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Ce guide est issu de l’expertise scientifique de
L’European Research Insitute on Natural Ingredients
ERINI, de la coordination du Pôle PASS, et de
l’engagement d’entreprises au service d’une action
collective inédite. Il a été rédigé par les Docteurs
Céline Roy et Yoann Fillâtre (ERINI).
Avec le soutien de :
Avec le mécénat de la Fondation d’Entreprise
Crédit Agricole Provence Côte d’Azur
SOMMAIRE
1. Pourquoi ce guide ? 5
Pourquoi un guide ? ...................................................................................................................................................................................... page 6
Objectifs ............................................................................................................................................................................................................... page 7
Moyens mis en œuvre ................................................................................................................................................................................. page 7
A qui le guide s’adresse-t-il ?. ................................................................................................................................................................... page 8
Que contient-il ? ..............................................................................................................................................................................................page 8
Comment l’utiliser ? ....................................................................................................................................................................................... page 9
2. Les réponses aux 10 questions les plus fréquentes 11
1. Que désigne-t-on sous le terme de « pesticide » ? ............................................................................................................. page 12
2. La réglementation sur les pesticides est-elle identique en Europe et dans le reste du monde ? ........ page 12
3. Que désigne-t-on sous le terme de « résidus » de pesticides ? ..................................................................................page 12
4. Est-il normal de trouver des résidus de pesticides dans les HEs issues
de l’agriculture biologique ? ............................................................................................................................................................ page 13
5. Existe-t-il des « limites maximales de résidus » (LMR) dans les HEs ?....................................................................... page 13
6. Quels pesticides doivent être recherchés en priorité dans les HEs, en fonction des matières
premières et des origines géographiques ? ........................................................................................................................... page 13
7. Pourquoi obtient-on des bulletins d’analyse différents lorsqu’un même échantillon
est envoyé à plusieurs laboratoires ? .......................................................................................................................................... page 14
8. Finalement, quelle limite de détection et de quantification est acceptable dans le cas des HEs ? .... page 16
9. Que faire lorsqu’un ou plusieurs pesticides ont été retrouvés dans une HE ? .................................................. page 17
10. Quelles questions dois-je poser au laboratoire d’analyse de pesticides
avant de lui envoyer mes échantillons ? ................................................................................................................................... page 17
3. Dossier technique 19
Introduction : Bulletin d’analyse / Liste des 75 pesticides prioritaires .......................................................... page 20
Chapitre 1 : Liste de pesticides recherchés .......................................................................................................................... page 22
1.1 Quelques définitions utiles ............................................................................................................................................................ page 22
Pesticide .................................................................................................................................................................................................... page 22
Produits phytosanitaires (en anglais, PPP ou « Plant Protection Products ») ................................................... page 23
Substances actives, ingrédients actifs .................................................................................................................................... page 23
Produits phytopharmaceutiques .............................................................................................................................................. page 23
Formulations commerciales ......................................................................................................................................................... page 23
1.2. L’usage très réglementé des pesticides dans l’UE .......................................................................................................... page 23
Procédure d’évaluation en vue d’une AMM ....................................................................................................................... page 23
Objectifs principaux de l’évaluation ........................................................................................................................................ page 23
Contenu de l’AMM .............................................................................................................................................................................. page 23
Période de validité .............................................................................................................................................................................. page 23
Le cas particulier de l’agriculture biologique .....................................................................................................................page 24
1.3. Qu’en est-il dans le reste du monde ? .................................................................................................................................... page 24
Marché des pesticides ...................................................................................................................................................................... page 24
Réglementation de l’utilisation des pesticides ................................................................................................................. page 25
Réglementation dans les pays producteurs d’HEs ......................................................................................................... page 25
3
4
1.4. Les résidus de pesticides au cœur des débats ................................................................................................................. page 27
Définition du terme « Résidu » ..................................................................................................................................................... page 27
Qu’appelle-t-on « limites maximales de résidus » (LMR) ? ........................................................................................... page 27
Comment sont établies les LMR ? ............................................................................................................................................. page 27
Des résidus de pesticides dans les produits BIO ..............................................................................................................page 28
1.5. Les pesticides analysés par les laboratoires ....................................................................................................................... page 28
Comment les listes de pesticides sont-elles établies par les laboratoires ? .................................................... page 28
Lorsqu’un pesticide d’intérêt ne figure pas dans la liste du laboratoire ............................................................page 28
Pesticides spéciaux .............................................................................................................................................................................page 29
1.6. Résidus de pesticides et huiles essentielles ....................................................................................................................... page 29
Aspects législatifs et réglementaires : aucune LMR dans les HEs .......................................................................... page 29
Qualité des HEs, en étroite relation avec les teneurs résiduelles de pesticides ............................................ page 30
Quel(s) pesticide(s) dans quelle HE ? ....................................................................................................................................... page 30
Les difficultés des laboratoires et des industriels à faire la diagnostic approprié .......................................page 32
Chapitre 2 : Interpréter les résultats .......................................................................................................................................... page 34
2.1. Présentation générale du bulletin d’analyse ..................................................................................................................... page 34
Le nom de la substance active mère ...................................................................................................................................... page 34
Sa concentration dans l’échantillon.........................................................................................................................................page 34
L’unité dans laquelle est exprimé le résultat....................................................................................................................... page 34
Les performances de la méthode utilisée............................................................................................................................ page 34
Des informations complémentaires et utiles .....................................................................................................................page 34
2.2. Des concentrations « limite » pour évaluer les performances des méthodes .............................................. page 35
Limites de détection et de quantification : notions-clés pour l’analyse de trace ........................................ page 35
Parlons de « reporting limit » ....................................................................................................................................................... page 35
Des performances élevées, soumises à variabilité.......................................................................................................... page 36
2.3. Incertitude, faux positifs et faux négatifs ............................................................................................................................. page 36
2.4. L’impact des effets matrice sur le dosage ............................................................................................................................page 36
Qu’appelle-t-on « effets matrice » ? ........................................................................................................................................... page 36
Quelles sont les origines des effets matrice en analyse ? ........................................................................................... page 37
Mise en évidence, impact sur le dosage ............................................................................................................................... page 37
Elimination ou compensation des effets matrice ........................................................................................................... page 39
Chapitre 3 : Méthodes d’analyse et validation .................................................................................................................. page 40
3.1. Les étapes de l’analyse de pesticides .....................................................................................................................................page 40
Préparation de l’échantillon .......................................................................................................................................................... page 40
Analyse instrumentale...................................................................................................................................................................... page 41
Focus : le mode d’acquisition SRM (analyse ciblée) ....................................................................................................... page 42
Les méthodes analytiques utilisées pour les HEs ............................................................................................................ page 43
3.2. La validation d’une méthode analytique ............................................................................................................................. page 44
Les enjeux ................................................................................................................................................................................................ page 44
Les principaux paramètres étudiés lors de la validation (méthodologie classique) ................................. page 45
Le plan de validation des méthodes analytiques ........................................................................................................... page 46
Les contrôles et vérifications avant de procéder à toute analyse ......................................................................... page 48
L’intérêt de réaliser un profil d’exactitude (méthodologie globale) ..................................................................... page 48
Tables et Figures ....................................................................................................................................................................................... page 50
1. POURQUOI CE GUIDE ?
6
Ce guide méthodologique est le fruit d’un travail collaboratif
impliquant 11 entreprises, un laboratoire de recherche et un pôle
de compétitivité coordonnateur de l’action, tous représentants
de la filière Parfum Arômes Senteurs Saveurs (PASS), couvrant
tous les secteurs d’activités-clés : production, transformation,
analyse, utilisation et commercialisation, des matières premières
naturelles aux produits finis, parfums ou cosmétiques.
POURQUOI UN GUIDE ?
Dans un contexte d’exigence sociétale relative à la présence de
substances indésirables dans les produits supérieure à la pression
réglementaire, ce guide pratique répond à un besoin croissant
des acteurs de la filière PASS : celui de disposer d’un outil d’aide à
la gestion des résultats d’analyse des résidus de pesticides dans
les extraits naturels, notamment dans les huiles essentielles (HEs).
Une démarche résolument responsable et avant-gardiste
Professionnelle, sociétale et environnementale, la responsabilité des entreprises incite celles-ci à s’interroger sans cesse sur la
qualité des matières premières qu’elles achètent, des produits qu’elles commercialisent, et donc sur l’interprétation des analyses
réalisées.
Proactive et déployée tout au long du processus de fabrication, elle se traduit notamment dans l’analyse chimique des matières
premières naturelles et de leurs produits transformés pour en maîtriser la composition et détecter l’éventuelle présence de
substances indésirables telles que les pesticides.
Des résultats d’analyse sujets à variabilité
Pour déterminer l’identité et la teneur d’éventuels pesticides dans leurs différents extraits, les entreprises confient le plus souvent
les analyses de contrôle à des laboratoires prestataires coutumiers du dosage de ces produits dans les matrices environnementales
et alimentaires. Comme en témoigne le chapitre suivant, nombreuses s’étonnent régulièrement des différences de résultats
obtenus par plusieurs laboratoires externes pour un seul et même échantillon - lors d’une mise en concurrence ou d’une analyse
de confirmation-, tout en avouant méconnaître les méthodes de dosage utilisées et leurs performances.
Mieux comprendre l’analyse des résidus de pesticides dans des matrices trop peu analysées, disposer d’une meilleure évaluation
des méthodes d’analyse et de leur fiabilité telles sont les principales demandes des industriels.
Des interrogations sur les pesticides à rechercher
La plupart des laboratoires privés actuels travaillent sur des listes-types de pesticides (200 à 500 substances actives parmi les 1150
répertoriées), variables d’un laboratoire à l’autre, directement issues du cadre réglementaire européen et des plans de surveillance
de substances désormais interdites mais persistantes dans l’environnement (DDT, lindane, chlordécone…). Bien que très élargie,
l’offre actuelle de prestation ne répond pas forcément aux besoins spécifiques de la filière aromatique. En effet, de nombreuses
HEs sont importées de pays hors de l’Union européenne et de sa législation. Dans ce contexte un peu particulier où la nature des
matières premières diverge tant, et où il est « facile » de passer à côté d’un pesticide préoccupant, la question du nombre et de la
nature des pesticides à détecter et doser en priorité pour respecter leurs engagements (toxicité, teneur, récurrence, conformité
avec les exigences d’organismes certificateurs…) se pose pour les industriels de la filière PASS.
Une connaissance inégale du sujet, un dialogue difficile entre les acteurs
Cette variabilité des résultats observée d’un bulletin d’analyses à l’autre génère deux problèmes majeurs pour les entreprises :
◆ elle fragilise leur confiance dans les méthodes des laboratoires prestataires, et l’aptitude de ces derniers à détecter et doser les
pesticides dans des matrices aussi particulières que les HEs mais aussi les concrètes et les absolues, des produits uniques,
complexes et « rares » comparés à ceux des centaines de milliers d’échantillons environnementaux et alimentaires analysés
chaque année.
◆ elle entrave leur argumentation auprès des fournisseurs et clients sur la qualité des produits.
SOMMAIRE
LE DOSAGE DES PESTICIDES DANS LES HUILES ESSENTIELLES
7
OBJECTIFS
Face au questionnement des industriels de la filière, ce guide a pour vocation d’aborder les notions-clés de l’analyse des résidus
de pesticides en visant 4 OBJECTIFS prioritaires :
Faciliter le « décryptage » du bulletin d’analyse
… en développant la connaissance des méthodes d’analyse utilisées et de tous les éléments-clé qui y sont associés (notations,
facteurs influençant le résultat…) ; ces derniers permettent d’en évaluer les performances et les limites, d’en comprendre la
complexité et les possibles raisons de variabilité des résultats… bref d’avoir un regard critique « éclairé » sur les résultats délivrés.
Établir une liste de pesticides prioritaires à rechercher dans les HEs, en optimiser l’analyse
… Quitte ensuite à élargir la recherche d’autres substances phytosanitaires à travers des méthodes de screening élargie, via les
listes multirésidus de pesticides des laboratoires prestataires ou les nouvelles stratégies d’analyse dites « non ciblées ».
Orienter vers des bases documentaires de référence pour enquêter
et tenter de justifier les résultats
Une quantité importante d’informations utiles à l’exploitation des résultats figure dans les textes réglementaires ou dans les guides
de référence. Elle offre à chacun la possibilité de s’informer en détail sur une problématique pesticide pour une HE donnée, en
particulier sur la règlementation en vigueur dans le pays d’origine des approvisionnements, ou sur les différents protocoles de
validation des méthodes dans les laboratoires d’analyse.
Disposer d’un support d’argumentation commun, adapté à la filière des HEs
et aux résultats obtenus
Ce guide est construit par les professionnels de la filière aromatique pour s’adapter à ses spécificités et difficultés. Couplé aux
autres sources d’informations réglementaires et scientifiques, il devient un support légitime de communication et d’argumentation
entre un fournisseur et son client, ou entre un donneur d’ordre et son prestataire (d’analyse par exemple), « un outil fiable et reconnu
à mettre au service de l’ensemble des sociétés de notre domaine. »
Il peut éventuellement aider à consolider une argumentation en cas de litige ou à engager des actions préventives ou correctives.
Il peut enfin accompagner toute entreprise dans le choix d’un laboratoire prestataire d’analyses, en l’aidant à identifier les
principales lignes directrices adoptées par le laboratoire pour analyser et quantifier les résidus de pesticides dans ses HEs.
MOYENS MIS EN ŒUVRE
Ils sont basés sur la collecte, le partage, le développement, la validation et le transfert de connaissances et/ou des compétences
au sein du groupe des partenaires engagés : une démarche volontaire dont le caractère inédit mérite d’être soulignée.
La collecte et le partage d’informations fiables et pertinentes
L’action collective orchestrée par le pôle de compétitivité PASS a permis de mettre en commun 282 bulletins d’analyse de
pesticides délivrés par une dizaine de laboratoires différents, portant sur 28 matières premières naturelles (principalement des
HEs) et issues de 23 pays du monde entier. La mise en commun inédite des résultats d’analyses obtenus depuis plusieurs années
par des entreprises représentantes de tous les opérateurs de la filière, parfois concurrentes, souvent partenaires commercialement,
constitue une preuve irréfutable de la démarche responsable, constructive et consensuelle dans laquelle tous ont décidé de
s’engager.
SOMMAIRE
1. POURQUOI CE GUIDE ?
8
Le développement et la validation des connaissances et savoir-faire
Ces actions ont été menées au sein d’une plateforme de recherche partenariale publique/privée, dédiée à l’analyse chimique (et
sensorielle) des extraits naturels, ERINI, et suivis du début à la fin, en toute transparence, par les partenaires de l’Action.
Différents moyens ont été mis en œuvre pour développer une solution analytique « sur mesure » et adaptée aux exigences en
vigueur (et difficultés) en matière d’analyse de résidus dans les HEs, à savoir :
◆ Des équipements analytiques performants, sur lesquels a été développée une méthode d’analyse ciblée des résidus de
pesticides « spécifiques HEs » (type GC-MS/MS), mais également une analyse non ciblée (type UHPLC-QTOF) pour élargir, si
besoin, le screening de substances actives. Cette dernière approche permettra également d’amender progressivement la liste
ciblée des pesticides « prioritaires », au fur et à mesure des données collectées dans chaque matrice et fonction des origines
de production.
◆ Une double validation des méthodes développées :
• « interne » tout d’abord, en tenant compte des recommandations du guide de référence SANCO 2015/11945 ;
• « externe » ensuite en participant, puis en organisant, un ring test sur échantillons réels relatif à la mesure des teneurs en
pesticides dans les HEs.
◆ L’analyse d’échantillons réels d’HEs de différentes origines (géographique, issues de productions classiques ou BIO, etc.)
◆ Une équipe opérationnelle compétente et expérimentée dont les travaux ont fait l’objet de publications scientifiques*
Le transfert de compétences via la formation et l’aide à la mise en place de méthodes
internes de contrôle des résidus de pesticides
Pour répondre aux besoins de formation et de transfert de compétences formulés par les industriels, des cessions de formation
spécifiques ont été développées, dans lesquelles les notions-clés évoquées dans ce guide sont détaillées et illustrées de cas
concrets. Une assistance des industriels désirant intégrer ces compétences dans leur laboratoire a également été possible.
À QUI LE GUIDE S’ADRESSE-T-IL ?
Construit par et pour les professionnels filière aromatique et cosmétique, confrontés à la problématique de la recherche et du
dosage des résidus de pesticides dans les HEs : producteurs, négociants en matières premières, fabricants de produits finis
contenant ces extraits, responsables qualité, chimistes analystes, organismes certificateurs…
QUE CONTIENT-IL ?
Toutes les notions-clés à maitriser y sont traitées, pour comprendre l’analyse de pesticides dans les HEs, interpréter les résultats et
mettre en place des actions adaptées. Spécificités et difficultés liées à la nature même des extraits et à leurs origines de fabrication
sont documentées pour favoriser le dialogue au sein de chaque filière et inter-filières (aromatique, cosmétique, diététique).
Publication en cours de rédaction
* Pesticides in Essential Oils: Occurrence and Concentration in Organic and Conventional Orange Essential Oils Originating from Eleven Countries.
A l'étude
Potential of an Accurate Mass Screening Method for the Analysis of Pesticides in (the Particular Context of) Essential Oils using Liquid Chromatography- Quadrupole-Time of Flight-Mass Spectrometry
with Automated Detection : Results of a qualitative validation in Orange EO.
SOMMAIRE
9
LE DOSAGE DES PESTICIDES DANS LES HUILES ESSENTIELLES
COMMENT L’UTILISER ?
Pour être complet et pédagogique, ce guide prend comme point de départ le fameux « bulletin d’analyse » que reçoit l’industriel
après avoir confié son huile essentielle à un laboratoire pour y rechercher la présence de résidus de pesticides et en connaitre la
concentration.
Référence de l'échantillon :
Matrice analysée :
Destinataire :
Prélèvement effectué par :
Transport effectué par :
État à réception : Réceptionné le : Description déclarée : T° de conservation :
Nos références : Code dossier : Nom de l'échantillon : Code étude :
SUBSTANCES
ACTIVES Résultat Unité
de mesure LQ LD RL Méthode Date d'analyses
(ou fin d'analyses)
Pesticide 1
Pesticide 2
…
Pesticide n
Ce bulletin constitue en effet la base des interrogations des industriels évoquées plus haut. Les plus fréquentes d’entre elles sont
présentées dans le chapitre suivant sous la forme d’une FAQ (Foire Aux Questions) auxquelles des réponses concises sont apportées
ainsi qu’une orientation vers la partie du guide plus spécifiquement dédiée. De plus, par sa construction –globalement similaire
d’un laboratoire à l’autre- et les résultats qu’il contient, le bulletin représente également un bon support pour évoquer toutes les
notions-clés de l’analyse d’éventuels résidus de pesticides, en y associant des exemples concrets de situations rencontrées dans
les huiles essentielles. Ces notions seront développées dans les chapitres suivants.
NI JUGEMENT, NI INJONCTION, MAIS UNE AIDE À LA COMPRÉHENSION ET À LA DÉCISION
• Le sujet traité est complexe, les solutions multiples. Il n’existe donc pas de protocole unique en matière d’analyse de
pesticides dans les huiles essentielles. De même, aucun jugement sur le travail réalisé par les laboratoires d’analyse n’est
porté.
• Cet outil a été conçu pour être un outil d’aide à la décision mais il n’y a pas d’obligation à suivre à la lettre l’ensemble des
recommandations proposées.
• Ce document ne prétend pas traiter de manière exhaustive tous les sujets et situations auxquels sont confrontés les
acteurs de la filière. Cette première version est également amenée à évoluer et s’enrichir en fonction des données
pertinentes collectées et des orientations prises par les professionnels du secteur PASS.
SOMMAIRE
2. LES RÉPONSES AUX 10 QUESTIONS LES PLUS FRÉQUENTES
12
RÉPONSES COURTES AUX
10 QUESTIONS LES PLUS
FRÉQUENTES À LA LECTURE
D’UN BULLETIN D’ANALYSE
1. Que désigne-t-on sous le terme de PESTICIDE ?
Les pesticides (étymologiquement « destructeurs de ravageurs ») sont des produits obtenus le plus souvent par synthèse chimique,
dont les propriétés toxiques permettent de lutter contre les organismes nuisibles. Ceux utilisés pour la protection des végétaux
sont désignés par la réglementation européenne sous le terme de produits phytopharmaceutiques ou produits phytosanitaires.
Les formulations commerciales utilisées en agriculture sont généralement des mélanges contenant une (ou plusieurs) substance(s)
active(s) à action « pesticide » et des adjuvants destinés à améliorer leur efficacité.
Pour en savoir plus rendez-vous CHAPITRE 1. § 1.1
2. La règlementation sur les pesticides est-elle identique en Europe
et dans le reste du monde ?
La réponse est clairement « non »
Avec l’utilisation croissante des pesticides et l’intensification des échanges de végétaux et de produits dérivés à travers le monde,
la FAO (Food and Agriculture Organization of the United Nations) a révisé en 2013 le « code international de conduite sur la gestion
des pesticides », pour « mettre de l’ordre dans le chaos législatif » et inciter les pays à organiser et harmoniser leurs pratiques
(http ://www.fao.org).
Aujourd’hui cependant, les règles en vigueur divergent beaucoup d’un pays à l’autre et à tous les niveaux : commercialisation
et utilisation des produits phytopharmaceutiques (et autres pesticides), plans de surveillance, mesures de prévention et de
protection, normes pour garantir la sécurité des denrées alimentaires d’origine végétale, ou normes pour protéger la qualité des
cultures… Etablies pour répondre aux enjeux économiques, environnementaux et de santé publique actuels, elles sont nettement
plus nombreuses, et souvent plus strictes et restrictives dans les pays développés que dans les pays en voie de développement.
Il est donc courant qu’une même substance phytosanitaire soit interdite sur une culture donnée par l’UE, et autorisée
par un pays hors EU. Retrouver cette substance dans des produits d’origine végétale, importés de pays hors EU, n’est donc pas
aberrant (ex : Atrazine, Propargite, Méthidation, Endosulfan, Profenofos, Diphenylamine… pour citer quelques pesticides retrouvés
dans certaines huiles essentielles à l’importation).
Attention cependant : d’un point de vue légal, tout produit importé doit satisfaire à la législation du pays importateur ;
pour être « conforme », il ne doit donc pas, a priori, contenir de pesticides interdits ou ne satisfaisant pas les standards nationaux
de sécurité alimentaire.
Pour en savoir plus, rendez-vous CHAPITRE 1. § 1.2 et § 1.3
3. Que désigne-t-on sous le terme de « résidus » de pesticides ?
Le résidu désigne l’ensemble des substances chimiques résultant de l’application d’un pesticide, qu’elles soient retrouvées dans le
végétal traité ou dans l’environnement (sol, eau, flore, faune…). Pour certains produits phytosanitaires, seule la substance active
de la formulation pesticide constitue le résidu ; pour d’autres, les produits de dégradation et les métabolites de la substance active
sont également concernés.
Une définition exacte du résidu pour chaque pesticide est publiée sur le site de la Communauté Européenne (accès libre).
(Exemple : Dimethoate (sum of dimethoate and omethoate expressed as dimethoate))
Pour en savoir plus rendez-vous CHAPITRE 1. § 1.4
Non exhaustives, les réponses courtes apportées aux questions
ci-dessous orientent pour de plus amples développements aux
chapitres du dossier technique.
SOMMAIRE
LE DOSAGE DES PESTICIDES DANS LES HUILES ESSENTIELLES
13
4. Est-il normal de trouver des résidus de pesticides dans les HEs issues
de l’agriculture biologique ?
Par principe, l’agriculture biologique exclut l’usage des substances chimiques de synthèse tout au long de la fabrication du produit.
Tous les acteurs engagés ou soutenant la filière BIO, du producteur au consommateur, s’attendent donc à ne trouver aucun résidu
de pesticides dans cette gamme de produits. Malheureusement, ceci n’est pas toujours le cas. Très souvent, la présence de résidus
relève de contaminations fortuites pendant la production du fait de contaminations anciennes ou accidentelles de l’environnement ;
elle est plus rarement associée à une fraude ou à un non-respect du mode de production biologique. Pour rappel, l’agriculture
biologique est une obligation de moyen et non de résultats.
Le mode de transformation des HEs, le transport ou le stockage sont aussi vecteurs de contaminations croisées, voire de
concentration de contaminations subsidiaires, qui, dès lors, deviennent détectables.
5. Existe-t-il des « limites maximales de résidus » (LMR) dans les HEs ?
Non.
Les HEs, comme l’ensemble des produits transformés (plats cuisinés et autres), ne figurent pas dans la liste des denrées alimentaires
pour lesquelles des LMR ont été fixées par la législation européenne. A notre connaissance les seules limites pouvant s’appliquant
aux HEs ont été fixées par l’US EPA pour une quarantaine de pesticides mais uniquement pour les HEs de citrus.*
Rappelons que la procédure d’élaboration d’une LMR pour une combinaison culture/pesticide donnée est étroitement liée à la
définition de la Bonne Pratique Agricole (BPA), et sa validation avec des essais réels « en plein champ ». A ce titre, un dépassement
de LMR est avant tout interprété comme un non-respect de la BPA.
Cette démarche est en fait difficilement applicable aux produits transformés comme les HEs : fixer des LMR impliquerait d’associer
à une BPA, « une bonne pratique de transformation », qui serait ensuite imposée aux industriels pour aboutir à un produit
transformé donné. Au-delà de sa faisabilité, la pertinence d’une telle démarche est fortement discutable étant donné le mode de
production des HEs : via différentes techniques d’extraction, éventuellement suivies de rectifications « à façon » (à l’origine du
savoir-faire et des secrets de fabrication des professionnels), le tout réalisé dans différents pays producteurs aux 4 coins du monde.
A discuter au cas par cas, inévitablement…
Pour en savoir plus rendez-vous CHAPITRE 1. § 1.6
6. Quels pesticides doivent être recherchés en priorité dans les HEs, en fonction des matières
premières et des origines géographiques ?
Une liste de 75 pesticides prioritaires (substance active et dérivées) a été établie lors de l’action collective coordonnée par le pôle
de compétitivité PASS. Elle figure à la page 20 de ce guide et a été construite sur la base de 400 bulletins d’analyses collectés
auprès de partenaires industriels. A notre connaissance, c’est la plus complète qui ait été publiée à ce jour.
L’ensemble des résultats collectés, enrichis par les quelques données disponibles dans la littérature scientifique ou lors de
séminaires professionnels, ne permet pas de différencier des listes pertinentes de pesticides en fonction des origines botaniques
et/ou géographiques.
Quelques observations importantes peuvent néanmoins être formulées :
◆ Environ 1 HE sur 2 est contaminée par au moins un pesticide. Conclusion de l’étude menée par l’association BAH
(Bundesverband der Arzneimittel-Hersteller, association allemande des fabricants de médicaments) où 47% des 600
échantillons d’HEs analysés (en 8 ans) étaient contaminés par au moins un pesticide.
◆ les HEs obtenues par expression, comme les HEs d’agrumes semblent être sujettes à une contamination par les pesticides plus
importante (nombre de pesticides et concentrations) que les HEs obtenues par distillation. Une des explications concerne le
nombre de traitements élevés, jusqu’à une trentaine, appliqués aux cultures de ces matières premières. Etant donné que la
production d’HEs d’orange et de citron représente plus de 50% de la production mondiale en HEs, une surveillance des résidus
de pesticides dans ce type d’extrait est légitime ; elle est d’ailleurs à l’origine d’action collective ciblée au sein d’organisations
agricoles interprofessionnelles comme AILIMPO (citron et pamplemousse espagnols) et d’une étude spécifique menée par
ERINI pendant l’action collective du Pôle PASS (publication des résultats à venir).
◆ Les substances actives détectées sont d’une grande diversité entre 50 et 100 molécules aux propriétés différentes.
◆ Il est possible de détecter plus d’une vingtaine de pesticides différents dans un même échantillon d’HE.
◆ Plusieurs pesticides détectés sont interdits d’utilisation au sein des pays de l’UE (ex : Atrazine, DDT, Dicofol, Endolsufan,
Methidathion Propargite, Lindane, Hexachlorobenzene, Trifluralin…). Le Chlorpyrifos, insecticide autorisé sur les cultures
fruitières et légumières en Europe et dans de nombreux pays du monde, est retrouvé régulièrement dans les HEs d’agrumes (et
autres).
* US Environmental Protection Agency Oce of Pesticide Programs, Index to Pesticide Chemical Names, Part 180 Tolerance Information, and Food and Feed Commodities (by Chemical Name), (2012).
SOMMAIRE
2. LES RÉPONSES AUX 10 QUESTIONS LES PLUS FRÉQUENTES
14
◆ Les concentrations des pesticides peuvent atteindre plusieurs dizaine de mg/L.
◆ Dans les HEs d’origine biologique, le nombre et la concentration des pesticides sont généralement faibles.
Pour en savoir plus rendez-vous CHAPITRE 1. § 1.6
7. Pourquoi obtient-on des bulletins d’analyse différents lorsqu’un même échantillon
est envoyé à plusieurs laboratoires ?
Comparons ce qui est comparable.
◆ Liste de résidus recherchés : chaque laboratoire est libre de définir la liste des substances d’intérêt à analyser, en fonction de
nombreux critères : propriétés des substances à analyser, pertinence de l’analyse, coût de revient des protocoles analytiques,
qualification et performances des ressources, etc. Les listes multirésidus (200 à 300 molécules recherchées en une fois) peuvent
donc varier sensiblement d’un laboratoire à l’autre, bien qu’ils partagent (normalement) le même objectif : offrir une prestation
au meilleur rapport qualité / prix / délai.
Avant de confier l’analyse d’un échantillon à un laboratoire, il est important de vérifier la cohérence entre vos besoins (cf. résidus
de pesticides jugés prioritaires dans la filière concernée) et la liste multirésidus proposée par le laboratoire. Cette comparaison
guidera votre choix.
Pour en savoir plus rendez-vous CHAPITRE 1. § 1.5
◆ La dénition du résidu pour chaque substance active : les métabolites et produits de dégradation des pesticides reconnus
par la législation ne sont pas tous commercialisés ; les acheter peut également augmenter significativement le cout de revient
de l’analyse. Certains laboratoires font donc le choix de ne pas les analyser systématiquement. Les résultats peuvent s’en trouver
impacter.
N’hésitez pas à demander des précisions aux laboratoires à ce sujet, avant de comparer leurs résultats.
Pour en savoir plus rendez-vous CHAPITRE 1. § 1.4
◆ L’unité de concentration dans laquelle est exprimé le résultat : selon le mode de prélèvement de l’échantillon, la
concentration d’un résidu d’une substance phytosanitaire est indiquée soit en milligramme de substance par litre d’échantillon
(mg/L) soit en milligramme de substance par kilogramme d’échantillon (mg/kg ou ppm). Les HEs étant des liquides plus ou
moins visqueux, les 2 protocoles sont parfois utilisés. Leur densité, plus elle s’éloigne de 1, peut conduire à des différences
significatives entre valeurs de concentration si ces dernières sont exprimées dans des unités différentes.
Multiplier la concentration exprimée en mg/L par la densité de l’échantillon permet de l’exprimer en mg/kg. Exprimées dans la
même unité, les valeurs peuvent alors être comparées.
Pour en savoir plus rendez-vous CHAPITRE 1. § 2.1
◆ Les performances des méthodes utilisées : du choix des protocoles expérimentaux et des « prouesses » des instruments
analytiques dépendent fortement la capacité des méthodes à détecter de très faibles teneurs en pesticides dans les
échantillons… jusqu’à certaines limites. La première valeur « seuil » est nommée « limite de quantification » (LOQ, voire RL pour
« reporting limit ») : En deçà de cette valeur, le signal du pesticide est si faible que la méthode ne peut le quantifier avec exactitude.
La seconde valeur seuil est désignée sous le terme « limite de détection » (LOD) : En deçà de cette valeur, aucun signal pouvant
correspondre à l’analyte n’a été détecté, soit parce que la méthode n’est pas assez « sensible » pour le faire, soit parce que le
pesticide est absent de l’échantillon.
Le schéma ci-dessous résume les différentes situations rencontrées en comparant les concentrations seuils (LOD, LOQ) avec la
concentration du pesticide (Cpest).
Seuil de
concentration
Mesure Cpest ‹ LOD LOD ‹ Cpest ‹ LOQ Cpest › LOQ
Notation ‹ LOD DNQ
détecté mais non quantifié Cpest
LOD LOQ
Pour en savoir plus rendez-vous CHAPITRE 1. § 2.2
SOMMAIRE
15
LE DOSAGE DES PESTICIDES DANS LES HUILES ESSENTIELLES
Notez que LOQ et LOD varient d’une substance à une autre, d’une technique analytique à une autre et, plus insidieusement,
d’un type d’échantillon à un autre. Notamment, les constituants des HEs, multiples et variés, influencent fortement les
performances des méthodes analytiques. L’impact est plus ou moins marqué d’ailleurs d’une HE à une autre (lavande, citron,
menthe…). Ce phénomène, redouté par les spécialistes mais un peu moins connu des néophytes, s’appelle les « effets (de)
matrice ». Pour être pertinentes et fiables, LOQ et LOD doivent être calculées en présence des constituants matriciels de
l’échantillon (ce qui n’est pas toujours possible ou le cas).
Les performances des méthodes peuvent différées sensiblement d’un laboratoire à l’autre en fonction des choix méthodologiques
qui ont été pris (méthode de préparation des échantillons, type d’appareillage, mode de détermination des LOD et LOQ). Une
bonne connaissance des protocoles, des systèmes de notations, et des limites analytiques, est nécessaire pour interpréter plus
finement les résultats fournis.
Pour en savoir plus rendez-vous CHAPITRE 1. § 2.1
◆ L’échantillonnage parfois en cause. Tout délai dans la conservation des échantillons ou dans l’extraction des résidus de
pesticides, augmente le risque de dégradation des résidus présents, notamment ceux à durée de vie courte (organophosphorés,
carbamates). Ceci augmente l’incertitude par rapport aux résultats analytiques et leur variabilité si les analyses sont réalisées par
2 laboratoires différents, à des périodes de l’année différentes, et si la parfaite maîtrise des conditions de stockage et de
manipulation ne sont pas assurées.
◆ Quelques pesticides « à problème ». Parce qu’ils se dégradent facilement dans certaines conditions, avant ou pendant le
processus analytique, ou parce qu’ils existent sous plusieurs formes isomères distinctes, certains pesticides restent difficiles à
analyser ; une plus grande variabilité des résultats obtenus sur un même échantillon peut alors être observée.
C’est par exemple le cas du Dicofol, connu pour se dégrader rapidement en en p,p’-Dichlorobenzophénone (DCBP), aussi bien
en plein champ qu’au cours de l’analyse (pendant le stockage de l’échantillon, la préparation de l’échantillon ou dans l’instrument
analytique). Son produit de dégradation, la DCBP ne fait pas partie de la définition du résidu du Dicofol. Il est donc important de
détecter le Dicofol en tant que tel et, pour un laboratoire, de tout mettre en œuvre pour en minimiser les pertes pendant
l’analyse.
SOMMAIRE
2. LES RÉPONSES AUX 10 QUESTIONS LES PLUS FRÉQUENTES
16
8. Finalement, quelle limite de détection et de quantification est acceptable
dans le cas des HEs ?
Généralement, une LOQ est fixée pour répondre à une exigence réglementaire (typiquement, vérifier que le résidu ne dépasse pas
la LMR). Dans la mesure où il n’existe pas de réglementation dans les HEs, et en particulier pas de LMR, répondre à cette question
reste délicat.
Avec les techniques LC-MS/MS et GC-MS/MS classiquement utilisées, on est en droit d’attendre des LOQ comprises entre 0.01
et 0.1 mg/kg (ou ppm, soit entre 10 et 100 ppb) pour la plupart des pesticides et dans la plupart des échantillons. Comme
mentionné plus haut, cette valeur est « pesticide et matrice dépendante » ; en d’autres termes, des valeurs plus élevées de LOQ
peuvent être légitimes pour certaines substances dans des matrices particulièrement complexes (HE patchouli par exemple). De
même, un interférent ponctuel de la matrice, mimant le signal de la substance dosée, peut imposer au laboratoire de « remonter »
ses seuils de détection et de quantification, pour réduire le risque de faux-positifs.
Exemple : cas du biphenyl dans l’huile essentielle d’orange
x102
3,5
2,5
1,5
4
3
2
1
0,5
0
0 8,81 8,82 8,83 8,84 8,85 8,86 8,87 8,88 8,89 8,90 8,91 8,92 8,93 8,94
Abondance relative (%)
154.0>153.0 154.0>152.0 Ratio = 50,8 (67,8%) 153.0>152.1 Ratio = 153,2 (241,3%)
154.0>153.0 154.0>152.0 Ratio = 75,9 (101,5%) 153.0>152.1 Ratio = 68,0 (107,0%)
x102
0,6
1
0,8
0,4
0,2
0
0 8,81 8,82 8,83 8,84 8,85 8,86 8,87 8,88 8,89 8,90 8,91 8,92 8,93 8,94
Temps d'acquisition (min)
Abondance relative (%)
HE orange non dopée
Interférent
(3 transitions SRMs
d’intensité différente)
Biphenyl
(3 transitions SRMs
d’intensité égale)
HE orange dopée en biphenyl
Un composé de l’huile essentielle d’orange est détecté avec les mêmes transitions SRMs que le biphényl et à un temps de rétention
très proche (8.86 min au lieu de 8.89 min). Seul l’étude du ratio SRMs permet d’identifier ce composé comme un interférent.
Pour le laboratoire prestataire de l’analyse comme pour le client, il est important d’avoir confiance dans la validité des résultats
rendus. Cette confiance n’est accordée que si des preuves suffisantes sont apportées pour témoigner de la fiabilité des données.
Etant donné l’absence actuelle de réglementation, la complexité et la diversité des HEs, il est sans doute plus pertinent pour un
laboratoire soucieux de la validité de ses résultats, d’indiquer des seuils de quantification « plus élevés » (ex : 0.1 mg/kg) qu’il sait
atteignables (i.e. preuves à l’appui), que des seuils « plus bas », inaccessibles dans bien des cas. En particulier, des valeurs de LOQ
faibles (ex : 0.01 mg/kg) et identiques pour tous les pesticides et ce, quelle que soit l’HE, doivent inciter les clients à enquêter
auprès du laboratoire prestataire pour comprendre sa façon de les déterminer.
Pour en savoir plus rendez-vous CHAPITRE 2. § 2.4 et CHAPITRE 3. § 3.2
SOMMAIRE
17
LE DOSAGE DES PESTICIDES DANS LES HUILES ESSENTIELLES
9. Que faire lorsqu’un ou plusieurs pesticides ont été retrouvés dans une HE ?
La remise en cause de la sûreté des HEs est un motif compréhensible de litiges commerciaux entre partenaires ; il est donc crucial
d’apporter des réponses adaptées aux questions que peut se poser chaque partie.
Voici quelques recommandations à destination de tous les acteurs qui sont confrontés à la présence de résidus de pesticides dans
les HEs qu’ils produisent, achètent ou utilisent :
◆ S’informer pour mieux connaitre les substances retrouvées :
• Quelle est son spectre d’action ? insecticide, fongicide… ?
• Sur quelle culture est-elle appliquée ? Est-ce cohérent avec la production végétale à l’origine de l’HE contaminée ? Par exemple,
retrouver dans une HE d’orange un insecticide qui est autorisé pour la production d’agrumes n’est pas une totale aberration…
• Quel est son statut réglementaire dans le pays de production ? au sein de la Communauté Européenne ? les différences législatives
entre pays expliquent parfois la présence de pesticide interdit en Europe. Des sites-clé d’informations sont listés dans le dossier
technique du guide. Rappelons cependant que du strict point de vue réglementaire, une telle HE importée peut difficilement
être qualifiée de « non-conforme » puisqu’aucune loi dans le monde n’impose de limite de résidus dans les HEs.
Pour en savoir plus rendez-vous CHAPITRE 1. § 1.3 et § 1.4
◆ Se rapprocher du laboratoire prestataire, pour s’assurer de la fiabilité des résultats (cf. Question 10) mais également bénéficier
de leur expertise sur le sujet. Par exemple, certains pesticides sont connus pour être des contaminants persistants dans les sols
et nappes phréatiques. Bien que leur utilisation soit interdite depuis de nombreuses années, leurs résidus continuent de polluer
les produits d’origine végétale et animale.
Pour en savoir plus rendez-vous CHAPITRE 3. §
◆ Enquêter à toutes les étapes du cycle de production de l’HE pour tenter d’identifier celles qui sont le plus exposées au
risque de contaminations croisées (sites d’extraction et de transformation, futs de stockage, conditions de transport…). Inutile
de cacher que cette démarche est longue et semée d’embuches ; elle est d’autant plus fastidieuse que l’accès direct aux
producteurs et (nombreux) intermédiaires reste impossible dans de nombreux pays exportateurs, et que la traçabilité y fait
cruellement défaut.
In fine, avec les informations collectées, et à la lumière de la future utilisation de l’HE (diluée dans un arôme, formulée dans un
produit cosmétique ou diététique, ou inhalée…), la décision de refuser ou non un lot d’HEs sous motif qu’il contient des résidus
de pesticides, n’appartient qu’aux partenaires. Aucune donnée ou étude scientifique portant sur la relation entre 1) résidus de
pesticides dans les HEs et 2) risque d’exposition des consommateurs, n’est en effet publiée à ce jour.
10. Quelles questions dois-je poser au laboratoire d’analyse de pesticides
avant de lui envoyer mes échantillons ?
Il est important pour le client d’avoir confiance dans le laboratoire à qui il va confier ses analyses. Voici quelques questions à lui
poser pour se faire une idée (avec des éléments de réponse dans le dossier technique du guide).
◆ Concernant la connaissance des HEs :
• Quel type d’HE avez-vous analysé ?
• Que faites-vous lorsque vous recevez une HE que vous n’avez jamais analysée ?
◆ Concernant la méthodologie utilisée :
• Quelle technique de préparation d’échantillon utilisez-vous pour les HEs ?
• Quelle technique analytique utilisez-vous pour doser les résidus de pesticides dans les HEs ?
• Quelles vérifications faites-vous en cas de résultats positifs ? / Comment confirmez-vous l’identité d’un pesticide détecté ?
• Comment déterminez-vous la concentration de pesticide dans l’HE ? Quelle méthode de quantification utilisez-vous pour prendre en
compte les effets matrice ?
SOMMAIRE
2. LES RÉPONSES AUX 10 QUESTIONS LES PLUS FRÉQUENTES
18
◆ Concernant les performances de la méthode :
• Comment sont déterminées les limites de quantification dans les HEs ? Vérifiez-vous que vous détectez bien tous les pesticides à la LOQ
annoncée ?
• La méthode utilisée pour les HEs, est-elle validée ? / Pour quelle HE, la méthode est-elle validée ?
• Vos protocoles de validation suivent-ils les recommandations de texte de référence comme le guide SANTE 11945/2015 ? si non, quel
protocole de validation suivez-vous ?
• Avez-vous participé récemment à des essais interlabotatoires portant sur l’analyse des résidus de pesticides dans les HEs ? Si oui, les
résultats de votre laboratoire sont-ils publics et accessibles ?
◆ Concernant l’environnement qualité :
• De quelle accréditation/certification bénéficie votre laboratoire ? ( ISO 17025, autre ?)
• La méthode d’analyse des résidus de pesticides dans les HEs est-elle accréditée ?
Remarque : la certification ou l’accréditation d’un système qualité d’un laboratoire ne garantit pas la fiabilité de ses « produits »,
c’est-à-dire, ne garantit pas la fiabilité de ses méthodes d’analyse.
Ainsi, un « laboratoire accrédité Cofrac » est un laboratoire ayant acquis la reconnaissance de son organisation et de l’exercice de
son activité selon une déontologie et des règles de l’art internationalement acceptées (impartialité, indépendance, compétence),
par un organisme d’évaluation de la conformité (ici, le Cofrac). La certification d’une méthode d’analyse est un processus
complémentaire et totalement indépendant. Elle atteste de la fiabilité et de la pertinence de la méthode (de l’échantillonnage
au rendu du résultat), et des résultats pour répondre aux attentes ou aux objectifs fixés.
Pour en savoir plus rendez-vous CHAPITRE 2. § 2.2 à 2.4 et CHAPITRE 3.
SOMMAIRE
3. DOSSIER TECHNIQUE
20
INTRODUCTION :
BULLETIN D’ANALYSE
LISTE DES 75 PESTICIDES
PRIORITAIRES
PESTICIDES /
SUBSTANCES
ACTIVES
RESULTAT
CONCENTRATION
(mg/kg ou mg/L)
LIMITE DE
QUANTIFICATION
OU DETERMINATION
OU REPORTING LIMIT
METHODE
2,4,6 TCP < LOD 0.010 GC-MS/MS
4,4 dichlorobenzophenone 0.035 0.010 GC-MS/MS
Aldrin < LOD 0.010 GC-MS/MS
Atrazine DNQ 0.010 GC-MS/MS
Azoxystrobin 0.899 0.025 GC-MS/MS
Bifenthrin 0.897 0.010 GC-MS/MS
Biphenyl < LOD 0.050 GC-MS/MS
Bromopropylate < LOD 0.010 GC-MS/MS
Buprofezin < LOD 0.004 LC-QTOF
Butralin < LOD 0.010 GC-MS/MS
Carbaryl < LOD 0.020 LC-QTOF
Carbofuran DNQ Non défini LC-QTOF
(screening)
Chlorfenvinphos < LOD 0.010 GC-MS/MS
Chlorpyrifos 2.305 0.010 GC-MS/MS
Chlorpyrifos Methyl < LOD 0.010 GC-MS/MS
Cyhalothrin I (lambda) 0.375 0.025 GC-MS/MS
Cypermethrin 0.261 0.025 GC-MS/MS
DDD, o,p'- < LOD 0.010 GC-MS/MS
DDD, p,p'- < LOD 0.010 GC-MS/MS
DDE, o,p'- < LOD 0.010 GC-MS/MS
DDE, p,p'- < LOD 0.010 GC-MS/MS
DDT, p,p'- < LOD 0.050 GC-MS/MS
Deltamethrin < LOD 0.025 GC-MS/MS
Diazinon < LOD 0.010 GC-MS/MS
Dicofol DNQ Non défini GC-MS/MS
Dieldrin < LOD 0.010 GC-MS/MS
Difenoconazole DNQ Non défini LC-QTOF
(screening)
Diflubenzuron DNQ Non défini LC-QTOF
Screening
Dimethoate < LOD 0.004 LC-QTOF
Diphenylamine DNQ 0.010 GC-MS/MS
Endosulfan (alpha isomer) < LOD 0.010 GC-MS/MS
Le cas particulier
du biphényl
CHAPITRE 2…
Lorsque le résidu
prend en compte
les produits
de dégradation
du pesticide…
CHAPITRE 2…
Le Dicofol,
un pesticide difficile
à analyser
CHAPITRE 2…
Les facteurs qui
influencent le choix
de la technique
analytique ?
CHAPITRE 2…
Les facteurs
qui influencent
les performances
de la méthode.
Zoom sur les
« effets matrices »
CHAPITRE 2…
SOMMAIRE
LE DOSAGE DES PESTICIDES DANS LES HUILES ESSENTIELLES
21
PESTICIDES /
SUBSTANCES
ACTIVES
RESULTAT
CONCENTRATION
(mg/kg ou mg/L)
LIMITE DE
QUANTIFICATION
OU DETERMINATION
OU REPORTING LIMIT
METHODE
Endosulfan (beta isomer) < LOD 0.010 GC-MS/MS
Endosulfan sulfate DNQ 0.010 GC-MS/MS
Ethion < LOD 0.025 GC-MS/MS
Fenpropathrin 0.074 0.025 GC-MS/MS
Fenthion < LOD 0.010 GC-MS/MS
Fenthion sulfoxide < LOD 0.010 GC-MS/MS
Fenthion-sulfone < LOD 0.025 GC-MS/MS
Fluazifop-p-butyl < LOD 0.010 GC-MS/MS
Flufenoxuron < LOD 0.010 GC-MS/MS
Fluvalinate-tau < LOD 0.010 GC-MS/MS
Folpet < LOD 0.025 GC-MS/MS
Hexachlorobenzene < LOD 0.010 GC-MS/MS
Imazalil 0.020 0.020 LC-QTOF
Lindane < LOD 0.010 GC-MS/MS
Lufenuron DNQ 0.010 GC-MS/MS
Malaoxon < LOD 0.010 GC-MS/MS
Malathion DNQ 0.020 LC-QTOF
Metalaxyl < LOD 0.020 LC-QTOF
Methidathion 0.462 0.010 GC-MS/MS
Omethoate < LOD 0.020 LC-QTOF
Paraoxon-methyl < LOD 0.020 LC-QTOF
Parathion methyl < LOD 0.100 GC-MS/MS
Pendimethalin < LOD 0.010 GC-MS/MS
Pentachloroanisole < LOD 0.010 GC-MS/MS
Permethrin < LOD 0.100 GC-MS/MS
Phenylphenol, o- < LOD 0.025 GC-MS/MS
Phosmet 0.706 0.020 LC-QTOF
Piperonyl butoxide < LOD 0.020 LC-QTOF
Pirimiphos-methyl < LOD 0.010 GC-MS/MS
Prochloraz < LOD 0.020 LC-QTOF
Procymidone DNQ 0.010 GC-MS/MS
Profenofos 0.013 0.010 GC-MS/MS
Propargite 4.030 0.020 LC-QTOF
Propyzamide < LOD 0.010 GC-MS/MS
Prothiofos < LOD 0.010 GC-MS/MS
Pyraclostrobin 0.728 0.040 LC-QTOF
Pyrimethanil < LOD 0.010 GC-MS/MS
Pyriproxyfen 0.011 0.010 GC-MS/MS
Tebuconazole 0.635 0.020 LC-QTOF
Tetradifon < LOD 0.010 GC-MS/MS
Triazophos < LOD 0.020 LC-QTOF
Trifloxystrobin 0.455 0.004 LC-QTOF
Trifluralin < LOD 0.010 GC-MS/MS
SOMMAIRE
3. DOSSIER TECHNIQUE
22
CHAPITRE 1 :
LISTE DE PESTICIDES
RECHERCHÉS
1.1. Quelques définitions utiles
◆ Pesticide
Étymologiquement, un pesticide est « un destructeur de ravageurs » (de l’anglais « pest » = ravageur). Le terme « pesticides »
regroupe les substances chimiques, naturelles ou de synthèse, destinées à prévenir, stopper ou réguler le développement
d’organismes nuisibles ou pathogènes des plantes ou des animaux.
Au-delà des produits à usage agricole ou destinés à l’entretien des espaces verts (également appelés « produits phytosanitaires »),
certains produits biocides et les antiparasitaires humains et vétérinaires sont également considérés comme pesticides par
l'Observatoire des Pesticides (Figure 1, www.observatoire-pesticide.fr).
Figure 1 : Cadres réglementaires régissant la mise sur le marché des pesticides
(Source : www.observatoire-pesticide.fr, reproduit avec autorisation
Produits phytopharmaceutiques
Produits anciens
ou interdits
mais persistants
Antiparasitaires
vétérinaires
Antiparasitaires
humains
Produits biocides
Reg. 1107/2009/CE
Dir. 2004/28/CE
Dir. 2004/27/CE Reg. 528/2012/CE
Les pesticides sont classés en sous-famille en fonction :
• de leur spectre d’action. Notons que certains pesticides sont très « sélectifs » et ne détruisent qu’un seul type de parasites
donné ; d’autres le sont moins et peuvent avoir des effets nocifs sur des espèces vivantes non ciblées, y compris les animaux
de compagnie et les humains.
Table 1 : Classification des pesticides selon leur spectre d’action
Acaricide Algicide Anticoagulant Agent attractif Avicide
Bactéricide Défoliant Déshydratant Fongicide Herbicide
Insecticide Miticide Molluscicide Nématicide Piscicide
Prédacide Régulateur de croissance Répulsif Rodenticide Silvicide
• des substances actives ou ingrédients actifs qu’ils renferment. Exemple : organochlorés (DDT, Lindane…), les organophosphorés
(Glyphosate, Malathion, Parathion…), les Triazines (Atrazine…), etc.
SOMMAIRE
LE DOSAGE DES PESTICIDES DANS LES HUILES ESSENTIELLES
23
Figure 2 : Classification des pesticides selon leur substance active (exemples)
DDT Glyphosate Atrazine
◆ Produits phytosanitaires (en anglais, PPPou «Plant Protection Products»)
Ce sont les pesticides destinés spécifiquement à la protection des plantes et des cultures, aussi bien dans le secteur agricole et
l’horticulture que pour les zones d’agrément et les jardins familiaux.
Le guide étant destiné aux pesticides retrouvés dans les huiles essentielles issues de productions végétales, les termes « pesticide »
et « produit phytosanitaire » auront la même signification et seront donc utilisés indifféremment dans la suite du document.
◆ Substances actives, ingrédients actifs
Ce sont souvent des molécules chimiques, pour la plupart synthétiques mais également d’origine naturelle (pyrethrine, rotenone)
desquelles découlent l’essentiel des propriétés du pesticide. Ce sont très généralement ces molécules qui sont analysées par les
laboratoires.
Autres ingrédients actifs possibles des pesticides : micro-organismes, virus, extraits de plantes, écomones (ex : phéromones), etc.
◆ Produits phytopharmaceutiques
Ces sont les substances actives des produits phytosanitaires, destinées à protéger la plante et/ou à favoriser son développement.
◆ Formulations commerciales
Présentes sous différentes formes (liquides, solides, granulés, poudre), elles sont composées de substance(s) active(s) et d’adjuvants.
Les adjuvants sont ajoutés pour faciliter la dissolution des substances actives, leur utilisation et leur efficacité sur le ravageur ciblé.
Pour aller plus loin…
• Définitions, chiffres-clés du marché, réglementation, résultats de plans de contrôle en France et en Europe… figurent sur le
site de l’OBSERVATOIRE DES PESTICIDES (www.observatoire-pesticide.fr).
1.2. L’usage très réglementé des pesticides dans l’UE
Le principal objectif de la législation phytosanitaire de l’Union consiste à protéger la sécurité des denrées alimentaires produites à
partir de végétaux et garantir la santé et la qualité des cultures dans tous les États membres. Ceci passe tout d’abord par le contrôle
de la vente et de l’usage des pesticides.
Avant d’entrer dans la formulation de produits commerciaux, les substances actives des pesticides subissent une évaluation
intensive en vue de l’obtention d’une « Autorisation de Mise sur le Marché » ou AMM.
◆ Procédure d’évaluation en vue d’une AMM
Elle se fait à la demande du metteur sur le marché (fabriquant, vendeur), en 2 étapes :
• l’Union Européenne, via un État membre rapporteur et par l’intermédiaire de l’autorité européenne de sécurité des aliments
(EFSA : European Food Safety Authority), évalue et approuve la(les) substance(s) active(s) utilisée(s) dans le pesticide ;
• Les États membres évaluent et autorisent, au niveau national, les produits eux-mêmes.
◆ Objectifs principaux de l’évaluation
Évaluer l’efficacité biologique de la préparation et mesurer les risques toxiques et les dangers pour les organismes vivants non
ciblés, ainsi que les risques de contaminations environnementales.
◆ Contenu de l’AMM
Y figurent tous les usages pour lesquels le produit est autorisé et les recommandations d’utilisation : objectifs visés, types de
culture, dose et conditions d’utilisation (ex : délai avant récolte).
◆ Période de validité
Une AMM est délivrée pour une durée maximale de 10 ans ; elle est renouvelable.
Au niveau européen, 423 substances actives sont actuellement autorisées, ce qui représente environ 4000 produits phytosanitaires
bénéficiant d’une AMM (source agriculture.gouv.fr).
SOMMAIRE
3. DOSSIER TECHNIQUE
24
En ce qui concerne les produits phytosanitaires, la Directive 1107/2009 abroge les directives 79/117/CEE et 91/414/CEE pour
ce qui est de la mise sur le marché des produits phytopharmaceutiques. On notera en particulier le règlement d’exécution n°
540/2011 qui concerne la liste des substances actives approuvées dans l’Union Européenne (Voir Figure 1 pour connaître les
autres directives en vigueur en matière de pesticides).
Pour aller plus loin…
• Généralités sur les AMM et leur délivrance : agriculture.gouv.fr/tout-savoir-sur-les-pesticides-et-leurs-autorisations-de-mise-
sur-le-marche
• Décisions individuelles d’AMM délivrées depuis le 1er juillet 2012 : www.anses.fr
• Liste des produits autorisés en France (et les conditions d’utilisation) par type de culture, d’usage ou de ravageurs :
e-phy.agriculture.gouv.fr
◆ Le cas particulier de l’agriculture biologique
Rappelons qu’en agriculture biologique, l’usage de produits chimiques de synthèse (pesticides et engrais) est interdit ; seuls
peuvent être utilisés les produits phytosanitaires listés à l’annexe II du règlement (CE) n° 889/2008, parmi lesquels on trouve
des substances d’origine animale, végétale (Pyréthres) ou minérale, des micro-organismes, etc. ; parmi celles-ci, l’huile essentielle
d’orange douce qui entre dans la composition de plusieurs spécialités commerciales exploitant son activité acaricide et insecticide.
Pour aller plus loin…
• Règlement d’exécution (UE) n° 1274/2011 de la Commission du 7 décembre 2011 concernant un programme de contrôle,
pluriannuel et coordonné, de l’Union pour 2012, 2013 et 2014, destiné à garantir le respect des teneurs maximales en résidus
de pesticides dans et sur les denrées alimentaires d’origine végétale et animale et à évaluer l’exposition du consommateur à
ces résidus
• Règlement (CE) n° 889/2008 de la Commission du 5 septembre 2008 portant sur les modalités d’application du règlement
(CE) n° 834/2007 du Conseil relatif à la production biologique et à l’étiquetage des produits biologiques en ce qui concerne
la production biologique, l’étiquetage et les contrôles
1.3. Qu’en est-il dans le reste du monde ?
◆ Marché des pesticides
Les premiers consommateurs de produits phytosanitaires mondiaux sont les États-Unis, le Brésil et le Japon. Viennent ensuite La
France et l’Allemagne. Le marché mondial des pesticides par région du monde est illustré sur la Figure 3. Il représente aujourd’hui
environ 50 milliards de dollars et concernent majoritairement les herbicides (46.9%), les fongicides (25.9%) et les insecticides (24.1%)
(Source : Union des Industries de la Protection des Plantes, Organisation des Nations Unies pour l’alimentation et l’agriculture).
Figure 3 : Répartition mondiale de la consommation de produits phytosanitaires
Amérique du Nord
20,6 %
Amérique Latine
20,8 %
Asie
23,1 %
Europe
31,7 %
Afrique
3,8 %
SOMMAIRE
25
LE DOSAGE DES PESTICIDES DANS LES HUILES ESSENTIELLES
◆ Réglementation de l’utilisation des pesticides
D’après l’Organisation des Nations Unies pour l’alimentation et l’agriculture (Food and Agriculture Organisation), « de nos jours,
quasiment tous les pays disposent d’une législation sur les pesticides et les produits sont généralement mieux étiquetés ».Ce
constat arrive 30 ans après le lancement par la FAO du Code international de conduite sur la distribution et l’utilisation des
pesticides (dernière mise à jour en 2013), invitant les 194 pays représentés à s’assurer que leurs cadres de réglementation de la
gestion des pesticides sont à jour. En dépit des progrès significatifs réalisés, la FAO estime qu’il reste encore beaucoup à accomplir
pour éliminer du marché les substances les plus toxiques, améliorer l’étiquetage des produits utilisés et les procédures d’usage
(notamment dans les pays en transition économique ou en voie de développement). Les règles en vigueur divergent encore
considérablement d’un pays à l’autre, tant sur le plan des pratiques culturales qu’en matière de réglementation ou de traçabilité.
Des informations sur les législations nationales en vigueur dans plusieurs pays du monde sont disponibles sur les sites officiels des
agences nationales de sécurité alimentaire, certains pouvant également proposer des bases de données sur le sujet (souvent dans
la langue du pays, plus ou moins actualisées et faciles d’accès).
Pour aller plus loin…
• Pour en savoir plus sur la FAO et le Code international de conduite sur la distribution et l’utilisation des pesticides : http ://
www.fao.org/news/story/fr/item/346165/icode/
• Organisation Mondiale pour la santé (OMS/WHO), pesticides : http ://www.who.int/topics/pesticides/en/
• Agence américaine pour la protection de l’environnement, pesticides : http ://www.epa.gov/pesticides/
◆ Réglementation dans les pays producteurs d’HEs
Les principaux pays producteurs d’HEs (Table 2) sont :
• sur le continent américain : les États-Unis, le Brésil, l’Argentine, le Mexique, le Paraguay, l’Uruguay et le Guatemala,
• en Asie : la Chine, l’Inde et l’Indonésie,
• en Afrique : le Maroc, l’Égypte, la Côte d’Ivoire et Madagascar,
• en Europe : l’Italie, l’Espagne, la France et le Portugal
65% de la production mondiale émanent en fait de pays en voie de développement disposant d’une main-d’œuvre bon marché et
d’une économie majoritairement rurale ; les manquements en matière de pratiques pour la gestion du cycle de vie des pesticides
(défauts de formation des opérateurs, de législation, de traçabilité et de contrôle) y sont également les plus fréquents.
Table 2 : Production mondiale d’huiles essentielles
HEs Production 2008 (Tonnes) Pays producteurs
Orange 51 000 Brésil, États-Unis, Espagne, Argentine
Menthe des champs 32 000 Inde, Chine, Argentine
Citron 9 200 Argentine, Italie, Espagne
Eucalyptus 4 000 Chine, Inde, Australie, Afrique du Sud
Menthe poivrée 3 300 Inde, États-Unis, Chine
Clou de girofle 1 800 Indonésie, Madagascar
Citronnelle 1 800 Chine, Sri Lanka, États-Unis
Menthe verte 1 800 États-Unis, Chine
Bois de cèdre 1 650 États-Unis, Chine
Litsea cubeba 1 200 Chine
Patchouli 1 200 Indonésie, Inde
Lavandin 1 100 France
Eucalyptus citronné 1 000 Chine, Brésil, Inde, Vietnam
Perfumer & Flavorist, A preliminary report on the world production of some selected essential oils and countries, Vol. 34, January 2009.
SOMMAIRE
3. DOSSIER TECHNIQUE
26
Le Tableau 3 liste quelques pays producteurs d‘HEs publiant, sur des sites référencés, des données réglementaires concernant les
produits phytosanitaires autorisés sur les cultures végétales concernées (plus ou moins complètes et à jour…).
Table 3 : Données réglementaires disponibles sur internet pour différents pays
Pays Source/site Web Notes
Codex
FAO – Codex
http ://www.fao.org/fao-who-codexalimentarius/standards/
pestres/pesticides/fr/
Une base de données des LMR adoptées par
le Codex.
Consultable par pesticide ou selon les produits
concernés
Site en français
Brésil ANVISA (Agence Brésilienne de Sécurité Alimentaire)
http ://portal.anvisa.gov.br/agrotoxicos
« Fiches d’agrotoxiques » (PDF) incluant les
LMR.
Site en portugais
USA
Electronic Code of Federal Regulations (e-CFR)
http ://www.ecfr.gov/cgi-bin/text-
idx ?SID=772f0ee0c413864c6f0e
9c569d461cc7&mc=true&node=pt40.26.180&rgn=div5
Tolérances pour les résidus de pesticides, cf.
“Title 40 : Protection of Environment”, part
180 : “tolerances and exemptions for pesticide
chemical residues in food”
Union Européenne
Commission Européenne
http ://ec.europa.eu/food/plant/pesticides/eu-pesticides-
database/public/ ?event=download.MRL
Base de données des LMR de l’UE et statut
d’autorisation des pesticides
Consultable par pesticide ou type de culture
Comprend des liens vers la règlementation sur
les LMR de la Commission Européenne
Site en anglais
Inde FSSAI (Food Safety and Standards Authority of India)
http ://www.fssai.gov.in/Default.aspx
LMR fournies dans Food Safety and Standards
Regulations (2010)
Site en anglais
Chine
(sur le site de l’USDA, département de l’agriculture des
États-Unis)
http ://gain.fas.usda.gov/Recent%20GAIN%20
Publications/Maximum%20Residue%20Limits%20
for%20Pesticides%20in%20Food_Beijing_China%20-%20
Peoples%20Republic%20of_4-30-2014.pdf
Document pdf avec LMR ici :
http ://202.127.42.84/tbt-sps/indexEnglish.do
en anglais
Australie
Nouvelle Zélande
FSANZ (Food Standards Australia New Zealand)
http ://www.foodstandards.gov.au/code/Pages/default.aspx
Liste de LMR
Site en anglais
Afrique du Sud
Department : Agriculture, Forestry and Fisheries (http ://
www.daff.gov.za/)
http ://www.daff.gov.za/daffweb3/Branches/Agricultural-
Production-Health-Food-Safety/Food-Safety-Quality-
Assurance/Maximum-Residue-Limits
Informations générales et liste LMR
Site en anglais
Base de données
payante
Homologa ™
http ://www.homologa-new.com/pls/
apex/f ?p=550 :1 :0 : :NO
informations législatives sur l’utilisation des
pesticides et MRL d’environ 80 pays
Site en anglais
SOMMAIRE
27
LE DOSAGE DES PESTICIDES DANS LES HUILES ESSENTIELLES
1.4. Les résidus de pesticides au cœur des débats
◆ Dénition du terme «Résidu»
Une fois appliquée sur le végétal, chaque substance active est susceptible de se dégrader sous l’influence de facteurs physico-
chimiques (température, rayonnement UV, eau) ou biologiques (métabolisation par la plante). Le terme de « résidus » désigne
alors l’ensemble des substances retrouvées dans les matrices contaminées, constituant le reliquat de l’emploi d’un pesticide.
En général, la substance active appliquée (SA), appelée aussi molécule mère, reste le composé majoritaire dans la plante et le
résidu est défini comme la substance active elle-même.
SA résidu = SA reliquat
Lorsque des métabolites majoritaires ou produits associés ont été identifiés, ils sont inclus dans la définition du « résidu » et
doivent, dans la mesure du possible (notamment si le standard analytique est disponible à un coût raisonnable), être pris en
compte lors de l’analyse.
Table 4 : Définition du résidu pour quelques exemples de pesticides
SA résidu = SA reliquat + metabolites + autre(s) produit(s) de dégradation
Exemples
Carbendazime : carbendazime et benomyl (somme du benomyl et de la carbendazime
exprimée en carbendazime)
DDT : somme des ppDDT opDDT ppDDE et DDD exprimée en DDT
Dieldrine : aldrine et dieldrine combinées exprimées en dieldrine
Diméthoate : somme du diméthoate et d'ométhoate exprimée en diméthoate
Malathion : somme du malathion et du malaoxon exprimée en malathion
Parathion méthyle : parathion méthyle et paraoxon méthyle exprimés en parathion méthyle
Phosmet : phosmet et phosmet oxon exprimés en phosmet
Prochloraze : somme du prochloraze et de ses métabolites 2,4,6 Trichlorophénol exprimée
en prochloraze
◆ Qu’appelle t’on «limites maximales de résidus» (LMR) ?
Afin de protéger les consommateurs de l’exposition à des teneurs en résidus inacceptables dans les produits destinés à la
consommation, des limites maximales applicables aux résidus (LMR) sont fixées pour un grand nombre de denrées destinées à
l’alimentation humaine et animale.
Dans l’Union Européenne, la législation concernant les LMR de pesticides est harmonisée entre les États membres (Règlement
(CE) n° 396/2005 de 23 février 2005) ceci pour des dizaines de milliers de combinaison pesticide/culture. En l’absence de
recommandations, une valeur par défaut de 0,01 mg/kg est préconisée.
Les LMR inscrites au règlement UE sont généralement plus faibles que les LMR inscrites au règlement des autres pays du monde.
Elles imposent aux acteurs de la filière agricole européenne de suivre les directives européennes (et nationales) en matière de
bonnes pratiques agricoles (BPA), sous peine d’être dépassées. Elles permettent aussi de minimiser les risques sanitaires (toxicité)
et environnementaux (pollution).
Pour les cultures qui s’effectuent en dehors de l’Union Européenne, les LMR sont fixées à la demande du pays exportateur (Direction
générale Santé et consommateurs).
◆ Comment sont établies les LMR ?
L’élaboration d’une LMR pour une combinaison culture/pesticide donnée est une procédure qui se déroule en deux étapes
distinctes correspondant à :
la définition de la Bonne Pratique Agricole critique (BPAc). Elle correspond à la pratique qui conduit au niveau maximal acceptable
de résidus de pesticides obtenue avec généralement le Délai Avant Récolte (DAR) le plus court, la dose par hectare la plus élevée,
le nombre maximum d’application par saison.
la mise en place des essais résidus.
Telle qu’elle est établie, la LMR apparaît comme une norme agronomique, reflet d’une utilisation de la substance active conforme
à une bonne pratique agricole, et non comme une norme toxicologique seule. Un dépassement de la LMR est d’ailleurs avant tout
interprété comme un non-respect d’une pratique agricole, en général un non-respect du DAR.
SOMMAIRE
3. DOSSIER TECHNIQUE
28
Pour aller plus loin…
• Consultez le site de la Commission Européenne pour trouver la LMR applicable à telle culture et à tel pesticide. Un outil
convivial de recherche permet de visualiser les LMR par culture, par groupe de cultures, par code de culture ou par pesticide
dans toutes les langues de l’UE. Des liens pointent vers les textes législatifs ayant instauré chaque LMR et l’historique des
modifications apportées aux LMR. L’information peut être exportée au format Excel. : http ://ec.europa.eu/sanco_pesticides/
public/index.cfm.
• Autres sites utiles :
• http ://www.fao.org/fao-who-codexalimentarius/codex-home/fr/,
• www.globalmrl.com
• http ://www.efsa.europa.eu/ (évaluation des LMR, rapport annuel sur les résidus de pesticides dans l’UE à partir des
informations de surveillance communiquées par les 27 États membres)
• AGRITOX : base de données sur les propriétés physiques et chimiques, la toxicité, l’écotoxicité, le devenir dans l’environnement,
les données réglementaires des substances actives phytopharmaceutiques : http ://www.dive.afssa.fr/agritox/index.php
• FOOTPRINT-PPDB, une base de données européenne des propriétés de tous les pesticides et de leurs principaux
métabolites : http ://www.eu-footprint.org/fr/ppdb.html
◆ Des résidus de pesticides dans les produits BIO
La certification des produits biologiques (label BIO européen et AB ou équivalents) garantissent que tout au long de la fabrication
du produit, les opérateurs de la filière se sont efforcés de respecter au mieux les principes de l’agriculture biologique, dictés
en réponse à des préoccupations sanitaires, sociales et environnementales. Cependant, l’environnement n’est pas exempt de
pesticides et malgré toute l’attention des opérateurs, des contaminations fortuites peuvent survenir dans les produits biologiques
pendant la production, la transformation, le transport ou le stockage. D’ailleurs, d’après l’étude du Syndicat National des
Transformateurs Biologiques (France Agrimer, 2007) menée sur les grandes cultures biologiques, la source de contamination la
plus importante serait le stockage. Les transports et les process sont également des points critiques.
La possible présence de résidus de pesticides de synthèse dans des produits biologiques (généralement à un niveau de
contamination largement inférieur à celui de produits non bio cependant) ne signifie donc pas pour autant qu’agriculteurs et
industriels n’aient pas respecté leurs engagements. Néanmoins, elle affecte significativement la confiance des acheteurs de cette
gamme de produits.
Pour aller plus loin…
• “Etat des lieux de la teneur en résidus de pesticides dans les produits biologiques bruts et de première transformation issus
des grandes cultures », Syndicat National des Transformateurs Biologiques
(https ://www.synabio.com/doc/synabio-doc-60.pdf )
1.5. Les pesticides analysés par les laboratoires
En introduction, rappelons que l’analyse de pesticides est extrêmement complexe du fait du grand nombre de substances
concernées (environ 1150 molécules inventoriées), de leur diversité chimique et des interférences souvent engendrées par les
matrices, également très variées. Le coût de revient de l’analyse multirésidus est également très important pour les organismes
prestataires (standards analytiques, équipements analytiques « haut de gamme », ressources humaines qualifiées, environnement
qualité…) et des compromis doivent être réalisés systématiquement pour maintenir une offre de prestation au meilleur rapport
qualité / prix / délai.
◆ Comment les listes de pesticides sont-elles établiespar les laboratoires ?
Il n’existe pas de procédure précise pour établir une liste de pesticides (et leurs métabolites) à analyser : chaque laboratoire a sa
manière de procéder.
Initialement, ces listes étaient plutôt établies par « filière » dans chaque pays, et définies selon les critères suivants :
• La matrice : type (agrumes, céréales, vins …) et origine géographique
• La substance active : nature chimique, toxicité et fréquence de détection
• Le contexte réglementaire et sanitaire : législation pour une combinaison pesticide/culture, plan de surveillance
Les avancées technologiques de ces 15 dernières années en matière d’instrumentation analytique et d’informatique autorisent
désormais l’analyse simultanée de plusieurs centaines de pesticides, l’étape la plus limitante étant souvent la préparation
d’échantillon.
SOMMAIRE
29
LE DOSAGE DES PESTICIDES DANS LES HUILES ESSENTIELLES
Les laboratoires proposent ainsi aujourd’hui des méthodes multirésidus de pesticides pouvant couvrir jusqu’à 600 pesticides
(200 à 300 plus communément). Ces listes étendues sont établies, non plus au regard de réalités « filière » et de leurs spécificités,
mais plutôt selon des considérations pratiques et analytiques : elles correspondent à un inventaire de substances pesticides
réglementées dans le pays ou incluses dans des plans de surveillance (persistance dans l’environnement, bioaccumulation) et
disponibles au laboratoire, qu’une méthode est en mesure de détecter et/ou de quantifier.
Elles présentent l’avantage de faire un criblage élargi de tous les résidus présents dans la matrice végétale, que les pesticides aient
été appliqués intentionnellement ou non (contaminations environnementales, négligences), dans le respect de la législation ou
pas (fraudes). Très généraliste et donc moins spécifique, il importe à chaque demandeur d’analyse de vérifier leur pertinence par
rapport aux caractéristiques de sa filière (type de culture, usage et législation des pesticides dans le pays de production, etc.).
◆ Lorsqu’un pesticide d’intérêt ne gure pas dans la liste du laboratoire…
L’ajout d’une substance à une liste établie multirésidus implique pour le laboratoire une phase de développement et de validation
analytique, plus ou moins longue et approfondie en fonction de l’analyte et de la matrice concernée (voir chapitre 3). Les délais
et coûts engendrés (rarement pris en charge par le demandeur d’analyse) sont des freins à l’extension des listes multirésidus.
Ceci est d’autant plus vrai que la demande client est ponctuelle, que peu d’échantillons sont concernés, ou que l’intérêt de suivre
systématiquement ces substances est limité (ex : cas de substances non utilisées depuis plusieurs années, dont le risque résidus
est jugé très faible). Les laboratoires s’efforcent néanmoins de faire évoluer les listes régulièrement pour satisfaire les besoins de
leurs clients et s’adapter aux enjeux environnementaux et réglementaires.
◆ Pesticides spéciaux
Certains pesticides, du fait de leurs propriétés physico-chimiques, ne peuvent être analysés avec ces méthodes multirésidus et
nécessitent donc des méthodes d’analyse spécifiques, entre autres :
• Glyphosate, Glufosinate, Acide Aminomethylphosphonique (AMPA)
• Ammoniums Quaternaires (Chlorméquat, Mépiquat, Diquat, Paraquat)
• Dithiocarbamates
• Fosétyl aluminium et acide phosphoreux
1.6. Résidus de pesticides et huiles essentielles
◆ Aspects législatifs et réglementaires : aucune LMR dans les HEs
Figure 4 : Les réglementations applicables aux HEs
SUBSTANCES CHIMIQUES
Règlements :
UE / EC N°1272/2008 (CLR)
USA / TSCH Inventaires des
substances chimiques (US EPA),
adapté au système harmonisé
des Nations Unies (UNGHS)
ARÔMES
Règlements :
UE / EC N°1334/2088
USA / GRAS
Autres :
Codex alimentarus
PARFUMS
Règlement :
UE / REACH
Autres normes :
IFRA
En revanche, il n’existe à ce jour aucune recommandation ou directive en matière de résidus de pesticide dans les HEs en Europe
et dans le reste du monde ; aucune LMR n’est donc imposée dans les HEs.
NB : Rappelons que les huiles essentielles entrent dans la composition de nombreux arômes alimentaires et de produits
cosmétiques ou se destinent à l’aromathérapie. Dans les deux premiers cas, elles sont ajoutées en faible quantité (entre 0.1 et 10
g par kg dans un arôme). En aromathérapie, elles peuvent être utilisées diluées ou pures (« quelques gouttes »).
SOMMAIRE
3. DOSSIER TECHNIQUE
30
◆ Qualitédes HEs, en étroite relation avec les teneurs résiduelles de pesticides
Traditionnellement, la qualité des HEs est jugée de par son profil aromatique, sa pureté (absence d’adultération) et les conditions
de stockage pour limiter les processus d’oxydation.
Plus récemment, elle est en étroite relation avec la présence de résidus agrochimiques. De ce point de vue, les exigences des
industriels sont largement supérieures à la pression réglementaire. Elles conduisent depuis 5 ans à une mobilisation des acteurs
de la filière aromatique (et associations professionnelles) qui multiplient en interne les plans de surveillance et donc les analyses
de résidus de pesticides dans leurs extraits naturels.
◆ Quel(s) pesticide(s) dans quelle HE ?
Malheureusement, les résultats de peu de travaux sur échantillons réels sont rendus publics.
Dans la littérature scientifique, les méthodes développées (sur une ou 2 familles de pesticides comme les organochlorés, les
organophosphorés…) sont rarement testées sur des échantillons commerciaux. Ne concernant que quelques pesticides
(organochlorés, organophosphorés notamment), les résultats publiés ne permettent pas de dresser un bilan exhaustif des résidus
de contaminations dans les HEs. Néanmoins, ils témoignent de la présence de Chlorpyrifos, Méthidation, Parathion, Methyl-
parathion, Quinalphos et Propiconazole dans les HEs de citrus, qui restent les plus étudiées. L’analyse d’un échantillon d’huile
essentielle de citron commercial et d’origine conventionnelle a permis la détection et quantification de 18 pesticides (sur 256
analysés) à des concentrations variant de 3 µg/L (linuron) à 11 mg/L (prochloraz).
On peut également citer parmi les actions et communications orales européennes les plus récentes :
• L’Université d’Angers et le laboratoire GIRPA, qui ont présenté en 2013 au congrès AOACI/ASFILAB « New Trends on Methods
for Pesticides and Drug Residues » les résultats de l’analyse de 12 huiles essentielles (25 échantillons) après la mise au point
d’une nouvelle méthode multirésidus par LC-MS/MS. 54 pesticides différents à des concentrations variant de quelques
microgramme par litre à une dizaine de milligramme par litre ont été détectés.
• l’association BAH (Bundesverband der Arzneimittel-Hersteller), qui a présenté en 2014 les résultats de leur plan de contrôle
initié 8 ans plus tôt, sur 28 HEs différentes, soit 589 échantillons lors d’un séminaire de l’International European Directorate for
the Quality of Medicines & Health Care. Les pesticides les plus fréquemment retrouvés sont : i) dans les HEs distillées : Biphenyl,
DDT, Hexachlorocyclohexane (HCH), Lindane, Trifluralin, ii) dans les HEs pressées : Biphenyl, Chlorpyriphos-ethyl et Methyl,
Dicofol, Methidathion, Methomyl, Propargite, O-phenylphenol et Tetradifon.
• l’association interprofessionnelle espagnole AILIMPO qui s’investit, aux côtés des producteurs de citrons et dérivés (dont
HEs) dans la réduction des résidus de produits phytosanitaires en lançant notamment une vaste campagne d’analyses des
pesticides du fruit au produit transformé (conférence publique à l’Assemblée générale annuelle de l’EFEO (European Federation
of Essential Oils, juin 2015, non publiée).
• l’Organisme de contrôle & de certification ECOCERT qui a lancé en 2015 les premiers essais interlaboratoires européens sur le
dosage de pesticides dans les huiles essentielles avec le BIPEA (Bureau Interprofessionnel d’Études Analytiques). Résultats non
publics à ce jour.
Les résultats de ces travaux ont récemment été présentés :
• Environ 1 HE sur 2 semble être contaminée par au moins un pesticide.(d’après l’association BAH).
• Jusqu’à 20 pesticides peuvent être détectés simultanément dans un même échantillon d’HE (cas du citron et de l’orange).
• Les concentrations en pesticides peuvent atteindre plusieurs dizaine de milligramme par litre
• Dans les HEs d’origine biologique, le nombre et la concentration des pesticides sont généralement faibles.
• corroborent l’idée, aujourd’hui admise, que les HEs obtenues par expression semblent être plus « contaminées » que les HEs
distillées. Ceci peut s’expliquer d’une part par un nombre de traitement important (jusqu’à une trentaine) sur ce type de
culture et d’autre part par une influence importante du processus de transformation. Ainsi, les essences d’agrumes, contenues
dans le péricarpe des fruits et extraites mécaniquement, présentent un nombre et des teneurs en résidus de pesticide plus
importants que les HEs obtenues par hydrodistillation ou par entrainement à la vapeur. Ces 2 derniers procédés favorisent en
effet l’élimination des composés les moins volatiles et thermolabiles.
• soulignent la grande variété des substances actives détectées, entre 50 et 100 molécules différentes, avec des fréquences
record pour le Chlorpyriphos-ethyl et le Biphenyl, et dans une moindre mesure : le DDT, l’Hexachlorobenzene, le Lindane, le
Trifluralin, le Dicofol, le Methidathion, le Methomyl et la Propargite.
• confirment la nécessité (et le challenge) d’améliorer la traçabilité des itinéraires de production des extraits, en provenance des
4 coins du monde ; également de définir ce qui est, ou n’est pas, acceptable en matière de résidus de pesticides dans les HEs.
SOMMAIRE
31
LE DOSAGE DES PESTICIDES DANS LES HUILES ESSENTIELLES
Pour aller plus loin…
• « Contaminants in herbal products », Steinhoff (2014), Conference EDQM : 50 Years of Leadership in the Quality of Medicines :
https ://wwwdev.edqm.eu/medias/fichiers/herbals.pdf
• Association AILIMPO : http ://www.ailimpo.com
• Organisme de contrôle & de certification ECOCERT : http ://www.ecocert.fr/
• “Pesticide and plasticizer residues in biological citrus essential oils from 2003–2004”, Di Bella et al. (2006), Flavour. Fragr. J.
21 :497–501
• “Pesticide and plasticizer residues in bergamot essential oils from Calabria (Italy)”, Di Bella et al. (2004) Chemosphere, 56 :777–782
• “The Dissipation of Tebuconazole and Propiconazole in Boronia (Boronia megastigma Nees)”, Garland et al. (2004), J. Agric.
Food Chem., 52 :6200–6204
• “Dissipation of propiconazole and tebuconazole in peppermint crops (Mentha piperita (Labiatae)) and their residues in
distilled oils”, Garland et al. (1999), J Agric Food Chem, 47 :294–298
• “Determination of pesticide minimum residue limits in essential oils - Report no. 4 : a report for the Rural Industries Research
and Development Corporation (Australian government)”, Garland et al. (2004), RIRDC publication, Barton, A.C.T.
• “Determination of chlorpyrifos and 3,5,6-trichloro-2-pyridinol residues in peppermint hay and peppermint oil”, Inman and al.
(1981), J. Agric. Food Chem., 29 :321–323
• “Insecticide Residues in Peppermint and Their Distillation with Peppermint Oil”, Starr et al. (1963), J. Agric. Food Chem. 11 :482–486.
• “Biological lemon and sweet orange essential oil composition”, Verzera et al. (2004) Flavour. Fragr. J. 19 :544–548
• “A rapid method of analysis of organophosphate pesticides in Mandarin Essential oils : detection and hazard assessment of
organophosphate pesticides in industrially distilled and cold-pressed mandarin oils.”, Gionfriddo at al., (2009), Perfum. Flavor.,
34 :28-31
• “A workflow for multiclass determination of 256 pesticides in essential oils by liquid chromatography tandem mass
spectrometry using evaporation and dilution approaches : Application to lavandin, lemon and cypress essential oils”, Fillâtre
et al., (2016), Talanta, 149 :176-186
Un travail conséquent de collecte de données a été mené par les partenaires industriels de l’action collective orchestrée par le pôle
PASS d’une part, et le Syndicat National des Industries Aromatiques Alimentaires (SNIAA) d’autre part. Ainsi, l’étude synthétique
de l’ensemble des résultats, soit plus de 400 bulletins d’analyse de pesticides étudiés, portant sur une trentaine d’extraits naturels
différents, produits dans 23 pays du monde, a conduit à l’élaboration d’une liste de 75 pesticides et/ou métabolites prioritaires.
Ces 75 substances ont été détectées au moins une fois dans un extrait naturel ; elles figurent toutes au bulletin d’analyse présenté
dans la partie III du guide.
Les 15 pesticides les plus détectés par les laboratoires d’analyse figurent sur l’histogramme ci-dessous (Figure 5).
Figure 5 : Synthèse de l’occurrence des pesticides dans les extraits naturels
182
54 45 40 39 33 32 30 27 24 23 22 22 18 16
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Chlorpyrifos
Dicofol
Methidathion
Endosulfan
Malathion (+Malaoxon)
Profenofos
Chlorpyrifos-methyl
Phenylphenol (Ortho-)
Diphenylamine
Diazinon
DDT
Fenpropathrin
Cypermethrin
(ά+β+θ+ζ)
Cyhalothrin-lambda
Imazalil
SNIAA Partenaires
SOMMAIRE
2. LES RÉPONSES AUX 10 QUESTIONS LES PLUS FRÉQUENTES
32
Remarque : Jusqu’à récemment, l’analyse de pesticides dans les huiles essentielles était très majoritairement réalisée par GC-MS/
MS, ce qui peut expliquer que les pesticides répertoriés dans la Figure 5 soit tous des pesticides « GC-amenable ». Il est probable
que l’analyse des pesticides dans les HEs par LC-MS/MS change un peu ce classement.
(Par exemple les pesticides tébuconazole, pyraclostrobine, azoxystrobine et trifloxystrobine ont été respectivement détecté 29,
26, 23 et 22 fois dans une cinquantaine d’échantillon d’HE d’orange [Données issus de l’action collective prochainemet publiées])
◆ Les dicultés des laboratoires et des industriels à faire le diagnostic approprié
En premier lieu, elles s’expliquent par la méconnaissance…
• des réglementations en vigueur dans les pays producteurs d’HEs en ce qui concerne l’usage agricole des « pesticides » (accès
difficile aux textes et données réglementaires, s’ils existent…)
• des traitements phytosanitaires réalisés annuellement sur les cultures (déficit de traçabilité)
• du devenir des pesticides pendant les procédés de transformation (élimination, concentration, dégradation)
• des conditions de transformation, d’assemblage (communelle), de stockage et de transport des HEs, toutes très propices aux
contaminations croisées.
Viennent ensuite l’hétérogénéité des résultats analytiques, en étroite relation avec
• la complexité des HEs, constituées de dizaines ou centaines de molécules différentes qui, lors de l’analyse, interfèrent largement
avec le signal des pesticides et engendrent facilement un biais dans leur quantification (voir § 2.4).
• leur diversité : les effets matrices sont HE dépendants, c’est-à-dire qu’ils varient en fonction de la nature du végétal d’origine
(citron, orange, menthe, rose…) et des procédés industriels utilisés (expression, distillation, rectification…).
• Le manque de spécificité des méthodes analytiques utilisées pour les HEs par certains laboratoires, du fait des développements
fastidieux que cela implique versus le faible nombre d’échantillons concernés (une « niche » comparée aux matières premières
alimentaires et échantillons environnementaux).
SOMMAIRE
3. DOSSIER TECHNIQUE
34
CHAPITRE 2 :
INTERPRÉTER
LES RESULTATS D’ANALYSE
2.1. Présentation générale du bulletin d’analyse
Les rapports d’analyses font apparaitre des informations qui sont nécessaires à l’interprétation des résultats.
Ainsi, pour chaque résidu de pesticide recherché, on trouvera :
◆ Le nom de la substance active mère
Les métabolites et produits de dégradation inclus dans la définition officielle du résidu peuvent être ou non mentionnés. En cas
de confusion ou d’absence de précision, ne pas hésiter à interroger le laboratoire prestataire à ce sujet.
◆ Sa concentration dans l’échantillon
Il s’agit d’une valeur numérique si une mesure analytique a pu être réalisée. Dans le cas contraire (mesure impossible ou incertaine),
il s’agit d’annotations, plus ou moins explicites, informant le lecteur averti des raisons de l’absence de mesure (en étroite relation
avec les performances de la méthode mentionnées plus bas).
◆ L’unité dans laquelle est exprimé le résultat
• Selon le mode de prélèvement de l’échantillon, la concentration d’un résidu d’une substance phytosanitaire est indiquée soit :
• en milligramme de substance par litre d’échantillon (mg/L)
• en milligramme de substance par kilogramme d’échantillon (mg/kg)
Il est aisé de passer de la première unité (mg/L) à la seconde (mg/kg) en multipliant la concentration trouvée par la densité de
l’échantillon.
Comme souvent pour les molécules traces, l’unité des concentrations peut également être la « ppm » (ou « partie par million), 1
ppm correspondant à 1 mg/kg. Possible mais plus rare, une concentration en (résidu) de pesticide peut également être exprimée
en « ppb » (ou « partie par billion).
Unités de concentration et conversion
Concentration mg /L = concentration mg/kg X densité
Rappel
1 ppm = 1 mg/kg ou 1 µg/g
1 ppb = 1 µg/kg ou 1 ng/g
◆ Les performances de la méthode utilisée
Elles sont mentionnées directement dans le tableau de résultats ou en annexe. En analyse de traces, elles s’évaluent au moyen
de valeurs (de concentration) seuils ou « limites », séparant des situations analytiques bien distinctes : LOD, LOQ, RL… ces valeurs
limites et leurs significations sont détaillées dans le paragraphe suivant.
◆ Des informations complémentaires et utiles
Technique analytique utilisée, protocoles de référence et normes qualité associés, date d’analyse… ces informations, si elles ne
sont pas clairement mentionnées sur le bulletin, peuvent être demandées au laboratoire prestataire car utiles à l’interprétation
des résultats.
Performances et limites des méthodes
SOMMAIRE
LE DOSAGE DES PESTICIDES DANS LES HUILES ESSENTIELLES
35
2.2. Des concentrations « limites » pour évaluer les performances des méthodes
◆ Limites de DETECTION et de QUANTIFICATION : notions-clés pour l’analyse de trace
Limites de détection, de quantification voire de détermination sont tous les noms de différentes limites qui décrivent les plus
faibles concentrations d’analyte qui peuvent être déterminées, selon une méthode donnée, avec un certain degré de confiance.
Il n’existe pas de définition harmonisée de ces limites mais le guide SANTE/11945/2015 (remplace SANCO/12571/2013) qui fait
souvent office de texte de référence pour la validation de méthodes d’analyse des résidus de pesticides, donne une définition
précise pour chacune d’entre elles.
Nous en citerons ici les 2 principales :
• La LOD (limite de détection) ou plus petite quantité (ou concentration) d’analyte dans un échantillon qui peut être détectée
mais pas nécessairement quantifiée en tant que valeur exacte.
• La LOQ (limite de quantification) ou plus faible concentration d’un analyte qui a été validée avec une exactitude acceptable
en appliquant la méthode analytique complète. Elle est parfois appelée « limite de détermination » avec malheureusement
une abréviation (LOD) qui porte facilement à confusion avec la limite de détection ci-dessus. Notamment, les LMR (MRL en
anglais) inscrites au Règlement Européen 396/2005 sont référencées comme étant des “LOD MRL”, en référence aux limites de
détermination (= LOQ) et non de détection.
Pour un échantillon et une substance active donnée, le résultat reporté sur le bulletin d’analyse sera fonction du seuil de concentration
atteint, comme schématisé ci-après (où Cpest est la concentration en pesticide dans l’échantillon, mesuré par la méthode).
Figure 6 : Méthodologie de report de résultats sur un bulletin d’analyse comparativement aux seuils de détection et de quantification
Seuil de
concentration
Mesure C
pest
‹ LOD LOD ‹ C
pest
‹ LOQ C
pest
› LOQ
Notation ‹ LOD DNQ
détecté mais non quantifié C
pest
Exemple
Hexachlorobenzene
Procymidone
Sa concentration est située entre la
LOD et la LOQ. Le pesticide présente
un signal suffisant pour être détecté
et identifié mais pas assez pour être
quantifié.
Chlorpyrifos
La concentration calculée, dans notre
cas, 2.305 mg/L, étant supérieure à la
RL (0.010 mg/L), elle est reportée sur le
bulletin.
LOD LOQ
◆ Parlons de « REPORTING limit »
Finalement, le plus souvent (et même si le terme n’est pas utilisé stricto sensu), ce sont des « Reporting Limits » qui sont utilisées
pour décrire la concentration des pesticides.
Le guide SANCO définit la RL comme « le plus petit niveau de résidus pouvant être reporté comme valeur absolue » et ajoute : « La
RL est supérieure ou égale à la LOQ ».
Les RL sont généralement fixées par les laboratoires analytiques à des concentrations au-dessus des limites de quantification,
basées ou non sur des LOD ou LOQ issus d’un protocole de validation (voir § 3.2pour plus de détails). Le plus souvent elles
sont établies en appliquant des facteurs de sécurité qui permettent aux laboratoires de gérer la variabilité associée à l’analyse
d’échantillons provenant de diverses sources avec des problématiques plus ou moins complexes (notamment les effets matrice,
traités au § 2.4).
Le schéma de notation ci-dessus devient
Figure 7 : Méthodologie de report de résultats sur un bulletin d’analyse comparativement aux « Reporting Limits »
Seuil de
concentration
Mesure Cpest ‹ RL/3 RL/3 ‹ Cpest ‹ RL Cpest › RL
Notation ‹ LOD DNQ
détecté mais non quantifié Cpest
RL/3 RL
La mention DNQ peut être également reportée lorsque la méthode ne permet pas d’aboutir à un résultat quantitatif du fait, par
exemple, de problèmes de dégradation non maitrisés lors de la préparation de l’échantillon ou de l’analyse.
Dans la suite du guide, LOQ et RL auront la même signification.
SOMMAIRE
3. DOSSIER TECHNIQUE
36
◆ Des performances élevées, soumises à variabilité
Limites de quantification ou « reporting limits » varient généralement de quelques µg/kg (ou ppb) à quelques mg/kg (ou ppm).
Dans les extraits naturels (huiles essentielles notamment), sur la base des 400 bulletins d’analyse de pesticides étudiés, elles
oscilleraient majoritairement entre 0.01 et 0.2 mg/kg.
Cette situation n’a rien d’anormal : de nombreux facteurs ou « combinaison de facteurs » affectent en effet les performances des
méthodes d’analyse, à savoir :
• le pesticide lui-même (propriétés physico-chimiques, comportement vis-à-vis du processus analytique)
• la méthode analytique utilisée (instrumentation et protocole expérimental)
• les effets matrice (cf. § 2.4)
• les interférences issues de l’échantillon ou du protocole analytique
• l’échantillonnage (qualité, représentativité)
• les conditions de stockage
En analyse de traces, on cherche à atteindre les LOQ ou RL les plus basses possibles pour être sûr de « ne pas passer à côté » d’un
analyte présent dans l’échantillon. Elles sont idéalement inférieures ou égales à la LMR établie pour un couple pesticide / matrice ;
à défaut d’indication spécifique, inférieures ou égales à la « LMR par défaut » de 0,01 mg/kg.
Ce niveau de performances (on parlera ici de « sensibilité de la méthode ») n’est cependant pas toujours accessible, surtout dans
les huiles essentielles réputées très complexes et diverses.
Quelques soient leurs valeurs, les concentrations-limites affichées sur un bulletin d’analyse sont celles que le laboratoire est en
mesure de garantir pour une combinaison pesticide / matrice, dans les conditions expérimentales retenues. Ceci suppose qu’elles
aient été vérifiées expérimentalement, voire validées.
2.3. Incertitude, faux positifs et faux négatifs
Même si les laboratoires s’efforcent de produire des résultats de qualité (c’est à dire adaptés à un usage précis), toutes les
méthodes d’analyse donnent des résultats présentant un certain degré d’incertitude. Ce niveau de variabilité augmentent par
ailleurs significativement aux très faibles concentrations. Il doit être pris en compte dans la comparaison de 2 résultats d’analyse.
Conjointement aux erreurs expérimentales affectant la mesure de concentration, on distingue 2 autres cas extrêmes de résultats
biaisés :
• le « faux négatif » : se dit d’un résultat indiquant, à tort, qu’une substance phytosanitaire est inférieure à la concentration-limite
communiquée. En d’autres termes, c’est indiquer que le pesticide n’a pas été détecté alors qu’il est présent dans l’échantillon
à une concentration supérieure à la LOQ.
• Le « faux positif » : se dit d’un résultat indiquant, à tort, qu’une substance phytosanitaire est supérieure à la concentration-limite
communiquée. En d’autres termes, c’est reporter un résultat indiquant une concentration du pesticide supérieure à la LOQ
alors que celui-ci est absent de l’échantillon où en quantité non détectable. Les cas de faux positifs sont généralement dus à
la présence d’interférents issus de la matrice qui « miment » le signal de l’analyte.
2.4. L’impact des effets (de) matrices sur le dosage
◆ Qu’appelle t’on «eets matrice» ?
Classiquement, l’analyse de pesticides implique de recourir à une technique chromatographique pour séparer analytes (les
pesticides) et autres constituants de l’échantillon injecté (la matrice). A la sortie du chromatographe, le signal de chaque analyte
est enregistré grâce à un détecteur ; son intensité est mesurée à des fins quantitatives : pour la plupart des détecteurs, l’intensité
du signal de l’analyte est proportionnelle à sa concentration.
Pourtant, il n’est pas rare d’observer des différences significatives d’intensité des signaux lorsque l’analyte est, à concentration
égale, analysé dans un solvant ou dans un extrait complexe. Ainsi, la matrice de l’échantillon peut engendrer une amplification ou
une atténuation du signal de l’analyte.
Ce phénomène, communément désigné sous le terme d’« effets matrice », est particulièrement important dans le dosage des
composés-traces, comme les pesticides, via des méthodes instrumentales.
Une chose est sûre : la non-prise en compte des effets matrices lors du dosage augmente considérablement le risque de délivrer
un résultat inexact, notamment dans le cadre des huiles essentielles, matrices de grande diversité et complexité.
SOMMAIRE
37
LE DOSAGE DES PESTICIDES DANS LES HUILES ESSENTIELLES
◆ Quelles sont les origines des eets matrice en analyse ?
Les effets matrice sont aujourd’hui bien connus des experts en chimie analytique sans que les mécanismes en jeu ne soient
parfaitement expliqués et (encore moins) maitrisés.
Selon l’hypothèse la plus répandue et généralisée, ils relèvent principalement d’effets de compétition entre les analytes et certaines
molécules co-éluées de la matrice, lors des réactions chimiques ou physiques mises en jeu au cours de l’analyse.
Leurs origines précises sont en fait très spécifiques de la technique analytique employée. Pour illustrer ce propos, un tableau
comparatif a été dressé pour les 2 techniques instrumentales les plus utilisées pour doser les pesticides : la GC-MS et la LC-MS,
simple ou en tandem ; il précise dans chaque cas les étapes de l’analyse sensibles aux effets matrices et la liste des facteurs
influents.
Table 5 : Description des effets matrices en GC-MS (/MS) et LC-MS (/MS)
GC-MS (/MS)
(avec source ionisation électronique)
LC-MS (/MS)
(avec source électrospray)
Phase
analytique
Au moment de l’injection de l’échantillon
principalement mais également pendant la séparation
chromatographique
Au moment de l’ionisation des composés principalement
Mécanismes
Compétition pour des sites d’interactions moléculaires
« actifs », présents dans le système GC (injecteur et
colonne)
Effet masquant ou thermoprotecteur (limite la
décomposition dans l’injecteur) de certains constituants
matriciels non volatiles
Compétition pour les charges disponibles crées à la
surface des gouttelettes
Modification de la viscosité et de la tension de surface des
gouttelettes par des interférents concentrés, perturbant
l’efficacité de formation du spray
Facteurs
influents
Instruments : nombre et types de sites actifs dans le liner
et la colonne, débit/pression des gaz, volumes d’injection
et d’expansion du solvant, dimension de la colonne…
Échantillons : concentration et structure chimique des
analytes (capacité à créer des liaisons hydrogènes,
thermolabilité, volatilité), nature et concentration de la
matrice
Instruments : température et débit du gaz de
désolvatation, substances exogènes (plastiques, résidus
de polymères, phtalates, réactifs paire d’ions, acides
organiques, tampons…), résolution chromatographique
Échantillons : substances endogènes de la matrice
(composés très polaires, tensio-actifs, composés
organiques divers, carbohydrates, lipides, peptides,
métabolite de structure analogue à l’analyte…)
Divers
Évolution possible en cours de séquence (contamination
de surface)
Pas d’influence sur le spectre de masse
Analyte et matrice dépendant
Peu d’évolution en cours de séquence
Influence possible sur le spectre de masse
Analyte et matrice dépendant
Effets Augmentation du signal généralement Suppression du signal généralement
◆ Mise en évidence, impact sur le dosage
En modifiant la spécificité, la linéarité, la précision et la reproductibilité de la réponse instrumentale, les effets matrices influent
aussi bien sur la caractérisation que sur la quantification des analytes (résultats erronés par excès ou par défaut, production de
faux positifs et faux négatifs).
Les mettre en évidence et en évaluer les conséquences est donc une priorité pour les chimistes analyticiens, qui ont à leur
disposition différentes méthodologies bien décrites dans la littérature, ou recourent aux protocoles expérimentaux proposés
dans les guides de référence pour la validation de méthode quantitative (ex : SANCO 2015/11945) ; la plus visuelle et utilisée
est probablement la comparaison des courbes de calibration issues de solutions standards préparées dans le solvant et dans la
matrice d’intérêt (exempte en analyte).
Les résultats obtenus dans le cas des pesticides dans les HEs illustrent parfaitement l’impact important que peut avoir la matrice
sur les signaux analytiques de composés-traces comme les pesticides, ainsi que les 2 principaux phénomènes observés en analyse
quantitative par LC-MS et GC-MS, à savoir :
• une diminution du signal du pesticide dans la matrice comparativement au solvant ; cet eet est plus fréquemment
observé en LC-MS(/MS) ; il est plus ou moins prononcé selon le couple analyte / matrice.
SOMMAIRE
3. DOSSIER TECHNIQUE
38
Il est illustré Figure 8 avec la superposition des droites de calibration du pesticide Atrazine, seul dans le solvant (Méthanol), et dans
4 HEs différentes (orange, lavandin, menthe poivrée, patchouli) diluées au 1/10e dans le solvant. Dans tous les cas, l’intensité du
signal de l’analyte croit proportionnément avec la concentration ; cependant, le facteur de réponse est beaucoup plus important
dans le solvant que dans les HEs et varie fortement d’une HE à l’autre. Cette situation est propice à une sous-estimation de la
teneur en pesticide dans les HEs si le dosage est réalisé en utilisant une courbe de calibration dans le solvant. Prenons un exemple
(voir Figure 8) : une aire de 500 enregistrée dans l’HE diluée de lavandin pour le pic d’Atrazine sera assignée à une concentration de
19 µg/L en utilisant la courbe de calibration dans le solvant, alors que l’Atrazine est en réalité à 59 µg/L, soit 3 fois plus concentrée.
Figure 8 : Effets de la matrice sur l’intensité du signal de l’Atrazine en LC-MS/MS en fonction de la concentration
3 000
2 500
2 000
1 500
1 000
500
0
0 50
Concentration (µg.L-1)
Aire du pic chromatographique
19 µg.L-1 59 µg.L-1
100
Solvant PatchouliHE orange HE lavandin HE menthe poivrée
• une augmentation du signal du pesticide dans la matrice comparativement au solvant ; cet effet est plus fréquemment
observé en GC-MS(/MS) ; il est également plus ou moins prononcé selon le couple analyte / matrice.
Il est illustré Figure 9 avec la superposition des droites de calibration du pesticide Bifenthrine, seul dans le solvant (Acétate d’éthyle),
et dans 4 HEs différentes (orange, lavandin, menthe poivrée, patchouli) diluées au 1/10e dans le solvant.
Dans ce cas-ci, le facteur de réponse est plus faible dans le solvant que dans les HEs. L’utilisation d’une courbe de calibration
dans le solvant conduit à une surestimation de la concentration du pesticide dans les HEs, variable en fonction de la nature
de l’HE. Dans l’exemple ci-dessous, une aire de pic chromatographique de 5000 est associée à une concentration de 358 µg/L
de Bifenthrine dans le solvant, de 169 µg/L dans l’HE de patchouli, de 46 µg/L dans l’HE menthe poivrée, de 41 µg/L dans l’HE
d’orange et de 27 µg/L dans l’HE lavandin.
Figure 9 : Effets de la matrice sur l’intensité du signal de la Bifenthrine en GC-MS/MS en fonction de la concentration
50 000
40 000
30 000
20 000
45 000
35 000
25 000
15 000
10 000
5000
0
050 100 150 200
Concentration (µg.L
-1
)
Aire du pic chromatographique
250
Solvant PatchouliHE orange HE lavandin HE menthe poivrée
41 µg.L-1
169 µg.L-1
46 µg.L-1
27 µg.L-1
SOMMAIRE
39
LE DOSAGE DES PESTICIDES DANS LES HUILES ESSENTIELLES
◆ Élimination ou compensation des eets matrices
La préparation d’échantillon joue un rôle primordial dans la réduction ou l’élimination des effets matrice. Elle a en effet pour
objectif d’extraire sélectivement le ou les pesticides de l’échantillon et donc de limiter la présence d’autres composés de la matrice
qui pourraient influer sur l’analyse.
Dans le cas des HEs, les techniques disponibles de préparation de l’échantillon ne sont pas suffisamment sélectives pour éliminer
spécifiquement les constituants matriciels sans diminuer le rendement d’extraction des pesticides. Elle est souvent simplifiée à
son maximum (dilution) et les effets matrice encore présents seront à compenser par d’autres moyens.
Le tableau ci-dessous dresse la liste d’autres stratégies analytiques pouvant être utilisées en cas d’effets matrices en GC-MS ou LC-
MS, avec en référence un exemple d’application dans la littérature scientifique. Aucune n’est parfaite et possède des avantages et
des inconvénients. Au chimiste de choisir celle qui sera la plus adaptée à sa problématique.
Table 6 : Stratégies analytiques pour compenser les effets matrices
GC-MS (/MS) LC-MS (/MS) Exemple dans la littérature
Calibration avec une gamme
réalisée dans la matrice ✓ ✓ J. Agric. Food Chem. (2015), vol 63,
4922−4932
Méthode des ajouts dosés ✓ ✓ J. Chromatogr. A (2009), vol 1216,
4798–4808
Utilisation d’étalons internes
marqués ✓ ✓ J. Chromatogr. A (2015), vol 1396,
109–116
Utilisation de protecteurs
analytiques ✓✘Anal. Chem. (2005), vol 77 (24),
8129–8137
Technique de l’écho-peak ✘✓J. Chromatogr. A (2004), vol 1058,
67–79
Approche par dilution
extrapolative ✓ ✓ Anal. Chim. Acta (2009), vol 651,
75–80
Pour aller plus loin…
• Dans la compréhension des effets matrices…
• “Matrix Effects in Mass Spectrometry Combined with Separation Methods - Comparison HPLC, GC and Discussion on Methods
to Control these Effects, L. Silvestro et al., Chapitre 1 de Tandem Mass Spectrometry - Molecular Characterization (2012) ISBN
978-953-51-1136-8, (accès libre sur le site http ://www.interchopen.com)
• “An overview of matrix effects in liquid chromatography–mass spectrometry”, H rufelli et al., Mass Spectrometry Reviews
(2011), vol. 30, 491– 509
• “Strategies for the Detection and Elimination of Matrix Effects in Quantitative LC–MS Analysis”, A. K. hewavitharana et al., LCGC
North America (2014), Vol. 32 (1), 54-64
• “Multiresidue determination of 256 pesticides in lavandin essential oil by LC/ESI/sSRM : advantages and drawbacks of a
sampling method involving evaporation under nitrogen”, Y. Fillâtre et al., Anal Bioanal Chem (2014), v 406, 1541–1550
SOMMAIRE
3. DOSSIER TECHNIQUE
40
CHAPITRE 3 :
MÉTHODES D’ANALYSE
ET VALIDATION
3.1. Les étapes de l’analyse de pesticides
Il existe environ 1150 substances actives de par le monde dont 423 sont autorisées dans l’Union Européenne. Il est par conséquent
inenvisageable de toutes les contrôler « les unes après les autres », avec des méthodes monorésidu. L’objectif d’une méthode
multirésidus est de couvrir autant de pesticides que possible à partir d’une seule portion d’échantillon et en utilisant une préparation
d’échantillon unique. Plus le spectre de pesticides couvert par les méthodes multirésidus est important, moins il est nécessaire
d’avoir de méthodes additionnelles pour couvrir les analytes d’intérêt. C’est donc tout logiquement que, au fur et à mesure
des évolutions technologiques, les méthodes multirésidus se sont imposées aux laboratoires prestataires comme méthodes
incontournables pour répondre aux besoins des clients, aux exigences réglementaires et aux contraintes opérationnelles.
Elles seules seront traitées dans ce chapitre même si des méthodes monorésidu restent incontournables pour doser quelques
contaminants spécifiques. Sans surprise, leur protocole inclut une étape de préparation de l’échantillon (i.e. fréquemment :
échantillonnage + extraction des analytes + purification ou « clean up »), suivie de l’analyse instrumentale à proprement
parler. Là encore, seules les techniques les plus utilisées ces dernières années seront évoquées ; les lecteurs souhaitant élargir
leurs connaissances sur le sujet sont invités à consulter les innombrables publications (bibliographie scientifique, brochures
fournisseurs…), dont quelques-unes sont citées ci-dessous.
◆ Préparation de l’échantillon
La récente méthode normalisée QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe), présentée pour la première fois en
2003 par Anastassiades et al., est plébiscitée par les laboratoires pour préparer les échantillons environnementaux et alimentaires
en vue d’une analyse multirésidus. Universelle et efficace à la fois, elle remplace (ou complète) progressivement les techniques
dites « classiques » (ex : extraction liquide-solide, extraction sur phase solide ou SPE, etc.). La version décrite dans la norme EN
15662 est présentée ci-dessous (Figure 10). Les protocoles appliqués peuvent variés sensiblement d’une matrice à l’autre, en
fonction de leur nature et composition (solide/liquide, teneur en eau ou en composés lipidiques, etc.).
Figure 10 : Principe de la méthode QuEChERS décrite dans la norme NF EN 15662
CEN 15662 (pour 10g d'échantillon)
Ajout 10 mL Acétonitrile
EXTRACTION
liquide/solide
PURIFICATION
dispersive SPE
AGITATION
AGITATION & CENTRIFUGATION
AGITATION
CENTRIFUGATION
4g sulfate de magnésium anhydre
1g chlorure de sodium
1g citrate trisodium dihydrate (CAS 6132-04-3)
0,5g citrate de sodium dibasique sesquihydraté (CAS 6132-05-4)
1,5g sulfate de magnésium anhydre
250mg phase PSA (amines primaires et secondaires)
Performances et limites des méthodes
SOMMAIRE
LE DOSAGE DES PESTICIDES DANS LES HUILES ESSENTIELLES
41
◆ Analyse instrumentale
La très grande majorité des analyses de routine conduites aujourd’hui dans les laboratoires sont réalisées au moyen de la
chromatographie gazeuse ou liquide couplée à un spectromètre de masse de type triple quadripôles (noté QQQ ou tQ ou
QqQ). C’est en effet le détecteur de choix dans l’analyse ciblée de traces grâce à la très grande sensibilité et spécificité du mode
« Selected Reaction Monitoring » (SRM, décrit plus bas), également appelé MRM (Multiple Reaction Monitoring). L’utilisation de
spectromètres de masse simple quadripôle avec le mode d’acquisition « Selected Ion Monitoring » (SIM), est également utilisé,
bien que moins spécifique et sensible.
Depuis quelques années les spectromètres de masse dits haute résolution (HRMS) enrichissent progressivement le parc analytique
des laboratoires d’analyse de pesticides ; ils offrent notamment de nouvelles perspectives analytiques grâce à la recherche « sans
a priori » des contaminants, désignée sous le terme d’« analyse non ciblée ». En effet, le nombre de substances à identifier et à
quantifier ne cesse de croître, avec l’obligation de respecter des impératifs de sensibilité, fiabilité et de productivité. Il devient par
ailleurs de plus en plus important d’identifier les métabolites en cours d’analyse mais également à postériori.
NB : Les autres types de détecteurs (ex : capture d'électrons, azote et phosphore, à barrettes de diodes, à fluorescence, etc.)
ne sont utilisés que ponctuellement aujourd’hui et/ou exclusivement sur certaines familles de substances actives (ex :
organophosphorés). Même en combinaison avec des colonnes de différentes polarités, ils ne fournissent pas une identification
de l’analyte sans ambiguïté. Par ailleurs, l’exploitation en routine d’autres techniques chromatographiques (à 2 dimensions, avec
fluide supercritique…), reste encore occasionnelle dans le cadre d’analyses de pesticides en routine (guide SANTE 11945/2015).
Table 7 : Caractéristiques des 2 méthodologies analytiques ciblée et non ciblée, bien distinctes et complémentaires
Analyse ciblée Analyse non ciblée
Couplage
analytique
Chromatographie en phase gazeuse (GC, mono et bi-dimensionnelle) ou liquide (HPLC et UHPLC, respectivement
haute et ultra-haute performance) essentiellement
Spectromètre de masse de type triple quadrupôles (QQQ)
le plus souvent
Spectromètre de masse haute résolution de type : TOF
(Time of flight), Orbitrap ou leur hybride (Q-TOF et
Q-Orbitrap)
Mode
d’acquisition
Sélectif : «Selected Reaction Monitoring» (SRM) ou
variante (MRM) Non-Sélectif : assimilé au mode “SCAN”
Méthodologie
de travail
Définition d’une liste ciblée de pesticides bien définis, à
analyser
Optimisation des performances instrumentales en
fonction des analytes recherchés
Analyse de l’échantillon en mode sélectif
Traitement des données : le rapport d’analyse mentionne
quel pesticide de la liste préétablie a été détecté ; le cas
échéant, il est quantifié simultanément.
Optimisation des performances pour couvrir une large
gamme de composés « inconnus » (nombre, propriétés,
concentration)
Analyse de l’échantillon en mode non sélectif
Indépendamment : construction de banque(s) de
substances d’intérêt avec leurs critères d’identification
analytique
Traitement des données : les signaux enregistrés dans
l’échantillon sont comparés aux informations contenues
dans les banques (« post-filtre »). Si correspondance il
y a, le composé est déclaré « détecté » dans le rapport
d’analyse
La quantification nécessite souvent une analyse
complémentaire.
Résultats
L’analyse ciblée permet de faire un zoom très
performant sur une partie de l’échantillon, définie à
l’avance par l’opérateur. : Spécifique, très sensible,
reproductible, robuste, grand domaine de linéarité
Analyses qualitative et quantitative simultanées sur
200 à 300 pesticides à la fois : Idéal pour des analyses de
routine
Bilan « tronqué » : seuls les pesticides de la liste sont
recherchés.
Flexibilité réduite : liste « sur-mesure » quasi-
impossible.
Standards analytiques obligatoires pour tous les
pesticides (disponibilité, coût)
L’analyse non ciblée permet de faire un bilan exhaustif
des contaminants (et autres substances d’intérêt).
Très spécifique, sensible, reproductible
Nombre « illimité » de substances (sauf contraintes
techniques), connues et inconnues, pressenties ou
non. Élucidation structurale possible des molécules
inconnues
Ré-exploitation des signaux de l’échantillon à d’autres
fins analytiques, sans réinjection
Seuls les standards analytiques des composés
détectés sont utilisés pour confirmer l’identification et
réaliser leur quantification
LOD et LOQ plus élevées généralement
Analyse quantitative non simultanée
Instrument plus couteux, pour personnel très qualifié
SOMMAIRE
3. DOSSIER TECHNIQUE
42
Dans le cadre de l’action collective PASS, une étude ciblée sur les pesticides retrouvés dans les HEs d’orange a été réalisée par ERINI.
En complément de l’analyse ciblée portant sur la liste des pesticides prioritaires, l’approche non-ciblée a permis de détecter (et de
confirmer) la présence de 9 pesticides supplémentaires. Les pesticides Carbofuran et Diflubenzuron ont notamment été détectés
respectivement 19 et 13 fois sur une cinquantaine d’échantillons d’HE d’orange, ce qui a permis de les intégrer ultérieurement
dans la liste principale des pesticides à rechercher.
Pour aller plus loin…
• “Sample Preparation Methods for Pesticides Analysis in Food Matrices and Environmental Samples by Chromatography-
Based Techniques : A Review”, Sobhanzadeh et al., (2009), J. Fund. Sci., 5 :106-128
• “A review of sample preparation methods for the pesticide residue analysis in foods “, Zhang et al. (2102), Cent. Eur.J.Chem.
(2012), 10 : 900-925
• “Methods of sample preparation for determination of pesticide residues in food matrices by chromatography–mass
spectrometry-based techniques : a review”, Lambropoulou and al. (2007), Anal. Bioanal. Chem.,389 : 1663–1683
• “QuEChERS Sample Preparation Approach for Mass Spectrometric Analysis of Pesticide Residues in Foods”, Lehotay (2011),
Mass Spectrometry in Food Safety, Methods and Protocols (Humana Press), 747 : 65-91
• “Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in the Analysis of Pesticide Residues in Food”, Stachniuk et al. (2016), Food Anal.
Methods, 9 :1654–1665
• Determination of 23 pesticide residues in leafy vegetables using gas chromatography–ion trap mass spectrometry and
analyte protectants”, Gonzalez-Rodrıguez et al. (2008) J. Chrom. A, 1196–1197 :100–109
• “Retrospective screening of relevant pesticide metabolites in food using liquid chromatography high resolution mass
spectrometry and accurate-mass databases of parent molecules and diagnostic fragment ions”, Polgára et al. (2012) J. Chrom.
A, 1249 : 83– 91
• “Optimization of separation and detection conditions for the multiresidue analysis of pesticides in grapes by comprehensive
two-dimensional gas chromatography–time-of-flight mass spectrometry”, Banerjee et al. (2008), J. Chrom. A,1190 : 350-357
• “Evolution of Orbitrap Mass Spectrometry Instrumentation”, Eliuk et al. (2015), 8 : 61-80
• “Recent trends in mass spectrometer development”, Hager JW (2004), Anal. Bioanal. Chem. 378 : 845-850
• “Mass Spectrometry, Review of the Basics : Electrospray, MALDI, and Commonly Used Mass Analyzers”, El-Aneed et al. (2009),
Appl. Spectrosc. Rev., 44 : 210-230
• “Mass Spectrometry, Review of the Basics : Ionization”, Awad et al. (2015), Appl. Spectrosc. Rev., 50 :158-175
◆ Focus : le mode d’acquisition SRM (analyse ciblée)
Le mode d’acquisition « Selected Reaction Monitoring » est de loin le plus prisé pour l’analyse multirésidus de pesticides. Son
usage est souvent implicite lorsqu’un chromatographe, GC ou LC, est couplé à un spectromètre de masse QQQ qui fonctionne en
« MS/MS » (cf. désignations GC-MS/MS et LC-MS/MS).
Le principe, illustré Figure 11, est le suivant : le premier analyseur quadripolaire fonctionne comme un filtre et permet de sélectionner
un ion issu de l’ionisation de l’analyte. Cet ion dit « parent » ou précurseur » est dirigé dans le deuxième analyseur quadripolaire,
souvent baptisé « cellule de collision », pour y être fragmenté en présence de gaz inerte. Plusieurs ions « fils » ou « fragments » sont
formés, puis dirigés vers le troisième analyseur quadripolaire, qui filtre à son tour les ions fils d’intérêt. Ainsi, dans la Figure 11 : l’ion
précurseur à m/z 296, issu de la Butraline, donne après fragmentation l’ion fils m/z 240. En changeant les conditions de collision,
d’autres ions fils peuvent être favorisés (ex : m/z 222 pour la Butraline). Le lien de parenté entre ion précurseur et ion fils est appelé
« transition » ; il est très spécifique, ce qui améliore aussi la sensibilité de la détection.
SOMMAIRE
43
LE DOSAGE DES PESTICIDES DANS LES HUILES ESSENTIELLES
Figure 11 : Principe de l'acquisition en SRM (ou MRM) en analyse ciblée
Q1
Filtre
Q2
Cellule de collision
Q3
Filtre
Signal SRM
(ou MRM)
Butraline
Sélection
Ion précurseur
m/z 222
m/z 240m/z 296
Energie
collision E1
Energie
collision E2
Fragmentation Temps
Intensité
Sélection
Ion fils
NO2
NO2
N
HH
NO2
NO2
NH3
NO
NO2
NH
Les performances des spectromètres QQQ modernes, notamment leurs vitesses d’acquisition, font qu’il est possible d’enregistrer
plusieurs transitions pour un même analyte… et surtout plusieurs centaines de transitions au cours d’une même analyse. Au
terme « SRM » est alors souvent préféré le terme « MRM » (Multiple Reaction Monitoring) pour désigner ce mode d’acquisition.
Attention : avec le mode SRM, seuls les signaux d’intérêt des pesticides recherchés sont enregistrés, laissant de côté les informations
provenant d’autres substances (i.e. composés de la matrice). Pour cette raison, certains utilisateurs pensent que les effets matrice,
causés par des composés co-élués, sont réduits ou éliminés en mode SRM, ce qui est bien sûr inexact !
La résolution des spectromètres QQQ actuels leur permet de distinguer 2 ions de rapport m/z proche, jusqu’à la décimale prêt
(ex : m/z 200.1 et m/z 200.2). On parle de spectromètres basse résolution ou avec une résolution unitaire.
◆ Les méthodes analytiques utilisées pour les HEs
• Préparation d’échantillons
Les méthodes génériques utilisées dans les matrices alimentaires et environnementales ne sont pas forcément très adaptées
à l’extraction des pesticides dans les HEs. En effet, contrairement aux matrices alimentaires, les HEs, en plus d’être caractérisées
par un milieu fortement apolaire, sont déjà issues d’un procédé d’extraction. Par conséquent, les pesticides susceptibles de se
retrouver dans ces extraits possèdent des propriétés physico-chimiques proches des constituants de l’HE. Au vu du nombre et
de la gamme de polarité des substances actives concernées, il apparaît compliqué d’établir une méthode de préparation capable
d’extraire sélectivement plusieurs centaines de pesticides, ou de purifier efficacement l’extrait sans perdre de molécules d’intérêt.
Lors d’essais interlaboratoires organisés par le BIPEA en 2015 sur l’analyse des pesticides dans 4 HEs (citron,lavande, cyprès et
géranium), les méthodes de préparation utilisées par la vingtaine de laboratoires européens participants figurent dans la liste
suivante :
• QuEChERS, la plus courante (protocole exact non précisé),
• Dilution,
• Extraction liquide-liquide
• PLE (Pressurised Liquid Extraction).
Pour ces essais, les meilleurs résultats ont été obtenus avec une dilution combinée à une quantification par ajouts dosés pour tenir
compte des effets matrice (résultats non publiés à ce jour).
• Analyse instrumentale
Comme pour la très grande majorité des analyses multirésidus, les deux couplages analytiques privilégiés dans les laboratoires
prestataires sont de type « ciblé ». Il s’agit de la LC-MS/MS et de la GC-MS/MS, utilisés en « binôme » pour élargir au maximum
la palette (et le nombre) de pesticides recherchés. Les sources d’ionisations les plus courantes pour réaliser le couplage entre
chromatographe et spectromètre QQQ sont les sources électrospray (ESI) dans le premier cas, la source d’ionisation électronique
(EI) dans le second.
Malgré la grande spécificité du mode d’acquisition SRM ou MRM, la résolution unitaire des spectromètres QQQ ne suffit pas
toujours à lever les ambiguïtés d’identification des pesticides présents dans les HEs : ces dernières sont constituées de centaines
de molécules en proportion variable, qui coéluent avec les pesticides et peuvent avoir des transitions SRM communes (attention
aux faux positifs et aux biais de quantification).
SOMMAIRE
3. DOSSIER TECHNIQUE
44
Dans ces conditions, l’apparition des spectromètres de masse haute résolution, de sensibilité et de gamme dynamique linéaire
se rapprochant des performances des spectromètres QQQ, offre des perspectives très intéressantes pour l’analyse des pesticides
dans les HEs et autres extraits naturels ; ceci pour 2 raisons :
• Leur pouvoir résolutif élevé leur permet de différencier 2 ions de masse très proche, par ex, m/z 200.1000 et m/z 200.1002
(erreur sur la mesure de masse à la ppm près) et donc de diminuer le risque d’identification.
• L’approche non ciblée qu’ils offrent est particulièrement séduisante dans un contexte où l’absence de recommandations
sur les résidus qui sont, ou ne sont pas acceptables, combinée aux multiples origines de ces extraits, complique fortement
l’établissement d’une liste a priori exhaustive des pesticides pertinents à rechercher.
Pour aller plus loin…
• “Analysis of pesticide residues in essential oils of citrus fruit by GC-MS and HPLC-MS after solid-phase extraction”, Barrek S et
al. (2003), Anal. Bioanal. Chem, 376(2) :157–161.
• “Comparison between GC-MS-SIM and GC-ECD for the determination of residues of organochlorine and organophosphorus
pesticides in Brazilian citrus essential oils”, Alves et al. (2012), J. Braz. Chem. Soc., 23 :306–314
• “Multiresidue Analysis of Multiclass Pesticides in Lavandin Essential Oil by LC/MS/MS Using the Scheduled Selected Reaction
Monitoring Mode”, Fillâtre et al. (2011), Anal. Chem., 83 :109–117
• “Multiresidue determination of 256 pesticides in lavandin essential oil by LC/ESI/sSRM : advantages and drawbacks of a
sampling method involving evaporation under nitrogen”, Fillâtre et al. (2014), Anal. Bioanal. Chem, 406 :1541–1550
• “Determination of pesticide minimum residue limits in essential oils - Report no. 4 : a report for the Rural Industries Research
and Development Corporation (Australian government)”, Garland et al. (2004), RIRDC publication, Barton, A.C.T.
• “Practical approaches to the analyses for pesticide residues in essential oils : a report for the Rural Industries Research and
Development Corporation (Australian government)”, Garland et al. (2004), RIRDC publication, Barton, A.C.T.
• “Determination of propiconazole residue in boronia extract (concrete)”, Groenewoud and al. (1995), J. Agric. Food Chem.,
43 :1230–1232
• “Determination of chlorpyrifos and 3,5,6-trichloro-2-pyridinol residues in peppermint hay and peppermint oil”, Inman and al.
(1981), J. Agric. Food Chem., 29 :321–323
• Determination of carbofuran and 3-hydroxycarbofuran residues in peppermint hay and peppermint oil, Inman and al. (1983),
J. Agric. Food Chem., 31 :918–919
• “Determination of the phenolic metabolites of carbofuran in peppermint hay and peppermint oil by multiple ion detection
mass spectrometry”, Inman et al.(1983), J. Agric. Food Chem., 31 :722–726
• “Practical approaches to the analyses for pesticide residues in essential oils : a report for the Rural Industries Research and
Development Corporation (Australian government)”, Garland et al. (2004), RIRDC publication, Barton, A.C.T.
• “Immunochemical screening of pesticides (simazine and cypermethrin) in orange oil”, Nichkova et al. (2009), J. Agric. Food
Chem., 57 :5673–5679
• “Pesticides and plasticizers in Citrus essential oils : An ordinary history of research, Saitta et al. (2012), J. Essent. Oil Res., 24 :171–
180
• “Pesticides determination in citrus essential oil by direct injection : comparison between fast GC-TOFMS and GCxGC-TOFMS
approach”, Mantegazza at al. (2012) poster Dani Instruments
• “A rapid method of analysis of organophosphate pesticides in Mandarin Essential oils : detection and hazard assessment of
organophosphate pesticides in industrially distilled and cold-pressed mandarin oils.”, Gionfriddo at al., (2009), Perfum. Flavor.,
34 :28-31
3.2. La validation d’une méthode analytique
◆ Les enjeux
Pour le laboratoire prestataire de l’analyse comme pour le client, il est important d'avoir confiance dans la validité des résultats
qui sont rendus. Cette confiance n’est accordée que si des preuves suffisantes sont apportées pour témoigner de la fiabilité et de
la pertinence de la méthode et des résultats en réponse aux attentes ou aux objectifs fixés. En validant une méthode analytique,
le laboratoire s’assure qu’il est en mesure de réaliser ce qu’il dit pouvoir/savoir-faire, et ce, tout au long de la durée d’exploitation
de la méthode.
SOMMAIRE
45
LE DOSAGE DES PESTICIDES DANS LES HUILES ESSENTIELLES
Le processus de validation de méthode revient à tester les performances de la méthode pour connaitre ses aptitudes comme ses
limites, mais également :
• à identifier les sources d’erreurs potentielles
• à vérifier que la méthode est adaptée à l’usage prévu
• à établir des preuves que la méthode analytique peut être utilisée pour prendre des décisions (par ex : le déclassement voire la
destruction de lot pour lequel il y a dépassement de LMR ; ou si la contamination résiduelle de pesticides de matrices d’origine
biologique ne satisfait pas aux exigences des labels BIO)
• à satisfaire des exigences réglementaires (accréditation COFRAC)
La validation ne doit intervenir que sur une méthode complètement mise au point. Elle est réalisée prioritairement en interne
(validation intralaboratoire), mais peut-être élargie à plusieurs laboratoires (validation interlaboratoires), dans le cas par exemple
de la reconnaissance de méthodes officielles. Les performances étudiées sont décrites ci-après.
◆ Les principaux paramètres étudiés lors de la validation (méthodologie classique)
Dans de nombreux documents de référence, la validation est présentée comme une suite d’études expérimentales servant à
calculer des critères de validation.
• L’exactitude de la mesure (degré de confiance dans la mesure)
Une méthode d’analyse est d'autant plus exacte que les résultats de mesure qu'il indique coïncident avec la « valeur vraie » que
l'on cherche à mesurer. L'exactitude de mesure est essentiellement liée à deux types de caractéristiques : la justesse (proximité des
valeurs vraie et mesurée) et la fidélité (dispersion des valeurs). Une méthode est exacte si elle est à la fois juste et fidèle.
Figure 12 : Justesse, fidélité et précision
Ni juste, ni fidèle (“imprécis”)
(erreur aléatoire + systématique)
Juste et fidèle (“précis”)
(erreurs faibles)
Pas juste mais fidèle
(erreur systématique)
Juste mais pas fidèle
(erreur aléatoire)
Justesse et fidélité se détermine en réalisant des « taux de recouvrement » (TR %) : un échantillon est dopé avec une quantité
connue d’un ou plusieurs pesticides, puis analysé comme un échantillon réel, c’est-à-dire en appliquant strictement le protocole
analytique choisi. Le résultat quantitatif (quantité de pesticide mesurée analytiquement) est alors comparé à la quantité de
pesticide introduite initialement, selon l’équation :
TR (%) = Quantité finale en pesticide x 100
Quantité initiale en pesticide
Pour un niveau de dopage donné, cette opération est répétée suffisamment de fois (5 réplicas minimum) pour pouvoir calculer
une moyenne (exprimant la justesse) et une déviation standard relative (exprimant la fidélité). Pour qu’un niveau de TR soit «validé»
le guide SANCO 2015/11945 donne les préconisations suivantes : la justesse doit être comprise entre 70 et 120 % et la fidélité
exprimé à travers le coefficient de variation (CV), inférieure à 20 %.
• La spécificité et sélectivité (degré de confiance dans l’identification)
La sélectivité est la capacité de l’extraction, de la purification, de la dérivatisation, du système de séparation et particulièrement du
détecteur à discriminer l’analyte d’intérêt des autres composés.
La spécificité est la capacité d’un détecteur (soutenu par la sélectivité de l’extraction, de la purification et du système de séparation
si nécessaire) à fournir des signaux qui identifie effectivement l’analyte d’intérêt.
Les différents types de spectromètres de masse et mode d’acquisition fournissent différents degrés de spécificité et sélectivité. Les
conditions d’identification recommandées sont décrites dans le tableau ci-après (Table 8, adapté du guide SANTE/11945/2015)
SOMMAIRE
3. DOSSIER TECHNIQUE
46
Table 8 : Exigences pour l'identification d'analytes dans le cas de techniques MS (SANCO 2015/11945)
Détecteur MS /
caractéristiques Exemples de systèmes Mode d’acquisition
Exigences pour
l’identification
Nombre minimum d’ions
Divers
Rapport signal/ bruit
(S/N) ≥ 35
Les pics des ions extraits
de l’analyte doivent
être parfaitement
superposables
• Rapport d’ions
• 30% du rapport moyen
obtenu sur les standards
de calibration de la
même séquence
MS, résolution
unitaire QQQ, trappe d’ions, TOF Full scan, SIM, gamme
m/z restreinte 3 ions
MS/MS
QQQ, Q-TOF,
Q-trap, trappe d’ions,
Q-orbitrap
SRM ou MRM, résolution
en masse pour la
sélection de l’ion
précurseur ≥ 1
2 ions fils
Mesure de
masse exacte
MS haute résolution :
(Q-)TOF,
(Q-)Orbitrap,
FT-ICR-MS,
secteur MS
Full scan, SIM, gamme
de m/z restreinte,
fragmentation avec/
sans sélection de l’ion
précurseur, combinaison
de cas
2 ions avec une
exactitude en masse
≤ 5 ppm1,2,3
MS simple ou en tandem
(MS/MS) avec une
résolution en masse
pour la sélection de l’ion
précurseur ≥ 1
2 ions : 1 ion moléculaire
– molécule (dé)protonée
ou adduit – avec une
exactitude en masse
≤ 5 ppm1,3
+ 1 ion fils en MS/MS4
1. Incluant de préférences l’ion moléculaire (molécule (dé)protonée ou adduit)
2. Incluant au moins un ion fragment
3. < 1mDa pour m/z < 200
4. Pas de d’exigences spécifiques pour l’exactitude en masse
5. En l’absence de bruit de fond, un signal doit être présent sur au moins 5 scans consécutifs
• La sensibilité (seuil de détection du pesticide)
La sensibilité est l'aptitude de la méthode à détecter de petites variations de concentration et se caractérise donc par la pente de
la courbe d'étalonnage. Cependant, il est fréquent (et réducteur) de l’associer à la plus petite quantité de pesticide détectable (cf.
LOD) ou quantifiable (LOQ, RL) par la méthode.
Pour aller plus loin…
• “ Analytical quality control and method validation procedures for pesticides residues analysis in food and feed”, Guidance
document SANTE/11945/2015, Commission Européenne, Direction Générale De La Santé Et De La Sécurité Alimentaire
(remplace SANCO/12571/2013)
◆ Le plan de validation des méthodes analytiques
Qu’il s’agisse de méthodes de référence (ex : méthode QuEChERS Norme NF EN 15662 pour les aliments d’origine végétale) ou de
méthodes « internes », tout laboratoire suit un plan de validation précis pour, in fine, produire au moindre coût une donnée que
personne ne puisse contester. Ce plan de validation est spécifiquement défini pour satisfaire à la fois aux objectifs analytiques
(performances de la méthode, cadence et nombre d’analyses), tout en tenant compte des moyens à disposition (ressources
humaines et matérielles notamment).
SOMMAIRE
47
LE DOSAGE DES PESTICIDES DANS LES HUILES ESSENTIELLES
D’un point de vue général, le processus de validation de méthode peut être synthétisé comme suit :
Figure 13 : Plan de validation de méthodes analytiques
Définition des objectifs
de la méthode
• Matrice de l'échantillon
• Analytes d'intérêt et concentration
• Équipements
Tests de performances
• Développement des protocoles d'essais
• Réalisation des essais selon les protocoles
• Comparaison des résultats avec les critères
d'acceptation
Définir les paramètres
de validation
• Performances
• Critères d'acceptation
Tests au cours de l'utilisation
de la méthode en routine
• Procédure d'opération standardisée
• Carte de contrôle des tests
• Contrôle qualité analytique
RAPPORT DE VALIDATION
PLAN DE VALIDATION
Les laboratoires commerciaux analysent souvent une grande variété d’échantillons et il est inconcevable (temps et argent) de
déterminer statistiquement les limites de détection dans chaque échantillon, de même que d’effectuer des validations poussées
sur toutes les matrices pour tous les pesticides.
En revanche, certains critères essentiels doivent être respectés. En particulier un regard critique doit être porté sur la manière dont
ont été déterminées les LOQ, et sur le mode opératoire retenu pour réaliser la quantification. À moins de résultat démontrant
l’absence d’effets matrice, ces derniers doivent absolument être pris en compte sur l’évaluation de la LOQ et lors de la quantification.
La Figure 14 illustre les usages analytiques les plus courants en analyse de routine et leur influence sur la qualité et le degré de
confiance du résultat (Figure).
Figure 14 : Méthodologies analytiques et leur influence sur le degré de confiance
Exemple de l'analyse d'une HE de lavande, lot A
NIVEAU DE CONFIANCE
1. Le degré de similitude de l'HE utilisée pour préparer la gamme de calibration avec la nature et composition de l'HE analysée affectera
fortement le niveau de confiance dans le résultat délivré.
Par exemple, utiliser une HE d'orange pour la courbe de calibration dans le but d'analyser une HE de lavande est très fortement
déconseillé.
2. L'origine botanique, géographique, la période de récolte mais également les étapes de rectification des HEs après extraction peuvent
influencer leur composition et donc les effets de la matrice sur l'analyse de pesticides.
SOMMAIRE
3. DOSSIER TECHNIQUE
48
◆ Les contrôles et vérications avant de procéder à toute analyse
La sensibilité des analyseurs évoluent au cours du temps et nécessitent des maintenances afin de rétablir leur sensibilité optimale.
Un des principaux challenges des laboratoires d’analyse est donc de pouvoir assurer constamment la limite de quantification qu’il
a fixée et/ou validée pour chaque pesticide, cela est rendu d’autant plus complexe avec le grand nombre de résidus analysés.
La sensibilité instrumentale peut être vérifiée à chaque série d’analyse avec l’injection d’un point de gamme matrice surchargée
avec l’ensemble des pesticides à leur LOQ.
Les performances de la méthode en routine peuvent être contrôlées par la réalisation d’un TR avec la série d’analyse.
L’établissement de profil d’exactitude pour suivre les performances de la méthode offre une autre approche pour la validation des
méthodes d’analyse quantitatives.
◆ L’intérêt de réaliser un prol d’exactitude (méthodologie globale)
Contrairement à la méthodologie classique qui valide une méthode « critère par critère », la méthodologie globale offre au
laboratoire la possibilité de fournir, à travers le suivi d’un critère « unique » et « global », la garantie que chaque résultat qui sera
obtenu en routine sera suffisamment proche de la valeur vraie de l’échantillon traité. Dans ce cas, la validation des méthodes
d’analyse quantitatives se fait au moyen du profil d’exactitude.
Le profil d’exactitude (Figure 15) est basé sur une application directe des principes décrits dans les normes de la série ISO 5725. On
y propose un modèle statistique, mis en graphique, pour estimer l’exactitude (justesse et fidélité) d’une méthode ou de résultats.
Le principe, la mise en œuvre et l’interprétation du profil d’exactitude font l’objet de publications détaillées, rédigées notamment
par Dr. Max Feinberg, ingénieur agronome à l’INRA et spécialiste en chimiométrie.
Figure 15 : Profil d'exactitude (validation globale)
140
120
100
130
110
90
80
70
60
Concentration connue (µg/g)
Taux de recouvrement (TR %)
LOQ
01 2345
DOMAINE DE VALIDITÉ
INTERVALLE D’ACCEPTABILITÉ
TR % MOYEN PAR NIVEAU
INTERVALLE DE TOLÉRANCE (entre limites basse et haute)
DOMAINE DE VALIDATION
SOMMAIRE
49
LE DOSAGE DES PESTICIDES DANS LES HUILES ESSENTIELLES
Pour aller plus loin…
• Références méthodologiques pour la validation de méthode, classique ou globale.
• La série d’articles publiés par la SFSTP (Société Française des Sciences et Techniques Pharmaceutiques) : « Harmonization of
strategies for the validation of quantitative analytical procedures », Hubert et al., J. Pharm. Biomed. Anal. (Part I à IV, de 2004 à
2008)
• Publications de Max Feinberg :
> Cahier des Techniques de l’Inra (numéro spécial, 2010) Validation des méthodes d’analyse quantitative par le profil
d’exactitude : i) Principes et vocabulaire pour la validation des méthodes ii) Mise en œuvre du profil d’exactitude, iii)
Interprétation du profil d’exactitude
> Labo-Stat : Guide de validation des méthodes d’analyse (2009), Lavoisier Tec&Doc, Paris
• “IUPAC Technical Report : Harmonized guidelines for single-laboratory validation of methods of analysis”, (2002), Pure Appl.
Chem., 74 (5) : 835-855
• Recommandations de l’ICH (International Conference on Harmonization of technical requirements for registration of
pharmaceuticals for human use), notamment “ Validation of Analytical Procedures : text and methodology, Q2(R1) 1994-1996,
téléchargeables en ligne : http://www.ich.org/products/guidelines/quality/article/quality-guidelines.html
• La série de Normes ISO 5725 « Exactitude (justesse et fidélité) des résultats et méthodes de mesure », 1994-1996 :
> ISO 5725 – 1 : principes généraux et définitions
> SO 5725 – 2 : méthode de base pour la détermination de la répétabilité et de la reproductibilité d’une méthode de mesure
normalisée
> ISO 5725 – 3 : mesures intermédiaires de la fidélité d’une méthode de mesure normalisée
> ISO 5725 – 4 : méthode de base pour la détermination de la justesse d’une méthode de mesure normalisée
> ISO 5725 – 5 : mesures alternatives pour la détermination de la fidélité d’une méthode de mesure normalisée
> ISO 5725 – 6 : utilisation dans la pratique des valeurs d’exactitude "La" référence en matière de validation statistique
• La Norme ISO 17025 : 2005 « Exigences générales concernant la compétence des laboratoires d’étalonnage et d’essais ». C’est
la référence pour l’accréditation des laboratoires par le COFRAC
SOMMAIRE
5050
TABLES ET FIGURES
Tables
1. Classification des pesticides selon leur spectre d’action ............................................................................................................ 20
2. Production mondiale d’huiles essentielles .......................................................................................................................................... 25
3. Données réglementaires disponibles sur internet pour différents pays .......................................................................... 26
4. Définition du résidu pour quelques exemples de pesticides .................................................................................................. 27
5. Description des effets matrices en GC-MS (/MS) et LC-MS (/MS) .......................................................................................... 37
6. Stratégies analytiques pour compenser les effets matrices ..................................................................................................... 39
7. Caractéristiques des 2 méthodologies analytiques ciblée et non ciblée, bien distinctes
et complémentaires .......................................................................................................................................................................................... 41
8. Exigences pour l'identification d'analytes dans le cas de techniques MS (SANCO 2015/11945) ...................... 46
Figures
1. Cadres réglementaires régissant la mise sur le marché des pesticides ............................................................................. 22
2. Classification des pesticides selon leur substance active (exemples) ................................................................................23
3. Répartition mondiale de la consommation de produits phytosanitaires ........................................................................ 24
4. Les réglementations applicables aux HEs ............................................................................................................................................29
5. Synthèse de l’occurrence des pesticides dans les extraits naturels ..................................................................................... 31
6. Méthodologie de report de résultats sur un bulletin d’analyse comparativement
aux seuils de détection et de quantification ...................................................................................................................................... 35
7. Méthodologie de report de résultats sur un bulletin d’analyse comparativement
aux « Reporting Limits »................................................................................................................................................................................... 35
8. Effets matrice en LC-MS (/MS) ..................................................................................................................................................................... 38
9. Effets matrice en GC-MS (/MS) .................................................................................................................................................................... 38
10. Principe de la méthode QuEChERS décrite dans la norme NF EN 15662......................................................................40
11. Principe de l'acquisition en SRM (ou MRM) en analyse ciblée .............................................................................................43
12. Justesse, fidélité et précision ..................................................................................................................................................................... 45
13. Plan de validation de méthodes analytiques .................................................................................................................................. 47
14. Méthodologies analytiques et leur influence sur le degré de confiance ......................................................................47
15. Profil d'exactitude (validation globale) ................................................................................................................................................ 48
SOMMAIRE
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