por lo que podría ser
utilizada en la identificación rápida del pató-
geno causante de la AHPND. Para lograr
esto, sería necesario determinar las proteí-
nas características del patógeno que podrían
ser detectadas con esta técnica.
Debido a que han habido últimamente
eventos de gran mortalidad en ciertos culti-
vos de camarón en Ecuador, donde algunos
camarones mostraron signos similares al
AHPND, se realizó la presente investigación
con el objetivo de evaluar si la técnica de
espectrometría de masas MALDI TOF-TOF
podría detectar proteínas asociadas a un po-
sible caso de AHPND en los cultivos de ca-
marón afectados, para de esta manera tener
una nueva técnica diagnóstica rápida y pre-
cisa para la detección de la enfermedad.
MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención de Muestras
La recolección de camarones se reali-
zó entre abril y octubre de 2016, en tres em-
presas camaroneras que reportaron mortali-
dades en sus cultivos y que se hallan ubica-
das en la zona de Bellavista del cantón Santa
Rosa en la provincia de El Oro, Ecuador (Fi-
gura 1). Se recolectaron 150 camarones de
1 a 9 g, que fueron transportados vivos en
bolsas plásticas al Laboratorio de Biología
Molecular de la Facultad de Ingeniería
Pesquera y Ciencias del Mar de la Universi-
dad Nacional de Tumbes, ubicado en la re-
gión Tumbes (Perú).
Cultivos Bacterianos
Se extrajo el hepatopáncreas de los ca-
marones, en forma aséptica, y se colocaron
en tubos de 1.5 ml (Axygen) conteniendo 500
µl de solución salina al 2%, donde fueron
macerados. Se tomó 20 µl del macerado y se
sembró en placas petri (Normax) contenien-
do medio tiosulfato citrato bilis sucrosa
(TCBS) (Merck) ajustado al 2% de NaCl
(Merck). Todas las placas fueron incubadas
a 37 °C durante 24 h. Las colonias bacterianas
no fermentadoras de sucrosa (de color ver-
de) que crecieron en el medio fueron sub-
cultivadas en agar tripticasa de soya (TSA)
(Oxoid) hasta obtener aislados puros. Poste-
riormente, las cepas bacterianas puras se
suspendieron de manera independiente en 1
ml de caldo Luria Bertani (LB) (Invitrogen)
ajustado al 2% de NaCl (Merck) y se incu-
baron a 37 °C durante 24 h.
Extracción de Proteínas Bacterianas
Se tomó 1 ml de caldo LB de cada uno
de los cultivos puros y las proteínas se extra-
jeron con el kit comercial Qproteome
Bacterial Protein Prep Kit (Qiagen) siguien-
do las especificaciones del fabricante. El
sobrenadante conteniendo las fracciones de
proteínas solubles fue teñido con buffer de
carga (0.125 M de Tris (Promega) pH 6.8;
4% de dodecil sulfato de sodio SDS (Merck),
20% de glicerol (Merck), 0.02% de azul de
bromofenol (Sigma-Aldrich), 0.2 M de DTT
(OmniPlus) y agua grado HPLC (Merck) e
incubado a 95 °C durante 5 min.
Se preparó gel de poliacrilamida, con-
formado por un gel separador al 15%, el cual
se preparó con 3.4 ml de agua bidestilada,
7.5 ml de mix de acrilamida al 30% (29.2%
de acrilamida [AppliChem], 0.8% de bis-
acrilamida [AppliChem] y agua bi-destilada),
3.8 ml de Tris (Promega) 1.5 M pH 8.8, 0.15

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Detección de una proteína asociada a AHPND en cultivo de L. vannamei en Ecuador
Figura 1. Ubicación del Cantón Santa Rosa (El Oro, Ecuador), donde se presentaron mortali-
dades en cultivos de camarones
ml de SDS (Merck) al 10%, 0.075 ml de
persulfato de amonio (APS) (AppliChem) al
10% y 0.0075 ml de TEMED (AppliChem);
además de un gel de alineamiento
(concentrador), preparado con 3.4 ml de agua
bi-destilada, 0.83 ml de mix de acrilamida al
30%, 0.63 ml de Tris 1 M pH 6.8, 0.05 ml de
SDS al 10%, 0.05 ml de APS al 10% y 0.005
ml de TEMED. Como tampón de migración
se utilizó TANK 1X el cual se diluyó a partir
de TANK 5X (0.124 M de Tris [Promega],
0.96M de glicina [Sigma-Aldrich], 0.5% de
SDS [Merck] y agua bidestilada [Merck]).
La separación de proteínas se realizó por
migración electroforética a 90 V durante 3 h
en el gel SDS-PAGE al 15%.
Las bandas presentes en el gel SDS-
PAGE se sometieron por 30 min a una solu-
ción de fijación conteniendo 50% de metanol
(Merck), 10% de ácido acético (Merck) y
40% de agua grado HPLC. Luego, el gel fue
colocado toda la noche en solución de tinción
conteniendo 50% de metanol, 10% de ácido
acético, 0.1% de azul de coomassie R-250 y
agua grado HPLC. Finalmente fueron deco-
loradas con solución de lavado conteniendo
45% de metanol (Merck), 10% de ácido acé-
tico (Spectrum) y 45% de agua grado HPLC
(Merck).
Recuperación y Digestión de Proteínas
La digestión de proteínas se realizó si-
guiendo el procedimiento descrito por
Shevchenko et al. (2006) modificado, donde
las proteínas de interés que migraron en el
gel SDS-PAGE fueron recuperadas cortan-
do con un bisturí estéril las secciones del gel
que las contenían. Estas secciones fueron
decoloradas en 50 µl de bicarbonato de amonio
(NH4HCO3) (Sigma-Aldrich) 100 mM y 50 µl
de acetonitrilo (Merck) e incubadas a 37 °C
durante 30 min, agitando ocasionalmente.
Luego fueron deshidratadas con 100 µl de
acetonitrilo absoluto e incubadas a tempera-
tura ambiente durante 30 min; para poste-
riormente ser tratadas con 30 µl de buffer de
digestión (13 ng/µl de tripsina [Promega],
50 mM de NH4HCO3, pH 8.0) e incubadas a
4 °C durante 2 h. Finalmente, se volvió a in-
cubar a 37 °C durante 18 h.
Identificación de Proteínas
Las muestras digeridas fueron mezcla-
das con 1 µl de matriz ácido α-ciano-4-hidroxi-
cinámico (CHCA) a concentración de 10 mg/ml
en 0.1% de ácido trifluroacético y 50% de
acetonitrilo (ACN) y depositadas sobre una
placa MALDI AB SCIEX. Los espectros de

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masa fueron adquiridos usando un espectró-
metro de masas MALDI-TOF/TOF ABI
SCIEX TOF/TOF TM 5800 SYSTEM (AB
Sciex, EEUU) en modo reflectrón (1 kV) con
un promedio de 750 disparos del láser, anali-
zándose un rango de masas de 400 a 4000
Da. La calibración previa se realizó usando
el kit de calibración del instrumento AB
SCIEX TOF/TOF, siguiendo las indicaciones
del fabricante.
Se seleccionaron como iones precurso-
res para la fragmentación aquellos con razón
masa/carga (m/z) de 2287.0730 y 2286.9246.
Las secuencias obtenidas en la fragmenta-
ción fueron procesadas a través del software
Protein Pilot (AB Sciex, EEUU), utilizando
para ello bases de datos de proteínas relacio-
nadas a AHPND disponibles en el sitio web
de Uniprot (http://www.uniprot.org). Dichas
secuencias también fueron analizadas con la
base de datos de proteínas del National Center
for Biotechnology Information (NCBI) (http:/
/b la st .n cb i .n lm . n i h. go v/B la st .c gi ?
PAGE=Proteins), mediante la herramienta
Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)
(Altschul et al., 1997).
Extracción de ADN de Cepas Bacte-
rianas
Se centrifugó 1 ml de la suspensión
bacteriana a 15 493 g durante 10 min, se eli-
minó el sobrenadante y se realizaron lavados
con solución salina al 2%. Para la lisis celular
se adicionó el buffer TENS (50 mM de Tris-
HCl [Promega], 50 mM de EDTA
[AppliChem], 100 mM de NaCl [Merck], 1%
de SDS [Merck]) y 5 µl de proteinasa K
(Merck) (20 mg/ml). Luego se incubó a 55 °C
durante 2 h. Posteriormente, se adicionaron
300 µl de fenol (Applichem), 288 µl de cloro-
formo (Merck) y 12 de alcohol isoamil
(Merck) (25:24:1), se homogenizó y se
centrifugó a 15 493 g durante 10 min. Se re-
cuperó 300 µl del sobrenadante en un nuevo
tubo de 1.5 ml y se adicionó solución de clo-
roformo y alcohol isoamil (24:1) en igual pro-
porción que el sobrenadante recuperado. Se-
guidamente se centrifugó a 1493 g durante
10 min. El sobrenadante fue transferido en
un tubo nuevo y se le adicionó el doble de su
volumen de etanol (Spectrum) al 95% y se
centrifugó a 15 493 g durante 10 min. Se eli-
minó el sobrenadante y el pellet fue lavado
con 1 ml de etanol al 75% centrifugándose a
9167 g durante 10 min. El sobrenadante fue
eliminado y el ADN sedimentado se dejó se-
car a temperatura ambiente. Finalmente, se
resuspendió en 50 µl de TE (10 mM Tris
[Promega] y 1 mM EDTA [Applichen]).
Identificación de Cepas Bacterianas
mediante ARNr 16S
El ADN de las cepas puras fue utiliza-
do para realizar la PCR con los cebadores
ARNr 16S para bacterias: w001 (5´-
AGAGTTTGATYMTGGCTCAG-3´) y
w002 (5´-GNTACCTTGTTACGACTT-3´)
que amplifican un producto de 1500 pares de
bases (pb) (Godon et al., 1997). El volumen
de reacción fue de 25 µl: 12.5 µl de PCR
Master Mix 2X, 10.5 µl de agua (Thermo
Scientific), 0.5 µl de cada cebador (0.4 pmol/µl)
y 1 µl de ADN. Se consideró como control
negativo agua estéril y como control positivo
el ADN de una cepa bacteriana aislada del
camarón previamente identificada.
Las condiciones de amplificación fue-
ron: desnaturalización inicial a 94 °C durante
3 min, seguido de 35 ciclos de
desnaturalización a 95 °C durante 30 s, ali-
neamiento a 55 °C durante 45 s, extensión a
72 °C durante 5 min, seguidos de un ciclo
final de extensión final a 72 °C durante 5 min.
Las reacciones de PCR fueron realizadas en
un termociclador de 24 pozos Piko™ series
(Thermo Scientific, EEUU). Los productos
amplificados fueron visualizados mediante
electroforesis en un gel de agarosa al 1.5%
teñido previamente con 3 µl de bromuro de
etidio a una concentración de 10 mg/ml.
La secuenciación la realizó la Empresa
Macrogen (Maryland, EEUU), empleándose
15 µl del producto de la PCR y los cebadores
universales para bacterias F518 (5´-
CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3´) y

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Detección de una proteína asociada a AHPND en cultivo de L. vannamei en Ecuador
R800 (5´-TACCAGGGTATCTAATCC -3´)
(Lane, 1991). Las secuencias obtenidas fue-
ron editadas y alineadas en el programa
informático MEGA v. 5. Para determinar la
afiliación filogenética se realizaron búsque-
das de similitud utilizando el programa BLAST
(Altschul et al., 1997).
Diagnóstico de AHPND mediante PCR
Las mismas cepas bacterianas fueron
sometidas a PCR con cebadores específicos
para la detección de la AHPND: TUMSAT-
Vp3 F (5´-GTGTTGCATAATTTTGTGCA-3´)
y TUMSAT-Vp3 R (5´-TTGTACAGA-
AACCACGACT-3´) que amplifican un pro-
ducto de 360 pb (Tinwongger et al., 2014).
Las condiciones de amplificación fueron:
desnaturalización inicial a 95 °C durante 2
min, 30 ciclos de desnaturalización 95 °C du-
rante 30 s, alineamiento a 56 °C durante 30 s
y elongación a 72 °C durante 30 s, seguido
de una extensión final a 72 °C durante 5 min.
Los productos amplificados fueron
visualizados en un gel de agarosa al 1.5 %
teñido con 3 µl de bromuro de etidio a una
concentración de 10 mg/ml. La secuenciación
la realizó la empresa Macrogen (Maryland,
EEUU), con los mismos cebadores de ampli-
ficación de los fragmentos para AHPND, y
la búsqueda de similitud se hizo con el pro-
grama BLAST.
Figura 2. Migración en electroforesis de gel de agarosa de fragmentos amplificados para la
detección de cepas de V. parahaemolyticus causante de AHPND. Los carriles de-
signados 114, 115 y 116 corresponden a diferente cepas bacterianas. Ce es el control
de extracción y MPM es el marcador de peso molecular. Las puntas de flecha seña-
lan bandas luminosas en los carriles 114 y 116 (correspondientes a muestras obtenidas
de una misma cepa), que indican un producto de amplificación de aproximadamente
360 pb, compatible con muestras positivas para AHPND

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K. Saavedra et al.
Fgura 3. Espectros de masas en el rango masa/carga de 400 a 4000 de proteínas de la cepa
bacterianas 116 de V. parahaemolyticus, analizadas por duplicado (Figuras 3A y 3B).
Las flechas señalan los picos de detección cercanos a 2287 Da, que sirvieron como
iones precursores en el análisis MS/MS
RESULTADOS
Del cultivo realizado en medio TCBS a
partir de muestras de hepatopáncreas de L.
vannamei con signos clínicos de AHPND se
aislaron 25 cepas no fermentadoras de saca-
rosa, que mediante caracterización molecular
por el ARNr 16S se identificaron como espe-
cies del género Vibrio, entre ellas V.
parahaemolyticus y V. alginolyticus.
De las 25 cepas bacterianas caracteri-
zadas mediante el análisis de un fragmento
del gen ARNr 16S, dos de ellas resultaron
positivas al ser amplificadas con los
cebadores TUMSAT-Vp3 específicos para
AHPND, originando un fragmento de ADN
del tamaño esperado (360 pb) (Figura 2).
Estas cepas fueron aisladas a partir de un
camarón de cerca de 1 g de peso. El alinea-
miento y posterior análisis en Blast indicó gran
similitud (99%) de la secuencia en estudio,

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Detección de una proteína asociada a AHPND en cultivo de L. vannamei en Ecuador
con la secuencia de V. parahaemolyticus
strain V.03 hypothetical protein, PirA-like
toxin, and PirB-like toxin genes, complete cds.
En la Figura 3 se muestra el perfil de
espectro de masas de las proteínas en el ran-
go aproximado de 400 a 4000 Da de una cepa
bacteriana positiva a AHPND mediante PCR,
el cual fue utilizado para seleccionar iones
con razón masa/carga (m/z) de 2287.0730 y
2286.9246 como iones precursores y frag-
mentados. Las secuencias peptídicas obteni-
das para los fragmentos fueron analizadas
con el software Protein Pilot, detectándose
varios fragmentos similares a la proteína
PirvpB de V. parahaemolyticus, en particu-
lar la secuencia aminoacídica TNEYVVT-
MSSLTEFNPNNAR, obtenida al analizar los
péptidos de la cepa investigada. Estas tuvie-
ron un nivel de confianza del 85% al ser com-
paradas con la secuencia JHE-Like toxin
PirB-like OS=V. parahaemolyticus de las
bases de datos Toxin Shrimp y AHPND de
Uniprot.
DISCUSIÓN
En esta investigación se detectó una
cepa bacteriana asociada a mortalidades de
camarón en cultivo en Ecuador, que fue iden-
tificada como correspondiente a V.
parahaemolyticus. En ella, además, se pudo
aislar un fragmento peptídico correspondien-
te a la proteína PirvpB. El análisis de PCR y
la posterior secuenciación también demostra-
ron que las cepas (incluyendo la anteriormen-
te mencionada) presentaron los genes de las
toxinas tipo PirvpA y PirvpB, características
de cepas causante de AHPND (Otta et al.,
2014; Han et al., 2015; Soto-Rodríguez et al.,
2015).
Se empleó la espectrometría de masas
como criterio diagnóstico para la AHPND tal
como también lo hicieron Han et al. (2015),
quienes lograron detectar proteínas Pirvp,
mostrando la utilidad de dicha técnica para
identificar las toxinas de la AHPND. Esta
técnica viene siendo utilizada con mayor fre-
cuencia para la detección de Vibrio en mues-
tras humanas en hospitales (Dieckmann et
al., 2010) por lo que debe ser considerada
como una técnica muy prometedora para
diagnóstico rápido, preciso y altamente sen-
sible (Hillenkamp et al., 1991; Vorm et al.,
1994; Shevchenko et al., 1996).
Asimismo, se confirmó por PCR que la
cepa mencionada portaba el plásmido con los
genes que codifican para las toxinas causan-
tes de AHPND. La detección de una secuen-
cia correspondiente al plásmido por PCR es
confiable, pues se utilizaron los cebadores de
TUMSAT-Vp3, en los cuales se ha reporta-
do hasta 100% de precisión al evitar falsos
positivos (Tinwongger et al., 2014).
A nivel de Latinoamérica AHPND ha
sido reportada solo en México (Nunan et al.,
2014; Soto-Rodríguez et al., 2015), realizán-
dose la detección mediant e técnicas
histológicas y PCR; así mismo, Restrepo et
al. (2016), valiéndose de análisis genómicos,
reportan una cepa patogénica de V.
paraha emoly ticus en camarones de
Sudamérica con síntomas de AHPND. En la
presente investigación se pudo lograr la iden-
tificación de una proteína asociada a AHPND
en Ecuador usando espectrometría de ma-
sas, la cual fue confirmada con la identifica-
ci ón de la cepa bacteriana mediante
secuenciación de un fragmento del gen ARNr
16S y de un fragmento del gen codificador
de la toxina PirVpB mediante PCR, lo que in-
dica que las cepas encontradas pueden origi-
nar AHPND.
Sería recomendable que se mantenga
una vigilancia sanitaria adecuada en los culti-
vos de camarón en Ecuador, para determinar
si existen posibles casos de presencia de
AHPND en los mismos o si lo encontrado en
esta investigación se trata de un caso aislado.

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K. Saavedra et al.
CONCLUSIONES
Se logró detectar, mediante MS MALDI
TOF/TOF, la secuencia peptídica
TNEYVVTMSSLTEFNPNNAR aso-
ciada a la toxina PirvpB causante de
AHPND.
Mediante MS MALDI TOF/TOF y
PCR se ha detectado por primera vez la
proteína PirvpB en una cepa bacteriana
aislada de camarones cultivados en
Ecuador.
Agradecimientos
Se agradece a los empresarios camaro-
neros de la zona de Bellavista (Ecuador) que
proporcionaron las muestras para esta inves-
tigación, al Círculo de Estudiantes de la
FIPCM (Universidad Nacional de Tumbes,
Perú) por el apoyo en el procesamiento de
las muestras y al Laboratorio Costero Tum-
bes del Instituto del Mar del Perú (IMARPE).
LITERATURA CITADA
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