Métodos económicos para la cuantificación de microorganismos

Abstract

La cuantificación de microorganismos es fundamental para entender como estos seres diminutos interaccionan con sus hospederos y en los ambientes donde se desarrollan. Para la química clínica la cuantificación de microorganismos es muy importante para conocer el grado de infección de un microorganismo, sin embargo, no se llevan a cabo como prueba de rutina debido al tiempo que los métodos consumen. En estudios de Ecología Microbiana también es importante conocer el número de microorganismos que se asocian con distintos hospederos, conocer sus dinámicas de población, así como, determinar el número de microorganismos que están colonizando un ambiente. Hay diversas formas para cuantificar a los microorganismos, muchos de ellos muy modernos y requieren de equipo especializado que está fuera del alcance de las posibilidades económicas de laboratorios de diagnóstico e incluso de laboratorios de investigación de Universidades Públicas promedio de México, América Latina y laboratorios modestos de otras partes del mundo. Sin embargo, hay métodos económicos y sencillos, con ventajas y desventajas, que podrían implementarse aún en laboratorios de escasos recursos, pero que darían resultados tan precisos como los métodos modernos. En este capítulo se describirán algunos de los métodos económicos para la cuantificación de microorganismos cultivables y algunos ejemplos.

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Instituciones de Educación Superior
La labor investigadora e innovadora en México
ScAsEd
Science Associated Editors L.L.C

Instituciones de Educación Superior
La labor investigadora e innovadora en México
Diciembre 2016

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Diciembre 6- 201
ISBN-10: 1-944162-16-X
ISBN-13: 978-1-944162-16-0
2016 Science Associated Editors, L. L. C
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Presentación
La labor investigadora e innovadora en México es una serie de libros conformada por
tomos que son un compendio de investigaciones que se están realizando en
instituciones mexicanas.
La investigación que desarrollamos en todas las áreas es nuestro granito de arena con
lo que buscamos mejorar un pequeño aspecto de nuestra vida. Somos conscientes que
nuestra aportación es un pequeño paso que deberá ser seguido de muchos otros que
deberemos mejorar.
Este libro de distribución libre es un esfuerzo de todos los autores por poner al
alcance de cualquier interesado los resultados de la labor investigadora que
realizamos con el fin de compartir e incentivar este trabajo que resulta
sorprendentemente gratificante.
Agradecemos a los autores por su esfuerzo al realizar su trabajo de investigación y
por el requerido para la realización del presente libro.
Science Associated Editors

1 Estudio de la Composición Química y Toxicológica de las hojas
de .................................................................................................Paulownia elongata 3
José L. Gutiérrez L., Ranulfo Reyes R., Alfredo Medina G., ManuelA. Reyes,
Luis A. Gutiérrez M. y Deneb Camacho M.
2 Evaluación de Cuatro dosis de fertilización en el desarrollo
de en Zumpango, Estado de México .......................................................13Paulownia
José L. Gutiérrez L. , Ranulfo Reyes G., Miguel A. Villalobos D., Hermilo D. Ávila
y Luis Morales R.
3 Hacia un manejo más eficiente de fertilizantes en sistemas de riego
de baja presión ...........................................................................................................25
Arturo García Saldaña, Cesáreo Landeros Sánchez, Eugenio Carrillo Ávila,
María del Refugio Castañeda Chávez, Arturo Pérez Vázquez y Juan Pablo Martínez Dávila
4 Criterios a considerar para desarrollar proyectos de restauración ecológica
..........................................................................45
Dos casos de éxito en el noreste de México
Miguel Pequeño Ledezma, Eduardo Alanís Rodríguez, Javier Jiménez Pérez,
Oscar Aguirre Calderón, Marco González Tagle, Laura Sanchez Castillo
y Victor Manuel Molina
5 Métodos económicos para la cuantificación de microorganismos ..........................67
Jesús Muñoz Rojas, Yolanda Elizabeth Morales García, Antonino Baez Rogelio,
Verónica Quintero Hernández, América Paulina Rivera Urbalejo y Rocío Pérez y Terrrón
6 Conductas alimentarias de riesgo en adolescentes ..................................................85
Margarita Magallanes G., R. Adriana. Martínez E. y Christian S. Franco T.
7 Diseño, fabricación y evaluación clínica de implantes trans-endodónticos
de óxido de zirconio ...................................................................................................103
Cesar Gaitán Fonseca , Alexis Larios Cervantes, LuisAlejandro Aguilera Galaviz,
María del Carmen Aceves y Héctor Flores Reyes
8 Inmunopatogénesis de la Artritis Reumatoide.
Diagnóstico y estrategias terapéuticas ...............................................................................113
Victor ErmiloArana Argáez, Julio Cesar Torres Romero, Mario Alberto Ramírez Camacho
y Julio Cesar Lara Riegos
9 Variación del comportamiento de la resistencia al esfuerzo cortante
en arcillas expansivas por efecto de la humedad ...................................................149
Alejandro García Elías, Alejandro Córdova Ceballos,Armando Aguilar Meléndez,
José Luis Sánchez Amador, Avril González Sierra y Juan Carlos Anzelmetti Zaragoza
Índice de capítulos

10 Series temporales caracterizando cambios impredecibles en radiación solar .....165
Rubén Sánchez Gómeza, Laura Esther Cortés Navarro, Silvia Sánchez Díaz,
Emilio Leonardo Ramírez Mora y Martha Leticia Rujano Silva
11 Modelado del proceso de hidroformado de un tubo cuadrado de acero
avanzado de alta resistencia mediante simulación .................................................183
Jorge Carlos León Anaya y Juan Carlos Cisneros Ortega
12 Transformación de los partidos políticos en México .............................................209
Miguel Ángel Sánchez Ramos
13 Contaminación petrolera de las corrientes fluviales del Río Coatzacoalcos,
1906-1922 ...................................................................................................................233
Martín Ortiz Ortiz
Índice de Autores ...............................................................................................................255
Índice de capítulos

Capítulo 5
Métodos económicos para la
cuantificación de microorganismos
Jesús Muñoz Rojas, Yolanda Elizabeth Morales García,
Antonino Baez Rogelio, Verónica Quintero Hernández,
América Paulina Rivera Urbalejo y Rocío Pérez y Terrrón

Science Associated Editors, L.L.C. 2016
Instituciones de Educación Superior. La labor investigadora e innovadora en México.
ISBN-10: 1-944162-16-X ISBN-13: 978-1-944162-16-0
Métodos económicos para la cuantificación
de microorganismos
Jesús Muñoz-Rojasa,1, Yolanda Elizabeth Morales-Garcíaa,b, Antonino Baez-Rogelioa,
Verónica Quintero-Hernándeza, América Paulina Rivera-Urbalejoa y Rocío Pérez-y-
Terrrónb
a Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas, Instituto de Ciencias-BUAP
b Biotecnología, Escuela de Biología, Benemérita Universidad Autónoma de Puebla
Resumen. La cuantificación de microorganismos es fundamental para entender
como estos seres diminutos interaccionan con sus hospederos y en los ambientes
donde se desarrollan. Para la química clínica la cuantificación de microorganismos
es muy importante para conocer el grado de infección de un microorganismo, sin
embargo, no se llevan a cabo como prueba de rutina debido al tiempo que los
métodos consumen. En estudios de Ecología Microbiana también es importante
conocer el número de microorganismos que se asocian con distintos hospederos,
conocer sus dinámicas de población, así como, determinar el número de
microorganismos que están colonizando un ambiente. Hay diversas formas para
cuantificar a los microorganismos, muchos de ellos muy modernos y requieren de
equipo especializado que está fuera del alcance de las posibilidades económicas de
laboratorios de diagnóstico e incluso de laboratorios de investigación de
Universidades Públicas promedio de México, América Latina y laboratorios
modestos de otras partes del mundo. Sin embargo, hay métodos económicos y
sencillos, con ventajas y desventajas, que podrían implementarse aún en
laboratorios de escasos recursos, pero que darían resultados tan precisos como los
métodos modernos. En este capítulo se describirán algunos de los métodos
económicos para la cuantificación de microorganismos cultivables y algunos
ejemplos.
Palabras claves. Cuantificación de microorganismos, Plaqueo, Goteo en Placa,
Colonias, GSPM, crecimiento de microorganismos.
1. Introducción
La cuantificación de microorganismos es fundamental en los estudios de ecología
microbiana y microbiología clínica para entender como estos seres diminutos
interaccionan con sus hospederos y en los ambientes donde se desarrollan [Morales-
García et al., 2016]. Para la química clínica la cuantificación de microorganismos es
muy importante para conocer el grado de infección de hospedero por un
microorganismo, sin embargo, los ensayos de recuento de microorganismos de alta
precisión no se llevan a cabo como prueba de rutina, debido al tiempo que los métodos
consumen. Por ejemplo en la orina se determina el contenido de bacterias con cruces en
laboratorios de rutina, siendo una visión muy ambigua de determinar este parámetro.
No obstante, para propósitos de investigación clínica los recuentos en el número de
1 Jesús Muñoz Rojas, joymerre@hotmail.com

Muñoz Rojas et al.
68
bacterias si son realizados [Flores-Alfaro et al., 2005]. En estudios de Ecología
Microbiana también es importante conocer el número de microorganismos que se
asocian con distintos hospederos, conocer sus dinámicas de población, así como,
determinar el número de microorganismos que están colonizando un ambiente [Corral-
Lugo et al., 2012]. En esta área de la microbiología, así como en estudios de
microbiología científica se ha tomado mayor consideración para determinar el número
de microorganismos implicados en un tema de estudio, no obstante, los métodos tienen
que retomarse por los laboratorios de análisis clínico, así como laboratorios de química
ambiental.
En estudios de microbiología, no solo es importante conocer al responsable de un
efecto benéfico o identificar al microorganismo potencial de causar alguna infección
severa, sino también es importante conocer el número de microorganismos implicados,
para determinar si el microorganismo en cuestión será capaz de desarrollar una función
benéfica o perjudicial [Corral-Lugo et al., 2012; Morales-García et al., 2016]. Por
ejemplo, se requieren alrededor de 109 Unidades Formadoras de Colonia (UFC) de la
bacteria del género Rhizobium/gramo (g) de nódulo en leguminosas, para que se lleve a
cabo una fijación biológica de nitrógeno efectiva [Wuadisirisuk & Weaver, 1985].
También es conocido que para obtener una promoción de crecimiento de plantas
exitosa se requiere una población de la bacteria Azospirillum en un rango de 106 a 108
UFC/g de suelo [Okon & Labandera, 1985]. El agua para consumo humano debe
cumplir con ciertas normas, la Organización Mundial de la Salud estipula que el agua
potable que se destina para uso doméstico no debe contener bacterias coliformes [WHO,
2008a]. La calidad del agua se ha clasificado en función de la presencia de estos
microorganismos en: A; completamente satisfactoria (0 Unidades Formadoras de
Colonia/mililitro (UFC/ml)), B; satisfactoria y representa riesgo bajo (1-10 UFC/ml, C;
marginalmente insatisfactoria (10-100 UFC/ml), D; insatisfactoria con riesgo alto (100-
1000 UFC/ml), E; inaceptable con riesgo muy alto (>1000 UFC/ml) [WHO, 2008b].
2. Métodos para la cuantificación de microorganismos cultivables vs métodos de
recuento moleculares
Existen varias estrategias para cuantificar a los microorganismos en muestras
ambientales y de laboratorio. Estos deben emplearse en función de la pregunta que se
desea responder. Si el cuestionamiento es conocer el número total de microorganismos
en una muestra, es casi imposible llegar a estimar este número usando métodos
tradicionales de cultivo, pues no todas las bacterias son capaces de crecer en el mismo
medio [Morales-García et al., 2013] y además la mayoría de los microorganismos son
no cultivables [Amann et al., 1995]. Sin embargo, los métodos microscópicos pueden
aproximarse para conocer ese número si se acoplan métodos de marcaje molecular
[Bouvier & del Giorgio, 2003] o si se usan métodos moleculares usando la
amplificación de genes clave usando la técnica de PCR de tiempo real [Tsushima et al.,
2007]; estos son altamente costosos como el método de FISH [Bouvier & del Giorgio,
2003] y frecuentemente requieren de sondas moleculares y también requieren de un
buen sistema de microscopía acoplado frecuentemente a fluorescencia. Mediante el uso
de métodos de recuento microscópico usando epifluorescencia, podríamos contar el
número de microorganismos presentes en una muestra con una magnificación 100X y
con ayuda de un sistema de cuadrícula graduada que podría ser la cámara de Neubauer
[Baena-Ruano et al., 2006], empero, para que los microorganismos sean visibles por

Muñoz Rojas et al.
69
este método se requiere acoplar fluoroforos como el SYTO 9TM y el bromuro de
propidio. Este método además nos ofrece la ventaja de conocer a las células viables y
distinguirlas de las no viables. Para el recuento de microorganismos de tamaño
considerablemente visible entre los que podemos destacar a los parásitos microscópicos
se puede usar la cámara de Neubauer con un microscopio convencional [Galindo et al.,
2008]. Otros métodos de recuento moleculares como el de amplificación de genes
como el que codifica para la unidad 16S rRNA pueden ser usados para el recuento de
microorganismos. Si los oligonucleótidos destinados para el recuento de los
microorganismos son universales, tendremos datos aproximados del total de bacterias
[Matsuki et al., 2004], en cambio si los oligonucleótidos están dirigidos contra un tipo
de microorganismos, entonces solo se detectarán a los microorganismos de interés, por
ejemplo el recuento de bacterias acéticas en el proceso de fermentación para la
obtención de vino [González et al., 2006]. Estos métodos son muy precisos, pero
requieren estandarizarse con referencia a métodos convencionales existentes y el costo
aun es elevado porque necesita del uso de termocicladores, oligonucleótidos enviados a
sintetizar en acuerdo con el microorganismo de interés, enzimas de tipo polimerasa,
dNTPs, buffers, marcadores de peso molecular, genes control, entre otros
requerimientos [Vandesompele et al., 2002].
En México y Latinoamérica, los laboratorios que usan detección y recuento
mediante PCR o PCR de tiempo real son generalmente los dedicados a investigación
[Tomé-Sandoval et al., 2008; Yanez et al., 2008] y aún son pocos los laboratorios
clínicos o ambientales que cuentan con esta tecnología. Sin embargo, hay una
diversidad grande de métodos clásicos que podrían ayudarnos a contar el número de
microorganismos de interés presente en una muestra. Estos métodos se basan
generalmente en el cultivo de microorganismos y por lo tanto no capturan el total de la
diversidad microbiana, no obstante, si logran capturar a algunos microorganismos que
sean de interés para un estudio determinado, para el diagnóstico clínico o para la
determinación de microbios de interés a partir de una muestra de otra procedencia
como por ejemplo, suelo, rizósfera, plantas, animales o muestras ambientales. En este
capítulo solo se abordará en detalle algunos métodos que se han usado extensamente
para la resolución de preguntas relacionadas con el número de bacterias u hongos
presentes en una muestra de interés clínico o biotecnológico. El capítulo abarcará, el
método de plaqueo, el método de vaciado en placa, el método de goteo en placa
[Herigstad et al., 2001; Hoben & Somasegaran, 2003], el método del número más
probable [Cavalcante & Döbereiner, 1988] y dos métodos para el recuento masivo que
han sido recientemente planteados: el método de goteo en placa 6X6 [Chen et al.,
2003] y el método de goteo por sellado en placa masivo (GSPM) [Corral-Lugo et al.,
2012; Leyva-Madrigal et al., 2015]. En general las metodologías se basan en realizar
diluciones seriadas 1:10, para colocar muestras de cada dilución en un medio de cultivo,
generalmente gelificado; sin embargo cada método presenta variantes que lo
caracterizan.
3. Métodos de recuento por plaqueo y por vaciado en placa
La técnica de recuento por plaqueo es una de las metodologías más ampliamente usada
para la determinación del número de bacterias u hongos presentes en una muestra
[Amann et al., 1995], aunque esta es una de las más antiguas [Fisher et al., 1922], los
datos obtenidos son muy precisos y aún es usado como método de referencia [Corral-

Muñoz Rojas et al.
70
Lugo et al., 2012]. El método de vaciado en placa es también ampliamente utilizado es
parte de las normativas para la detección de microorganismos y cada vez menos usado
en investigación, pero aún hay trabajos reportados con esta metodología [Montañez et
al., 2011].
Tanto el método de plaqueo como el de vaciado en placa consisten en diluir en
factor 1:10 a la muestra original hasta la dilución 1:10000000 (tubo 7, Fig. 1). Para el
método de plateo, se colocan 100 µl de cada una de las diluciones en placas
independientes que contienen un medio de cultivo gelificado. La gota de 100 µl de cada
placa es extendida (plaqueada) con ayuda de una varilla de vidrio o bien con bolitas de
vidrio, en ambos casos el material de vidrio es estéril y frio. Una vez que cada gota fue
extendida, las placas son colocadas bajo condiciones de incubación, tomando en
consideración las condiciones de crecimiento que requiere el microorganismo que va a
ser cuantificado (Fig. 1).
Después de que las colonias han crecido, se selecciona la placa que contiene
colonias que pueden ser distinguidas y que son independientes para poder cuantificarlas.
Se dice que una placa con colonias cuantificables debe contener entre 30 a 300 colonias
independientes. Para calcular el número de bacterias presentes en la muestra, se
multiplica por 10 al número de colonias presente en la caja contable; debido a que
pusimos 100 µl de muestra y esto representa la décima parte de un mililitro. El
resultado obtenido es entonces multiplicado por el factor de dilución para obtener el
número de unidades formadoras de colonia por mililitro (UFC/ml). Por ejemplo, si
obtenemos una placa con 35 colonias a partir del tubo 6 (dilución 1:1000000), entonces
el cálculo seria 35 X 10 X 1000000 lo que equivale a 3.5X108 UFC/ml.
Figura 1. Método de recuento por plaqueo.
Para el método de vaciado en placa se colocan 100 µl de cada dilución en placas
independientes y vacías, posteriormente se vacía una cantidad suficiente de medio a
punto de gelificar en cada gota, se agita con suavidad y se permite que el agar gelifique
bajo condiciones de esterilidad. Una ventaja del método de vaciado en placa es que
podrían crecer otro tipo de bacterias en referencia al plaqueo, ya que se permiten
condiciones con bajo contenido de oxígeno para aquellas colonias que se desarrollan

Muñoz Rojas et al.
71
entre el agar del medio de selección. El cálculo del número de microorganismos es
similar al método de plaqueo.
4. Goteo en placa
Quizás una de las técnicas cuyo uso se ha intensificado en nuestros días para el
recuento bacteriano, es la técnica de goteo en placa, debido a que ésta es fácil, rápida y
económica [Herigstad et al., 1982; Hoben & Somasegaran, 2001]. En este método
también se realizan las diluciones 1:10 a partir de la muestra original, pero a diferencia
del método de plaqueo, aquí se colocan tres gotas de 20 µl de cada una de las
diluciones seriadas en las placas de medio gelificado (Figura 2) y después del
crecimiento de colonias se elige la dilución contable. No hay una regla para elegir la
dilución contable, no obstante, recomendamos se cuenten entre 3 a 15 colonias en la
gota seleccionada. A partir del número de colonias presentes en la dilución contable se
realizan los cálculos requeridos. Por ejemplo en la figura 2, a partir de la dilución
1:1000000 se detectaron 4 colonias en la primera gota, 4 en la segunda y 3 en la tercera,
por lo que sumando el número de colonias y dividiendo ese valor entre tres, obtenemos
un valor promedio de 3.6666 UFC presentes en 20 los µl adicionados. Este valor es
posteriormente multiplicado por 50 dando un valor de 18.3333 que significa el número
de UFC en 1000 µl y finalmente multiplicamos este valor por el factor de dilución (en
este caso 106), obteniendo un valor final de 1.833X108 que significa el número de
UFC/ml presentes en la suspensión original.
Los medios de cultivo y las condiciones de crecimiento serán variables en función
del microorganismo explorado. Por ejemplo, para Pseudomonas putida KT2440 se
puede usar LB gelificado y las bacterias se crecen a 30 oC [Muñoz-Rojas et al., 2006],
para Escherichia coli se puede usar medio MacConkey y su crecimiento es a 37 oC
[Jure et al., 2010] y para el hongo Penicillum sp. UAPGRC-1 el medio de cultivo
utilizado es MESMA-Cm80 a 30 oC [Morales-García et al., 2016]. Algunos hongos
presentan la ventaja de crecer de forma dimórfica; en medio líquido crecen como
células independientes (levaduriforme) y en medio gelificado crecen en forma miceliar.
La técnica de goteo en placa es una metodología útil para cuantificar el número de
células fúngicas dimórficas presentes en muestras líquidas, en distintas etapas de
crecimiento, similar a lo que se ha propuesto para bacterias en una curva de
crecimiento característico [Morales-García et al., 2016].
Una variante del método es que en lugar de poner las tres gotas de la misma
dilución en la misma placa, se coloca una gota de cada dilución en una placa,
realizando tres replicas en placas independientes, de esta manera las colonias son
visualizadas mejor y no hay riesgo de que se fusionen; lo cual es particularmente
importante para la cuantificación de hongos (Figura 3). El método de goteo en placa se
puede acoplar al método número más probable para aquellos experimentos donde las
colonias no se pudieran diferenciar, en este caso se toma el dato de los crecimientos
positivos y negativos como se explicará en la sección 5. Esto podría ocurrir para
hongos micelares de crecimiento muy rápido.

Muñoz Rojas et al.
72
Figura 2. Método de recuento por goteo en placa
Figura 3. Cuantificación de un hongo por el método de goteo en placa
5. Número más probable (NMP)
En algunos casos se desea cuantificar la presencia de algún microorganismo específico
difícil de aislar o con un crecimiento que no permite distinguir colonias delimitadas
(Figura 4), por ejemplo cuando producen gran cantidad de polisacárido. Una alternativa
es seguir alguna actividad metabólica característica del microorganismo en cuestión.
En este sentido, algunas bacterias fijadoras de nitrógeno se han cuantificado por este
método usando tubos de medio semigelificado libre de nitrógeno [Cavalcante &

Muñoz Rojas et al.
73
Döbereiner, 1988]. Bajo estas condiciones las bacterias fijadoras de nitrógeno crecen
usando nitrógeno de la atmósfera como fuente de este componente y si se usan medios
de cultivo con una selección adicional, es altamente probable que solo crezca la
bacteria deseada. Por ejemplo, Gluconacetobacter diazotrophicus es una bacteria
endófita de la caña de azúcar que se ha cuantificado a partir de tallos de esta planta
mediante el método NMP; usando el medio LGI sin nitrógeno combinado, que contiene
30% de sacarosa y es altamente selectivo para esta bacteria [Cavalcante & Döbereiner,
1988; Reis et al, 1994]. Otra bacteria cuantificada a partir de rizósfera de maíz es
Azospirillum brasilense [Bashan and Levanony, 1985]. La rizósfera se define como el
suelo que está influenciado por los exudados de las raíces de las plantas [Molina-
Romero et al., 2015] y es un sistema complejo donde existe una diversidad enorme de
bacterias y hongos, razón por la que resulta difícil cuantificar a A. brasilense a partir de
esas muestras. Sin embargo, el medio JNFb semigelificado permite una selección
adecuada de esta bacteria gracias a que contiene ácido málico como fuente de carbono;
un compuesto que da preferencia al crecimiento de esta bacteria, bajo condiciones
diazótrofas [Reis et al., 2015]. Algunos hongos también podrían cuantificarse usando el
método de NMP por la aparición del micelio característico.
Figura 4. Ejemplos de microorganismos cuyas colonias son difíciles de diferenciar en placa
El método NMP como en otros métodos de recuento, se realizan diluciones 1:10
hasta la dilución 1:10000000 (Figura 5). A partir de cada dilución se toman 100 µl por
triplicado o por réplicas de 5 y se siembran en el medio de cultivo donde esperamos ver
el crecimiento característico del microorganismo deseado. Para propósitos de
explicación, aquí nos enfocaremos al método cuando se usan tres réplicas. Así, cada
una de las diluciones es sembrada en réplicas de 3 y todos los medios se colocan a
incubación en función de las condiciones que requiere el microorganismo. En el
ejemplo de la Figura 5, después del crecimiento se espera que el medio de los tubos se
torne de color amarillo, que es el indicativo de que hay actividad del microorganismo
que se está cuantificando. Entonces se procede a contar el número de tubos positivos de
cada dilución. El método dice que tenemos que considerar la última dilución con la
presencia de tres tubos positivos, que es a partir de donde se realizarán los cálculos
[Döbereiner et al., 1995]. Supongamos que en el recuento de una bacteria de interés por
el método NMP, encontramos 3 tubos con crecimiento positivo para las diluciones
bajas y así ocurre hasta la dilución 1:0000, en la dilución 1:100000 ya solo hay dos
tubos con crecimiento positivo y en las diluciones subsecuentes ya no hay tubos
positivos para el crecimiento del microorganismo, esto significa que se genera el
número 320 en la dilución 1:10000. Se busca el número generado en las tablas de
McCrady [Döbereiner et al., 1995], en este caso ese número corresponde a un número
más probable de 9.5 bacterias. Este valor está contenido en los 100 µl explorados y

Muñoz Rojas et al.
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debe ser multiplicado por 10 para tener el número de bacterias presentes en 1000 µl de
la dilución respectiva. Finalmente el valor obtenido se multiplica por el factor de
dilución en este caso por 10000, obteniendo un valor de 9.5X105 bacterias por mililitro
de la muestra original.
Figura 5. Método del número más probable para el recuento de microorganismos
6. Goteo por sellado en placa masivo (GSPM)
Para la cuantificación masiva de muestras se pueden elegir dos métodos, el llamado
6X6 [Chen et al., 2003] o bien el método GSPM [Corral-Lugo et al., 2012]. Ambos
métodos se basan en realizar diluciones seriadas 1:10 con la ayuda de una pipeta
multicanal sobre placas multipozos y además en colocar micro-gotas de cada dilución
en el medio de selección. La diferencia entre ambos métodos radica en que para el
método 6X6 las gotas de cada dilución son dispensadas con la pipeta multicanal y en el
método GSPM las gotas se colocan con ayuda de un replicador metálico dispensando
alrededor de 2 µl (Fig. 6). En cuestión de ahorro de material el método GSPM tiene
ventajas pues no se requiere el uso de puntas para una micropipeta durante la
dispensación de las gotas y en referencia al tiempo destinado para dicho goteo también
es mucho menor en el método GSPM debido a que las gotas se colocan en un solo paso,
en cambio en el otro método hay que ir dispensando muestras de cada dilución con la
pipeta multicanal.

Muñoz Rojas et al.
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Figura 6. Dispensación de la muestra en el método de Goteo por Sellado en Placa Masivo
Para calcular el número de UFC/ml en cada una de las muestras, se toma el
número de colonias de la dilución contable (ejemplo 5 colonias); asumiendo que una
colonia es igual a una UFC, el valor equivale al número de UFC que existen en el
volumen de la gota que dejó el replicador (Ejemplo: 2 µl). Después mediante una
“regla de tres”, se determina el número de UFC que hay en 100 μl (250) y
posteriormente en 1 ml (2500). Una vez determinado el número de UFC/ml, el
resultado se multiplica por el factor de dilución en la cual se contaron las colonias y así
se obtiene el número de UFC/ml de la bacteria de interés contenida en la muestra
original. Si las 5 colonias antes mencionadas crecieron a partir de la dilución
1:1000000, el valor final calculado de estas bacterias es de 2.5X109 UFC/ml en la
suspensión original.
Figura 7. Ejemplo de cuantificación de bacterias mediante el método GSPM
El método GSPM es ideal para la cuantificación de bacterias [Reyes-Darías et al.,
2015, Rodríguez-Andrade et al., 2015] u hongos [Figueroa-López et al., 2016; Leyva-
Madrigal et al., 2015] cuando existe un amplio número de muestras, una sola persona
puede procesar alrededor de 50 muestras en 30 minutos, lo que facilita el trabajo y se
evita que el número de microorganismos oscile entre el recuento de la primera muestra
y la última, por el excesivo tiempo de procesamiento; como ocurriría con otros
métodos antes mencionados. Además si se realizan tres réplicas de cada muestra, el
método GSPM se puede acoplar al método de NMP para realizar cálculos a partir datos
de crecimiento positivo o negativo. Ejemplos de placas con bacterias cuantificadas por
el método GSPM se muestran en la figura 7.

Muñoz Rojas et al.
76
7. Cuantificación de microorganismos para establecer curvas de crecimiento
Uno de los experimentos de rutina en los laboratorios de investigación es la
determinación de una curva de crecimiento, con el fin de conocer el comportamiento
del microorganismo que se está estudiando ante el consumo de un sustrato específico.
En el caso de bacterias requerimos conocer la velocidad con la que los
microorganismos están creciendo a partir de la determinación en distintos puntos; con
lo cual podemos determinar las fases de crecimiento, la tasa e incluso modelar el
crecimiento a partir de los datos generados [Baranyi & Pin, 1999]. La curva de
crecimiento típica abarca la fase de adaptación, la fase exponencial, la fase estacionaria
y la fase de muerte. Esto nos permite decidir el punto en el cual se recogerán las células
de una bacteria para un experimento posterior, por ejemplo, para evaluar la tolerancia a
la desecación; la cual varía en función de la fase de crecimiento bacteriana, fue
necesario determinar el tiempo adecuado para someter a las células de P. putida
KT2440 a liofilización [Muñoz-Rojas et al., 2006].
En una curva de crecimiento típica, Burkholderia tropica MTo-293 muestra una
fase exponencial a las 3 horas, una fase estacionaria temprana alrededor de las 9 horas
y una fase estacionaria tardía a las 24 horas (Figura 8); los cuales son tiempos ideales
para realizar ensayos de tolerancia a la desecación y comparar el comportamiento de la
bacteria ante este estrés. Para el caso de hongos, la determinación de su curva de
crecimiento también nos da pistas de cuál es la fase de crecimiento exponencial y
donde ha llegado a estabilizarse el crecimiento (Figura 9) [Morales-García et al., 2016];
para el caso particular de hongos hemos observado que estos se adaptan mejor en
interacción con plantas en fase estacionaria por lo que la inoculación de plantas la
realizamos en esta fase de crecimiento. Cuando trabajamos bacterias u hongos
individuales, el método que más nos conviene es el método de goteo en placa, ya que el
número de réplicas (generalmente 5) es permisible para realizarse rápidamente.
Figura 8. Curva de crecimiento de Burkholderia tropica MTo-293
Tiempo (h)
Log UFC/ml

Muñoz Rojas et al.
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Figura 9. Curva de crecimiento de Penicillum sp. UAPGRC-1.
Cabe destacar que la capacidad de crecimiento de una bacteria o de un hongo va a
depender del medio de cultivo donde se desarrolla, por lo tanto las fuentes de carbono o
de nitrógeno exploradas son componentes clave que definirán el comportamiento de los
microorganismos y la producción de metabolitos [Morales-García et al., 2013].
8. Cuantificación de microorganismos a partir de ambientes naturales
En trabajos de investigación microbiológica o biotecnológica, con frecuencia
requerimos conocer el número de bacterias u hongos de interés a partir de muestras
recolectadas en la naturaleza. La recolección de las muestras es importante para
transportar a los microorganismos hasta el laboratorio donde serán detectados y
cuantificados.
Quizás lo más correcto sería procesar las muestras en el punto donde son
recolectadas, pero pocos grupos de investigación cuentan con laboratorios móviles para
llevar a cabo esto. Así que daremos algunas recomendaciones para la colecta de las
muestras.
8.1. Recolección de muestras de suelo
Para la recolección de suelos debe considerarse .que debemos contar con contenedores
estériles, por ejemplo tubos Falcon de 50 ml, donde serán colocadas las muestras.
Primero debemos seleccionar la profundidad de la muestra. Si deseamos explorar un
suelo superficial, con un utensilio estéril por ejemplo una pala pequeña, se toma un
poco de suelo de la superficie, este se depositará dentro del contenedor. Si se requiere
suelo más profundo se debe tener un método para cavar sin alterar mucho el ecosistema.
En ocasiones el microbiólogo tiene que ser astuto y colectar muestras aprovechando
que se está cavando a profundidades mayores con otros propósitos, por ejemplo cuando
se construyen carreteras, en minas e incluso construcciones de casas. Esos suelos
suelen contener microorganismos diferentes a los encontrados en la superficie [XXX].
En todos los casos no se requiere más que unos cuantos gramos de suelo que deben de
ser transportados inmediatamente al laboratorio para su recuento y aislamiento [XXX].
Log UFC/ml
Tiempo (h)

Muñoz Rojas et al.
78
8.2. Recolección de muestras de rizósfera, región endófita y epífita.
Cuando colectamos muestras de rizósfera generalmente se tiene que extraer la planta
completa, esta debe ser introducida en un contenedor estéril de tamaño adecuado y ser
transportada hasta el laboratorio donde será procesada. Por esta razón, cuando esto
ocurre debemos aprovechar en su totalidad a la muestra y recabar datos del contenido
de bacterias de la región endófita (interior de la planta) y la zona epífita de las mismas.
Para el caso de la rizósfera es necesario obtener suelo que esté íntimamente relacionado
con las raíces de las plantas [Morales-García et al., 2011], un gramos de este suelo de
distintos puntos de la rizósfera serán mezclados con 10 ml de solución amortiguadora,
la cual será la suspensión inicial para realizar las diluciones seriadas, el resultado final
del cálculo UFC/ml se tendrá que multiplicar por 10 para tener el Número de Unidades
Formadoras de Colonia por cada gramo de suelo rizosférico (No. UFC/g de suelo de
rizósfera). En experimentos de laboratorio, frecuentemente se usa vermiculita como
sustrato inerte para experimentos de inoculación en plantas, similar a lo que ocurre con
el recuento de microorganismos en suelo rizosférico, aquí se considera rizósfera a la
vermiculita íntimamente asociada a las raíces de las plantas y normalmente se reporta
como No. UFC/g de V (Vermiculita) [Rodríguez-Andrade et al., 2015].
Para contar el número de microorganismos de la región epífita es necesario pesar
una porción de la región aérea de la planta. Esta es ligeramente enjuagada con agua
destilada estéril y posteriormente en una proporción 1:10 de P/V (Peso sobre volumen
de la planta/agua) se agita vigorosamente o se somete a sonicación para desprender a
las bacterias finamente adheridas a la superficie de la planta [Mercier & Lindow, 2000].
La suspensión obtenida es sometida a recuento bacteriano y el resultado de No.
UFC/ml se multiplica por 10 para tener el No. UFC/g de planta.
Para la determinación de la población endófita, primero hay que seleccionar la
región de la planta que sea interesante de analizar. Para el caso de plantas pequeñas,
generalmente se decide esterilizar la superficie de la planta mediante métodos químicos
[Muñoz-Rojas & Caballero-Mellado, 2003; Muñoz-Rojas et al., 2005]; por ejemplo
usando cloramina T al 2% o bien se podría usar hipoclorito de sodio al 6.5% durante 20
minutos en ambos casos. Una forma alternativa para realizar el esterilizado es con
fuego, para ello se rocía la muestra con alcohol de 96º y se acerca una chispa; pero este
método solo sirve para tallos de alto calibre y firmeza como la caña de azúcar. Después
de esterilizar superficialmente a la planta, esta tiene que enjuagar varias veces en agua
destilada estéril y una vez que se ha lavado y no quedan rastros de olor a cloro, la
planta es separada en parte aérea y raíz bajo condiciones de esterilidad. Un gramo de
cada región es pesado y macerado en un mortero con 9 ml de agua destilada estéril. La
suspensión obtenida es sometida a diluciones seriadas para su recuento. El valor del No.
UFC/ml obtenido del recuento se multiplica por 10 para obtener el No. UFC/g de
planta.
El número de microorganismos de otras regiones de la planta también podría ser
explorado, como por ejemplo el rizoplano, las flores, los frutos, las semillas, las cuales
se han reportado en menor frecuencia.

Muñoz Rojas et al.
79
8.3. Recolección de muestras de agua
La búsqueda de microorganismos en agua es una práctica cotidiana, para el caso de
agua para el consumo humano esta debe cumplir con los parámetros de salud
establecidos [WHO, 2008 a y b]. Sin embargo, la determinación del número de
microorganismos a partir de ríos, lagunas, manantiales y otras fuentes naturales nos
puede dar una idea de la salud del planeta. En cualquiera de los casos el agua debe ser
colectada en un contenedor estéril e inmediatamente debe ser transportada al
laboratorio, donde será procesada para su recuento. Para ello, el agua colectada debe
resuspenderse perfectamente mediante agitación para que se realice las diluciones
seriadas. En acuerdo con la normativa el método de elección para el recuento es el
vaciado en placa, pero los métodos de goteo en placa y los métodos masivos podrían
servir para monitorear más medios de cultivo en un corto tiempo.
El número de microorganismos de otras regiones de la planta también podría ser
explorado, como por ejemplo el rizoplano, las flores, los frutos, las semillas, las cuales
se han reportado en menor frecuencia.
8.4. Recolección de muestras de clínicas
En el caso de las muestras que se obtienen a partir de pacientes y alimentos, éstas se
encuentran completamente reglamentadas y hay manuales y procedimientos para la
toma correcta de ellas, razón por la que aquí no serán abordadas. Sin embargo, es
importante destacar que no están diseñadas para un correcto recuento de
microorganismos, pero si para el transporte y la búsqueda de la presencia de
microorganismos asociados con la patogenicidad. En este sentido los métodos de
selección en la química clínica son de gran ayuda para aislar solo a algunos
microorganismos. Con el conocimiento actual sabemos que existen muchas especies
bacterianas sin ser descubiertas y que la mayoría permanecen como no cultivables
[Amann et al., 1995], entonces es apetitosa la pregunta de ¿cuál es la probabilidad de
que el microorganismo aislado de un paciente sea el responsable de una enfermedad?
Más aún si con frecuencia en los laboratorios clínicos no se realiza el recuento
bacteriano de las especies de interés, ¿cómo podemos entonces atribuir que el proceso
patogénico sea debido al microorganismo aislado? si desconocemos si el
microorganismo es abundante respecto de otros en ese ambiente. Los laboratorios
clínicos deben realizar el recuento de microorganismos como prueba de rutina y los
métodos masivos como el GSPM [Corral-Lugo et al., 2012] serán ideales para este
proceso.
9. Conclusiones
Existen muchos métodos modernos para la cuantificación de microorganismos, pero
estos requieren de infraestructura de punta para poder realizarlos. Desafortunadamente
los laboratorios clínicos y ambientales de México y en general de América Latina,
carecen de los recursos suficientes para el equipamiento adecuado. Mientras tanto es
necesario conocer el número de microorganismos cultivables que pudieran estar
implicados en un proceso patogénico o beneficioso. Por esta razón es que los métodos
clásicos de recuento deben seguir implementándose, para poder responder a preguntas
básicas como cuál es la abundancia de un microorganismos de interés en un hábitat

Muñoz Rojas et al.
80
determinado. Hay varios métodos para el recuento de bacterias cultivables, por
ejemplo: el plaqueo, el vaciado en placa, el método de NMP, el goteo en placa y los
métodos de recuento masivo como el 6X6 y el GSPM. De estos destacan el método de
goteo en placa para una baja cantidad de muestras y el método GSPM para una alta
cantidad de muestras para su recuento. Ambos métodos son muy rápidos de llevar a
cabo y también son altamente económicos. Los laboratorios clínicos y ambientales de
rutina deben implementar el uso de estos métodos para el recuento de bacterias de
interés a partir de sus muestras.
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Aceves, María del Carmen...................................................................................103
Aguilar Meléndez, Armando................................................................................149
Aguilera Galaviz, Luis Alejandro ........................................................................103
Aguirre Calderón, Oscar ........................................................................................45
Alanís Rodríguez, Eduardo ....................................................................................45
Anzelmetti Zaragoza, Juan Carlos .......................................................................149
Arana Argáez, Víctor Ermilo................................................................................113
Ávila, Hermilo D....................................................................................................13
Baez Rogelio, Antonino.........................................................................................67
Camacho M., Deneb.................................................................................................3
Carrillo Ávila, Eugenio ..........................................................................................25
Castañeda Chávez, María del Refugio...................................................................25
Cisneros Ortega, Juan Carlos ...............................................................................183
Córdova Ceballos, Alejandro...............................................................................149
Cortés Navarro, Laura Esther...............................................................................165
Flores Reyes, Héctor ............................................................................................103
Franco T., Christian S.............................................................................................85
Gaitán Fonseca, Cesar..........................................................................................103
García Elías, Alejandro ........................................................................................149
García Saldaña, Arturo...........................................................................................25
González Sierra, Avril..........................................................................................149
González Tagle, Marco...........................................................................................45
Gutiérrez L., José L. ..........................................................................................3, 13
Gutiérrez M., Luis A. ...............................................................................................3
Jiménez Pérez, Javier .............................................................................................45
Landeros Sánchez, Cesáreo....................................................................................25
Lara Riegos, Julio Cesar.......................................................................................113
Larios Cervantes, Alexis ......................................................................................103
León Anaya, Jorge Carlos ....................................................................................183
Magallanes G., Margarita.......................................................................................85
Martínez Dávila, Juan Pablo ..................................................................................25
Martínez E., R. Adriana..........................................................................................85
Medina G. , Alfredo .................................................................................................3
Molina Guerra, Víctor Manuel...............................................................................45
Morales García, Yolanda Elizabeth........................................................................67
Morales R., Luis.....................................................................................................13
Muñoz Rojas, Jesús................................................................................................67
Ortiz Ortiz, Martín ...............................................................................................233
Pequeño Ledezma, Miguel.....................................................................................45
Pérez Vázquez, Arturo............................................................................................25
Pérez y Terrrón, Rocío............................................................................................67
Quintero Hernández, Verónica...............................................................................67
Ramírez Camacho, Mario Alberto........................................................................113
Ramírez Mora, Emilio Leonardo .........................................................................165
Reyes R., Ranulfo ..............................................................................................3, 13
Índice de autores

Reyes, Manuel A......................................................................................................3
Rivera Urbalejo, América Paulina..........................................................................67
Rujano Silva, Martha Leticia ...............................................................................165
Sánchez Amador, José Luis..................................................................................149
Sánchez Castillo, Laura..........................................................................................45
Sánchez Díaz, Silvia.............................................................................................165
Sánchez Gómez, Rubén .......................................................................................165
Sánchez Ramos, Miguel Ángel............................................................................209
Torres Romero, Julio Cesar..................................................................................113
Villalobos D., MiguelA. ........................................................................................13
Índice de autores

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194416216
ISBN 194416216-X
Instituciones de Educación Superior
La labor investigadora e innovadora en México
Este libro contiene una selección de artículos producto de la labor
investigadora de diversos autores que en su gran mayoría están adscritos
a Instituciones Mexicanas, algunas de ellas Instituciones Educativas.
Representa un esfuerzo de todos los involucrados para difundir trabajos
de investigación entre todos los interesados de una forma gratuita,
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