Gestión de la cadena de frío en Biobancos

Abstract

La gestión y control de la cadena de frío en todos los procesos del Biobanco es uno de los factores más relevantes a la hora de obtener muestras de elevada calidad y reducir el número de errores derivados de una mala conservación en la investigación basada en muestras de biobancos

Full text

INSTALACIONES Y EQUIPOS DE
CONSERVACIÓN DE MUESTRAS BIOLÓGICAS
Málaga, 5-6 de junio
Mantenimiento de la cadena de frío y perfil térmico durante la
conservación de muestras”
F. Javier García Palomo
Responsable de Gestión de Equipos
Banco Nacional de ADN Carlos III (Salamanca)

La importancia de la gestión integral de productos
“Availability of high-quality biospecimens is a requirement for biomarker
discovery and for determining the specificity and sensitivity of the discovered
biomarkers. The quality of the biospecimens depends upon preanalytical
variables (ie, collection and processing techniques, freeze/thaw stability and
storage stability), which account for > 60%–90% of the diagnostic errors.” (2)
(2) Hubel, Aksan y Skubitz.”State of the art in preservation in fluid bioespecimen”. Biopreservation and Biobanking, 2011, vol. 9, 3.
GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”
“Sometimes diseases are associated with very small changes in the DNA
(single-nucleotide polymorphisms), and using reliable samples to study such
biomarkers becomes crucial. Without proper protocols and the use of
advanced technologies, the integrity and viability of these samples can often
be at risk. Small variations in sample handling and temperature can affect
the reproducibility of basic and clinical research, particularly in rapidly
advancing fields like cell therapy. “(1)
(1) Malm et al. “Developments in biobanking workflow standardization providing sample integrity and stability.” Proteomics. 2013, vol 16, 95

El ciclo de vida de una muestra
GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”
Planificación
Recolección
Transporte
Procesado
Almacenado
Distribución
Análisis
Imagen tomada de Katheryn Shea. “The life cycle of a sample”, Strategic sample management, Brooks Life Science Systems

El ciclo de vida de una muestra
PLANIFICACIÓN
GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”
Tipo de muestra y uso destinado (presente y futuro)
Técnica de recolección
Temperaturas, tiempos y método de
transporte
Tamaño/volumen de muestra necesaria
Tipo y material del contenedor
Método de preservación a largo plazo
Exposición a ciclos de congelación descongelación
Temperaturas y tiempos previstos durante
manipulación y procesado
Estabilizantes necesarios

El ciclo de vida de una muestra:
RECOLECCIÓN, TRANSPORTE y PROCESADO
GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”
Hora de extracción, torniquete, alcohol, orden de extracción de tubos,… (1)
ACTH, ACE, Catecolaminas, ácidos grasos libres, …, se deben refrigerar de
inmediato
Fotosensibilidad (bilirrubina)
Viabilidad celular: tubos separadores son estables 8 h. a RT y 48h a 4ºC
(1) NCCLS – Procedures for the Collection of Diagnostic Blood Specimens by Venipuncture; Approved Standard, Fifth Edition, H3-A5 Vol. 23 No. 32, December 2003.
Metabolismo celular: cambios en expresión de proteínas, ciclo celular,
cambios en permeabilidad de membrana,…, derivados de stress térmico (2)
(2) Sonna y Craig. “Molecular Biology of Thermoregulation Invited Review: Effects of heat and cold stress on mammalian gene expression”. J Appl Physiol 92, 2002
Factores que pueden afectar muestra durante la extracción:

El ciclo de vida de una muestra
Logística de recolección: “Las tres T”
GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”

Plasma y suero
25ºC
-196ºC 0ºC -20ºC
-80ºC
Orina, LCR
Ácidos nucleicos, saliva
Células nucleadas
Sangre total
Eritrocitos, plaquetas
Tejidos
-10ºC a -4ºC
Nucleación
±130ºC
Tg
Hubel, Aksan y Skubitz,.”State of the art in preservation in fluid bioespecimen”. Biopreservation and Biobanking, 2011, vol. 9,3.
El ciclo de vida de una muestra
Elección de temperatura de almacenamiento
GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”

El ciclo de vida de una muestra
Ejemplos de estabilidad
GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”
BIOESPECIMEN Duración
ensayo Rango
temperaturas
Analito valorado
Sangre 8 horas -4ºC Heparina
1 año -196ºC Hemoglobina
Plasma 1 año -80ºC MMP-9
37 meses -40ºC Factor de coagulación VIII
Suero 1 hora -80ºC Alfa-1 antiquimotripsina
Hasta 23 años -25ºC Hormonas tiroideas
Orina 160 días -70ºC Albúmina
1 año -20ºC Catecolaminas
Eritrocitos 37 años -10ºC a -75ºC Hemolisis, ATP,…
HSCs Hasta 14 años -196ºC Viabilidad
PBPCs 1 año -140ºC UFC
Tejido cáncer pulmón 100 días -20ºC a -196ºC Receptor específico de estrógenos
Tejido del tracto
reproductivo 8 semanas -196ºC Receptor de estrógenos
Piel 12 meses -196ºC Integridad cromosómica
Hubel, Spindler y Skubitz . “Storage of Human Biospecimens: Selection of the Optimal Storage Temperature”. Biopreservation and Biobanking, 2014,Vol.12,3

El ciclo de vida de una muestra
“Congelar no significa estabilizar”
GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”
25ºC
-196ºC 0ºC -20ºC
-80ºC
-56ºC
Ribonucleasa A
-90ºC
RNAsa A
-70ºC
Β-Glucosidasa
±130ºC
Tg
Hubel, Spindler y Skubitz . “Storage of Human Biospecimens: Selection of the Optimal Storage Temperature”. Biopreservation and Biobanking, 2014,Vol.12,3

El ciclo de vida de una muestra
Consejos en almacenamiento de proteínas
GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”
Enzimas y Abs son muy sensibles y rápidamente pierden actividad (2 horas)
La adición de proteasas puede interferir con las técnicas donde se use
Algunos antibacterianos son muy tóxicos
Tener en cuenta la adsorción al contenedor de almacenamiento a bajas
concentraciones

“Preservación y conservación de muestras biológicas:
mucho más que almacenamiento”
Elección de métodos de almacenamiento
Consejos para almacenamiento de células viables
Optar por temperaturas por debajo de
-150°C siempre que sea posible
Realizar rampas de congelación de 0,5-
1°C/min y descongelaciones rápidas (lavado
de crioprotectores inmediato) mejoran la
estabilidad a largo plazo del producto y la
viabilidad posterior
Soluciones proteicas complejas, células,…, suelen requerir de
crioprotectores y/o estabilizantes
Las fluctuaciones en las temperaturas de conservación y las vibraciones afectan
al producto, acelerando su degradación (1)
(1) Nikolaev y. Williams. “The sensitivity of human mesenchymal stem cells to vibration and cold storage conditions representative of cold transportation”. J. R. Soc. Interface , 2012,9.

Registro de temperaturas
¿Cuál es la temperatura REAL?
Sondas de temperatura de
un mismo equipo dan
lecturas diferentes:
¿Calibración?
¿Posición?
GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”
El ciclo de vida de una muestra
Mantenimiento de la cadena de frío en almacenes

Registro de temperaturas
¿Cuál es la temperatura REAL?
GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”
El ciclo de vida de una muestra
Mantenimiento de la cadena de frío en almacenes
>
Posición
Carga de equipo
Convección interior
Sonda en inmersión/aire
Calibración

Eventos 24/7
Apertura de puertas
Entrada de muestras para
congelar
“Picking” de tubos para
procesar, envíos,…
Reorganización de ULT´s,…
Averías
GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”
El ciclo de vida de una muestra
Mantenimiento de la cadena de frío en almacenes

Evento 24/7:
“Apertura de puerta en ULT durante 1 minuto”
La caja Micronic© permanece en el interior
Sondas en tubos Micronic 0,6ml con 500µl de SBF
(posiciones 1 y 44) y caja vacía.
Ultracongelador THERMO SCIENTIFIC REVCO, Serie UxF.
-80ºC
-78ºC
-76ºC
-74ºC
-72ºC
-70ºC
-68ºC
-66ºC
0 1 2 4 5 6 8 9 10 12 13 14 16 17 18 20 21 22 24 25 26 28 29 30 32 33 34 36 37 38 40 41 42 44 45 46 48 49 50 52 53 54 56 57 58 60 61 62 64 65 66 68 69 70 72 73 74 76 7778 80 81 82 84 85 86 88 89 90 92 93 94 96 97 98
Minutos
Sonda en esquina
Sonda central
Equipo
12345678910 11 12
A1 9 17 25 33 41 49 57 65 73 81 89 A
B210 18 26 34 42 50 58 66 74 82 90 B
C311 19 27 35 43 51 59 67 75 83 91 C
D412 20 28 36 44 52 60 68 76 84 92 D
E513 21 29 37 45 53 61 69 77 85 93 E
F614 22 30 38 46 54 62 70 78 86 94 F
G715 23 31 39 47 55 63 71 79 87 95 G
H816 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96 H
12345678910 11 12
GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”

-80,0 ºC
-70,0 ºC
-60,0 ºC
-50,0 ºC
-40,0 ºC
-30,0 ºC
-20,0 ºC
-10,0 ºC
0,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11121314 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24252627 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37383940 41 42 43 44 45 46 47 48 49 505152 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62636465 66 67 68
Minutos
Ensayo 1 min Sonda esquina [°C]
Ensayo 1 min Sonda centro [°C]
Ensayo 2 min Sonda esquina [°C]
Ensayo 2 min Sonda centro [°C]
Ensayo 3 min Sonda esquina [°C]
Ensayo 3 min Sonda centro [°C]
Sondas en tubos Micronic 0,6ml con 500µl de SBF
(posiciones 1 y 44) y caja vacía.
Ultracongelador THERMO SCIENTIFIC REVCO, Serie UxF.
12345678910 11 12
A1 9 17 25 33 41 49 57 65 73 81 89 A
B210 18 26 34 42 50 58 66 74 82 90 B
C311 19 27 35 43 51 59 67 75 83 91 C
D412 20 28 36 44 52 60 68 76 84 92 D
E513 21 29 37 45 53 61 69 77 85 93 E
F614 22 30 38 46 54 62 70 78 86 94 F
G715 23 31 39 47 55 63 71 79 87 95 G
H816 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96 H
12345678910 11 12
GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”
Evento 24/7
Extracción de caja Micronic durante 1,2 ó 3 minutos
“SIN protección”

GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”
Evento 24/7
Extracción de caja Micronic 1 minuto cada 10 (500µl)
“SIN protección”
-45ºC
-52ºC
-58ºC

GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”
Evento 24/7
Extracción de caja Micronic 1 minuto cada 10 (500µl)
“CON protección”
-67ºC
-64ºC -61ºC

GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”
Caja amortiguadora
Aire caliente
Hielo seco Gel frío
Aire caliente

Evento 24/7
Introducir 14 tubos con 500µl para congelar junto a otras ya
congeladas
-80,0 ºC
-70,0 ºC
-60,0 ºC
-50,0 ºC
-40,0 ºC
-30,0 ºC
-20,0 ºC
0 1 2 4 5 6 8 9 10 12 13 14 16 17 18 20 21 22 24 25 26 28 29 30 32 33 34 36 37 38 40 41 42 44 45 46 48 49 50 52 53 54 56 57 58 60 61 62 64 65 66 68 69 70 72 73 74 76 77 78 80 81
Minutos
Media sonda centro[°C]
Sonda borde exterior [°C]
Ensayo introducción 14 tubos sin congelar (42 a 56).
Sondas en 41 y 44 (500µl).
Tiempo de proceso 1 minuto: SIN HIELO SECO.
Ultracongelador THERMO SCIENTIFIC REVCO, Serie UxF.
Tiempo máximo para
“desviación” en SGC de
BNADN
12345678910 11 12
A1 9 17 25 33 41 49 57 65 73 81 89 A
B210 18 26 34 42 50 58 66 74 82 90 B
C311 19 27 35 43 51 59 67 75 83 91 C
D412 20 28 36 44 52 60 68 76 84 92 D
E513 21 29 37 45 53 61 69 77 85 93 E
F614 22 30 38 46 54 62 70 78 86 94 F
G715 23 31 39 47 55 63 71 79 87 95 G
H816 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96 H
12345678910 11 12
GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”

¿El volumen en el tubo tiene algo que ver?
Ensayo con sondas de 250µl
-80ºC
-70ºC
-60ºC
-50ºC
-40ºC
-30ºC
-20ºC
-10ºC
0
0 1 3 5 6 8 10 11 13 15 16 18 20 21 23 25 26 28 30 31 33 35 36 38 40 41 43 45 46 48 50 51 53 55 56 58 60 61 63 65 66 68 70 71 73 75 76 78
Minuto
Sonda exterior[°C]
Sonda centro[°C]
Ensayo introducción 14 tubos sin congelar (42 a 56).
Sondas en 37 y 41 (250µl).
Tiempo de proceso 1 minuto: SIN hielo seco.
Ultracongelador THERMO SCIENTIFIC REVCO, Serie UxF.
Tiempo máximo para
“desviación” en SGC de
BNADN
GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”

12345678910 11 12
A1 9 17 25 33 41 49 57 65 73 81 89 A
B210 18 26 34 42 50 58 66 74 82 90 B
C311 19 27 35 43 51 59 67 75 83 91 C
D412 20 28 36 44 52 60 68 76 84 92 D
E513 21 29 37 45 53 61 69 77 85 93 E
F614 22 30 38 46 54 62 70 78 86 94 F
G715 23 31 39 47 55 63 71 79 87 95 G
H816 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96 H
12345678910 11 12
Ensayo introducción 15 tubos de 100µl
sin congelar (42 a 56).
Sondas en 37 y 41 (100µl).
Tiempo de proceso 1 minuto: CON HIELO SECO.
Ultracongelador THERMO SCIENTIFIC REVCO, Serie UxF.
GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”
¿El volumen en el tubo tiene algo que ver?
Ensayo con sondas de 100µl

-80,00ºC
-70,00ºC
-60,00ºC
-50,00ºC
-40,00ºC
-30,00ºC
-20,00ºC
-10,00ºC
0,00
0 1 2 4 5 6 8 9 10121314161718202122242526282930323334363738404142444546484950525354565758606162646566686970727374767778808182848586888990929394969798
Sonda córner[°C]
Sonda centro[°C]
Tiempo máximo para
incidencia en proteínas
Ensayo introducción 15 tubos sin congelar (42 a 56).
Sondas en 37 y 41 (250µl).
Tiempo de proceso 1 minuto: CON hielo seco.
Ultracongelador THERMO SCIENTIFIC REVCO, Serie UxF.
¿Y si utilizo hielo seco?
12345678910 11 12
A1 9 17 25 33 41 49 57 65 73 81 89 A
B210 18 26 34 42 50 58 66 74 82 90 B
C311 19 27 35 43 51 59 67 75 83 91 C
D412 20 28 36 44 52 60 68 76 84 92 D
E513 21 29 37 45 53 61 69 77 85 93 E
F614 22 30 38 46 54 62 70 78 86 94 F
G715 23 31 39 47 55 63 71 79 87 95 G
H816 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96 H
12345678910 11 12
GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”

La mayor repercusión parece estar en el volumen y la
proximidad.
Ensayo introducción tubos de 100µl de 8 en 8
sin congelar (42 a 80).
Sondas en 37 y 41 (250µl).
Tiempo de proceso 1 minuto: SIN HIELO SECO.
Ultracongelador THERMO SCIENTIFIC REVCO, Serie UxF.
12345678910 11 12
A1 9 17 25 33 41 49 57 65 73 81 89 A
B210 18 26 34 42 50 58 66 74 82 90 B
C311 19 27 35 43 51 59 67 75 83 91 C
D412 20 28 36 44 52 60 68 76 84 92 D
E513 21 29 37 45 53 61 69 77 85 93 E
F614 22 30 38 46 54 62 70 78 86 94 F
G715 23 31 39 47 55 63 71 79 87 95 G
H816 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96 H
12345678910 11 12
-80,00
-75,00
-70,00
-65,00
-60,00
-55,00
-50,00
-45,00
-40,00
-35,00
-30,00
0 1 2 4 5 6 8 9 10 12 13 14 16 17 18 20 21 22 24 25 26 28 29 30 32 33 34 36 37 38 40 41 42 44 45 46 48 49 50 52 53 54 56 57 58 60 61 62 64 65
Promedio col 57-64
Promedio col 65-72
Promedio col 73-80
Promedio 42 a 56
GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”

¿Y para los tanques de nitrógeno líquido?
GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”
Warhust, Fink y Zandi. “Protection of Innocents: continued sample warm-up after return to a criogenic environment (below -150ºC) following a transient ambient picking operation”. Conference
of Society of Cellular therapy´s”. 2015, Las Vegas. Published by Brooks Life Science systems.

Conclusiones
La cualificación y el control de temperaturas de
nuestros equipos no muestra la realidad de lo que
le sucede a las muestras en el trabajo 24/7
Aunque para ADN se puede demostrar con las técnicas
disponibles que no hay degradación, para el resto de
biomoléculas la inestabilidad térmica posiblemente
produzca daños que debemos evaluar y controlar
(proteasas, agregación, pH shifts,…)
Este proceso de inestabilidad térmica, aplicado a
viales con células, ya ha demostrado que produce
pérdida de viabilidad, incluso en tanques de LN2
(próximas a Tg)
GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”

Consejos para evitar el impacto de las
fluctuaciones de temperaturas
Para el personal
Entrenamiento en gestión de la cadena de frío:
•Minimizar el tiempo de exposición de muestras congeladas a
la temperatura ambiente
•Evitar tener posiciones vacías provee de masa térmica que
reduce la extensión de las excursiones (escarcha, foam,
bloques fríos,..)
•Evitar la exposición a HVAC durante el trabajo
GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”

GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”
Procedimientos (SOP)
Estrictos protocolos para la manipulación de muestras
congeladas:
•Una muestra expuesta a TA no debería ser de nuevo
expuesta hasta, por lo menos, pasada una hora
•Congelar muestras en cajas con otra muestras ya
congeladas produce “excursiones de temperatura” que
pueden ocasionar degradación
Consejos para evitar el impacto de las
fluctuaciones de temperaturas

GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”
Documentación
Registre todos los datos relativos a la muestra,
desde la extracción hasta el envío final (también transporte)
Consejos para evitar el impacto de las
fluctuaciones de temperaturas

GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”
Control de calidad
Realice auditorías de los productos almacenados/enviados
en todas las fases de producción
Consejos para evitar el impacto de las
fluctuaciones de temperaturas
Betsou y Chuaqui. “Identification of Evidence-Based Biospecimen Quality-Control Tools”. Journal of molecular diagnostics, 2013, vol 15;1

GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”
USO DE HIELO SECO (CO2)
Murphy et Fitchmun. “Protein instability following transport or storage on dry ice”. Nature Methods 10, 278-279 (2013)
Es un gas capaz de difundir a través de la junta de tubos
habitualmente utilizados (también parafilm).
Se mezcla con el aire que queda en el tubo y termina
bajando el pH de las soluciones
Agregación, pérdida de afinidad, degradación,…

GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”
USO DE HIELO SECO (CO2)
Solución
Murphy et Fitchmun. “Protein instability following transport or storage on dry ice”. Nature Methods 10, 278-279 (2013)
Asegúrese de utilizar materiales similares en tubo y tapón o
utilice SOLO tubos con junta de goma. Asegure bien el cierre
Para tejidos o placas selladas con film,
no use zip-bags.
En su lugar use las bolsas con cierre
adhesivo hermético
(ADR, Instrucción de embalaje P650, bolsas 95Kpa
certificadas)
Permita que, una vez recibido, el gas se evapore metiendo la
muestra en ULT

¿ PREGUNTAS ?

1. Crioprotector: ensayo de toxicidad
2. Rampa de congelación elegida: Criomed©,
Mr.Frosty™, Coolcell®,…
3. Condiciones de almacenamiento.
4. Método de recuperación (rampa de calentamiento,
dilución de crioprotectores,…)
Para nuevas líneas
0% 20% 40% 60% 80% 100%
Muestra 1
Muestra 2
Muestra 3
Muestra 4
Muestra 5
Muestra 6
Muestra 7
Muestra 8
% Recuperado
5. Tasa de recuperación:
¿es suficiente?
El ciclo de vida de una muestra
Factores relevantes en el proceso de criopreservación
GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”

El ciclo de vida de una muestra
Tamaño/volumen de muestra
GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”
Inmortalización
Número de células NECESARIAS PARA INICIAR cultivo
Densidad en cultivo: 300.000-900.000 cel/ml
Inicio de cultivo con 1,5mL
Linfocitos B son ±8-10% de PBMC
Recuperación mínima necesaria > 4 millones de PBMC
Cada ml de sangre tiene 5-8 millones de leucocitos
Sólo un 40% son PBMCs
Se necesitan al menos 3 ml de sangre

El ciclo de vida de una muestra
Estabilizantes y temperaturas necesarios
GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”
DIAS POST-
EXTRACCIÓN
ANTICOAGULANTE Y MODO DE ALMACENAMIENTO
ACD EDTA 4ºC AMBIENTE TOTAL
0-7 DÍAS 85% 58% 68% 67% 68%
8-14 DÍAS 56% 24% 31% 0% 31%
>15 DÍAS 0% 0% 0% 0% 0%
EFECTOS DE LAS CONDICIONES DE EXTRACCIÓN Y ALMACENAMIENTO
SOBRE LA EFECTIVIDAD DE LA TRANSFORMACIÓN CON EBV
Establishment of stably EBV-transformed Cell lines from residual Clinical blood-samples. Timothy T. Stenzel, PhD, Medical Director, Vysis Inc., Duke University Medical Center

El ciclo de vida de una muestra:
Temperatura de transporte
GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”

GESTIÓN DE LA “CADENA DE FRÍO”