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Pharmacological collection of puma semen (Puma concolor)

Authors:

Abstract

The objective of this study was to evaluate the methodology of pharmacological collection of semen with urethral catheter in pumas kept in captivity. For the pharmacological collection Medetomidine was used to induce the release of semen in the urethra and urethral catheter for cats without lateral window to collect the semen by capillarity. The method was effective in all animals used. With this technique, samples with lower volume (106.7 μL) and higher concentration (524.1 x 106 spermatozoa/mL) were collected. The evaluations of vigor, motility and spermatic pathology have demonstrated that the technique does not affect semen quality. In this way, the proposed methodology consists of a more practical and efficient technique in the collection of semen with good quality dispensing the electroejaculator.
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Coleta farmacológica de sêmen de
onças-pardas (Puma concolor)
Gediendson Ribeiro de Araujo
1
*, Tarcízio Antônio Rego de Paula
2
, Thyara de
Deco-Souza
3
, Letícia Bergo Coelho Ferreira2, Leanes Cruz da Silva2, Pedro
Nacib Jorge Neto
4
Resumo: O estudo foi conduzido com objetivo de avaliar a metodologia de coleta farmacológica de sêmen com
sondagem uretral em onças pardas mantidas em cativeiro. Para a coleta farmacológica foi utilizada Medetomidina
para induzir a liberação de sêmen na uretra e sonda uretral para gatos, sem janela lateral, para coleta do sêmen por
capilaridade. O método foi eficaz em todos os animais utilizados. Com esta técnica, amostras com menor volume
(106,7 μL) e maior concentrão (524,1 x 106 espermatozoides/mL) foram coletadas. As avaliações de vigor,
motilidade e patologia espermática demonstraram que a técnica não afeta a qualidade do sêmen. Desta forma, a
metodologia proposta consiste em uma técnica mais prática e eficiente na coleta de sêmen com boa qualidade
dispensando o eletroejaculador.
Palavras-chave: Medetomidina. Reprodução assistida. Puma concolor.
Pharmacological collection of puma semen (Puma concolor)
Abstract: The objective of this study was to evaluate the methodology of pharmacological collection of semen with
urethral catheter in pumas kept in captivity. For the pharmacological collection Medetomidine was used to induce the
release of semen in the urethra and urethral catheter for cats without lateral window to collect the semen by capillarity.
The method was effective in all animals used. With this technique, samples with lower volume (106.7 μL) and higher
concentration (524.1 x 106 spermatozoa/mL) were collected. The evaluations of vigor, motility and spermatic pathology
have demonstrated that the technique does not affect semen quality. In this way, the proposed methodology consists of
a more practical and efficient technique in the collection of semen with good quality dispensing the electroejaculator.
Keywords: Medetomidine. Assisted reproduction. Puma concolor.
Introdução
A onça parda (Puma concolor) vem sofrendo grandes pressões antrópicas que tem resultado na diminuição das
populações de vida livre. Uma das estratégias de conservação de animais ameaçados de extinção acontece por meio
de programas de reprodução assistida, que visam a manutenção de uma população geneticamente viável (Plano
Nacional de Conservação da Onça Parda - PAN Onça Parda, Portaria MMA nº 76 / 2014). Apesar do progresso nos
estudos para o desenvolvimento de biotecnologias reprodutivas em felinos silvestres, os entraves em desenvolver tais
tecnologias iniciam na dificuldade em se obter amostras representativas de sêmen. A eletroejaculação é a técnica de
escolha para coleta de sêmen em felinos silvestres, porém por exigir equipamentos específicos, operador treinado e,
principalmente, resultar em amostras de sêmen muito diluídas e por vezes contaminadas com urina, torna-se uma
técnica pouco viável para animais de vida livre (ZAMBELLI et al., 2008; LUEDERS et al., 2012). Além disso, a
estimulação elétrica inerente à eletroejaculação excita o animal, exigindo doses anestésicas maiores para garantir a
analgesia e a segurança da equipe ao manipular um grande felino. Uma nova possibilidade para coleta de sêmen de
felinos surgiu com o trabalho de Zambelli et al. (2008) que desenvolveram um método farmacológico de coleta de
sêmen em gato usando a medetomidina. A medetomidina é um α-2-agonista que provoca a contração dos ductos
deferentes auxiliando a ejaculação (TURNER et al., 1995), e até o momento foi testado em gatos e leões africanos,
possibilitando a obtenção de amostras concentradas de sêmen nestes animais anestesiados, dispensando o
eletroejaculador e consequentemente sem perda da qualidade espermática, sendo assim uma técnica promissora a
ser aplicada nas demais espécies de felinos (ZAMBELLI et al., 2008; LUEDERS et al., 2012). Dessa forma, o objetivo
1
Projeto Onças do Rio Negro, Fazenda Barranco Alto, 79200-000, Aquidauana, Mato Grosso do Sul.
2
Universidade Federal de Viçosa, 36570-900, Viçosa, Minas Gerais.
3
Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, 79070-900, Campo Grande, Mato Grosso do Sul.
4
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, 05508-270, São Paulo, São Paulo.
* gediendson@gmail.com.
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do presente estudo foi avaliar a metodologia de coleta farmacológica de sêmen com sondagem uretral após aplicação
da medetomidina em onças pardas mantidas em cativeiro.
Material e Métodos
Foram utilizadas três onças pardas mantidas em cativeiro pela ONG Mata Ciliar (SP) e pelo Zoológico de Paulínia
(SP), sendo realizado uma coleta por animal. Os animais eram mantidos em recintos individuais com água ad libitum e
dieta a base de carne bovina e suína. A coleta farmacológica de sêmen por cateterização uretral foi realizada após
jejum alimentar (12h), sendo os animais anestesiados com associação de Medetomidina (0,08-0,1 mg/kg) e Ketamina
(5 mg/kg), sendo esta revertida, após os procedimentos, com Atipamezole (0,25 mg/kg) via IM. A sondagem uretral foi
realizada entre 20 e 40 minutos após a aplicação do anestésico a fim de permitir a ação da medetomidina sobre a
ejaculação. O pênis foi exposto para facilitar a sondagem da uretra, e foi previamente limpo com soro fisiológico e
gazes. Foi utilizada uma sonda uretral estéril para gatos (tom cat), de 14 cm de comprimento, descartável, semi
flexível e sem janela lateral para a coleta, lubrificada com soro fisiológico estéril e inserida cuidadosamente, evitando
lesões a mucosa da uretra. Em seguida, foi acoplada uma seringa de 1 ml à sonda para a coleta do sêmen. Após
retirada da sonda, o sêmen foi acondicionado em tubo graduado mantido a 37ºC em banho maria para avaliação e
processamento. O sêmen foi avaliado fisicamente em relação à coloração e classificado como: leitosa (coloração
esperada), aquosa (amostra muito diluída), amarelada (contaminação por urina) ou avermelhada (contaminação por
sangue). Na sequencia, o sêmen foi diluído na proporção 2:1 em meio de manutenção (MM; 24g/L de TRIS, 14 g/L de
ácido cítrico, 8 g/L de glicose, 2 g/L de amicanina, 200 g/L de gema de ovo; Nutricell®, SP-Brasil). Para aferição do
volume, foi utilizada uma micropipeta de volume ajustável. O sêmen foi avaliado quanto ao vigor e motilidade
espermática. A avaliação subjetiva foi expressa em porcentagem para a motilidade, e escores de zero (ausência de
movimento) a cinco (movimento retilíneo progressivo intenso). A concentração espermática foi realizada em câmara
de Neubauer. A morfologia espermática foi realizada com uma alíquota de sêmen fixada em formol salino tamponado
(1:10). Foram contadas 200 células em preparação úmida utilizando um microscópio de contraste de fase e
classificadas em normais ou quanto aos tipos de defeitos maiores e menores. Os dados obtidos nas análises do
sêmen fresco foram expressos em média e desvio padrão. Usou-se o teste de Lillifors para verificar distribuição
normal ou não das variáveis. A homogeneidade das variâncias foi avaliada por meio do teste de Cochrane Bartlett.
Para variáveis que não permitiram análise paramétrica e para o dado qualitativo vigor, foi usado o teste não
paramétricode Wilcoxon a 5% de significância.
Resultados e Discussão
Por meio da coleta farmacológica utilizando a medetomidina, o sêmen foi coletado com a introdução da sonda uretral,
em média 12 cm, e por meio de uma leve pressão negativa na seringa, sendo possível coletar sêmen em todos os
animais, no entanto, um animal (Pc3) só ejaculou líquido seminal. A coloração observada nos ejaculados foi leitosa,
com exceção apenas do animal Pc3 que foi translúcida. Este estudo apresenta a primeira descrição das
características de sêmen de onças pardas coletado por sondagem uretral após aplicação da medetomidina, um
sedativo da classe dos α-2-adrenérgicos (α-2A) com maior seletividade para os receptores alfa-2, e
consequentemente, maior eficácia dentre os sedativos da categoria. A medetomidina não causou ereção e nem a
ejaculação nos pumas, mas promoveu a liberação dos espermatozoides na uretra. Esta liberação possivelmente es
relacionada à estimulação dos receptores α-2A que promovem a contração dos ductos deferentes, do trígono vesical e
do esfíncter da bexiga durante a ejaculação (TURNER et al., 1995). Foram obtidos ejaculados em todos os animais,
no entanto um macho (Pc3), de 20 anos de vida, ejaculou apenas líquido seminal. Neste macho, a senilidade
possivelmente está associada à azospermia e degeneração testicular, sendo os dados utilizados apenas para cálculo
de volume de sêmen coletado. Por meio da coleta farmacológica foi possível obter amostras de sêmen concentradas
(524,1 x 106 sptz/mL) com menor volume em relação à eletroejaculação, sem prejuízo ao total de células coletadas,
sendo os resultados semelhantes obtidos em gatos (ZAMBELLI et al., 2008) e em leões africanos (LUEDERS et al.,
2012), utilizando o mesmo método de coleta farmacológica. O vigor (3) e motilidade (70%) foram superiores aos
encontrados por Miller et al. (1990) e inferior aos descritos por Deco et al. (2010) e volume do ejaculado (106,7µL) foi
inferior (em volume e quantidade total de células) ao descritos por Wild et al. (1988) e por Deco et al. (2010), sendo
que todos estes estudos utilizaram a eletroejaculação, para a coleta. Devido ao reduzido número de machos avaliados
neste trabalho, não é possível afirmar que o resultado inferior do total de espermatozoides coletados é um reflexo da
metodologia aplicada, podendo estar relacionado as características dos indivíduos. Apesar do volume testicular ainda
não ter sido relacionado com produção espermática em felinos, os indivíduos Pc1 e Pc2 apresentaram volume
testicular (3,2 mL no testículo direito e 2,7 mL no testículo esquerdo) muito inferior ao descrito por Deco et al. (2010)
(7,59 mL no testículo direito e 7,49 mL no testículo esquerdo), podendo explicar a diferença obtida entre duas
pesquisas. A média de espermatozoides morfologicamente anormais foi de 59,5%. As principais patologias
encontradas na categoria de defeitos maiores foram cauda fortemente dobrada e cauda fortemente enrolada,
enquanto que na categoria de defeitos menores foi observado maior quantidade de cauda dobrada. Na família Felidae
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é comum uma alta porcentagem de patologias espermáticas, no entanto, a etiologia das anormalidades específicas
assim como seu impacto sobre a fertilidade ainda é controversa. A metodologia de coleta de sêmen proposta facilitou
a logística do trabalho, permitindo a coleta de amostras com alta concentração de espermatozoides e baixa
concentração de líquido prostático, dispensando o uso da centrífuga, e principalmente, por se tratar de um
procedimento muito mais rápido e prático que a metodologia da eletroejaculação. Outra vantagem foi a reversão
imediata dos efeitos da medetomidina após aplicação do atipamezole, diminuindo substancialmente o tempo
despendido no manejo do animal capturado. Desta forma, a metodologia proposta permite a coleta de amostras de
sêmen com concentração superior à eletroejaculaçao sem perda da qualidade de movimentação ou mesmo sem
influência sobre a morfologia espermática dispensando o uso do eletroejaculador e utilizando um protocolo de
contenção química seguro e eficaz.
Conclusões
A metodologia proposta mostrou-se eficiente para a coleta de sêmen com qualidade em onças pardas, dispensando o
uso da eletroejaculação, podendo ser utilizada em programas de inseminação artificial e criopreservação espermática
nessas espécies. Por ser uma técnica simples, prática e segura, a sondagem uretral após administração da
medetomidina é passível de ser utilizada em procedimentos com animais de vida livre.
Agradecimentos
Agradecemos ao CNPq, Fapemig e Fundect pelo apoio financeiro.
Referências
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MILLER, A. M.; ROELKE, M. E.; GOODROWE, K. L.; HOWARD, J. G.; WILDT, D. E. Oocyte recovery, maturation and
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ZAMBELLI, D; PRATI, F.; CUNTO, M.; LACONO, E.; MERLO, B. Quality and in vitro fertilizing ability of cryopreserved
cat spermatozoa obtained by urethral catheterization after medetomidine administration. Theriogenology, v. 69, n. 4,
p. 485-490, 2008.
Reunião da Associação Brasileira de Andrologia Animal (ABRAA) (2. : 2017 : Uberlândia, MG).
Anais da 2a Reunião da Associação Brasileira de Andrologia Animal (ABRAA), Uberlândia, MG, 09 a 10 de junho de 2017
[recurso eletrônico] / organizado por Juliana Corrêa Borges Silva ... [et al.]. – Dados eletrônicos. – Corumbá: Embrapa
Pantanal, 2017.
201 p. (Documentos / Embrapa Pantanal, ISSN 1981-7223 ; 146).
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Article
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For wild and domestic felids, electroejaculation (EE) is the most common semen collection method. However, the equipment is expensive, there is a risk of urine contamination and animals usually show strong muscular contraction despite general anesthesia. Accordingly, we tested the feasibility of a different approach using urethral catheterization (UC) in seven African lions, previously described for domestic cats only. After general anesthesia with the α2-agonist medetomidine (which also stimulates semen release into the urethra) and ketamine, a transrectal ultrasound was performed to locate the prostate. A commercial dog urinary catheter (2.6 or 3.3 mm in diameter) was advanced approximately 30 cm into the urethra to allow semen collection into the lumen of the catheter by capillary forces. After retraction, sperm volumes between of 422.86 ± 296.07 μl yielded motility of 88.83 ± 13.27% (mean ± SD) with a mean sperm concentration of 1.94 × 10(9)/ml. Here we describe a simple, field friendly and effective method to attain highly concentrated semen samples with excellent motility in lions and potentially other wild felid species as an alternative to electroejaculation.
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Eight female pumas were treated i.m. with 1000 (N = 5) or 2000 (N = 3) i.u. PMSG followed 84 h later by 800 i.u. hCG. Eggs were recovered 24-26 h after hCG from ovarian follicles by using laparoscopy and transabdominal aspiration. Mature eggs were inseminated in vitro 4-6 h later whereas immature eggs were cultured for 24 h and then inseminated. Electroejaculates from 3 pumas were diluted with mKRB before insemination to evaluate the influence of sperm concentration on fertilization. Seven of 8 pumas responded with follicle development, and 140 eggs were recovered from 145 follicles (96.6%; 77 mature, 43 immature, 20 degenerate eggs; mean +/- s.e.m., 20.0 +/- 5.9 eggs/female). Overall fertilization rate was 43.5% (total eggs fertilized = 40) despite using inseminates containing 82-99% pleiomorphic spermatozoa. Of the 36 immature oocytes matured in vitro and inseminated, 12 were fertilized even though 50% of the inseminating spermatozoa contained an acrosomal defect. Fertilization rate of mature oocytes collected from follicles appeared unrelated (P greater than 0.05) to PMSG dose or number of spermatozoa/inseminate. This study demonstrates that a high proportion of follicular eggs can be recovered laparoscopically from adult pumas treated with PMSG and hCG. These gametes are capable of being fertilized in vitro (immediately or after maturation in vitro) even with low quality semen with a high incidence of sperm pleiomorphisms.
Article
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Male cheetahs, tigers, leopards, and pumas maintained under the same conditions were anesthetized and 1) serially bled before, during, and after electroejaculation (EE); 2) serially bled only (AO); or 3) serially bled before and after receiving adrenocorticotropin hormone (ACTH). Ejaculates from leopards contained higher (p less than 0.05) sperm concentrations than cheetahs and pumas but lower (p less than 0.05) sperm motility ratings than all other species. Tigers produced a larger seminal volume and the greatest number of motile sperm/ejaculate (p less than 0.05). The percentage of morphologically abnormal spermatozoa was greater (p less than 0.05) in cheetahs (64.6%), leopards (79.5%), and pumas (73.5%) than in tigers (37.5%). The most prevalent spermatozoal deformities included a tightly coiled or bent flagellum, a deranged midpiece, or a residual cytoplasmic droplet. Mean baseline serum cortisol concentrations in leopards were 2- and 4-fold greater (p less than 0.05) than in tigers and cheetahs, respectively. Basal cortisol concentrations in pumas were similar to those of tigers, but irrespective of treatment increased 2-fold (p less than 0.01) during the bleeding period. An acute rise and fall in cortisol attributable to EE was observed only in cheetahs. In tigers and leopards, mean peak cortisol concentrations after ACTH were similar to maximal values observed after EE. However, peak cortisol levels in cheetahs and pumas after ACTH were greater (p less than 0.01) than the concentrations measured after EE, indicating that these manipulatory procedures were not eliciting a maximal adrenal response. In the EE groups, luteinizing hormone (LH) and testosterone levels in cheetahs were lower (p less than 0.05) than in other species, whereas levels of both hormones were comparable (p greater than 0.05) in tigers, leopards, and pumas. Elevated cortisol levels in cheetahs and pumas had no discernible effect on LH/testosterone patterns; however, the results were equivocal in tigers, and, among leopards, testosterone concentrations consistently declined over time. In this study, using a standardized approach, we identify different ejaculate and endocrine characteristics of captive cheetahs, tigers, leopards, and pumas. The data extend earlier observations and demonstrate that some, but not all, Felidae species ejaculate high numbers of pleiomorphic spermatozoa. However, inter-species differences in sperm integrity do not appear related to inter-species variations in cortisol, LH, or testosterone. The observation of continuously declining testosterone concentrations only in leopards after AO, EE, or ACTH treatment suggests that rising and/or elevated cortiso
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Ejaculation was pharmacologically induced in a 13-year-old Quarter Horse stallion with a spiral fracture of the radius. The owners desired to have semen from the stallion frozen prior to euthanatizing the horse, but because of the debilitating injury, standard methods of semen collection could not be used. With the stallion standing quietly in a stall, a plastic collection bag was positioned over the stallion's penis, and clomipramine hydrochloride (2.2 mg/kg of body weight, IV) was administered. Fifty-five minutes later, xylazine hydrochloride (0.5 mg/kg, IV) was administered. The stallion ejaculated 2 minutes after xylazine administration. The semen sample was of low volume and had a high concentration of spermatozoa; however, motility of spermatazoa was poor and the semen was unacceptable for freezing. The stallion was euthanatized. Semen aspirated from the epididymis after euthanasia was of similar quality to that of the ejaculated sample. Pharmacologic induction of ejaculation can be useful for obtaining semen from stallions when standard techniques cannot be applied.
Article
Quality and in vitro fertilizing ability of frozen-thawed cat semen collected by urethral catheterization (CT) or electroejaculation (EE) after medetomidine administration were compared. Sperm collection was performed by an urinary tomcat catheter and, 4 days apart, by electroejaculation from each of eight tomcats. Results showed that semen collected by CT was characterized by lower volume (10.5+/-5.3 microL, P<0.05), higher sperm concentration (1868.4+/-999.8 x 10(6)/mL, P<0.05) and lower pH (7.0+/-0.4, P<0.05) than that collected by EE (67.1+/-25.9 microL, 542.9+/-577.9 x 10(6)/mL, and 7.9+/-0.4, respectively). Spermatozoa characteristics after thawing at 0, 3 and 6h did not differ between the two methods of collection. Also cleavage rate and embryo production from oocytes fertilized with frozen-thawed spermatozoa collected by CT or EE showed no significant differences (P>0.05). In conclusion, the results obtained in the present study indicate that good quality freezable semen can be collected from cats by urethral catheterization after medetomidine administration. This new method of semen collection appears very useful in practice and, compared with the electroejaculation protocol, permits to obtain semen samples characterized by a higher concentration of spermatozoa, lower total volume and lower pH.
Collection and semen evaluation of captive adult cougars (Puma concolor Linnaeus, 1771). Revista Brasileira de Reprodução Animal
  • S T Deco
  • T A R Paula
  • D S Costa
  • G R Araujo
  • R M Garay
  • G S C Vasconcelos
  • A C Csermak Junior
  • L C Silva
  • J B Barros
DECO, S. T.; PAULA, T. A R.; COSTA, D. S.; ARAUJO, G. R.; GARAY, R. M.; VASCONCELOS, G. S. C.; CSERMAK JUNIOR, A. C.; SILVA, L. C.; BARROS, J. B. G. Collection and semen evaluation of captive adult cougars (Puma concolor Linnaeus, 1771). Revista Brasileira de Reprodução Animal, v. 34, n. 4, p. 252-259, 2010.