ArticlePDF Available

Review. Ruolo oncogenetico dei radicali liberi nel fumo di tabacco/Oncogenic role of reactive oxygen species in tobacco smoke.

Authors:
  • President of Italian Society of Tobaccology (Sitab) and former Manager in Pneumology and Tobaccology in Azienda Unità Sanitaria Locale di Bologna

Abstract and Figures

Riassunto I radicali liberi dell'ossigeno (reactive oxygen species-ROS) sono specie molto reattive poiché possiedono un numero dispari di elettroni e tendono facilmente ad accoppiare l'elettrone spaiato nell'orbita esterna, dando origine a reazioni a catena in grado di automantenersi e amplificarsi. Lo stress ossidativo deriva da uno squilibrio tra specie ossidanti e difese antiossidanti all'interno dell'organismo e può essere definito come una aumentata esposizione agli ossidanti e/o una ridotta capacità di difesa degli antiossidanti. Il fumo di sigaretta rappresenta una formidabile sorgente di ROS (10 15-17 per aspirata), i quali si possono suddivide-re in due differenti gruppi: radicali a lunga emivita nella fase corpuscolata (fase tar) e radicali ad emivita breve nella fase aerifor-me (fase gas). Essi contribuiscono a rendere il fumo di sigaretta un carcinogeno completo, dal momento che può agire sia come iniziatore che come promotore. I ROS infatti non agiscono solo danneggiando direttamente l'epitelio polmonare, ma possono anche modificare il DNA, inducendo mutazioni che comportano un aumento del potenziale neoplastico. Abstract Reactive Oxygen Species (ROS) are very reactive molecules and atoms, due to an odd number of electrons and they easily tend to couple the unmatched electron, giving rise to chain reactions that are able to automaintain and amplify themsleves. The oxi-dative stress results from an imbalance between oxidative species and antioxidants defences in the human organism, and it can be definied as an increased exposure to oxidants and/or a reduced defensive capacity of the antioxidants. Cigarette smoke is an extraordinary source of ROS (10 15-17 for every aspiration), that can be subdivided in 2 groups: radicals with long half-life in the cor-puscular phase (tar phase) and radicals with short half-life in the aeriform phase (gas phase). These radicals contribute to make cigarette smoke a complete carcinogen agent, as it can act both as initiator and promoter. ROS in fact do not operate only by damaging directly the pulmonary epithelium, but also causing alterations of DNA, and therefore inducing mutations that imply an increased neoplastic potential.
Content may be subject to copyright.
27
Reviews
Zagà V. et al, Tabaccologia 2003;2: 27-32
Riassunto
I radicali liberi dell’ossigeno (reactive oxygen species - ROS) sono specie molto reattive poiché possiedono un numero dispari di
elettroni e tendono facilmente ad accoppiare l’elettrone spaiato nell’orbita esterna,dando origine a reazioni a catena in grado di
automantenersi e amplificarsi. Lo stress ossidativo deriva da uno squilibrio tra specie ossidanti e difese antiossidanti all’interno
dell’organismo e può essere definito come una aumentata esposizione agli ossidanti e/o una ridotta capacità di difesa degli
antiossidanti. Il fumo di sigaretta rappresenta una formidabile sorgente di ROS (1015-17 per aspirata), i quali si possono suddivide-
re in due differenti gruppi: radicali a lunga emivita nella fase corpuscolata (fase tar) e radicali ad emivita breve nella fase aerifor-
me (fase gas). Essi contribuiscono a rendere il fumo di sigaretta un carcinogeno completo, dal momento che può agire sia come
iniziatore che come promotore.I ROS infatti non agiscono solo danneggiando direttamente l’epitelio polmonare,ma possono
anche modificare il DNA, inducendo mutazioni che comportano un aumento del potenziale neoplastico.
Parole chiave: radicali liberi, stress ossidativo, fumo di sigaretta,danno genotossico, N-acetil-L-cisteina.
Abstract
Reactive Oxygen Species (ROS) are very reactive molecules and atoms, due to an odd number of electrons and they easily tend
to couple the unmatched electron, giving rise to chain reactions that are able to automaintain and amplify themsleves.The oxi-
dative stress results from an imbalance between oxidative species and antioxidants defences in the human organism,and it can
be definied as an increased exposure to oxidants and/or a reduced defensive capacity of the antioxidants.Cigarette smoke is an
extraordinary source of ROS (1015-17 for every aspiration),that can be subdivided in 2 groups: radicals with long half-life in the cor-
puscular phase (tar phase) and radicals with short half-life in the aeriform phase (gas phase).These radicals contribute to make
cigarette smoke a complete carcinogen agent,as it can act both as initiator and promoter.ROS in fact do not operate only by
damaging directly the pulmonary epithelium, but also causing alterations of DNA,and therefore inducing mutations that imply
an increased neoplastic potential.
Key words: free radicals,oxidative stress,cigarette smoke,genotossic damage,N-Acetyl-Cysteine.
Vincenzo Zagà: Presidio Pneumotisiologico,Azienda ASL Città di Bologna
Marco Mura: Dottorato di Ricerca in Scienze Pneumo-cardio-toraciche, UNIBO
Mario Fabbri:Direttore della Scuola di Specializzazione in Malattie dell’Apparato Respiratorio,UNIBO
Ruolo oncogenetico dei radicali liberi
nel fumo di tabacco
Oncogenic role of reactive oxygen species in tobacco smoke
Introduzione
Il crescente interesse in campo medico-
scientifico e lo studio dei meccanismi
patogenetici mediati dai radicali liberi
costituisce oggi un argomento di viva
attualità ed interesse per le recenti e
numerose conferme di una loro implica-
zione nella patologia umana, anche neo-
plastica.
Le prime osservazioni sulla riduzione
dell’ossigeno molecolare e delle sue
capacità di ossidare composti organici ed
enzimi risalgono al 1931, ad opera di
Haber e Willstatter. In seguito Haber e
Weiss nel 1934 spiegarono la conversio-
ne dell’ossigeno in radicali idrossilici. Ma
la reale portata di queste reazioni fu com-
presa soltanto in seguito alla scoperta nel
1969, da parte di McCord e Fridovich, del-
l’enzima superossido dismutatasi (SOD) e
della descrizione della reazione di trasfor-
mazione (1). Ciò permise di spiegare
come i metaboliti dell’ossigeno siano
prodotti normalmente nella cellula
vivente e che una famiglia di superossido
dismutasi, di catalasi e di perossidasi agi-
sca come meccanismo di difesa intracel-
lulare nei confronti della trasformazione
di potenti composti ossidanti. In seguito
apparve chiaro che estesi danni tessutali
potessero riferirsi sia ad una sovrappro-
duzione di prodotti intermedi dell’ossi-
geno che ad una diminuzione di questi
V. Za gà, M . Mura,M.Fabbri
tabaccologiadef 09-09-2003 14:18 Pagina 27
Reviews Zagà V. et al, Tabaccologia 2003;2: 27-32
28
enzimi intracellulari, che con un termine
piuttosto colorito sono stati chiamati sca-
venger (spazzini).Nel 1976 fu evidenziato
da Babior et al. che i neutrofili,attivati in
seguito ad uno stimolo come il fumo di
tabacco o una infezione microbica, pro-
ducono una quantità notevole di radicali
liberi dell’ossigeno (2).
I radicali liberi
dell’ossigeno:
origine e
meccanismo d’azione
I radicali liberi dell’ossigeno (reactive
oxygen species - ROS) sono atomi e
molecole che possiedono un elettrone
spaiato nell’orbita esterna ed includono
l’anione superossido (O2
.- ), il radicale
idrossile (OH.) e il radicale perossidrile
(OH.
2); il perossido d’idrogeno (H2O2) e gli
acidi ipoalosi, come l’acido ipocloroso
(HOCl), non sono ROS ma vengono clas-
sificati come tali, in quanto derivano dal-
l’ossigeno e prendono parte alla tossicità
dell’ossigeno.Esistono inoltre anche altri
metaboliti derivati dall’ossigeno, come
l’ossigeno singoletto,l’ozono e i radicali
perossili (R-OO.) ed alcossili (R-O.).
I ROS svolgono un ruolo fondamenta-
le in molte reazioni utili all’interno del-
l’organismo,come le ossidazioni media-
te dal citocromo P450, distruggendo i
microrganismi e consentendo un buon
funzionamento della muscolatura liscia
(3).
Il citocromo P450 è una proteina con-
tenente il complesso eme e trae vantag-
gio dalla reattività della combinazione
ferro-ossigeno per catalizzare l’ossida-
zione di vari composti endogeni e xeno-
biotici. Il citocromo P450, inoltre, agisce
come una perossidasi in cui i perossidi
vengono utilizzati come donatori di ossi-
geno. Quando l’ossidazione di un sub-
strato viene catalizzata dal citocromo
P450, con NADPH/O2o perossidi come
donatori, i ROS svolgono un ruolo fonda-
mentale nel ciclo della reazione (3).
I radicali liberi esplicano la loro azione
tossica solo quando sono prodotti con
una velocità o in una quantità tale da
non poter essere inattivati dai sistemi di
difesa cellulare.
Gli organismi aerobi infatti sono dota-
ti di valide difese antiossidanti che bilan-
ciano la produzione radicalica legata la
metabolismo di sostanze endogene ed
esogene: esiste quindi un equilibrio tra
sostanze ossidanti ed antiossidanti; lo
stress ossidativo può essere definito
come una aumentata esposizione agli
ossidanti e/o una ridotta capacità di dife-
sa degli antiossidanti (Tab.1).
Con il termine di antiossidante si defini-
sce qualunque sostanza che,presente in
basse concentrazioni rispetto alle con-
centrazioni di un substrato ossidabile,
ritarda o previene in misura significativa
l’ossidazione del substrato in questione.Il
termine “substrato ossidabile” compren-
de quasi tutto ciò che si trova nelle cellu-
le viventi, comprese le proteine, i lipidi,i
carboidrati e il DNA (5).
Le difese antiossidanti sono incentrate
sul sistema del glutatione,che rappresen-
ta il principale donatore tiolico intracellu-
lare a basso peso molecolare; questo tri-
peptide è caratterizzato da un gruppo
tiolico e da un legame peptidico gamma-
glutamilico peptidasi-resistente. Il pool
cellulare del glutatione è il risultato di un
equilibrio dinamico fra la sua sintesi ed il
turnover correlato;quest’ultimo consiste
principalmente nella liberazione di gluta-
tione ridotto (GSH) della cellula (6).
Il GSH svolge un ruolo importante nei
meccanismi di detossificazione e nella
protezione delle cellule contro gli ossi-
danti. La rimozione dei ROS viene cataliz-
zata dalla GSH-perossidasi che utilizza
come substrato il GSH; quest’ultimo vie-
ne rigenerato dalla forma ossidata
(GSSG) per azione della GSH-reduttasi
con il NADPH, i cui livelli vengono mante-
nuti dal ciclo dei pentoso-fosfati (7)
Le specie radicaliche sono molto reatti-
ve perché possiedono un numero dispari
di elettroni e tendono facilmente ad
accoppiare l’elettrone spaiato, sia prele-
vando un elettrone da un’altra molecola
sia cedendo il proprio elettrone.
Qualunque sia la reazione che si verifica
(cessione o acquisizione dell’elettrone), la
specie non-radicale si trasforma in radica-
le libero capace di estendere e propagare
il danno,in una reazione a catena in gra-
do di automantenersi e amplificarsi. La
reazione termina in una fase in cui i radi-
cali liberi vengono “consumati”attraverso
una ricombinazione in prodotti stabili,
detto processo di arresto della reazione a
catena (8).
I processi quantitativamente più
importanti nell’innesco e mantenimento
di queste reazioni sono la riduzione
monoelettronica dell’ossigeno e la peros-
sidazione lipidica.
Infatti l’azione catalitica di una grande
quantità di enzimi cellulari implica il tra-
sferimento di singoli elettroni con la con-
seguente produzione di intermedi radi-
calici; allo stesso risultato porta l’attività
delle catene respiratorie di trasporto elet-
tronico (4).
Numerose sono quindi le fonti intracel-
lulari di radicali liberi: la membrana pla-
smatica, il reticolo endoplasmatico, i
mitocondri, i perossisomi e la frazione
citoplasmatica solubile (4).
Oltre a questo molti idrocarburi aroma-
tici policiclici (PAH), presenti nel fumo di
tabacco, vengono trasformati nel corso
del loro metabolismo cellulare in inter-
medi radicalici del sistema microsomiale,
che dipende dagli isoenzimi del citocro-
mo P450 (4).L’(O2
.-) viene generato da rea-
zioni di autoossidazione, come l’ossida-
zione dei chinoni e dei polifenoli, da rea-
O2
.-
OH.
HO2
H2O2
HOCl
HOBr
R-OO
R-O.
R-OOH
sostanze antiossidanti: concentrazioni nel plasma e nel fluido di rivestimento epitelialespecie reattive all’ossigeno (ROS) coinvolte nei processi ossidoriduttivi
acido ascorbico
glutatione
acido urico
bilirubina
α−tocoferolo
β−carotene
albumina SH
plasma
40
1,5
300
10
25
0,4
500
ELF
100
100
90
-
2,5
-
70
radicale anione superossido
radicale idrossile
radicale perossidrossile
perossido d’idrogeno
acidi ipoalosi
radicali perossili
radicali alcossili
idroperossidi
TAB. 3. Principali ROS e sostanze antiossidanti nell’organismo umano (Del Donno et al 1999, modificata).
tabaccologiadef 09-09-2003 14:18 Pagina 28
Reviews
Zagà V. et al, Tabaccologia 2003;2: 27-32
29
zioni enzimatiche,come la dissociazione
della xantina da parte della xantina ossi-
dasi, da fattori ambientali,come le radia-
zioni ultraviolette e gli ioni metallici o
dall’attivazione metabolica dei polimor-
fonucleati neutrofili (PMN) e dei macrofa-
gi, attraverso l’attivazione della NADPH
ossidasi, un complesso enzimatico legato
alla membrana (9,10).
Infatti la vita dei radicali liberi è molto
breve e si svolge nelle immediate vici-
nanze della sede di produzione.Tuttavia,
se non sono neutralizzati da un accettore
fisiologico, i radicali attaccano i diversi
costituenti endocellulari entro un raggio
d’azione variabile a seconda del tipo di
radicale stesso (13).Qualunque sia il mec-
canismo d’azione attraverso cui si forma-
no,i radicali idrossilici reagiscono veloce-
mente con la maggior parte delle mole-
cole che incontrano nelle cellule viventi,
soprattutto con le proteine,con i carboi-
drati e con il DNA, dando origine a radi-
cali proteici liberi, radicali lipidici liberi e
radicali DNA liberi. I primi due tipi di radi-
cali sono responsabili rispettivamente di
inattivazioni enzimatiche metaboliche di
ogni tipo e di interazioni con le membra-
ne cellulari e formazione di lipidi perossi-
di. I radicali DNA liberi,attraverso la for-
mazione di mutageni, sono in grado di
provocare rotture e modificazioni.
L’OH.è il ROS più reattivo e può essere
generato attraverso la radiolisi dell’acqua
da parte delle radiazioni ionizzanti; tutta-
via la maggior parte del radicale idrossili-
co si origina in vivo dalla dissociazione
dell’H2O2.Tale molecola è estremamente
reattiva ed è in grado di danneggiare o
modificare biomolecole quali acidi
nucleici, proteine, polisaccaridi, acidi
grassi insaturi di membrana; l’emivita
dell’OH.è pari a 10-9 secondi e pertanto
la formazione dell’OH.,per poter causare
danni, deve avvenire nelle vicinanze del
target (DNA o altro) ed essere quindi
“site-specific”.Se lOH
.reagisce col DNA,
questo può portare alla formazione di
basi del DNA idrossilate o a strand breaks
(11,12).
Per quanto riguarda la quantificazione
dello stress ossidativo in vivo,la scoperta
degli isoprostani (IsoPS) quali prodotti
della perossidazione lipidica non enzima-
tica, ha aperto nuove prospettive nello
studio del ruolo dei ROS nella fisiopatolo-
gia e nello studio della patogenesi di
varie malattie.Gli F2-isoprostani sono del-
le prostaglandine che si originano dalla
perossidazione dell’acido arachidonico;
la loro valutazione quantitativa nel pla-
sma sanguigno mediante spettrofoto-
metria di massa si è dimostrata essere
una accurata misura dello stress ossidati-
vo in vivo (14).
Nei soggetti fumatori, infatti,i livelli di
IsoPS sono significativamente più elevati
che nei controlli, mentre si riducono
altrettanto significativamente dopo asti-
nenza dal fumo per 2 settimane (14).
Il surfattante polmonare,le cellule epi-
teliali e le cellule endoteliali del polmone
contengono substrati per gli agenti ossi-
danti in elevate concentrazioni.
Il fumo di sigaretta contiene altrettan-
to elevate concentrazioni di ROS (40), in
grado di deteriorare il patrimonio di
agenti antiossidanti contenuti nelle cellu-
le epiteliali del parenchima polmonare
attraverso meccanismi legati all’aumen-
tato stress ossidativo. Inoltre l’abitudine
al fumo di sigaretta determina un incre-
mento del numero di PMN nel fluido
broncopolmonare e i particolati del fumo
possono attivare queste cellule,che quin-
di produrranno maggiori quantità di ROS
(15).
Ciò è stato evidenziato in una diminu-
zione dei livelli di Vitamina C e di gluta-
tione e in un aumento dei livelli di peros-
sidazione lipidica nel sangue in un grup-
po di fumatori adulti (16).
Anche il materiale estratto dal catrame
contenuto nel fumo si è dimostrato in
grado di produrre H2O2e conseguente
danno al DNA (4-17). Un radicale semichi-
none contenuto nel catrame, infatti, è
indefinitamente stabile e può essere
osservato con metodi ESR (electron spin
resonance); estratti acquosi di catrame,
che contengono questo radicale,riduco-
no l’ossigeno a O2
.- e perciò producono
H2O2e OH.(18).
Fumo di sigaretta e
danno al DNA
Pryor e collaboratori hanno identificato
nel fumo di sigaretta due differenti grup-
pi di radicali liberi: radicali a lunga emivi-
ta nella fase corpuscolata (fase tar) e radi-
cali ad emivita breve nella fase aeriforme
(fase gas). Il principale radicale della fase
tar è costituito dal complesso chinone-
idrochinone (1017 spin/g), un sistema
FIG.1: Meccanismi di interazione che causano un danno ossidativo cellulare (Halliwell in Allegra
et al1992, modificata).
tabaccologiadef 09-09-2003 14:18 Pagina 29
30
review
Reviews Zagà V. et al, Tabaccologia 2003;2: 27-32
redox molto attivo e in grado di ridurre
l’ossigeno molecolare a radicale superos-
sido e quindi a perossido di idrogeno e a
radicale idrossilico. La fase gas del fumo
di sigaretta contiene invece una gran
quantità di piccoli radicali alchilici e
alcossilici (1015-17 per aspirata di fumo di
sigaretta) dotati di una reattività di gran
lunga superiore ai radicali della fase cor-
puscolata (8,19,20). Anzi, recenti studi
hanno evidenziato che il carico sequen-
ziale di ROS che si sviluppa ad ogni aspi-
rata di sigaretta è di gran lunga superiore
a quello finora conosciuto,a causa di una
reazione buia,che per essere evidenziata
con la tecnica di chemiluminescenza ha
bisogno della presenza di uno scintillan-
te come il 2,5-difenilossazolo (40).
Il fumo di sigaretta è una miscela carci-
nogena completa, dal momento che può
agire sia come iniziatore che come pro-
motore, e contiene numerosi composti
cancerogeni, quali PAH, diidrobenzeni, N-
nitrosamine,amine eterocicliche,Polonio
210, aldeidi e appunto i ROS (21).
Il danno al DNA può essere causato sia
da sostanze mutageniche dirette e indi-
rette prodotte dall’uomo con il fumo di
tabacco,che da agenti endogeni come i
ROS, o ancora può essere dovuto all’azio-
ne di endonucleasi DNA-specifiche (22).
Recentemente è stato evidenziato da
più parti che i ROS sono coinvolti sia nel-
l’iniziazione che nella promozione e/o
progressione della carcinogenesi chimi-
ca.
La formazione di strand-breaks indotti
dall’esposizione al fumo su DNA cellulare
isolato viene inibita parzialmente dalla
catalasi, suggerendo che l’H2O2e l’OH.
rivestono un ruolo importante nel danno
genotossico (23).
L’H2O2ha di recente mostrato di indur-
re metaplasia squamosa in un modello
colturale di trachea di criceto.Visto che la
metaplasia squamosa è associata con lo
sviluppo del carcinoma broncogenico, la
presenza di H2O2nel fumo di tabacco può
rivestire un ruolo rilevante per le sue pro-
prietà carcinogeniche (24).
Secondo le osservazioni di Leander-
son, che ha studiato la formazione di
DNA-single strand breaks (DNA-SSB) e
della base modificata 8-idrodeossigua-
nosina (8-OH-dG), entrambi marker di
danno ossidativo del DNA, in cellule pol-
monari umane in coltura dopo esposizio-
ne al fumo di tabacco, la formazione di
DNA-SSB osservata era dose- e tempo-
dipendente dall’esposizione. Lo stesso
accadeva dopo esposizione a H2O2ed a
idrochinone (un diidrobenzene), ma in
questo caso il danno non aumentava col
passare del tempo (25). Anche Kiyosawa
e coll. hanno riscontrato un aumento di
8-idrossi-ossiguanosina, uno dei prodotti
del danno ossidativi a carico del DNA, in
leucociti umani periferici (26).
La catalasi annullava quasi totalmente
la formazione di DNA-SSB dopo esposi-
zione all’H2O2e ne causava una riduzione
anche dopo esposizione a fumo di tabac-
co; anche l’agente chelante lipofilico del
ferro o-fenantrolina e lo scavanger
dell’OH.(altamente permeabile e non
tossico) dimetiltiourea si sono dimostrati
in grado di ridurre la formazione di DNA-
SSB in entrambi i casi, mentre il tratta-
mento con acido aurintricarbossilico (AT)
(un composto noto per le sua capacità di
ridurre l’attività endonucleasica) era effi-
cace solo dopo la esposizione al fumo di
tabacco (25).
La formazione dell’addotto 8-OH-dG
veniva osservata solo successivamente
ad esposizione al fumo di tabacco; si ritie-
ne che questo tipo di mutazione del DNA
sia mediata dall’OH..La ragione per cui
non si osservava formazione di 8-OH-dG
dopo esposizione all’H2O2forse è costitui-
ta dal fatto che l’esposizione ad un singo-
lo agente quale l’H2O2non disturba i siste-
mi riparativi intracellulari del DNA e che
quindi l’8OHdG eventualmente formato-
si viene immediatamente riparato (25).
L’incorporazione di un gruppo OH nel-
la posizione C-8 della guanosina modifi-
ca il campo elettrostatico della molecola
e può pertanto modificare i sistemi ripa-
rativi del DNA o l’azione della DNA poli-
merasi durante la replicazione. Recente-
mente la formazione di addotti 8-OH-dG
si è dimostrata mutagena nel genoma
del fago M13mp19 (1-41) ed in grado di
causare sostituzioni guanosina_timina e
adenosina_citosina nel DNA M13mp2
dell’E. Coli (27).
Lo stesso Leanderson ha studiato
anche il danno al DNA prodotto su cellu-
le polmonari umane in coltura dal catra-
me delle sigarette,e in particolare la for-
mazione di DNA-SSB indotte da PMN e
dall’H2O2(25).
L'estratto di catrame da solo non cau-
sava alcun danno genotossico, ma si
osservava un significativo aumento di
DNA-SSB quando le cellule venivano
anche esposte all’H2O2dopo l'estratto di
FIG.2: Meccanismi di interazione che causano un danno ossidativo cellulare (Halliwell in Allegra
et al1992, modificata).
tabaccologiadef 09-09-2003 14:18 Pagina 30
catrame.Lo stesso fenomeno si osservava
anche nelle cellule esposte a PMN attiva-
ti con forbolo miristato acetato (PMA)
(25).
E’ possibile che le cellule il cui DNA è
stato “impresso”dal catrame o altri com-
posti organici unipolari derivati dal fumo
siano più sensibili al danno genotossico
causato dai ROS generati dai PMN duran-
te l’infiammazione (25).
Nessuna formazione di DNA-SSB veni-
va osservata invece in presenza di catala-
si, indicando che l’H2O2è importante per il
danno al DNA indotto dai PMN (25).
Questi risultati suggeriscono che la for-
mazione di DNA-SSB fumo-indotta sia
legata all'azione dell’OHgenerato dopo
la dissociazione di H2O2sito-specifica e
forse all'azione delle endonucleasi che
posso essere attivate dai diidrobenzeni
quali l'idrochinone. Quest'ultimo agisce
in senso genotossico probabilmente non
solo attivando le endonucleasi ma anche
attraverso la sua azione autoossidante e
generante H2O2(25).
In effetti l’idrochinone ha mostrato di
poter indurre foci caratterizzati da altera-
zioni enzimatiche nei ratti e scambi di
materiali tra coppie di cromatidi nei linfo-
citi umani (28-29); può inoltre legarsi al
DNA e formare addotti deossiguanosina-
idrochinone (30).
Il condensato di fumo di sigaretta,ed in
primo luogo la frazione acida che contie-
ne diidrobenzeni quali l’idrochinone e il
catecolo (o pirocatechina),si è dimostra-
to essere direttamente mutageno, por-
tando alla inattivazione di geni soppres-
sori importanti nella carcinogenesi pol-
monare (31).
Recenti studi in vivo effettuati utiliz-
zando il metodo TUNEL (terminal deoxy-
nucleotidyl transferase-mediated dUTP-
nick end labeling) e le microscopia a tra-
smissione elettronica (TEM) hanno con-
fermato i risultati in vitro,vale a dire che
la formazione di DNA-SSB e la necrosi
sono i meccanismi preminenti del dan-
no prodotto dal fumo sulle cellule epi-
teliali polmonari (32).
Un’altra ipotesi sul potenziale di danno
genotossico del fumo è quella legata al
recettore aril-idrocarbone (AhR), che
sembra potenziare in vivo la tossicità
genetica del benzopirene (un PAH) e del
condensato di fumo di sigaretta.
Utilizzando un antagonista di tale recet-
tore, il 3’-metossi-4’-nitroflavone
(3’M4’NFR), a varie dosi sui topi esposti al
benzopirene, il danno cromosomico è
stato valutato mediante uno score della
frequenza di micronuclei nei reticolociti
del sangue periferico delle cavie; è stata
così confermata l’azione protettiva del-
l’antagonista sul danno citotossico e
genotossico indotto dal benzopirene
(33).
Una documentata azione del benzopi-
rene,tra l’altro,è costituita dalla formazio-
ne di addotti non solo del DNA nucleare
(nDNA) ma soprattutto del DNA mito-
condriale (mtDNA); la formazione di
addotti, che sono ritenuti essere gli inizia-
tori della carcinogenesi polmonare, è sta-
ta misurata in vari organi di ratto,tra cui il
polmone, attraverso tecniche molecolari
dosimetriche,quali la spettrofotometria a
fluorescenza sincrona. Ad ulteriore ripro-
va di questo,lo stesso fenomeno è stato
osservato anche dopo esposizione al
fumo di sigaretta (34).
In uno studio condotto su organi isola-
ti di ratto esposti per 5 giorni alla setti-
mana e 6 ore al giorno al fumo di sigaret-
te Kentucky 2R1 (particolato totale pari a
73-93 mg/m) la formazioni di DNA addot-
ti è stata misurata mediante (32)P-post-
labelling. Le modificazioni del DNA rag-
giunsero i massimi livelli dopo 4-5 setti-
mane di esposizione,non solo nel polmo-
ne ma anche a livello dell’epitelio tra-
cheale, delle cellule del lavaggio bron-
coalveolare (BAL), del cuore, fegato, vesci-
ca e testicolo (35).
Il danno ossidativo correlato al fumo fu
dimostrato attraverso il rilievo di un signi-
ficativo incremento della 8-idrossi-2’-
deossiguanosina nel DNA polmonare;
contemporaneamente venivano riscon-
trate una induzione progressiva nel tem-
po dell’attività delle aril-idrocarbone
idrossilasi microsomiale,un aumento del-
l’attività della glutatione-S-transferasi
citosolica e una moderata ma progressi-
va deplezione del glutatione ridotto.
Interrompendo l’esposizione per una set-
timana, i livelli di DNA-addotti si riduce-
vano significativamente nel polmone ma
non nel BAL. La selettiva localizzazione e
la differente persistenza di queste modi-
ficazioni nucleotidiche nei vari organi di
ratto suggeriscono che l’esposizione al
fumo ad elevate concentrazioni espone
al rischio di sviluppare malattie legate
alle mutazioni genetiche (36).
L’esposizione sistemica a carcinogeni
derivati dal tabacco è dimostrata dalla
osservazione di elevati livelli di DNA
addotti anche in tessuti non direttamen-
te esposti al fumo di tabacco (37).
Anche altri tipi di addotti contribuisco-
no all’instabilità genomica ed all’aumen-
tato rischio di carcinoma polmonare; gli
addotti O4-etiltimidina (O4-etT), infatti,
mostrano una correlazione altamente
significativa con gli addotti PAH-DNA
(35).
Un’altra interessante metodica per
valutare il danno al DNA indotto dal
fumo di sigaretta è rappresentata dalla
elettroforesi su gel a singola cellula (SCG,
o Comet assay);questa rapida e sensibile
indagine fluorescente microscopica
potrà in futuro essere impiegata nella
sorveglianza contro la cancerogenesi
(38).
La contemporanea ingestione di etano-
lo sembra inoltre determinare un incre-
mento degli addotti di DNA fumo-indotti
attraverso un aumento della biodisponi-
bilità dei componenti del fumo che si
legano al DNA, favorendone anche la dis-
tribuzione sistemica (39).
Nel polmone esistono diversi meccani-
smi antiossidanti intracellulari ed extra-
cellulari di difesa, destinati al manteni-
mento della normale funzionalità cellula-
re polmonare. Il muco respiratorio possie-
de proprietà antiossidanti che forniscono
uno schermo protettivo contro il fumo di
sigaretta e i polluttanti atmosferici. La
SOD,la catalasi e la GSH-perossidasi sono
i principali sistemi di difesa antiossidante
intracellulare che eliminano i radicali O2
.-,
H2O2e gli idroperossidi lipidici (7).
Il mantenimento di un bilancio adegua-
to dei livelli intracellulari di GSH è critico
Reviews
31
Zagà V. et al, Tabaccologia 2003;2: 27-32
Cristallografia della struttura della Vitamina C
tabaccologiadef 09-09-2003 14:18 Pagina 31
Reviews Zagà V. et al, Tabaccologia 2003;2: 27-32
per il sistema di difesa antiossidante. La
mancanza di precursori, principalmente
di L-cisteina, può provocare uno squilibrio
del delicato sistema di difesa intracellula-
re (7).
I ROS sembrano essere in definitiva un
importante fattore nella carcinogenesi
indotta dall’infiammazione: l’attivazione
dei PMN e dei macrofagi dà origine ad
una aumentata produzione di O2
.-,che può
portare alla formazione di H2O2,che si dis-
socia quindi in OH.(25).
Conclusione
Il fumo di sigaretta rappresenta una
importante sorgente di ROS. Questi non
solo agiscono danneggiando diretta-
mente l’epitelio polmonare, ma, attra-
verso la formazione di DNA-single
strand breaks e la necrosi, possono
anche modificare il DNA, inducendo
mutazioni che comportano un aumento
del potenziale neoplastico.
1. McCord SM, Fridovich I. Superoxide dismutase.An enxymic function for
erythrocuprein (hemocuprein). J Biol Chem 1969 Nov25;244(22):6049-55.
2. Babior BM, Curnutte JT, McMurrich BJ.The particulate superoxide-forming
system from human neutrophils. Properties of the system and further evi-
dence supporting its participation in the respiratory burst. J Clin Invest.1976
Oct;58(4):989-96
3. Bast A, Haenen GRMM,Doelmann CJA.Ossidanti e antiossidanti: stato del-
l’arte. In:Allegra L,Crystal RG,Grassi C. GSH System - Glutathione in antioxi-
dant defense. 1992 Excerpta Medica, ed.italiana;pp.5-19
4. Del Donno M,Verduri A. I radicali liberi ed i meccanismi ossido-riduttivi.
European Respiratory News 1999; n.3: pp.238-43.
5. Halliwell B. Le specie reattive dell’ossigeno nei sistemi viventi: origine,bio-
chimica e ruolo nelle malattie dell’uomo. In:Allegra L, Crystal RG, Grassi C.
GSH System - Glutathione in antioxidant defense.1992 Excerpta Medica,ed.
italiana;pp.24-38.
6.Albertini A. Ossidanti e antiossidanti:determinanti fisiopatologici e agenti
terapeutici. In:Allegra L,Crystal RG,Grassi C.GSH System - Glutathione in
antioxidant defense.1992 Excerpta Medica,ed. italiana; pp.20-23.
7. Grassi C. Specie reattive dell’ossigeno e malattie polmonari.In: Allegra L,
Crystal RG, Grassi C.GSH System - Glutathione in antioxidant defense. 1992
Excerpta Medica, ed.italiana; pp.59-62.
8. Pryor W.A.: Free radicals in biology. Vol. 1, 3.Academic press, New York,
1976.
9. Di Guiseppi J, Fridovich I.The toxicology of molecular oxygen. CRC Crit Rev
Toxicol 12 :315-342.
10. Fisher AB. Oxidants and antioxidants :Transatlantic Airway Conference
2002 – Chairman’s Summary. Am J Respir Crit Care Med Vol.166.pp.S2-S3,
2002.
11. Aruoma OI, Halliwell B,Gajewski E, Dizdaroglu M. Dmage to bases in DNA
by hydrogen peroxide and ferric ion chelates, J Biol Chem 1989;264:20509-12.
12.Bradley MO,Erickson LC. Comparison of the effect of hydrogen peroxide
and X-ray irradiation on toxicity,mutation, and DNA damage/repair in mam-
malian cells (V-79). Biochem Biophys Acta 1981;654:134-41.
13. Bielski B.H.J.: Reactivity of H2O/O2 radicals in acqueous solution.J Phys
Chem Ref Data, 1985;14:1041-1100
14. Morrow JD,Jackson Roberts L.The Isoprostanes - Their role as an index of
oxidant stress status in human pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med
Vol.166; pp.S25-S30,2002.
15. Moldeus P, Berggren M,Gravstrom R.N-acetylcysteine protection against
the toxicity of cigarette smoke and cigarette smoke condensate in various
tissues and cells in vitro. Eur Respir Dis 1985;139:123-129.
16. Banerjee KK, Marimuthu P, Sarkar A, Chaudhuri RN.Influence of ciagrette
smoking on Vitamin C, glutathione and lipid peroxidation status.Indian J
Public Health 1998;42(1):20-3.
17. Izzotti A, Balansky RM,Blagoeva PM,Mircheva ZI, Tumiliero L,Cartiglia C,
De Flora S.DNA alterations in rat organs after chronic exposure to sigarette
smoke and/or ethanol ingestion. FASEB J 1998 Jun;12(9):753-8.
18.Pryor WA. Biolog ical effects of cigarette smoke, wood smoke and the
smoke from plastics: the use of electron spin resonance.Free Radic Biol Med
1992 Dec;13(6):659-76.
19. Church D.F., Pryor W.A.: Free radicals chemistry of cigarette smoke and its
toxicological implications. Environ Health Perspect, 1985; 64:111-126.
20. Pryor W.A., Ha les B.J., Pnemovic P.I., Church D.F.: The radicals in cigarette
tar: their nature and suggested physiological implications.Science, 1983; 220:
425-427.
21. IARC. Mongraphs on the evaluation of carcinogenic risks to humans.
Vol.38. Tobacco smoke. 1986 IARC.Lyon France.
22. Orrenius S, McConkey DJ,Bellomo G,Nicotera P.Role of Ca2+ in toxic cell
killing.Trends Pharmacol. Sci.1988;10:281-5.
23.Borish ET,Cosgrove JP,Church DF,Deutsch A,Pryor WA. Cigarette tar cau-
ses single strand-breaks in DNA. Biochem Byophys Res Commun
1985;133:780-6.
24. Radosevich CA,Weitzman SA.Hydrogen peroxide induces squamous
metaplasia in a hamster tracheal organ explant culture model.
Carcinogenesis 1989;10:1943-6.
25. Leanderson P.Cigarette smoke-indiced DNA damage in cultured human
lung cells. Annals New York Academy of Sciences.Ann N Y Acad Sci. 1993 May
28;686:249-59; discussion 259-61.
26.Kiyosawa H, Suka M,Okudaira H,Murata K, Miyamoto T,Chung HH, Kasai
H, Nishimura S:Cigarette smoking induces formation of 8-hydroxy-deoxygua-
nosine, one of the oxidative products of DNA damage in human peripheral
leukocytes. Free Radical Res Commun 1990;11: 1-3.
27. Cheng KC, Cahill DS,Kasai H, Nishimura S, Loeb LA.8-Hydroxyguanine, an
abundant form of oxidative Dna damage causes G_T and A_C substitutions.J
Biol Chem.1991;267:166-72.
28. Stenius U,Warholm M,Rannug A, Walles S,Lundberg I,Hogberg J. The role
of GSH depletion and toxicity in hydroquinone-induced development of
enzyme-altered foci. Carcinogenesis 1989;593-9.
29. Morimoto K,Wolff S,Koizumi A. Induction of sister-chromatide exchanges
in human lymphocytes by microsomial by microsomial activation of benzene
metabolites. Mutat Res.1983;119:355-60.
30. Jowa L,Wits G,Snyder R. Synthesis and characterisation of deoxyguanosi-
ne-bensoquinone adducts. J Appl Toxicol 1990;10:47-54.
31.Matsukura N,Willey J, Miyashita M, Taffe B, Hoffmann D,Waldren C, Puck
TT, Harris CC.Detection od direct mutagenicity of sigarette smoke condensa-
te in mammalian cells. Carcinogenesis 1991;12:685-9.
32. Jung M, Davis WP,Taatjes DJ,Churg A,Mossman BT. Asbestos and cigaret-
te smoke causes increased DNA strand breaks and necrosis in bronchiolar
epithelial cells in vivo.Free Radic Biol Med 2000 Apr 15;28(8):1295-9..
33. Dertinger SD,Nazarenko DA, Silverstone AE, Gasiewicz TA. Aryl hydrocar-
bon receptor signaling plays a significant role in mediating benzo[a]pyrene-
and cigarette smoke consensate-induced cytogenetic damage in vivo.
Carcinogenesis 2001 Jan;22(1):171-7.
34. Balansky R, Izzotti A,Scatolini L,D’Agostini F, De Flora S. Induction by car-
cinogens and chemioprevention by N-acetylcystein of adducts to mitochon-
drial DNA in rat organs. Cancer Res 1996 Apr 1;56(7):1642-7.
35.Godschalk R, Nair J,Van Schooten FJ, Risch A,Drings P, Kayser K,
Dienemann H, Bartsch H.Comparison of multiple DANN adduct types in
tumor adjacent human lung tissue: effect of cigarette smoking.
Carcinogenesis Dec 2002; vol.23(12):2081-6.
36. Izzotti A,Bagnasco M,D’Agostini F, Cartiglia C, Lubet RA,Kelloff GJ,De
Flora S. Formation and persistence of nucleotide alterations in rats exposed
whole-body to enviromental sigarette smoke. Cancerogenesis 1999
Aug;20(8):1499-505.
37. Phillips DH. Smoking-related DNA and protein adducts in human tissues.
Carcinogenesis Dec 2002;vol.23(12), 1979-2004.
38.Poli P, Buschini A,spaggiari A,Rizzoli V,Carlo-Stella C,Rossi C. DNA dama-
ge by tabacco smoke and some antiblastic drugs evaluated using Comet
assay.Toxicol Lett 1999 Sep;108(2-3):267-76.
39.Van Schooten JV, Besarati Nia A, De Flora S,D’Agostini F, Izzotti A,
Camoirano A, Balm AJM,Dallinga JW, Bast A,Haenen GRMM,Van’t Veer L,Baas
P, S a ka i H, V an Zandwijk N. Effects of oral administration of N-acetyl-L-cystei-
ne: a multi-bimarker study in smokers.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev.
2002 Feb;11(2):167-75.
40. Zagà V, Gattavecchia E.Radicali liberi e fumo di sigaretta.Giorn It Mal Tor
2002;56,5:375-391.
Bibliografia
32
tabaccologiadef 09-09-2003 14:18 Pagina 32
... come promotore della carcinogenesi. I radicali liberi infatti non agiscono solo danneggiando direttamente l'epitelio polmonare, ma possono anche modificare il DNA, inducendo mutazioni che comportano un aumento del potenziale neoplastico (32). ). ...
... Recentemente è stato evidenziato da più parti che i ROS sono coinvolti sia nell'iniziazione che nella promozione e/o progressione della carcinogenesi chimica (32). ...
... I ROS sembrano essere in definitiva un importante fattore nella carcinogenesi indotta dall'infiammazione: l'attivazione dei PMN e dei macrofagi dà origine ad una aumentata produzione di anione superossido, che può portare alla formazione di perossido d'idrogeno, che si dissocia quindi in radicale ossidrile (15,32,39). ...
Article
Full-text available
Introduzione Il fumo di sigaretta rappresenta una importante sorgente di radicali liberi sia nella sua componente gassosa (fase gas) che corpuscolata (fase tar). Essi contri-buiscono a rendere il fumo di sigaretta un carcinogeno completo, dal momento che può agire sia come iniziatore che M. Mura, V. Zagà, M. Fabbri Riassunto I radicali liberi dell'ossigeno (reactive oxygen species-ROS) sono specie molto reattive che danno origine a reazioni a catena in grado di automantenersi e amplificarsi. Il fumo di sigaretta rappresenta una formidabile sorgente di ROS (1015 per aspira-ta,i quali si possono suddividere in due differenti gruppi: radicali a lunga emivita nella fase corpuscolata (fase tar) e radicali a breve emivita nella fase aeriforme (fase gas). Essi contribuiscono a rendere il fumo di sigaretta un carcinogeno completo, dal momento che può agire sia come iniziatore che come promotore. La strategia terapeutica e preventiva pertanto deve essere volta ad aumentare le difese antiossidanti degli organi colpiti, in modo da ristabilire l'equilibrio tra ossidanti ad antiossidanti a favore di questi ultimi. Numerosi agenti sono attualmente allo studio, ed in questo ambito la sostanza più promettente risulta essere la N-acetil-L-cisteina (NAC), che in numerosi studi in vitro, sugli animali e recentemente anche sull'uomo, si è dimostra-ta in grado di ridurre e prevenire il danno genotossico indotto dai ROS del fumo di tabacco. Parole chiave: radicali liberi, stress ossidativo, fumo di sigaretta, danno genotossico, N-acetil-L-cisteina. Abstract Reactive Oxygen Species (ROS) are very reactive molecules and atoms, giving rise to chain reactions that are able to maintain and amplify themselves. Cigarette smoke is an extraordinary source of ROS (1015 for every aspiration), that can be subdivided in 2 groups: radicals with long half-life in the corpuscular phase (tar phase) and radicals with short half-life in the aeriform phase (gas phase). These radicals contribute to make cigarette smoke a complete carcinogen agent, as it can act both as initiator and promoter. Consequently, therapeutic and preventive strategy should aim at increasing the antioxidants defences of the damaged organs and restoring the balance between oxidants and oxidants. A large amount of protective agents are being studied at the moment, and the most promising substance in this area is N-acetylcysteine (NAC). In numerous studies in vitro, in animals and recently also in human beings, NAC has shown the capacity of reducing and preventing the genotossic damage induced by ROS of tobacco smoke.
... La glicina, aminoacido non essenziale, invece, sembrerebbe avere un'azione riducente sulla reattività neuronale, mediata dall'acido gamma-ammino-butirrico: in sinergia con la prolina favorisce la formazione di vari amminoacidi e la rigenerazione delle masse muscolari e tendinee, produce glucagone, attivatore del glicogeno. Partecipa inoltre alla costituzione dell'emoglobina e dei citocromi (20). Pertanto questi due aminoacidi non essenziali, si rivelano di una certa importanza in una situazione di inquinamento da fumo in cui i citocromi epatici sono particolarmente attaccati. ...
... La fenilalanina , aminoacido essenziale, è notoriamente un precursore della tirosina e, quindi, delle catecolamine, che migliora i processi nervosi favorendo l'umore, l'attenzione e l'apprendimento. Inoltre la sua capacità di favorire la produzione di dopamina e altri neurotrasmettitori , agendo positivamente sul senso della fame ed sul craving, può collocare questo aminoacido tra le terapie coadiuvanti della smoking cessation (20). ...
Article
Full-text available
Riassunto INTRODUZIONE. Diverse molecole di origine vegetale sono potenzialmente utili per ridurre l'intensità dei sintomi astinenziali correlati alla disassuefazione da fumo o per contrastare gli effetti dannosi che il tabacco esercita sull'organismo. Si tratta di sostanze ad azione indiretta, che da sole non possono essere validate col significato di terapia specifica nella dipendenza nico-tinica, ma che possono utilmente intervenire con funzione complementare avendo un effetto ansiolitico, digestivo, antiossi-dante ed epatoprotettore. MATERIALE E METODI. Le osservazioni qui riferite si riferiscono ad un campione di 80 soggetti, di cui 65 trattati con un inte-gratore amino-fitoterapico e 15 non trattati. RISULTATI. Tra il gruppo di soggetti trattati si e' osservata una tendenza, non significativa, ad una più alta percentuale di disas-suefazione testata ad un mese dalla fine del trattamento (84,6% vs 73,3%), ed in particolare un indice di soddisfazione (auto-valutato) elevato per quel che riguarda l'efficacia sul piano ansiolitico (100%), sul tono dell'umore (98%), nonché sul "buon fun-zionamento" dell'intestino (98%). CONCLUSIONI. La scarsa numerosità del campione indica tuttavia la necessità di studi più ampi. Parole chiave: disassuefazione dal fumo, sostanze fitoterapiche, sindrome d'astinenza. Abstract BACKGROUND. Several vegetal molecules are potentially useful for the reduction of tobacco withdrawal symptoms and, moreover, for the protection from harmful effects of tobacco. These substances have an indirect effect which cannot currently be validated as specific therapy against nicotine dependence. However, these vegetal substances may be useful as coadju-vants of smoking cessation because of their anxiolytic, digestive, anti-oxidant and hepatoprotective effects. MATERIALS AND METHODS. Our findings are from a sample of 80 subjects, 65 treated with aminoacids and phytotherapic inte-grator and 15 not-treated. RESULTS. It has been observed a not significant trend toward a greater smoking cessation rate in treated subjects (84.6% vs. 73.3 in not-treated subjects). High self-evaluated index of satisfaction with the therapy has been described by treated subjects on anxiety (100%), mood (98%) and gastroenteric functions (98%). CONCLUSIONS. The limited sample size suggests further investigations on these vegetal substances.
Article
Full-text available
Riassunto Il polmone è continuamente soggetto all’azione di ossidanti inalati dall’ambiente o prodotti durante le reazioni biochimiche del nostro organismo. Le principali fonti di ossidanti esogeni sono rappresentate dall’inquinamento atmosferico e dal fumo di tabacco. Cellule infiammatorie come i polimorfonucleati, i macrofagi alveolari e gli eosinofili sono in grado di produrre ossidanti endogeni attraverso reazioni enzimatiche e non enzimatiche. È noto come lo stress ossidativo sia capace di indurre danni a livello tissutale, cellulare e subcellulare ed in ultima analisi contribuire alla patogenesi della broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) ed ai suoi effetti sistemici. Nel tessuto polmonare a questi agenti ossidanti si oppongono una serie di antiossidanti rappresentati da enzimi e sostanze non enzimatiche. È in discussione il ruolo degli antiossidanti nel prevenire tali danni e quindi contrastare lo sviluppo e la progressione della BPCO. Summary Oxidants inhaled from the environment or produced during biochemical reactions exert their action on the lung continuously. The main sources of exogenous oxidants are air pollution and cigarette smoke. Inflammatory cells like PLM, alveolar macrophages and eosinophils generate oxidants via enzymatic or non-enzymatic reactions. It is well known that oxidative stress can cause damage at the tissutal, cellular or subcellular level and eventually contribute to the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease and its systemic effects. Several antioxidants, such as enzymes or non-enzymatic substances, counteract oxidant agents in lung tissue. The role of antioxidants to prevent those damages and contrast the development and progression of COPD is controversial.
Article
Full-text available
Mutations caused by oxidative DNA damage may contribute to human disease. A major product of that damage is 8-hydroxyguanine (oh8Gua). Because of differences in experimental design, the base pairing specificity of oh8G in vivo is not completely resolved. Here, oh8dGTP and DNA polymerase were used in two complementary bacteriophage plaque color assays to examine the mutagenic specificity of oh8Gua in vivo. The first is a reversion assay that detects all three single-base substitutions caused by misreading of guanine analogues inserted at a specific site. oh8Gua at that site gave a mutation frequency of 0.7%. Twenty-two of the 23 mutations were G----T substitutions. The second assay, a forward mutation assay, tests the mispairing potential of any altered nucleotide 1) during incorporation as substrate nucleotide, and 2) after multiple incorporations into a single-stranded DNA gap region of M13mp2. Substituting oh8dGTP for dGTP during polymerization produced 16% mutants; two classes of mutations were observed, both caused by pairing of oh8Gua with A. Seventy-six of 78 mutations were A----C substitutions, and two were G----T substitutions. These assays thus illustrate mutagenic replication of oh8Gua as template causing G----T substitutions and misincorporation of oh8Gua as substrate causing A----C substitutions, both caused by oh8Gua.A mispairs.
Article
Full-text available
Incubation of a number of ferric ion chelates with H2O2 at pH 7.4 generated a reactive species able to produce chemical modifications of the bases in DNA that are very similar to those produced in DNA by the hypoxanthine/xanthine oxidase system (Aruoma, O.I., Halliwell, B., and Dizdaroglu, M. (1989) J. Biol. Chem. 264, 13024-13028). Products were identified and quantitated by the use of gas chromatography-mass spectrometry with selected-ion monitoring. Compared with other complexes used, ferric ion-nitrilotriacetic acid produced by far the largest amount of the base products. Typical hydroxyl radical scavengers and superoxide dismutase provided significant decreases in the yields of the products. On this basis, it is proposed that ferric ion complexes react with H2O2 to produce hydroxyl radical; this was also shown using the deoxyribose assay. Inhibition of product formation by superoxide dismutase suggests the involvement of superoxide radical in this reaction. It is likely that hydroxyl radical generated by reaction of the ferric ion-nitrilotriacetic acid complex with H2O2 contributes to the carcinogenicity and nephrotoxicity associated with this chelating agent.
Article
Benzene expresses its carcinogenic potential in humans largely in the form of acute leukemia. Because an understanding of the formation of DNA adducts by benzene metabolites may help to explain the etiologkal role they play in benzene-induced bone marrow disease, we have synthesized, isolated and characterized adducts formed by the reaction of deoxyguanosine with hydroquinone and p-benzoquinone, two toxic metabolites of benzene. [3H]Deoxyguanosine and [14C]hydroquinone reacted in neutral aqueous buffer containing iron to form two dual-labeled products, which were separated using HPLC. When p-benzoquinone was substituted for hydroquinone, the same adducts were formed in the absence of added iron. The ultraviolet and fluorescence spectra of the less polar adduct, called Adduct 2, were distinctly different from the spectra of the starting materials. NMR and mass spectrometry suggested a compound with a mass of 357 with the p-benzoquinone moiety bound to the N-1 and N2 positions of deoxyguanosine. Based on these data it is proposed that Adduct 2 is (3′OH)benzetheno(1,N2)deoxyguanosine. The more polar product, Adduct 1, was found to have a unique ultraviolet spectrum but did not appear to be fluorescent. Both adducts were observed after calf thymus DNA was incubated with hydroquinone and digested to its constituent nuceosides.
Article
Studies were performed to characterize the previously reported particulate O2--forming system from human neutrophils. Of eight reducing agents examined, including glutathione, ascorbic acid, and intermediates of the glycolytic and hexose monophosphate shunt pathways, only the pyridine nucleotides could serve as electron donors. At 0.1 mM pyridine nucleotide, O2- production was relatively independent of pH. The Km for NADH was approximately 0.7 mM regardless of pH, while with NADPH the Km varied from 0.02 mM at pH 6.0 to 0.3 mM at pH 7.5. The molar ratio of NADPH oxidized to O2- produced was consistent with the reaction: NADPH + 2 O2- leads to NADP+ H+; the product nucleotide was shown enzymatically to be NADP. O2- production was not inhibited by CN-, Na-, EDTA, or 1,10-phenanthroline. Particulate O2- production accounted for 35% of the oxygen taken up during the respiratory burst by an equivalent number of intact neutrophils. Greatly diminished O2- production was seen with particles prepared from cells obtained from three patients with chronic granulomatous disease, with 2.5 mM NADPH as electron donor. With 5.0 mM NADH similar observations were made with particles from two of the patients, but with this nucelotide, O2- production was only slightly reduced in the third case. The evidence available suggests that this particulate O2- -forming system is the one responsible for the respiratory burst in activated neutrophils. The relationship between this system and other O2- -forming system found in human neutrophils is discussed.
Article
This review compares and contrasts the chemistry of cigarette smoke, wood smoke, and the smoke from plastics and building materials that is inhaled by persons trapped in fires. Cigarette smoke produces cancer, emphysema, and other diseases after a delay of years. Acute exposure to smoke in a fire can produce a loss of lung function and death after a delay of days or weeks. Tobacco smoke and the smoke inhaled in a burning building have some similarities from a chemical viewpoint. For example, both contain high concentrations of CO and other combustion products. In addition, both contain high concentrations of free radicals, and our laboratory has studied these free radicals, largely by electron spin resonance (ESR) methods, for about 15 years. This article reviews what is known about the radicals present in these different types of smokes and soots and tars and summarizes the evidence that suggests these radicals could be involved in cigarette-induced pathology and smoke-inhalation deaths. The combustion of all organic materials produces radicals, but (with the exception of the smoke from perfluoropolymers) the radicals that are detected by ESR methods (and thus the radicals that would reach the lungs) are not those that arise in the combustion process. Rather they arise from chemical reactions that occur in the smoke itself. Thus, a knowledge of the chemistry of the smoke is necessary to understand the nature of the radicals formed. Even materials as similar as cigarettes and wood (cellulose) produce smoke that contains radicals with very different lifetimes and chemical characteristics, and mechanistic rationales for this are discussed. Cigarette tar contains a semiquinone radical that is infinitely stable and can be directly observed by ESR. Aqueous extracts of cigarette tar, which contain this radical, reduce oxygen to superoxide and thus produce both hydrogen peroxide and the hydroxyl radical. These solutions both oxidize alpha-1-proteinase inhibitor (a1PI) and nick DNA. Because of the potential role of radicals in smoke-inhalation injury, we suggest that antioxidant therapy (such as use of an inhaler for persons brought out of a burning building) might prove efficacious.
Article
Mutagenicity of cigarette smoke condensate (CSC) and the acidic, basic and neutral fractions of CSC was examined in the AL hybrid cell, a Chinese hamster ovary cell containing one human chromosome 11. Since the human chromosome 11 is not necessary for survival of the AL cells, mutations involving large deletions and chromosomal loss by non-dysjunction are non-lethal events that are detectable by loss of human cell surface antigens (a1, a2 and a3) encoded by genes on chromosome 11p (a1 and a3) and 11q (a2) through an antibody-complement lysis assay. Exposure of AL cells to CSC without exogenous metabolic activation caused a dose-dependent cytotoxicity and mutagenicity. Mutagenicity also increased with time of incubation up to 3 h with a maximum of 300 a1- mutants/10(5) survivors (250% above background; P less than 0.0005) after incubation with 100 micrograms/ml CSC. Cytotoxicity and mutagenicity of CSC were inversely proportional to cell density. Fifty percent lethal doses for the acidic, basic and neutral fractions of CSC after 3 h of incubation were 30, 100 and 240 micrograms/ml respectively, and the acidic fraction at a concentration of 25 micrograms/ml induced 350 a1- mutants/10(5) survivors (230% above background; P less than 0.0005); the basic and neutral fractions were less mutagenic. These results indicate that CSC and fractions of CSC can directly produce a spectrum of mutations, through both deletional and non-dysjunctional mechanisms of a kind known to lead to inactivation of tumor suppressor genes.
Article
Active oxygen species (AOS) such as O2- and H2O2 have been shown to be generated from both gas and tar phases of cigarette smoke and it has been suggested that they are involved in carcinogenesis due to cigarette smoking. Therefore, we investigated the effect of cigarette smoking on oxidative DNA damages in human peripheral blood cells using 8-hydroxydeoxy-guanosine (8-OH-dG) as a marker. From ten healthy male volunteers aged 20-22 years, 5 ml of blood was taken before and 10 minutes after smoking 2 cigarettes in 10 minutes. After lysis of blood cell membranes leukocyte DNA was isolated using a DNA extractor and 8-OH-dG levels were determined using high performance liquid chromatography (HPLC) with electrochemical detection. The mean levels of 8-OH-dG increased significantly (P less than 0.05) from 3.3 +/- 0.8/10(6) dG (mean +/- SD) to 5.1 +/- 2.5 after smoking. These results indicate that cigarette smoking induces oxidative DNA damage in peripheral blood cells in a relatively short time.
Article
Hydroquinone (HQ) may activate oxygen via redox cycles in biological systems and may also deplete glutathione (GSH). Both these reactions are potentially harmful, and we have studied their possible involvement in hydroquinone-induced development of gamma-glutamyltranspeptidase (GGT)-positive enzyme-altered foci in rat liver. The effect of HQ was compared to the effect of duroquinone, catechol, resorcinol and phenol. The dose was 100 mg/kg per day and the test substances were administered for 7-12 weeks in these foci experiments. HQ gave an increased number of foci and increased the foci volume, while none of the other compounds had any significant effect on these parameters. HQ, duroquinone and resorcinol were also tested at a higher dose level (200 mg/kg per day), but this dose gave a lower number of foci than the 100-mg dose. HQ, duroquinone and catechol induced single-strand breaks in hepatic DNA. Single doses of HQ (200 mg/kg) increased malondialdehyde excretion in urine, indicating in vivo lipid peroxidation. Duroquinone, phenol and resorcinol were negative with respect to malondialdehyde excretion. Catechol could not be properly tested as the 200-mg dose killed several animals. HQ and catechol induced hepatic ornithine decarboxylase activity. This effect was correlated to GSH depletion. An in vitro model for toxicity studies with hepatocytes from carcinogen-treated rats was also used. In this model HQ could be shown to be selectively toxic to GGT-negative cells in the presence of extracellular GSH. The toxicity was preceded by a rapid depletion of GSH. Catechol also depleted GSH and could be shown to be selectively toxic, but higher concentrations than those used for HQ had to be used. Duroquinone, phenol and resorcinol were not selectively toxic to GGT-negative cells. As duroquinone can be regarded as a more potent inducer of redox cycles than HQ, it can be concluded that the foci data provide no evidence for an involvement of redox cycles in HQ induced development of enzyme-altered foci. They suggest that GSH depletion may act to develop enzyme-altered foci, and the in vitro data indicate a mechanism by which GSH depletion and toxicity may induce this effect.