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Biotestbatterie… …volle Breitseite beim toxikologischen Effektnachweis

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  • Landesamt für Natur Umwelt und Verbraucherschutz NRW

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Die klassische instrumentelle Analytik kann gezielt Einzelstoffe im Wasser detektieren. Eine Aussage über die Wirkung aller im Wasser vorkommenden Stoffe als Ganzes ist damit jedoch nicht möglich. Biotestbatterien, als Instrument der wirkungsbezogenen Analytik, erlauben durch den Einsatz verschiedener Bioassays letztendlich eine differenzierte Beurteilung der Toxizität von Wasserproben. Dabei bildet jeder einzelne Bioassay summarisch biologische Wirkungen ab, so dass ebenfalls Aussagen über bspw. Mischungstoxizitäten möglich werden.
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Originalbeiträge
24. Jahrg. 2018/ Nr.1 Mitt Umweltchem Ökotox
Biotestbatterie…
…volle Breitseite beim toxikologischen Effektnachweis
Anne Simon (a.simon@iww-online.de), Elke Dopp (e.dopp@iww-online.de)
IWW Rheinisch-Westfälisches Institut für Wasserforschung gGmbH
Abstract
Die klassische instrumentelle Analytik kann gezielt Einzelstoffe
im Wasser detektieren. Eine Aussage über die Wirkung aller im
Wasser vorkommenden Stoffe als Ganzes ist damit jedoch
nicht möglich. Biotestbatterien, als Instrument der wirkungs-
bezogenen Analytik, erlauben durch den Einsatz verschie-
dener Bioassays letztendlich eine differenzierte Beurteilung der
Toxizität von Wasserproben. Dabei bildet jeder einzelne
Bioassay summarisch biologische Wirkungen ab, so dass
ebenfalls Aussagen über bspw. Mischungstoxizitäten möglich
werden.
Hintergrund
Mehr als 137 Millionen organische und anorganische
Substanzen wurden bis Anfang 2018 beim Chemical Abstracts
Service, einer Unterabteilung der American Chemical Society,
katalogisiert (https://www.cas.org/31.01.2018), von denen
mehrere Millionen kommerziell verfügbar sind. Während in
einer gewöhnlichen Umweltprobe einige Tausend dieser
Substanzen detektierbar sind, umfasst ein typisches
Monitoringprogramm routinemäßig zwischen 10 und 100
Einzelsubstanzen (European Commission, 2013). Diese
Identifizierung und Quantifizierung von Stoffen in wässrigen
Systemen dient in der Regel einer Zustands- oder Prozess-
bewertung. Da die chemische Analytik jedoch nur einen Bruch-
teil der potentiell im Wasser vorkommenden Mikroschadstoffe
untersuchen kann, müssen Stoffe ebenfalls hinsichtlich ihrer
Wirkungen charakterisiert werden. Zudem muss ein Ansatz zur
Reduzierung der Komplexität geschaffen werden, der gleich-
zeitig die Möglichkeiten beschränkt, dass Substanzen, die
tatsächlich ein Risiko beherbergen oder Effekte verursachen,
übersehen werden (Brack et al. 2016). Die wirkungsbezogene
Analytik (WBA) stellt einen solchen Ansatz dar, der die bis-
herige Herangehensweise umkehrt. Anstatt eine möglichst um-
fassende chemische Analytik von Wasserproben durchzu-
führen, werden bioanalytische Methoden in Form von zell-
basierten Bioassays und/oder organismischen Tests, eine
sogenannte Biotestbatterie, zur Wirkungscharakterisierung
vorangestellt. Dies kann an nativen Wasserproben und zu-
sätzlich an angereicherten Proben geschehen. Dabei sind
Prozesskontrollen bei der Anreicherung unbedingt erforderlich,
um falsch positive Aussagen in den Bioassays zu vermeiden.
Jeder einzelne Bioassay bildet summarisch biologische
Wirkungen ab, wie zum Beispiel Zytotoxizität, Gentoxizität,
oder endokrine Wirkungen über rezeptorgebundene Mecha-
nismen. Werden signifikante Effekte in den Bioassays
festgestellt, so erfolgt eine sequentielle Reduzierung der
Komplexität der Probe durch Fraktionierung, erneute Durch-
führung der Biotests und Eliminierung der Fraktionen mit
geringer oder keiner biologischen Aktivität (Brack et al. 2016).
Im Optimalfall gelingt es, die toxische Fraktion zu isolieren und
den für die gemessene Wirkung verantwortlichen Schadstoff
mittels instrumenteller Analytik zu identifizieren (Abbildung 1).
Abb. 1 Allgemeines Schema der wirkungsbezogenen
Analytik (WBA) nach Brack et al. 2016.
Aus biologischer Sicht stellt die Zusammenstellung der Bio-
tests eine große Herausforderung dar. Der Schlüssel jeder
wirkungsbezogenen Studie ist die gezielte Formulierung des
Problems und erfolgt aus der Integration allen relevanten
Wissens aller Beteiligten (z.B. Wissenschaft, Behörden,
Industrie). Die Biotestbatterie ist somit konzipiert als ein Instru-
ment zur WBA, das am Ende eine differenzierte Beurteilung
der Toxizität von Wasserproben erlaubt. Zur umfassenden
Zustandsbewertung von Gewässern sollte in jedem Fall eine
Kombination verschiedener Wirkungstests herangezogen
werden, die dem Konzept des Adverse Outcome Pathway
(AOP) folgen (Ankley et al. 2010). Der Grundgedanke des
AOP-Konzepts liegt darin begründet, dass eine Kaskade
zellulärer Ereignisse sequentiell negative Auswirkungen auf
der Ebene der Individuen, auf ganze Populationen und schließ-
lich auf das Ökosystem auslösen kann (Abbildung 2).
Der zelluläre Toxizitätspfad (in vitro) beginnt mit Ereignissen
auf molekularer Ebene durch Interaktion einer Chemikalie mit
einem biologischen Ziel, gefolgt von zellulären Reaktionen, bis
hin zu Abwehr-/Reparaturmechanismen. Erst wenn die Abwehr
versagt, stirbt die Zelle, was letztendlich über die Zytotoxizität
bestimmt werden kann.
Bei der in vivo Testung (Organismentests) sollten mehrere
Trophieebenen untersucht werden, angefangen von Primär-
produzenten wie der Grünalge und der Wasserlinse über
Invertebraten bis hin zu Fischen bzw. Fischembryonen.
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Originalbeiträge
Mitt Umweltchem Ökotox 24. Jahrg. 2018/ Nr. 1
Abb. 2 Schlüsselereignisse des Adverse Outcome Pathway
(AOP) Konzept, modifiziert nach Brack et al. 2016.
In jedem Fall sollten mehrere Tests auf unspezifische Toxizität
und spezifische Wirkungen für die umfassende Zustands-
bewertung von Wasserproben für die Biotestbatterie heran-
gezogen werden. Optimaler Weise liefert die Biotestbatterie so
differenzierte Toxizitätsprofile des Wassers in weitergehender
Übereinstimmung mit den Ergebnissen der chemischen
Wasseranalytik.
Beispiele aus der Praxis
In einem ersten, 2014 abgeschlossenen, Forschungsvorhaben
zur Untersuchung der toxikologischen Relevanz von Trans-
formationsprodukten aus der Ozonung von Kläranlagen-
abläufen in Nordrhein-Westfalen wurde bereits eine sehr
umfangreiche Biotestbatterie angewandt (Az.: IV-7-042 600
001J). Insgesamt kamen 14 verschiedene biologische Test-
verfahren mit unterschiedlichen Endpunkten wie zum Beispiel
der Zytotoxizität, Östrogenität, Gentoxizität, Phytotoxizität,
sowie akute und chronische Toxizität von Invertebraten zum
Einsatz (Abbildung 3).
Abb. 3 Umfangreiche Biotestbatterie bestehend aus 14 ver-
schiedenen biologischen Testverfahren
Die ausgewählte Biotestbatterie erwies sich generell als ge-
eignetes Instrument für die Zustandsbewertung des Abwassers
vor und nach Ozonung sowie nach einer nachgeschalteten
biologischen Behandlungsstufe. Als einziger Untersuchungs-
parameter für den Gentoxizitätsnachweis erwies sich der
Comet-Assay als nicht geeignet. Dies lag an der zum Teil un-
klaren Interpretation der Ergebnisse. Aus diesem Grund sollte
zukünftig stattdessen oder zumindest ergänzend der Mikro-
kern-Test durchgeführt werden. Ebenso wurde deutlich, dass
gegenläufige Trends für unterschiedliche Endpunkte auftreten
können. Dies führte dazu, dass die im Projekt eingesetzte Bio-
testbatterie für den Vergleich der biologischen Wirkungen vor
und nach Ozonung zu keinem eindeutigen Ergebnis führte.
Hinzu kommt noch die Problematik in der Vergleichbarkeit von
nativen Wasserproben und angereicherten Proben. So
konnten in vereinzelten Fällen signifikante Unterschiede für die
nativen Proben festgestellt werden; diese ließen sich jedoch
nicht für jede angereicherte Probe reproduzieren. Die Ergeb-
nisse zeigen neben der methodischen Weiterentwicklung, u.a.
Anpassung an die Abwassermatrix, einzelner biologischer
Testsysteme vor allem den Bedarf einer ganzheitlichen
Interpretation aller Endpunkte der WBA auf. Dies gilt ebenfalls
für die Kompatibilität von Anreicherungsverfahren mit in vitro
und in vivo Testsystemen. Hierzu erfolgte im Herbst 2017 der
Aufruf von Seiten des Umweltbundesamts zu einem For-
schungsprojekt (FKZ 3717 26 326 0) das vielversprechende
Ergebnisse zum einen speziell zur Anreicherung von Östro-
genen und zum anderen zu einem gemeinsamen Anrei-
cherungsverfahren für die chemische und biologische Analytik
erwarten lässt. Zudem wurde in den letzten Jahren intensiv an
der Validierung und Standardisierung von drei östrogenen
rezeptorgebundenen Bioassays (ER CALUX, A-YES, YES)
gearbeitet. Als Ergebnis erfolgt im Laufe des Jahres 2018 die
Verabschiedung und Veröffentlichung dieser drei ISO-Normen
(ISO/FDIS 19040-1, ISO/FDIS 19040-2, ISO/FDIS 19040-3).
In einem weiteren, 2017 abgeschlossenen, Forschungs-
vorhaben erfolgte die Erprobung einer Biotestbatterie zum
Monitoring der Spurenstoffadsorption bei der weitergehenden
Abwasserreinigung mit granulierter Aktivkohle (Az.: 17-
04.02.01-04b/201). Der Fokus lag ausschließlich auf der
Effektivität und Filtratqualität granulierter Aktivkohle (GAK)
Festbettadsorber von drei unterschiedlichen Kläranlagen. Für
die biologische Analytik wurden native Wasserproben ein-
gesetzt, es erfolgte keine Anreicherung. Durch den Einsatz der
Biotestbatterie ergab sich somit neben der rein chemischen
Analytik organischer Einzelstoffe die Möglichkeit einer ganz-
heitlichen Betrachtung der Wasserqualität (Abbildung 4).
Die umfangreichen Untersuchungen an den drei Kläranlagen
zeigten, dass der nach einer Adsorptionsstufe noch ver-
bleibende Spurenstoffeintrag in die Vorfluter überwiegend
unterhalb der toxikologischen Wirkschwellen lag. Die Über-
schreitungen der Wirkschwellen für Primärproduzenten (Algen,
Wasserlinsen) und Süßwasserkrebse (Daphnien) erwiesen
sich als Einzelbefunde und führten nicht zu einer verschlech-
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24. Jahrg. 2018/ Nr.1 Mitt Umweltchem Ökotox
terten Einstufung der Wasserqualität an den jeweiligen Klär-
anlagenabläufen. Die Ergebnisse verdeutlichen jedoch, dass
Primärproduzenten empfindlich auf die Abwasserinhaltsstoffe
im Zu- und Ablauf der GAK-Filter reagieren. Da sich bereits in
den durchgeführten Algen- und Wasserlinsentests deutliche
Unterschiede zwischen den Organismen gezeigt haben, ist zu
empfehlen, weitere Pflanzentests zu betrachten. Makrophyten
wie Myriophyllum sp. (Tausendblatt) oder Glyceria maxima
(Wasserschwade), welche für die Pflanzenschutzmitteltestung
im Gespräch sind, könnten eventuell noch sensitiver reagieren
und als Monitoringinstrument geeignet sein.
Abb. 4 Fließschema der verwendeten Biotests von der zellu-
lären Ebene bis hin zu Primärkonsumenten.
Erste Schritte zu einer ergänzenden Analytik des chemischen
und biologischen Spektrums sind bereits mit der WBA ge-
macht. Auch wenn die regulatorische Toxikologie noch einen
weiten Weg vor sich hat, so erfolgen mit jedem Projekt neue
Erkenntnisgewinne, die von Jahr zu Jahr das Untersuchungs-
spektrum der Gewässer verbessern lassen.
Literatur
Ankley, G. T., Bennett, R. S., Erickson, R. J., Hoff, D. J.,
Hornung, M. W., Johnson, R. D., Mount, D. R., Nichols, J.
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Brack, W., Ait-Aissa, S., Burgess, R. M., Busch, W., Creusot,
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Seiler, T.-B., Tindall, A. J., De Aragão Umbuzeiro, G.,
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Science of the Total Environment 544: 1073-1118.
European Commission, 2013. Directive 2013/39/EU of the
European Parliament and the Council of 12. August 2013
amending Directives 2000/60/EC and 2008/105/EC as
regards priority substances in the field of water policy. Off.
J. Eur. Union 2013 (L 226/1).
ISO/FDIS 19040-1, Water quality -- Determination of the
estrogenic potential of water and waste water -- Part 1:
Yeast estrogen screen (Saccharomyces cerevisiae)
ISO/FDIS 19040-2, Water quality -- Determination of the
estrogenic potential of water and waste water -- Part 2:
Yeast estrogen screen (A-YES, Arxula adeninivorans)
ISO/FDIS 19040-3, Water quality -- Determination of the
estrogenic potential of water and waste water
Part 3: In vitro human cell-based reporter gene assay
Korrespondenzadresse
Dr. Anne Simon
IWW Rheinisch-Westfälisches Institut für Wasserforschung
gGmbH
Geschäftsfeld Toxikologie
Moritzstraße 26
45476 Mülheim an der Ruhr
Telefon: +49 208 40303 363
E-Mail: a.simon@iww-online.de
Biotestbatterie
Zelluläre Ebene
MTT-Assay
ER-CALUX
umuC-Assay
Primärproduzenten
Algen
Wasserlinsen
Destruenten
Leuchtbakterien
(akut und chronisch)
Primärkonsumenten
(pseudo-)
estrogens nucleus
cell
estrogen
receptors
mRNA
mRNA
luciferase
transcription
pEREtata-Luc gene
protein
ERE gene
translation
activated
receptor
+ D-luciferin
luminescence
(oxyluciferin)
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... The additional use of more specific in vitro tests investigating reporter gene activities and DNA damaging potentials might then help to establish a human health risk assessment. As supplementation to in vitro methods, which allow for a screening at the molecular level through cell based systems, in vivo methods enable detection of combined effects Escher and Leusch 2011;Schmidt et al. 2018;Simon and Dopp 2018). The addition of chemical analyses and aquatic studies may then provide a complete overview starting with detection of a substance, determination of the concentration, detection of molecular and systemic effects of a certain substance or mixture effects, e.g. ...
Article
The aim of this interdisciplinary research project in North Rhine-Westphalia (NRW), Germany, entitled “Elimination of pharmaceuticals and organic micropollutants from waste water” involved the conception of cost-effective and innovative waste-water cleaning methods. In this project in vitro assays, in vivo assays and chemical analyses were performed on three municipal waste-water treatment plants (WWTP). This publication focuses on the study of the in vitro bioassays. Cytotoxic, estrogenic, genotoxic and mutagenic effects of the original as well as enriched water samples were monitored before and after wastewater treatment steps using MTT and PAN I, ER Calux and A-YES, micronucleus and Comet assays as well as AMES test. In most cases, the measured effects were reduced after ozonation, but in general, the biological response depended upon the water composition of the WWTP, in particular on the formed by-products and concentration of micropollutants. In order to be able to assess the genotoxic and/or mutagenic potential of waste-water samples using bioassays like Ames test, Comet assay or micronucleus test an enrichment of the water sample via solid-phase extraction is recommended. This is in agreement with previous studies such as the “ToxBox”-Project of the Environmental Agency in Germany.
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