Review. Ruolo oncogenetico dei radicali liberi nel fumo di tabacco/Oncogenic role of reactive oxygen species in tobacco smoke.

Abstract

Riassunto
I radicali liberi dell'ossigeno (reactive oxygen species-ROS) sono specie molto reattive poiché possiedono un numero dispari di elettroni e tendono facilmente ad accoppiare l'elettrone spaiato nell'orbita esterna, dando origine a reazioni a catena in grado di automantenersi e amplificarsi. Lo stress ossidativo deriva da uno squilibrio tra specie ossidanti e difese antiossidanti all'interno dell'organismo e può essere definito come una aumentata esposizione agli ossidanti e/o una ridotta capacità di difesa degli antiossidanti. Il fumo di sigaretta rappresenta una formidabile sorgente di ROS (10 15-17 per aspirata), i quali si possono suddivide-re in due differenti gruppi: radicali a lunga emivita nella fase corpuscolata (fase tar) e radicali ad emivita breve nella fase aerifor-me (fase gas). Essi contribuiscono a rendere il fumo di sigaretta un carcinogeno completo, dal momento che può agire sia come iniziatore che come promotore. I ROS infatti non agiscono solo danneggiando direttamente l'epitelio polmonare, ma possono anche modificare il DNA, inducendo mutazioni che comportano un aumento del potenziale neoplastico.
Abstract
Reactive Oxygen Species (ROS) are very reactive molecules and atoms, due to an odd number of electrons and they easily tend to couple the unmatched electron, giving rise to chain reactions that are able to automaintain and amplify themsleves. The oxi-dative stress results from an imbalance between oxidative species and antioxidants defences in the human organism, and it can be definied as an increased exposure to oxidants and/or a reduced defensive capacity of the antioxidants. Cigarette smoke is an extraordinary source of ROS (10 15-17 for every aspiration), that can be subdivided in 2 groups: radicals with long half-life in the cor-puscular phase (tar phase) and radicals with short half-life in the aeriform phase (gas phase). These radicals contribute to make cigarette smoke a complete carcinogen agent, as it can act both as initiator and promoter. ROS in fact do not operate only by damaging directly the pulmonary epithelium, but also causing alterations of DNA, and therefore inducing mutations that imply an increased neoplastic potential.

Full text

27
Reviews
Zagà V. et al, Tabaccologia 2003;2: 27-32
Riassunto
I radicali liberi dell’ossigeno (reactive oxygen species - ROS) sono specie molto reattive poiché possiedono un numero dispari di
elettroni e tendono facilmente ad accoppiare l’elettrone spaiato nell’orbita esterna,dando origine a reazioni a catena in grado di
automantenersi e amplificarsi. Lo stress ossidativo deriva da uno squilibrio tra specie ossidanti e difese antiossidanti all’interno
dell’organismo e può essere definito come una aumentata esposizione agli ossidanti e/o una ridotta capacità di difesa degli
antiossidanti. Il fumo di sigaretta rappresenta una formidabile sorgente di ROS (1015-17 per aspirata), i quali si possono suddivide-
re in due differenti gruppi: radicali a lunga emivita nella fase corpuscolata (fase tar) e radicali ad emivita breve nella fase aerifor-
me (fase gas). Essi contribuiscono a rendere il fumo di sigaretta un carcinogeno completo, dal momento che può agire sia come
iniziatore che come promotore.I ROS infatti non agiscono solo danneggiando direttamente l’epitelio polmonare,ma possono
anche modificare il DNA, inducendo mutazioni che comportano un aumento del potenziale neoplastico.
Parole chiave: radicali liberi, stress ossidativo, fumo di sigaretta,danno genotossico, N-acetil-L-cisteina.
Abstract
Reactive Oxygen Species (ROS) are very reactive molecules and atoms, due to an odd number of electrons and they easily tend
to couple the unmatched electron, giving rise to chain reactions that are able to automaintain and amplify themsleves.The oxi-
dative stress results from an imbalance between oxidative species and antioxidants defences in the human organism,and it can
be definied as an increased exposure to oxidants and/or a reduced defensive capacity of the antioxidants.Cigarette smoke is an
extraordinary source of ROS (1015-17 for every aspiration),that can be subdivided in 2 groups: radicals with long half-life in the cor-
puscular phase (tar phase) and radicals with short half-life in the aeriform phase (gas phase).These radicals contribute to make
cigarette smoke a complete carcinogen agent,as it can act both as initiator and promoter.ROS in fact do not operate only by
damaging directly the pulmonary epithelium, but also causing alterations of DNA,and therefore inducing mutations that imply
an increased neoplastic potential.
Key words: free radicals,oxidative stress,cigarette smoke,genotossic damage,N-Acetyl-Cysteine.
Vincenzo Zagà: Presidio Pneumotisiologico,Azienda ASL Città di Bologna
Marco Mura: Dottorato di Ricerca in Scienze Pneumo-cardio-toraciche, UNIBO
Mario Fabbri:Direttore della Scuola di Specializzazione in Malattie dell’Apparato Respiratorio,UNIBO
Ruolo oncogenetico dei radicali liberi
nel fumo di tabacco
Oncogenic role of reactive oxygen species in tobacco smoke
Introduzione
Il crescente interesse in campo medico-
scientifico e lo studio dei meccanismi
patogenetici mediati dai radicali liberi
costituisce oggi un argomento di viva
attualità ed interesse per le recenti e
numerose conferme di una loro implica-
zione nella patologia umana, anche neo-
plastica.
Le prime osservazioni sulla riduzione
dell’ossigeno molecolare e delle sue
capacità di ossidare composti organici ed
enzimi risalgono al 1931, ad opera di
Haber e Willstatter. In seguito Haber e
Weiss nel 1934 spiegarono la conversio-
ne dell’ossigeno in radicali idrossilici. Ma
la reale portata di queste reazioni fu com-
presa soltanto in seguito alla scoperta nel
1969, da parte di McCord e Fridovich, del-
l’enzima superossido dismutatasi (SOD) e
della descrizione della reazione di trasfor-
mazione (1). Ciò permise di spiegare
come i metaboliti dell’ossigeno siano
prodotti normalmente nella cellula
vivente e che una famiglia di superossido
dismutasi, di catalasi e di perossidasi agi-
sca come meccanismo di difesa intracel-
lulare nei confronti della trasformazione
di potenti composti ossidanti. In seguito
apparve chiaro che estesi danni tessutali
potessero riferirsi sia ad una sovrappro-
duzione di prodotti intermedi dell’ossi-
geno che ad una diminuzione di questi
V. Za gà, M . Mura,M.Fabbri
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enzimi intracellulari, che con un termine
piuttosto colorito sono stati chiamati sca-
venger (spazzini).Nel 1976 fu evidenziato
da Babior et al. che i neutrofili,attivati in
seguito ad uno stimolo come il fumo di
tabacco o una infezione microbica, pro-
ducono una quantità notevole di radicali
liberi dell’ossigeno (2).
I radicali liberi
dell’ossigeno:
origine e
meccanismo d’azione
I radicali liberi dell’ossigeno (reactive
oxygen species - ROS) sono atomi e
molecole che possiedono un elettrone
spaiato nell’orbita esterna ed includono
l’anione superossido (O2
.- ), il radicale
idrossile (OH.) e il radicale perossidrile
(OH.
2); il perossido d’idrogeno (H2O2) e gli
acidi ipoalosi, come l’acido ipocloroso
(HOCl), non sono ROS ma vengono clas-
sificati come tali, in quanto derivano dal-
l’ossigeno e prendono parte alla tossicità
dell’ossigeno.Esistono inoltre anche altri
metaboliti derivati dall’ossigeno, come
l’ossigeno singoletto,l’ozono e i radicali
perossili (R-OO.) ed alcossili (R-O.).
I ROS svolgono un ruolo fondamenta-
le in molte reazioni utili all’interno del-
l’organismo,come le ossidazioni media-
te dal citocromo P450, distruggendo i
microrganismi e consentendo un buon
funzionamento della muscolatura liscia
(3).
Il citocromo P450 è una proteina con-
tenente il complesso eme e trae vantag-
gio dalla reattività della combinazione
ferro-ossigeno per catalizzare l’ossida-
zione di vari composti endogeni e xeno-
biotici. Il citocromo P450, inoltre, agisce
come una perossidasi in cui i perossidi
vengono utilizzati come donatori di ossi-
geno. Quando l’ossidazione di un sub-
strato viene catalizzata dal citocromo
P450, con NADPH/O2o perossidi come
donatori, i ROS svolgono un ruolo fonda-
mentale nel ciclo della reazione (3).
I radicali liberi esplicano la loro azione
tossica solo quando sono prodotti con
una velocità o in una quantità tale da
non poter essere inattivati dai sistemi di
difesa cellulare.
Gli organismi aerobi infatti sono dota-
ti di valide difese antiossidanti che bilan-
ciano la produzione radicalica legata la
metabolismo di sostanze endogene ed
esogene: esiste quindi un equilibrio tra
sostanze ossidanti ed antiossidanti; lo
stress ossidativo può essere definito
come una aumentata esposizione agli
ossidanti e/o una ridotta capacità di dife-
sa degli antiossidanti (Tab.1).
Con il termine di antiossidante si defini-
sce qualunque sostanza che,presente in
basse concentrazioni rispetto alle con-
centrazioni di un substrato ossidabile,
ritarda o previene in misura significativa
l’ossidazione del substrato in questione.Il
termine “substrato ossidabile” compren-
de quasi tutto ciò che si trova nelle cellu-
le viventi, comprese le proteine, i lipidi,i
carboidrati e il DNA (5).
Le difese antiossidanti sono incentrate
sul sistema del glutatione,che rappresen-
ta il principale donatore tiolico intracellu-
lare a basso peso molecolare; questo tri-
peptide è caratterizzato da un gruppo
tiolico e da un legame peptidico gamma-
glutamilico peptidasi-resistente. Il pool
cellulare del glutatione è il risultato di un
equilibrio dinamico fra la sua sintesi ed il
turnover correlato;quest’ultimo consiste
principalmente nella liberazione di gluta-
tione ridotto (GSH) della cellula (6).
Il GSH svolge un ruolo importante nei
meccanismi di detossificazione e nella
protezione delle cellule contro gli ossi-
danti. La rimozione dei ROS viene cataliz-
zata dalla GSH-perossidasi che utilizza
come substrato il GSH; quest’ultimo vie-
ne rigenerato dalla forma ossidata
(GSSG) per azione della GSH-reduttasi
con il NADPH, i cui livelli vengono mante-
nuti dal ciclo dei pentoso-fosfati (7)
Le specie radicaliche sono molto reatti-
ve perché possiedono un numero dispari
di elettroni e tendono facilmente ad
accoppiare l’elettrone spaiato, sia prele-
vando un elettrone da un’altra molecola
sia cedendo il proprio elettrone.
Qualunque sia la reazione che si verifica
(cessione o acquisizione dell’elettrone), la
specie non-radicale si trasforma in radica-
le libero capace di estendere e propagare
il danno,in una reazione a catena in gra-
do di automantenersi e amplificarsi. La
reazione termina in una fase in cui i radi-
cali liberi vengono “consumati”attraverso
una ricombinazione in prodotti stabili,
detto processo di arresto della reazione a
catena (8).
I processi quantitativamente più
importanti nell’innesco e mantenimento
di queste reazioni sono la riduzione
monoelettronica dell’ossigeno e la peros-
sidazione lipidica.
Infatti l’azione catalitica di una grande
quantità di enzimi cellulari implica il tra-
sferimento di singoli elettroni con la con-
seguente produzione di intermedi radi-
calici; allo stesso risultato porta l’attività
delle catene respiratorie di trasporto elet-
tronico (4).
Numerose sono quindi le fonti intracel-
lulari di radicali liberi: la membrana pla-
smatica, il reticolo endoplasmatico, i
mitocondri, i perossisomi e la frazione
citoplasmatica solubile (4).
Oltre a questo molti idrocarburi aroma-
tici policiclici (PAH), presenti nel fumo di
tabacco, vengono trasformati nel corso
del loro metabolismo cellulare in inter-
medi radicalici del sistema microsomiale,
che dipende dagli isoenzimi del citocro-
mo P450 (4).L’(O2
.-) viene generato da rea-
zioni di autoossidazione, come l’ossida-
zione dei chinoni e dei polifenoli, da rea-
O2
.-
OH.
HO2
H2O2
HOCl
HOBr
R-OO
R-O.
R-OOH
sostanze antiossidanti: concentrazioni nel plasma e nel fluido di rivestimento epitelialespecie reattive all’ossigeno (ROS) coinvolte nei processi ossidoriduttivi
acido ascorbico
glutatione
acido urico
bilirubina
α−tocoferolo
β−carotene
albumina SH
plasma
40
1,5
300
10
25
0,4
500
ELF
100
100
90
-
2,5
-
70
radicale anione superossido
radicale idrossile
radicale perossidrossile
perossido d’idrogeno
acidi ipoalosi
radicali perossili
radicali alcossili
idroperossidi
TAB. 3. Principali ROS e sostanze antiossidanti nell’organismo umano (Del Donno et al 1999, modificata).
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zioni enzimatiche,come la dissociazione
della xantina da parte della xantina ossi-
dasi, da fattori ambientali,come le radia-
zioni ultraviolette e gli ioni metallici o
dall’attivazione metabolica dei polimor-
fonucleati neutrofili (PMN) e dei macrofa-
gi, attraverso l’attivazione della NADPH
ossidasi, un complesso enzimatico legato
alla membrana (9,10).
Infatti la vita dei radicali liberi è molto
breve e si svolge nelle immediate vici-
nanze della sede di produzione.Tuttavia,
se non sono neutralizzati da un accettore
fisiologico, i radicali attaccano i diversi
costituenti endocellulari entro un raggio
d’azione variabile a seconda del tipo di
radicale stesso (13).Qualunque sia il mec-
canismo d’azione attraverso cui si forma-
no,i radicali idrossilici reagiscono veloce-
mente con la maggior parte delle mole-
cole che incontrano nelle cellule viventi,
soprattutto con le proteine,con i carboi-
drati e con il DNA, dando origine a radi-
cali proteici liberi, radicali lipidici liberi e
radicali DNA liberi. I primi due tipi di radi-
cali sono responsabili rispettivamente di
inattivazioni enzimatiche metaboliche di
ogni tipo e di interazioni con le membra-
ne cellulari e formazione di lipidi perossi-
di. I radicali DNA liberi,attraverso la for-
mazione di mutageni, sono in grado di
provocare rotture e modificazioni.
L’OH.è il ROS più reattivo e può essere
generato attraverso la radiolisi dell’acqua
da parte delle radiazioni ionizzanti; tutta-
via la maggior parte del radicale idrossili-
co si origina in vivo dalla dissociazione
dell’H2O2.Tale molecola è estremamente
reattiva ed è in grado di danneggiare o
modificare biomolecole quali acidi
nucleici, proteine, polisaccaridi, acidi
grassi insaturi di membrana; l’emivita
dell’OH.è pari a 10-9 secondi e pertanto
la formazione dell’OH.,per poter causare
danni, deve avvenire nelle vicinanze del
target (DNA o altro) ed essere quindi
“site-specific”.Se l’OH
.reagisce col DNA,
questo può portare alla formazione di
basi del DNA idrossilate o a strand breaks
(11,12).
Per quanto riguarda la quantificazione
dello stress ossidativo in vivo,la scoperta
degli isoprostani (IsoPS) quali prodotti
della perossidazione lipidica non enzima-
tica, ha aperto nuove prospettive nello
studio del ruolo dei ROS nella fisiopatolo-
gia e nello studio della patogenesi di
varie malattie.Gli F2-isoprostani sono del-
le prostaglandine che si originano dalla
perossidazione dell’acido arachidonico;
la loro valutazione quantitativa nel pla-
sma sanguigno mediante spettrofoto-
metria di massa si è dimostrata essere
una accurata misura dello stress ossidati-
vo in vivo (14).
Nei soggetti fumatori, infatti,i livelli di
IsoPS sono significativamente più elevati
che nei controlli, mentre si riducono
altrettanto significativamente dopo asti-
nenza dal fumo per 2 settimane (14).
Il surfattante polmonare,le cellule epi-
teliali e le cellule endoteliali del polmone
contengono substrati per gli agenti ossi-
danti in elevate concentrazioni.
Il fumo di sigaretta contiene altrettan-
to elevate concentrazioni di ROS (40), in
grado di deteriorare il patrimonio di
agenti antiossidanti contenuti nelle cellu-
le epiteliali del parenchima polmonare
attraverso meccanismi legati all’aumen-
tato stress ossidativo. Inoltre l’abitudine
al fumo di sigaretta determina un incre-
mento del numero di PMN nel fluido
broncopolmonare e i particolati del fumo
possono attivare queste cellule,che quin-
di produrranno maggiori quantità di ROS
(15).
Ciò è stato evidenziato in una diminu-
zione dei livelli di Vitamina C e di gluta-
tione e in un aumento dei livelli di peros-
sidazione lipidica nel sangue in un grup-
po di fumatori adulti (16).
Anche il materiale estratto dal catrame
contenuto nel fumo si è dimostrato in
grado di produrre H2O2e conseguente
danno al DNA (4-17). Un radicale semichi-
none contenuto nel catrame, infatti, è
indefinitamente stabile e può essere
osservato con metodi ESR (electron spin
resonance); estratti acquosi di catrame,
che contengono questo radicale,riduco-
no l’ossigeno a O2
.- e perciò producono
H2O2e OH.(18).
Fumo di sigaretta e
danno al DNA
Pryor e collaboratori hanno identificato
nel fumo di sigaretta due differenti grup-
pi di radicali liberi: radicali a lunga emivi-
ta nella fase corpuscolata (fase tar) e radi-
cali ad emivita breve nella fase aeriforme
(fase gas). Il principale radicale della fase
tar è costituito dal complesso chinone-
idrochinone (1017 spin/g), un sistema
FIG.1: Meccanismi di interazione che causano un danno ossidativo cellulare (Halliwell in Allegra
et al1992, modificata).
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redox molto attivo e in grado di ridurre
l’ossigeno molecolare a radicale superos-
sido e quindi a perossido di idrogeno e a
radicale idrossilico. La fase gas del fumo
di sigaretta contiene invece una gran
quantità di piccoli radicali alchilici e
alcossilici (1015-17 per aspirata di fumo di
sigaretta) dotati di una reattività di gran
lunga superiore ai radicali della fase cor-
puscolata (8,19,20). Anzi, recenti studi
hanno evidenziato che il carico sequen-
ziale di ROS che si sviluppa ad ogni aspi-
rata di sigaretta è di gran lunga superiore
a quello finora conosciuto,a causa di una
reazione buia,che per essere evidenziata
con la tecnica di chemiluminescenza ha
bisogno della presenza di uno scintillan-
te come il 2,5-difenilossazolo (40).
Il fumo di sigaretta è una miscela carci-
nogena completa, dal momento che può
agire sia come iniziatore che come pro-
motore, e contiene numerosi composti
cancerogeni, quali PAH, diidrobenzeni, N-
nitrosamine,amine eterocicliche,Polonio
210, aldeidi e appunto i ROS (21).
Il danno al DNA può essere causato sia
da sostanze mutageniche dirette e indi-
rette prodotte dall’uomo con il fumo di
tabacco,che da agenti endogeni come i
ROS, o ancora può essere dovuto all’azio-
ne di endonucleasi DNA-specifiche (22).
Recentemente è stato evidenziato da
più parti che i ROS sono coinvolti sia nel-
l’iniziazione che nella promozione e/o
progressione della carcinogenesi chimi-
ca.
La formazione di strand-breaks indotti
dall’esposizione al fumo su DNA cellulare
isolato viene inibita parzialmente dalla
catalasi, suggerendo che l’H2O2e l’OH.
rivestono un ruolo importante nel danno
genotossico (23).
L’H2O2ha di recente mostrato di indur-
re metaplasia squamosa in un modello
colturale di trachea di criceto.Visto che la
metaplasia squamosa è associata con lo
sviluppo del carcinoma broncogenico, la
presenza di H2O2nel fumo di tabacco può
rivestire un ruolo rilevante per le sue pro-
prietà carcinogeniche (24).
Secondo le osservazioni di Leander-
son, che ha studiato la formazione di
DNA-single strand breaks (DNA-SSB) e
della base modificata 8-idrodeossigua-
nosina (8-OH-dG), entrambi marker di
danno ossidativo del DNA, in cellule pol-
monari umane in coltura dopo esposizio-
ne al fumo di tabacco, la formazione di
DNA-SSB osservata era dose- e tempo-
dipendente dall’esposizione. Lo stesso
accadeva dopo esposizione a H2O2ed a
idrochinone (un diidrobenzene), ma in
questo caso il danno non aumentava col
passare del tempo (25). Anche Kiyosawa
e coll. hanno riscontrato un aumento di
8-idrossi-ossiguanosina, uno dei prodotti
del danno ossidativi a carico del DNA, in
leucociti umani periferici (26).
La catalasi annullava quasi totalmente
la formazione di DNA-SSB dopo esposi-
zione all’H2O2e ne causava una riduzione
anche dopo esposizione a fumo di tabac-
co; anche l’agente chelante lipofilico del
ferro o-fenantrolina e lo scavanger
dell’OH.(altamente permeabile e non
tossico) dimetiltiourea si sono dimostrati
in grado di ridurre la formazione di DNA-
SSB in entrambi i casi, mentre il tratta-
mento con acido aurintricarbossilico (AT)
(un composto noto per le sua capacità di
ridurre l’attività endonucleasica) era effi-
cace solo dopo la esposizione al fumo di
tabacco (25).
La formazione dell’addotto 8-OH-dG
veniva osservata solo successivamente
ad esposizione al fumo di tabacco; si ritie-
ne che questo tipo di mutazione del DNA
sia mediata dall’OH..La ragione per cui
non si osservava formazione di 8-OH-dG
dopo esposizione all’H2O2forse è costitui-
ta dal fatto che l’esposizione ad un singo-
lo agente quale l’H2O2non disturba i siste-
mi riparativi intracellulari del DNA e che
quindi l’8OHdG eventualmente formato-
si viene immediatamente riparato (25).
L’incorporazione di un gruppo OH nel-
la posizione C-8 della guanosina modifi-
ca il campo elettrostatico della molecola
e può pertanto modificare i sistemi ripa-
rativi del DNA o l’azione della DNA poli-
merasi durante la replicazione. Recente-
mente la formazione di addotti 8-OH-dG
si è dimostrata mutagena nel genoma
del fago M13mp19 (1-41) ed in grado di
causare sostituzioni guanosina_timina e
adenosina_citosina nel DNA M13mp2
dell’E. Coli (27).
Lo stesso Leanderson ha studiato
anche il danno al DNA prodotto su cellu-
le polmonari umane in coltura dal catra-
me delle sigarette,e in particolare la for-
mazione di DNA-SSB indotte da PMN e
dall’H2O2(25).
L'estratto di catrame da solo non cau-
sava alcun danno genotossico, ma si
osservava un significativo aumento di
DNA-SSB quando le cellule venivano
anche esposte all’H2O2dopo l'estratto di
FIG.2: Meccanismi di interazione che causano un danno ossidativo cellulare (Halliwell in Allegra
et al1992, modificata).
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catrame.Lo stesso fenomeno si osservava
anche nelle cellule esposte a PMN attiva-
ti con forbolo miristato acetato (PMA)
(25).
E’ possibile che le cellule il cui DNA è
stato “impresso”dal catrame o altri com-
posti organici unipolari derivati dal fumo
siano più sensibili al danno genotossico
causato dai ROS generati dai PMN duran-
te l’infiammazione (25).
Nessuna formazione di DNA-SSB veni-
va osservata invece in presenza di catala-
si, indicando che l’H2O2è importante per il
danno al DNA indotto dai PMN (25).
Questi risultati suggeriscono che la for-
mazione di DNA-SSB fumo-indotta sia
legata all'azione dell’OH•generato dopo
la dissociazione di H2O2sito-specifica e
forse all'azione delle endonucleasi che
posso essere attivate dai diidrobenzeni
quali l'idrochinone. Quest'ultimo agisce
in senso genotossico probabilmente non
solo attivando le endonucleasi ma anche
attraverso la sua azione autoossidante e
generante H2O2(25).
In effetti l’idrochinone ha mostrato di
poter indurre foci caratterizzati da altera-
zioni enzimatiche nei ratti e scambi di
materiali tra coppie di cromatidi nei linfo-
citi umani (28-29); può inoltre legarsi al
DNA e formare addotti deossiguanosina-
idrochinone (30).
Il condensato di fumo di sigaretta,ed in
primo luogo la frazione acida che contie-
ne diidrobenzeni quali l’idrochinone e il
catecolo (o pirocatechina),si è dimostra-
to essere direttamente mutageno, por-
tando alla inattivazione di geni soppres-
sori importanti nella carcinogenesi pol-
monare (31).
Recenti studi in vivo effettuati utiliz-
zando il metodo TUNEL (terminal deoxy-
nucleotidyl transferase-mediated dUTP-
nick end labeling) e le microscopia a tra-
smissione elettronica (TEM) hanno con-
fermato i risultati in vitro,vale a dire che
la formazione di DNA-SSB e la necrosi
sono i meccanismi preminenti del dan-
no prodotto dal fumo sulle cellule epi-
teliali polmonari (32).
Un’altra ipotesi sul potenziale di danno
genotossico del fumo è quella legata al
recettore aril-idrocarbone (AhR), che
sembra potenziare in vivo la tossicità
genetica del benzopirene (un PAH) e del
condensato di fumo di sigaretta.
Utilizzando un antagonista di tale recet-
tore, il 3’-metossi-4’-nitroflavone
(3’M4’NFR), a varie dosi sui topi esposti al
benzopirene, il danno cromosomico è
stato valutato mediante uno score della
frequenza di micronuclei nei reticolociti
del sangue periferico delle cavie; è stata
così confermata l’azione protettiva del-
l’antagonista sul danno citotossico e
genotossico indotto dal benzopirene
(33).
Una documentata azione del benzopi-
rene,tra l’altro,è costituita dalla formazio-
ne di addotti non solo del DNA nucleare
(nDNA) ma soprattutto del DNA mito-
condriale (mtDNA); la formazione di
addotti, che sono ritenuti essere gli inizia-
tori della carcinogenesi polmonare, è sta-
ta misurata in vari organi di ratto,tra cui il
polmone, attraverso tecniche molecolari
dosimetriche,quali la spettrofotometria a
fluorescenza sincrona. Ad ulteriore ripro-
va di questo,lo stesso fenomeno è stato
osservato anche dopo esposizione al
fumo di sigaretta (34).
In uno studio condotto su organi isola-
ti di ratto esposti per 5 giorni alla setti-
mana e 6 ore al giorno al fumo di sigaret-
te Kentucky 2R1 (particolato totale pari a
73-93 mg/m) la formazioni di DNA addot-
ti è stata misurata mediante (32)P-post-
labelling. Le modificazioni del DNA rag-
giunsero i massimi livelli dopo 4-5 setti-
mane di esposizione,non solo nel polmo-
ne ma anche a livello dell’epitelio tra-
cheale, delle cellule del lavaggio bron-
coalveolare (BAL), del cuore, fegato, vesci-
ca e testicolo (35).
Il danno ossidativo correlato al fumo fu
dimostrato attraverso il rilievo di un signi-
ficativo incremento della 8-idrossi-2’-
deossiguanosina nel DNA polmonare;
contemporaneamente venivano riscon-
trate una induzione progressiva nel tem-
po dell’attività delle aril-idrocarbone
idrossilasi microsomiale,un aumento del-
l’attività della glutatione-S-transferasi
citosolica e una moderata ma progressi-
va deplezione del glutatione ridotto.
Interrompendo l’esposizione per una set-
timana, i livelli di DNA-addotti si riduce-
vano significativamente nel polmone ma
non nel BAL. La selettiva localizzazione e
la differente persistenza di queste modi-
ficazioni nucleotidiche nei vari organi di
ratto suggeriscono che l’esposizione al
fumo ad elevate concentrazioni espone
al rischio di sviluppare malattie legate
alle mutazioni genetiche (36).
L’esposizione sistemica a carcinogeni
derivati dal tabacco è dimostrata dalla
osservazione di elevati livelli di DNA
addotti anche in tessuti non direttamen-
te esposti al fumo di tabacco (37).
Anche altri tipi di addotti contribuisco-
no all’instabilità genomica ed all’aumen-
tato rischio di carcinoma polmonare; gli
addotti O4-etiltimidina (O4-etT), infatti,
mostrano una correlazione altamente
significativa con gli addotti PAH-DNA
(35).
Un’altra interessante metodica per
valutare il danno al DNA indotto dal
fumo di sigaretta è rappresentata dalla
elettroforesi su gel a singola cellula (SCG,
o Comet assay);questa rapida e sensibile
indagine fluorescente microscopica
potrà in futuro essere impiegata nella
sorveglianza contro la cancerogenesi
(38).
La contemporanea ingestione di etano-
lo sembra inoltre determinare un incre-
mento degli addotti di DNA fumo-indotti
attraverso un aumento della biodisponi-
bilità dei componenti del fumo che si
legano al DNA, favorendone anche la dis-
tribuzione sistemica (39).
Nel polmone esistono diversi meccani-
smi antiossidanti intracellulari ed extra-
cellulari di difesa, destinati al manteni-
mento della normale funzionalità cellula-
re polmonare. Il muco respiratorio possie-
de proprietà antiossidanti che forniscono
uno schermo protettivo contro il fumo di
sigaretta e i polluttanti atmosferici. La
SOD,la catalasi e la GSH-perossidasi sono
i principali sistemi di difesa antiossidante
intracellulare che eliminano i radicali O2
.-,
H2O2e gli idroperossidi lipidici (7).
Il mantenimento di un bilancio adegua-
to dei livelli intracellulari di GSH è critico
Reviews
31
Zagà V. et al, Tabaccologia 2003;2: 27-32
Cristallografia della struttura della Vitamina C
tabaccologiadef 09-09-2003 14:18 Pagina 31

Reviews Zagà V. et al, Tabaccologia 2003;2: 27-32
per il sistema di difesa antiossidante. La
mancanza di precursori, principalmente
di L-cisteina, può provocare uno squilibrio
del delicato sistema di difesa intracellula-
re (7).
I ROS sembrano essere in definitiva un
importante fattore nella carcinogenesi
indotta dall’infiammazione: l’attivazione
dei PMN e dei macrofagi dà origine ad
una aumentata produzione di O2
.-,che può
portare alla formazione di H2O2,che si dis-
socia quindi in OH.(25).
Conclusione
Il fumo di sigaretta rappresenta una
importante sorgente di ROS. Questi non
solo agiscono danneggiando diretta-
mente l’epitelio polmonare, ma, attra-
verso la formazione di DNA-single
strand breaks e la necrosi, possono
anche modificare il DNA, inducendo
mutazioni che comportano un aumento
del potenziale neoplastico.
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