ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ СВОЙСТВ УРСОЛОВОЙ КИСЛОТЫ И ЕЕ ПРОИЗВОДНЫХ IN VITRO

Full text

Якушин А. С., Чересиз С. В., Шварц Я. Ш., Шульц Э. Э., Покровский А. Г. Исследование противовоспалительных
свойств урсоловой кислоты и ее производных in vitro // Вестн. Новосиб. гос. ун-та. Серия: Биология, клиническая
медицина. 2015. Т. 13, вып. 4. С. 13–18.
ISSN 1818-7943. ¬ÂÒÚÌËÍ Õ√”. –Âрˡ: ¡ËÓÎӄˡ, ÍÎËÌ˘ÂÒ͇ˇ ωˈË̇. 2015. “ÓÏ 13, ‚˚ÔÛÒÍ 4
© ¿. –. flÍÛ¯ËÌ, –. ¬. ◊ÂрÂÒËÁ, fl. ÿ. ÿ‚‡рˆ, ›. ›. ÿÛθˆ, ¿. √. œÓÍрÓ‚ÒÍËÈ, 2015
УДК 612.322
А. С. Якушин 1, С. В. Чересиз 1, Я. Ш. Шварц 2
Э. Э. Шульц 3, А. Г. Покровский 1
1 Новосибирский государственный университет
ул. Пирогова, 2, Новосибирск, 630090, Россия
2 Институт терапии и профилактической медицины
ул. Бориса Богаткова, 175/1, Новосибирск, 630089, Россия
3 Новосибирский институт органической химии им. Н. Н. Ворожцова СО РАН
пр. Акад. Лаврентьева, 9, Новосибирск, 630090, Россия
a.yakuschin@gmail.com
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ СВОЙСТВ
УРСОЛОВОЙ КИСЛОТЫ И ЕЕ ПРОИЗВОДНЫХ IN VITRO
Исследованы противовоспалительные свойства урсоловой кислоты и ее производных, изучено их влияние
на продукцию оксида азота и экспрессию генов провоспалительных и противовоспалительных цитокинов при
ЛПС-индуцированном воспалительном ответе макрофагов. Противовоспалительные свойства производных урсоло-
вой кислоты, проявляющиеся в уменьшении количества синтезируемого оксида азота ЛПС-стимулированными мы-
шиными макрофагами, сравнимы по эффективности с дексаметазоном в концентрации 10 μM. Обнаружены уни-
кальные производные урсоловой кислоты SP-16, SP-2, которые оказались эффективнее урсоловой кислоты в
подавлении продукции оксида азота при ЛПС-индуцированной воспалительной реакции макрофагов (р < 0,05). Про-
изводные SP-16 и SP-2 подавляли экспрессию про- и противовоспалительных цитокинов. Соединение SP-2 изменяло
соотношение экспрессии TNF-α к IL-10 в сторону преобладания противовоспалительной активности.
Ключевые слова: урсоловая кислота, производные, противовоспалительные, оксид азота.
Основными препаратами противовоспа-
лительной терапии являются нестероидные
и стероидные средства. В связи с недостат-
ками существующих противовоспалитель-
ных препаратов постоянно разрабатываются
и исследуются новые соединения, способ-
ные подавлять воспалительную реакцию.
Одними из перспективных биологически
активных соединений признаны соединения
из группы высших терпеноидов на основе
урсоловой кислоты, которые, по данным
литературы, ингибируют один из основных
внутриклеточных механизмов развития вос-
палительного ответа – ядерный фактор
NF-kB [1]. Подавление внутриклеточных
механизмов развития воспаления имеет ряд
преимуществ по сравнению с другими мето-
дами. Нестероидные противовоспалительные
средства являются ингибиторами ферментов
циклооксигеназ. Они воздействуют лишь на
один из конечных этапов воспалительной
реакции, а ингибиторы ядерных факторов –
на механизм, запускающий воспаление.
Стероидные лекарственные средства обла-
дают не только противовоспалительной ак-
тивностью, но и многими другими биологи-
ческими свойствами. Это обуславливает их
побочные действия, а соединения группы
высших терпеноидов способны компен-
сировать явление синдрома «отмены» при
прекращении приема глюкокортикостерои-
дов [2].
Развивающимся направлением противо-
воспалительных средств на данный момент
являются моноклональные антитела к сиг-
нальным молекулам воспаления − цитоки-

ŒрË„Ë̇θÌ˚ ËÒÒΉӂ‡Ìˡ
14
нам и хемокинам. Однако известно, что до
35 % пациентов прекращают применение
блокаторов TNF-α в течение первого года.
Причины связывают с отсутствием ответа
на проводимое лечение, снижением эффек-
тивности действия, развитием побочных
эффектов [3]. Данный факт является зако-
номерным, ведь кроме TNF-α еще более ста
цитокинов и хемокинов участвует в воспа-
лительном каскаде [4]. Использование ин-
гибиторов ядерных факторов является более
целесообразным способом подавления вос-
паления, так как внутриклеточные меха-
низмы активации воспалительной реакции
являются универсальными для различных
сигнальных молекул воспаления [5; 6].
Химические свойства урсоловой кислоты
и ее производных представляют практиче-
ский интерес для создания новых противо-
воспалительных препаратов [7]. С помощью
химических трансформаций и модифика-
ций урсоловой кислоты ведется поиск со-
единений, для которых предполагается на-
личие оптимальных противовоспалительных
свойств.
Цель исследования – изучить противо-
воспалительные свойства урсоловой кисло-
ты и ее производных in vitro.
Материал и методы
Исследовали 26 соединений: урсоловая
кислота, а также ее производные с заме-
щением в различных положениях R, R1,
R2, полученные в лаборатории медицин-
ской химии Института органической химии
СО РАН. Соединения растворяли в ДМСО
в соотношении 1мг в 1мл, хранили при тем-
пературе –20 °С.
Макрофагальные клеточные линии мыши
ANA-1, J774 культивировали в среде DMEM,
содержащей 10 % сыворотки крови эмбрио-
нов крупного рогатого скота, 2 ммоль/л
L-глютамина, 80 мкг/мл гентамицина, при
температуре 37 °С во влажной атмосфере, со-
держащей CO2 (в CO2-инкубаторе).
Первичные мышиные перитонеальные
макрофаги получены методом индукции
асептического перитонита у мышей путем
введения в брюшную полость раствора
крахмала. Использовались в работе через
24 ч после выделения их из пассажа брюшной
полости. Отмытые на третий день, культиви-
руемые в таких же условиях, что и ANA-1
и J774.
Наиболее распространенной и легко вос-
производимой фармакологической моделью
для исследования противовоспалительных
свойств соединений является изучение их
влияния на продукцию оксида азота ЛПС-сти-
мулированными макрофагами мыши, потому
что NO представляет собой непосредственный
продукт макрофагов в ответ на ЛПС-стимуля-
цию [8]. Известно, что макрофаги мыши, а не
человека продуцируют достаточное для изу-
чения количество оксида азота [9]. Оценка
продукции оксида азота ЛПС-стимулирован-
ными макрофагами осуществлялась колори-
метрическим методом с помощью реактива
Грисса.
К первичным перитонеальным макрофа-
гам мыши и перевиваемым макрофагам мы-
ши линий ANA-1, J774 добавляли 10 мкг/мл
ЛПС Е. coli («Sigma», США). Затем клетки
культивировали в течение 48 ч. По оконча-
нии инкубационную среду собирали, замо-
раживали при –20 °С и хранили несколько
суток. Продукцию оксида азота оценивали
по аккумуляции нитритов в культуральной
среде колориметрическим методом с помо-
щью реактива Грисса, который готовили как
смесь равных объемов 1 % сульфаниламида
(«Sigma») в 30 %-й уксусной кислоте и 0,1 %
N-[нафтил]-этилендиаминдигидрохлорида
(«Sigma») в 60 %-й уксусной кислоте. Аликво-
ты культуральных супернатантов в коли-
честве по 50 мкл смешивали с равным количе-
ством реагента в 96-луночных плоскодонных
микропланшетах, инкубировали в темноте
при комнатной температуре 10 мин и да-
лее с помощью микропланшетного фото-
метра TECAN Sunrise при длине волны
570 нм измеряли светопоглощение. Кон-
тролем служила такая же культуральная
среда, инкубированная в отсутствие кле-
ток. Концентрацию нитритов подсчиты-
вали, используя в качестве стандартной
калибровочной кривой последовательные
разведения 1 мМ раствора нитрита натрия
в культуральной среде. Определения про-
водились в трипликатах в трех независи-
мых экспериментах.
В данной фармакологической модели воз-
никла необходимость выбора наиболее под-
ходящей макрофагальной клеточной линии.
В связи с этим оценивалась способность
макрофагов перевиваемых клеточных линий
мыши ANA-1, J774 и первичных перитоне-
альных макрофагов мыши продуцировать
оксид азота и также уменьшать продукцию

flÍÛ¯ËÌ ¿.–. Ë ‰р.
»ÒÒΉӂ‡ÌË ҂ÓÈÒÚ‚ ÛрÒÓÎÓ‚ÓÈ ÍËÒÎÓÚ˚
15
этого соединения в ответ на добавление про-
тивовоспалительного стероидного препарата –
дексаметазон.
Наибольшее количество оксида азота в
ответ на ЛПС-стимуляцию вырабатывали
макрофаги перевиваемой линии ANA-1 по
сравнению с первичными перитонеальны-
ми мышиными макрофагами и макрофагами
перевиваемой линии J774 (p < 0,05). Досто-
верных отличий в синтезе оксида азота меж-
ду первичными перитонеальными мышиными
макрофагами и макрофагами перевиваемой
линии J774 не выявлено. При изучении
уровня продукции оксида азота ЛПС-стиму-
лированными макрофагами, инкубированны-
ми с дексаметазоном, выяснилось, что силь-
нее всего этот гормон ингибировал синтез
оксида азота в ЛПС-стимулированных мак-
рофагах линии ANA-1 по сравнению с пер-
вичными перитонеальными макрофагами,
макрофагами линии J774 (p < 0,05). Полу-
ченные данные свидетельствовали в пользу
того, что эффективнее всего изучать влия-
ние урсоловой кислоты и ее производных на
макрофагах перевиваемой клеточной линии
мыши ANA-1.
Действие веществ, проявивших наиболь-
шую активность в данной фармакологиче-
ской модели, в дальнейшем исследовалось с
помощью метода ОТ-ПЦР.
Выделение суммарной мРНК из клеток осу-
ществляли с помощью набора RNeasyMiniKit
(«Qiagen») согласно рекомендациям произ-
водителя. Качество выделенной мРНК оце-
нивали по наличию бэндоврибосомальной
РНК при электрофорезе в 1 % агарозном
геле. Для определения количества выделен-
ной суммарной РНК измеряли концентра-
цию РНК в растворе на спектрофотометре
Implen в объеме раствора 1 мкл. Синтезирова-
ли кДНК из 2 мкг суммарной РНК с исполь-
зованием набора для обратной транскрипции
M-MuLVRH («БиолабМикс», Россия) в
соответствии с протоколом производителя.
В качестве затравки в реакции обратной
транскрипции применяли гексануклеотидные
случайные праймеры.
Полимеразная цепная реакция в режиме
реального времени проводилась на прибо-
ре CFX 96™ Real-Time PCR DetectionSystems
(«Bio-Rad») с использованием интерка-
лирующего флуоресцентного красителя
SYBR Green из набора qPCRMix SYBR (2×)
(«БиолабМикс», Россия) согласно реко-
мендациям производителя. Для амплифи-
кации применялись праймеры, представлен-
ные в таблице.
В качестве эндогенного внутреннего
контроля выбран ген домашнего хозяйства
GAPDH. Реакцию амплификации для всех
генов проводили в следующих условиях:
предварительная денатурация при 95 °C –
5 мин, далее 45 циклов при 95 °C – 15 с, да-
лее при 60 °C – 20 с, далее при 72 °C – 30 с,
далее при 80 °C – 20 с. По окончании осу-
ществлялась детекция уровня флюорес-
ценции.
Все эксперименты проводились в трой-
ных независимых повторах, полученные
средние значения данных использовались для
определения кратности изменения экспрессии
про- и противовоспалительных генов.
Статистическую обработку полученных
данных проводили с помощью электрон-
ных таблиц программы Microsoft Exсel.
Для оценки достоверности отличий (р)
использовали t-критерий Стьюдента. Дос-
товерными считали отличия при р < 0,05.
Нуклеотидная последовательность праймеров для ОТ-ПЦР
Праймеры
Цитокин
прямые обратные
TNF-α 5′-CAAATGGCCTCCCTCTCAT-3′ 5′-GGTTGTCTTTGAGATCCATGC-3′
IL-1 5′-GGGCCTCAAAGGAAAGAATC-3′ 5′-TACCAGTTGGGGAACTCTGC-3′
IL-10 5′-ATCGATTTCTCCCCTGTGAA-3′ 5′-CACACTGCAGGTGTTTTAGCTT-3′
GAPDH 5'-TGACCACAGTCCATGCCATC-3' 5'-GACGGACACATTGGGGGTAG-3'

ŒрË„Ë̇θÌ˚ ËÒÒΉӂ‡Ìˡ
16
Результаты исследования
и обсуждение
Мы провели оценку противовоспали-
тельных свойств урсоловой кислоты и ее
производных методом оценки продукции
оксида азота ЛПС-стимулированными мак-
рофагами колориметрическим методом с
помощью реактива Грисса. Продемонстри-
рована способность урсоловой кислоты и ее
активных производных в зависимости от
концентрации подавлять синтез оксида азо-
та ЛПС-стимулированными макрофагами
(рис. 1).
Макрофаги ANA-1 показали разную сте-
пень чувствительности к действию урсоло-
вой кислоты и ее производных. Изучаемая
кислота достоверно снижала количество
продуцируемого оксида азота до 62,1 %
при концентрации 1 μM, на 47,2 % – при
концентрации 10 μM и на 24,0 % – при кон-
центрации 100 μM (p < 0,05). Наибольшую
эффективность проявили производные ур-
соловой кислоты под шифрами SP-2, SP-16
и SP-23. Наиболее активные соединения
(SP-2, SP-16) в концентрации 1 μM прояв-
ляли такую же активность, что и сама ур-
соловая кислота в концентрации 100 μM
(p < 0,05).
Следующим этапом исследовано влияние
соединений SP-2 и SP-16 на экспрессию
про- и противовоспалительных цитокинов в
модели ЛПС-стимулированных макрофагов.
Данные представлены на рис. 2.
Экспрессия провоспалительного цитоки-
на TNF-α в ЛПС-стимулированных макро-
фагах, культивированных с производными
урсоловой кислоты SP-16 и SP-2, умень-
шалась в 2,5 и 2,2 раза соответственно
по сравнению с макрофагами, культи-
вированными только с ЛПС (p < 0,05).
Экспрессия провоспалительного цитокина
IL-1 в ЛПС-стимулированных макрофагах,
культивированных с SP-16 и SP-2, снижа-
лась в 14,5 и 7,2 раза соответственно по
сравнению с макрофагами, культивирован-
ными только с ЛПС (p < 0,05). Уровень экс-
прессии противовоспалительного цитокина
IL-10 также снижался в ЛПС-стимулиро-
ванных макрофагах, культивированных с
соединениями SP-16 и SP-2, в 3,4 и 1,6 раза
соответственно по сравнению с макрофа-
гами культивированными только с ЛПС
(p < 0,05).
100
62
74
53 51
47
42
37
26
21
5
47 49
46
32 32
26
29
19
12
24
38 39
11
17
8877
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Продукция NO, % от ЛПС-ко нтр оля
1 μM10 μM100 μM
Рис. 1. Продукция оксида азота ЛПС-стимулированными макрофагами линии ANA-1, % от ЛПС-контроля

flÍÛ¯ËÌ ¿.–. Ë ‰р.
»ÒÒΉӂ‡ÌË ҂ÓÈÒÚ‚ ÛрÒÓÎÓ‚ÓÈ ÍËÒÎÓÚ˚
17
1,0
4,2
1,6
1,9
1,0
3,4
1,0
2,1
1,0
2,9
0,2
0,4
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
Конт рол ь ЛПС SP-16 SP-2
Относительный уровень
экспрессии генов
TNF-α
IL-10
IL-1
Рис. 2. Уровень экспрессии противо- и провоспалительных цитокинов ЛПС-стимулированными
макрофагами линии ANA-1, культивированными с соединениями SP-16 и SP-2 относительно
контроля (без ЛПС), выровненными по экспрессии гена домашнего хозяйства GAPDH
Факт снижения экспрессии противовос-
палительного цитокина IL-10 может объяс-
няться тем, что производные урсоловой ки-
слоты подавляют воспалительную реакцию
не путем усиления противовоспалительных
механизмов, а ингибированием всей воспа-
лительной реакции, включающей как про-
воспалительный, так и следующий за ним
противовоспалительный каскады.
Для того чтобы оценить влияние произ-
водных урсоловой кислоты на про- или про-
тивовоспалительную направленность ответа
макрофагов, рассчитано соотношение TNF-α
к IL-10. В пробе, содержащей только ЛПС
без добавления производных, данное соотно-
шение равнялось 1,2. Для соединений SP-16 и
SP-2 изучаемое соотношение составило 1,6
и 0,9 соответственно. Производное урсоло-
вой кислоты SP-16 уменьшает экспрессию
цитокинов TNF-α, IL-1 и IL-10 в несколько
раз, но соотношение TNF-α / IL-10 уве-
личивалось по сравнению с показателем
ЛПС-стимулированных макрофагов. Произ-
водное урсоловой кислоты SP-2 уменьшало
экспрессию цитокинов TNF-α, IL-1 и IL-10
в несколько раз. Если соотношение TNF-α /
IL-10 меньше единицы, то это свидетельст-
вует о преобладании противовоспалительной
реакции макрофагов. Сопоставляя данные о
влиянии урсоловой кислоты и ее производ-
ных на экспрессию цитокинов и продукцию
оксида азота, можно предположить, что про-
изводное урсоловой кислоты SP-2 проявляет
наибольшую противовоспалительную актив-
ность по сравнению с самой кислотой и ос-
тальными производными.

ŒрË„Ë̇θÌ˚ ËÒÒΉӂ‡Ìˡ
18
Заключение
Обнаружены новые производные урсо-
ловой кислоты SP-16, SP-2, которые оказа-
лись достоверно эффективнее урсоловой
кислоты и других производных в подавлении
продукции оксида азота при ЛПС-индуциро-
ванной воспалительной реакции макрофагов.
Данные соединения также подавляют экс-
прессию про- и противовоспалительных ци-
токинов в модели ЛПС-стимулированных
макрофагов. Наибольшей противовоспали-
тельной активностью обладает производное
урсоловой кислоты SP-2. Данное соединение
в модели ЛПС-стимулированных макрофагов
продемонстрировало снижение продукции
оксида азота, подавление экспрессии про- и
противовоспалительных цитокинов, измене-
ние соотношения экспрессии TNF-α / IL-10 в
сторону преобладания противовоспалитель-
ной активности.
Список литературы
1. McInnes I. B., Schett G. The pathogenesis
of rheumatoid arthritis // New Engl. J. 2012.
Vol. 365. Р. 2205–2219.
2. Seavey M. M., Dobrzanski P. The many
faces of Janus kinase // Biochem. Pharmacol.
2012. Vol. 83, № 9. Р. 1136–1145.
3. Wang C. Y., Kao T. C., Lo W. H., Yen G. C.
Glycyrrhizic acid and 18β-glycyrrhetinic acid
modulate lipopolysaccharide-induced inflam-
matory response by suppression of NF-κB
through PI3K p110δ and p110γ inhibitions //
J. Agric. Food Chem. 2011. Vol. 59, № 14.
Р. 7726–7733.
4. Chun J., Lee C., Hwang S. W., Im J. P.,
Kim J. S. Ursolic acid inhibits nuclear factor-κB
signaling in intestinal epithelial cells and macro-
phages, and attenuates experimental colitis in
mice // Life Science. 2014. Vol. 110, № 1.
Р. 23–34.
5. Толстиков Г. А., Балтина Л. А.,
Шульц Э. Э., Покровский А. Г. Глицирризи-
новая кислота // Биоорганическая химия.
1997. №9. С.691–709.
6. Blom M., Kievit W., Fransen J., Kuper I. H.,
Broeder A. A. den, Gendt C. M. de, Jansen T. L.,
Brus H. L., Laar M. A. van de, Riel P. L. van. The
reason for discontinuation of the first tumor
necrosis factor (TNF) blocking agent does not
influence the effect of a second TNF blocking
agent in patients with rheumatoid arthritis //
J. Rheumatol. 2009. Vol. 36. Р. 2171–2177.
7. Bonilla-Hernán M. G., Miranda-Carús M. E.,
Martin-Mola E. New drugs beyond biologics in
rheumatoid arthritis: the kinase inhibitors //
Rheumatology. 2011. Vol. 50, № 9. Р. 1542–
1550.
8. Fu L., Lin Q. X., Liby K. T., Sporn M. B.,
Gribble G. W. An efficient synthesis of methyl
2-cyano-3,12-dioxoursol-1,9-dien-28-oate
(CDDU-methyl ester): analogues, biological
activities, and comparison with oleanolic acid
derivatives // Org. Biomol. Chem. 2014.
Vol. 12. Р. 5192–5200.
9. Whittle B. J. R. Role of iNOS in Gut
Inflammation and Injury // Drug News Perspect.
1999. Vol. 12, № 3. Р. 157.
Материал поступил в редколлегию 10.10.2015
A. S. Yakushin, S. V. Cheresiz, I. Sh. Shwartz, E. E. Shults, A. G. Pokrovskij
RESEARCH OF ANTI-INFLAMMATORY PROPERTIES
OF URSOLIC ACID AND ITS DERIVATIVES IN VITRO
Were studied anti-inflammatory properties of ursolic acid and its derivatives, their effect on nitric oxide production
and gene expression of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokines in LPS-induced inflammatory response of
macrophages. Anti-inflammatory properties of derivatives of ursolic acid, is a decrease in the amount of synthesized nitric
oxide in LPS-stimulated murine macrophages, are comparable in efficiency with dexamethasone 10 μM (p > 0,05). Found
unique ursolic acid derivatives of SP-16, SP2, which proved effective in suppressing ursolic acid nitric oxide production
in LPS-induced inflammatory response of macrophages (p < 0,05). The SP-16 and SP-2 inhibited the expression of pro-
and anti-inflammatory cytokines (p < 0,05). The SP2 changes the ratio of expression TNF to IL-10 in the prevalence of
the anti-inflammatory activity.
Keywords: ursolic acid, derivatives, anti-inflammatory, nitric oxide.