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Contribuição para a utilização de fungos micorrízicos como protecção contra Phytophthora cinnamomi em espécies lenhosas

Authors:
  • Research Institute for Medicines (iMed.ULisboa)

Abstract and Figures

Este trabalho insere-se no capítulo da prevenção contra a acção de Phytophthora cinnamomi e para tal foram realizados testes de confronto entre diferentes fungos micorrízicos e o oomiceta, para desde logo apurar quais as estirpes mais antagónicas e úteis para melhorar a resistência das plantas ao ataque deste agente patogénico. Foi também estudado o efeito do exsudado produzido pelas estirpes de Pisolithus tinctorius, relativamente ao seu efeito contra Phytophthora cinnamomi. Para além disso, observaram-se micorrizas naturais de sobreiro e estabeleceram-se outras micorrizas em laboratório com Cistus ladanifer e Xolantha guttata, tendo também se desenvolvido um protocolo de produção de inóculo fúngico, o qual foi utilizado para inoculação de plantas de sobreiro em viveiro. Após todo o trabalho de microbiologia, recorreu-se à biologia molecular em que, para grande parte das estirpes utilizadas, foi extraído DNA, realizado PCR e electroforese e seguido o protocolo de purificação de DNA, para serem sequenciadas as amostras. Por fim, analisaram-se as sequências obtidas uma a uma para confirmação da respectiva espécie.
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Instituto Politécnico de Coimbra
Escola Superior Agrária de Coimbra
Licenciatura em Biotecnologia
Relatório de Estágio
Contribuição para a utilização de fungos
micorrízicos como protecção contra
Phytophthora
cinnamomi
em espécies lenhosas
Local de Estágio: Instituto Nacional de Recursos Biológicos, I.P. (INRB)
Trabalho elaborado por: Gonçalo Filipe Rodrigues Garcia
Orientador interno: Filomena Gomes
Orientador externo: Helena Machado
Coimbra, 14 de Novembro de 2011
Jeremias W. Jenks
"A entrada para a mente do homem é o que ele aprende, a saída é o que ele realiza. Se a sua
mente não for alimentada continuamente por novas ideias, que ele põe a trabalhar com um
propósito, e se não houver uma saída por uma acção, essa mente torna-se estagnada. Tal
mente é um perigo para o indivíduo que a possua e inútil para a comunidade."
iii
ÍNDICE
LISTA DE FIGURAS ......................................................................................................................................... IV
LISTA DE TABELAS ........................................................................................................................................ VI
LISTA DE GRÁFICOS .................................................................................................................................... VII
AGRADECIMENTOS ....................................................................................................................................VIII
1 RESUMO ........................................................................................................................................ 1
1.1 ABSTRACT ........................................................................................................................................ 2
2 INTRODUÇÃO .............................................................................................................................. 3
2.1 CONTEXTUALIZAÇÃO DO TRABALHO ................................................................................................ 3
2.2 PHYTOPHTHORA CINNAMOMI ............................................................................................................ 3
2.2.1 Caracterização taxonómica ........................................................................................................ 3
2.2.2 Ciclo de vida ............................................................................................................................... 4
2.2.3 Patogenicidade ............................................................................................................................ 5
2.2.4 Principais focos de contaminação .............................................................................................. 5
2.2.5 Prevenção.................................................................................................................................... 5
2.3 FUNGOS MICORRÍZICOS ..................................................................................................................... 6
2.4 FUNGOS SAPRÓBIOS ........................................................................................................................ 12
2.5 TESTES DE CONFRONTO .................................................................................................................. 12
2.5.1 Com tempos de inoculação distintos ......................................................................................... 13
2.5.2 Com tempos de inoculação simultâneos ................................................................................... 14
2.6 ENSAIOS COM EXSUDADO DE PISOLITHUS TINCTORIUS ..................................................................... 14
2.7 ENSAIOS DE MICORRIZAÇÃO IN VITRO COM XOLANTHA GUTTATTA E CISTUS LADANIFER ................... 15
2.7.1 Xolantha guttata ........................................................................................................................ 15
2.7.2 Cistus ladanifer ......................................................................................................................... 16
2.8 INOCULAÇÕES IN VIVO NA ESTUFA ................................................................................................... 16
2.8.1 Sobreiro (Quercus suber) .......................................................................................................... 16
2.8.2 Produção de inóculo e inoculação ............................................................................................ 17
2.8.3 Recolha, observação e análise de micorrizas ........................................................................... 17
2.9 A TÉCNICA DE PCR E SEQUENCIAÇÃO ............................................................................................ 18
2.10 OBJECTIVOS .................................................................................................................................... 19
3 MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................................... 20
3.1 LISTA DE MATERIAL ........................................................................................................................ 20
3.2 CORRESPONDÊNCIA ENTRE OS CÓDIGOS DA ESTIRPE, A ESPÉCIE, ANO DE ISOLAMENTO, HOSPEDEIRO
E LOCAL………………………………………………………………………………………………………...20
3.3 ESTABELECIMENTO DAS CULTURAS IN VITRO .................................................................................. 21
3.3.1 Tipos de meio de cultura usados no desenvolvimento das culturas .......................................... 21
3.4 TESTES DE CONFRONTO .................................................................................................................. 22
3.5 PREPARAÇÃO DOS BALÕES ERLENMEYER EM AGITAÇÃO E INOCULAÇÕES IN VIVO .......................... 23
3.6 ENSAIOS COM EXSUDADO DE PISOLITHUS TINCTORIUS ..................................................................... 25
3.7 ENSAIO DA MICORRIZAÇÃO EM CISTUS LADANIFER E XOLANTHA GUTTATTA ................................. 26
3.7.1 Desenvolvimento do protocolo de germinação para Cistus ladanifer e Xolantha guttatta ...... 26
3.8 EXTRACÇÃO E OBSERVAÇÃO DE MICORRIZAS DE SOBREIRO (QUERCUS SUBER) ............................. 30
3.9 EXTRACÇÃO DE DNA ..................................................................................................................... 31
3.10 PCR E OPTIMIZAÇÃO DAS SUAS CONDIÇÕES .................................................................................... 33
3.11 ELECTROFORESE EM GEL DE AGAROSE............................................................................................ 34
3.12 PURIFICAÇÃO DE DNA ................................................................................................................... 34
3.13 SEQUENCIAÇÃO .............................................................................................................................. 35
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................................. 36
4.1 TESTES DE CONFRONTO .................................................................................................................. 36
4.1.1 - Com tempos de inoculação distintos ....................................................................................... 36
4.1.2 - Com tempos de inoculação simultâneos ................................................................................. 53
4.2 INOCULAÇÕES EM CISTUS LADANIFER E XOLANTHA GUTTATA ........................................................... 57
4.3 TESTES COM EXSUDADO DE PT14HS .............................................................................................. 58
iv
4.4 INOCULAÇÕES IN VIVO ..................................................................................................................... 59
4.5 SEQUENCIAÇÃO E ANÁLISE DE DADOS ............................................................................................ 59
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................................................................... 61
6 BIBLIOGRAFIA .......................................................................................................................... 62
7 ANEXOS ....................................................................................................................................... 64
7.1 CONSTITUIÇÃO DO MEIO MMN ...................................................................................................... 64
7.2 CONSTITUIÇÃO DO MEIO BAF ......................................................................................................... 64
7.3 CONSTITUIÇÃO DO MEIO ODDOUX (1957) .................................................................................... 65
7.4 CONSTITUIÇÃO DO MEIO PDA ........................................................................................................ 65
7.5 CONSTITUIÇÃO DO MEIO MS ........................................................................................................... 66
7.6 DADOS ESTATÍSTICOS DOS TESTES DE CONFRONTO ......................................................................... 67
7.7 FOTOGRAFIAS CAPTURADAS AO MICROSCÓPIO DOS TESTES DE CONFRONTO E DE EXSUDADO ......... 75
7.8 FOTOGRAFIAS CAPTURADAS À LUPA E AO MICROSCÓPIO DAS MICORRIZAS EM CISTUS LADANIFER E
XOLANTHA GUTTATA ........................................................................................................................................... 78
7.9 LISTA DE MATERIAL UTILIZADO ...................................................................................................... 80
Lista de Figuras
Figura 1 Ciclo de Vida da Phytophthora cinnamomi .............................................................................................................. 4
Figura 2 estruturas típicas de basidiomicetes segundo Ernst Haeckel..................................................................................... 6
Figura 3 Corte vertical numa frutificação (cogumelo) de Pisolithus tinctorius no qual vemos umas estruturas redondas
muito características deste organismo e que vão mudando de cor desde a base até ao topo indicando por ordem crescente as
diferentes fases de maturação dos esporos ................................................................................................................................. 7
Figura 4 Cogumelo de Boletus aereus .................................................................................................................................... 8
Figura 5 Vários planos do cogumelo de cortinarius variicolor, sendo o de baixo um corte longitudinal ................................. 8
Figura 6 Cogumelo de Paxillus involutus ............................................................................................................................... 9
Figura 7 Cogumelo de Lactarius acerrimus ........................................................................................................................... 9
Figura 8 - Cogumelos de Amanita ponderosa .......................................................................................................................... 10
Figura 9 - Cogumelo de Xerocomus subtomentosus ................................................................................................................ 10
Figura 10 - Cogumelo de Scleroderma cepa ............................................................................................................................ 11
Figura 11 - Russula virescens .................................................................................................................................................. 11
Figura 12 - Cogumelos de Macrolepiota procera .................................................................................................................... 12
Figura 13 - Xolantha guttata .................................................................................................................................................... 15
Figura 14 - Cistus ladanifer ..................................................................................................................................................... 16
Figura 15 Planície típica com povoamento de Sobreiro (Quercus suber) ............................................................................. 16
Figura 16 Esquema do traçado da caixa de Petri para os testes de confronto. A vermelho estão os dois locais onde se
efectuam as inoculações e estão, tal como os dois riscos horizontais, a 3 cm’s um do outro e a 1,5 cm’s do centro da caixa. 22
Figura 17 - Balões inoculados com material biológico proveniente das respectivas placas ..................................................... 23
Figura 18 - Balões com inóculo em agitação ........................................................................................................................... 23
Figura 19 - Filtragem do conteúdo dos balões ......................................................................................................................... 24
Figura 20 - Conteúdo filtrado (PT14HS) ................................................................................................................................. 24
Figura 21 - Inoculação de 30mL da solução em cada um dos contentores do sobreiro ............................................................ 25
Figura 22 - Esquema do traçado da caixa de Petri para os ensaios com exsudado de Pisolithus tinctorius. A vermelho está o
local onde se efectua a inoculação que corresponde ao centro da caixa. .................................................................................. 26
Figura 23 - Sementes dentro dos seus filtros na solução de hipoclorito de cálcio com agitação .............................................. 27
Figura 24 - Sementes desinfectadas de Xolantha guttatta (à esquerda) e de Cistus ladanifer (à direita) ................................. 27
Figura 25 - estufa climatizada com as plantas .......................................................................................................................... 27
Figura 26 - Cistus ladanifer (à esquerda) e Xolantha guttata (à direita) a germinarem sete dias depois de irem para o meio
gelosado ................................................................................................................................................................................... 28
v
Figura 27 - Caixas de micropropagação com vermiculite e turfa (10/1) + 50mLBAF. Xolantha guttata (à esquerda) e Cistus
ladanifer (à direita) .................................................................................................................................................................. 28
Figura 28 - Caixas de micropropagação com meio MS. Xolanthas guttata (à esquerda) e Cistus ladanifer (à direita) ........... 28
Figura 29 À esquerda uma caixa de micropropagação em que se pode ver a forma como o inóculo foi colocado junto à raiz
das quatro plantas e à direita um grande plano de uma planta e o seu inóculo em que já vemos a raiz a penetrar o agar onde
está o fungo. ............................................................................................................................................................................. 30
Figura 30 - Raízes curtas vistas à lupa com ausência de pêlos radiculares e presença de micélio em redor das estruturas
vegetais - uma prova concreta da presença de micorrizas. ....................................................................................................... 30
Figura 31 - Captura em microscópio de uma micorriza. Preparação feita por esmagamento................................................... 31
Figura 32 - Esquema da purificação de DNA .......................................................................................................................... 34
Figura 33 - Sucessão do desenrolar dos acontecimentos nas placas de confronto desfasado de .............................................. 38
Figura 34 - Phytophthora cinnamomi com cristais do exsudado de Pisolithus tinctorius e com a sua morfologia ligeiramente
alterada. Foto tirada por microscopia a 400X na zona de confronto da placa. ......................................................................... 38
Figura 35 - Desenrolar dos acontecimentos nas placas de confronto desfasado de PH025 vs PH1160. Em 1º está o período
após inoculação de PT005 e a sua libertação de exsudado; 2º está a fase inicial da inoculação de PH1160; 3º Uma fase mais
avançada do confronto, em que o PT005 já está a colonizar espaços que já tinham PH1160, atingindo o seu núcleo de
inoculação. ............................................................................................................................................................................... 40
Figura 36 Imagem do eixo de confrontação em que, estruturas semelhantes à assinalada pela bolinha azul são de PH1160
com cristais de exsudado absorvidos e estruturas assinaladas pelas bolinhas a vermelho são ansas anastomosas que nos
indicam a presença de basidiomicetas (que neste caso é o PT025). Ampliação com objectiva 40X. ....................................... 40
Figura 37 Deferentes fases nas placas de confronto desfasado de PH14HS vs PH1160. Na primeira imagem vemos a
PH1160 já com bastante área colonizada, enquanto PT14HS continua em crescimento lento. Na segunda imagem vemos que
a PH1160 estagnou o crescimento e com isso o PT14HS vai aos poucos colonizando espaços que já tinham PH116. ........... 42
Figura 38 Zona de confronto, na qual à direita vemos PH1160 com cristais de exsudado absorvidos e à esquerda uma
“nuvem” de hifas de PT14HS produzindo exsudado em massa. .............................................................................................. 42
Figura 39 Várias etapas no desenvolvimento do confronto de TN3 com PH1160. A primeira foto é TN3 uns dias após
inoculação, a segunda é numa altura em que PH1160 estava vigorosa e a colonizar toda a placa incluindo em redor do TN3 e
na terceira foto a TN3 continua a crescer lentamente em zonas já povoados por PH1160 mas sem grande eficácia já com a
PH1160 em declínio................................................................................................................................................................. 44
Figura 40 - Fotografia tirada em microscopia da zona do eixo de confronto. Ampliação com objectiva de 400X. ................. 44
Figura 41 - Aspecto de PH1160 na placa de confronto com TN3. ........................................................................................... 44
Figura 42 Evolução do confronto, na qual vemos claramente o PX001 estagnado e a PH1160 a colonizar toda a placa.
Vemos também muita presença de exsudado tanto no meio como por cima do fungo. ........................................................... 45
Figura 43 - Esta figura demonstra como a PH1160 estava vigorosa, com presença de muitos swelings. Como se pode ver, a
PH1160 não absorveu o exsudado do meio, ou se o fez não tingiu como nos confrontos com PT’s. Ampliação na objectiva
20X. ......................................................................................................................................................................................... 46
Figura 44 - Esta foto é da zona de confronto, na qual vemos um hifa do PX001 corada com o seu próprio exsudado e as
estruturas correspondentes a PH1160 continuma indiferentes. Ampliação na objectiva 40X. ................................................. 46
Figura 45 - Imagens do confronto entre BS163 e PH1160. Note-se que o crescimento de PH1160 em meio BAF não é
idêntico ao do meio PDA, sendo que neste meio BAF, a PH1160 tende a adoptar um aspecto mais felpudo e em relevo. ..... 48
Figura 46 Foto do eixo de confrontação, no qual vemos estruturas lisas e compridas relativas a BS163 e estruturas
ramificadas em swelings relativas a PH1160. Foto obtida com ampliação na objectiva 60X. ................................................. 48
Figura 47 Evolução do confronto entre BS142 e PH1160, no qual podemos observar que BS142 não se sente ameaçado
com a presença de PH1160 mas esta parece mostrar alguma inibição ao aproximar-se do fungo. .......................................... 50
Figura 48 - Fotografia tirada em microscopia do eixo de confrontação. Ampliação com objectiva de 20X ............................ 50
Figura 49 Evolução do confronto entre AP2 e PH1160 ........................................................................................................ 51
Figura 50 - Imagem capturada em microscopia com objectiva de 60X das hifas de AP2 com presença de septos. ................. 52
Figura 51 - Cistus ladanifer em vermiculite/turfa inoculada com M164 (Scleroderma cepa). Corte transversal na micorriza,
em que vemos hifas em redor e a entrar na raiz. Ampliação na objectiva de 40X ................................................................... 57
Figura 52 Arbúsculos em Xolantha guttata em meio MS inoculada com MU29 (Boletus aereus). Ampliação com objectiva
40X .......................................................................................................................................................................................... 57
Figura 53 - À esquerda uma placa de meio PDA convencional, e à direita uma placa com meio PDA alterado (em anexo 7.5)
contendo exsudado de PT14HS. Fotografias tiradas 8 dias após a inoculação de PH1160 em ambas as placas. ..................... 58
Figura 54 - À esquerda uma placa de meio MMN convencional com PH1160, e à direita uma placa com o meio MMN de
cultura de PT14HS contendo o seu exsudado. Fotografia tirada 6 dias após a inoculação de ambas as placas........................ 58
vi
Lista de Tabelas
Tabela 1 - Tabela com os organismos utilizados, o seu respectivo código, ano de isolamento, hospedeiro e local
de colheita ............................................................................................................................................................. 20
Tabela 2 - Estirpes e meios utilizados nos diversos testes de confronto ............................................................... 22
Tabela 3 - Inóculações dos diversos fungos consoante a planta em questão e o meio ......................................... 29
Tabela 4 - Estirpes utilizadas para extracção, PCR e sequenciação ..................................................................... 31
Tabela 5 - tabela dos reagentes, volumes e concentrações do master mix ............................................................ 33
Tabela 6 - Programa de PCR ................................................................................................................................ 33
vii
Lista de gráficos
Gráfico 1 Confrontação entre PT005 (azul) e PH1160 (vermelho) e com as respectivas testemunhas a verde e a
lilás respectivamente ............................................................................................................................................. 37
Gráfico 2 - Gráfico obtido do crescimento de PT005 vs PH1160 na placa, segundo o eixo de confronto XX de 3
centímetros entre cada núcleo de inoculação. ....................................................................................................... 37
Gráfico 3 - Confrontação entre PT025 (azul) e PH1160 (vermelho) e com as respectivas testemunhas a verde e a
lilás respectivamente ............................................................................................................................................. 39
Gráfico 4 - Gráfico obtido do crescimento de PT025 vs PH1160 na placa, segundo o eixo de confronto XX de 3
centímetros entre cada núcleo de inoculação. ....................................................................................................... 39
Gráfico 5 - Confrontação entre PT14HS (azul) e PH1160 (vermelho) e com as respectivas testemunhas a verde e
a lilás respectivamente .......................................................................................................................................... 41
Gráfico 6 - Gráfico obtido do crescimento de PT14HS vs PH1160 na placa, segundo o eixo de confronto XX de
3 centímetros entre cada núcleo de inoculação. .................................................................................................... 41
Gráfico 7 - Confrontação entre TN3 (azul) e PH1160 (vermelho) e com as respectivas testemunhas a verde e a
lilás respectivamente ............................................................................................................................................. 43
Gráfico 8 - Gráfico obtido do crescimento de TN3 vs PH1160 na placa, segundo o eixo de confronto XX de 3
centímetros entre cada núcleo de inoculação. ....................................................................................................... 43
Gráfico 9 - Confrontação entre PX001 (azul) e PH1160 (vermelho) e com as respectivas testemunhas a verde e a
lilás respectivamente ............................................................................................................................................. 45
Gráfico 10 - Gráfico obtido do crescimento de PX001 vs PH1160 na placa, segundo o eixo de confronto XX de
3 centímetros entre cada núcleo de inoculação. .................................................................................................... 46
Gráfico 11 - Confrontação entre BS163 (azul) e PH1160 (vermelho) e com as respectivas testemunhas a verde e
a lilás respectivamente .......................................................................................................................................... 47
Gráfico 12 - Gráfico obtido do crescimento de BS163 vs PH1160 na placa, segundo o eixo de confronto XX de
3 centímetros entre cada núcleo de inoculação. .................................................................................................... 47
Gráfico 13 - Confrontação entre BS142 (azul) e PH1160 (vermelho) e com as respectivas testemunhas a verde e
a lilás respectivamente .......................................................................................................................................... 49
Gráfico 14 - Gráfico obtido do crescimento de BS142 vs PH1160 na placa, segundo o eixo de confronto XX de
3 centímetros entre cada núcleo de inoculação. .................................................................................................... 50
Gráfico 15 - Confrontação entre AP2 (azul) e PH1160 (vermelho) e com a testemunha da PH1160 a verde. ..... 51
Gráfico 16 - Gráfico obtido do crescimento de AP2 vs PH1160 na placa, segundo o eixo de confronto XX de 3
centímetros entre cada núcleo de inoculação. ....................................................................................................... 52
Gráfico 17 Confrontação em simultâneo entre PT005 (azul) e PH1160 (vermelho) e respectivas testemunhas a
verde e a lilás respectivamente ............................................................................................................................. 53
Gráfico 18 - Gráfico obtido do crescimento de PT005 vs PH1160 na placa, segundo o eixo de confronto XX de
3 centímetros entre cada núcleo de inoculação. .................................................................................................... 53
Gráfico 19 - Confrontação em simultâneo entre PT025 (azul) e PH1160 (vermelho) e respectivas testemunhas a
verde e a lilás respectivamente ............................................................................................................................. 54
Gráfico 20 - Gráfico obtido do crescimento de PT025 vs PH1160 na placa, segundo o eixo de confronto XX de
3 centímetros entre cada núcleo de inoculação. .................................................................................................... 54
Gráfico 21 - Confrontação em simultâneo entre PT14HS (azul) e PH1160 (vermelho) e respectivas testemunhas
a verde e a lilás respectivamente........................................................................................................................... 55
Gráfico 22 - Gráfico obtido do crescimento de PT14HS vs PH1160 na placa, segundo o eixo de confronto XX
de 3 centímetros entre cada núcleo de inoculação. ............................................................................................... 55
Gráfico 23 - Confrontação iniciada em simultâneo entre TN3 (azul) e PH1160 (vermelho) e respectivas
testemunhas a verde e a lilás respectivamente ...................................................................................................... 56
Gráfico 24 - Gráfico obtido do crescimento de TN3 vs PH1160 na placa, segundo o eixo de confronto XX de 3
centímetros entre cada núcleo de inoculação. ....................................................................................................... 56
viii
Agradecimentos
Em primeiro lugar gostaria de agradecer aos meus pais e irmão pelo apoio que me
deram, mesmo estando eles à distância de um oceano. Queria também agradecer a atenção
prestada pela Doutora Helena Machado, que enquanto orientadora externa dedicou o seu
precioso tempo a transmitir um pouco do seu conhecimento, permitindo também que eu
pudesse desenvolver um raciocínio crítico quanto ao trabalho desenvolvido e projectado.
Queria também agradecer à minha orientadora interna, Professora Filomena Gomes pela sua
dedicação a esclarecer assuntos relativos ao estágio.
Deixo também um especial agradecimento ao professor Kiril Bahcevandziev pela ajuda e
esclarecimento de questões de caracter burocrático relacionadas com o estágio em si e o seu
modo de funcionamento.
Ainda gostaria de deixar o meu obrigado à Márcia Silva pela disponibilidade prestada na
parte relativa à biologia molecular. À Florinda Medeiros, a “comandante” dos laboratórios de
microbiologia e uma amiga sempre pronta a ajudar no que puder. À Marina Soares “eh
marine”, à Rita Sousa “Ritinha” e à Susana Sousa “Susaninha” que foram pessoas que
contribuíram para o bem-estar nos laboratórios e se revelaram amigas sempre prontas a
ajudar nas diversas tarefas.
Não poderia deixar de agradecer ao Daniel Gaspar, pelas viagens de ida e volta no seu
carro e pela amizade à três anos demonstrada como colega de curso e estágio; à Helena
Silva, que da mesma forma que o Daniel foi uma amiga de curso e da vida e que ao longo de
4 meses foi a minha companhia de casa em Oeiras, nos bons e maus momentos de ambos; à
Patrícia Ribeiro e Bruno Ribeiro pela hospitalidade com que me receberam e ajudaram a
integrar na instituição. Por fim, deixo um grande obrigado à Carmen Santos que, pela sua
amizade e dedicação nas questões da execução deste relatório, desde logo por ter emprestado
a sua tese de mestrado e pelas correcções e solicitações, teve um importante papel na
realização do mesmo. Para todos, o meu sincero obrigado!
Resumo
1 RESUMO
Este trabalho insere-se no capítulo da prevenção contra a acção de Phytophthora
cinnamomi e para tal foram realizados testes de confronto entre diferentes fungos
micorrízicos e o oomiceta, para desde logo apurar quais as estirpes mais antagónicas e úteis
para melhorar a resistência das plantas ao ataque deste agente patogénico.
Foi também estudado o efeito do exsudado produzido pelas estirpes de Pisolithus
tinctorius, relativamente ao seu efeito contra Phytophthora cinnamomi.
Para além disso, observaram-se micorrizas naturais de sobreiro e estabeleceram-se
outras micorrizas em laboratório com Cistus ladanifer e Xolantha guttata, tendo também se
desenvolvido um protocolo de produção de inóculo fúngico, o qual foi utilizado para
inoculação de plantas de sobreiro em viveiro.
Após todo o trabalho de microbiologia, recorreu-se à biologia molecular em que, para
grande parte das estirpes utilizadas, foi extraído DNA, realizado PCR e electroforese e
seguido o protocolo de purificação de DNA, para serem sequenciadas as amostras. Por fim,
analisaram-se as sequências obtidas uma a uma para confirmação da respectiva espécie.
Palavras-chave:
Resistência a Phytophthora cinnamomi, fungos micorrízicos, testes de confronto, estirpes
antagónicas, sobreiro, sequências de DNA
Resumo
1.1 Abstract
The main concern of this work was the prevention against Phytophthora cinnamomi
in plants, especially in cork oak. Confrontation tests were carried out between the different
mycorrhizal fungi and the oomycete, to find out, using statistical analysis, which strains are
more antagonistic and useful in order to improve resistance in plants, preventing
Phytophthora cinnamomis attack.
Was also studied the effect of the exudate produced by strains of Pisolithus tinctorius
due its effect against Phytophthora cinnamomi verified in confrontation tests.
In addition, cork oak’s natural mycorrhizas were observed under microscope and
other mycorrhizas were induced in laboratory and observed with Xolantha guttata and Cistus
ladanifer.
To complement all the work of microbiology, we used molecular biology in which,
for most of the strains used, DNA was extracted, done PCR and electrophoresis and followed
the protocol for purification of DNA samples to be sequenced. Finally, the DNA sequences
were analyzed one by one to confirm its species.
Key words:
Resistance to Phytophthora cinnamomi, mycorrhizal fungi, confrontation tests, antagonist
strains, cork oak, DNA sequences.
Introdução
3
2 INTRODUÇÃO
2.1 Contextualização do trabalho
Algumas espécies vegetais características de Portugal, tais como Castanea sativa ou
Quercus suber, castanheiro e sobreiro respectivamente, estão juntamente com muitas outras,
ameaçadas pela presença e contaminação das suas raízes por Phytophthora cinnamomi. Este
microorganismo é um Oomiceta sendo também um organismo modelo desta classe (Raffaele
et al, 2010). É um microorganismo extremamente nocivo para a agricultura pois penetra os
tecidos vegetais na raiz destruindo os vasos condutores da planta ao nível desta e
propagando-se a toda a planta. Tem também a capacidade de se reproduzir assexuadamente
por esporângios, clamidósporos e zoósporos, mas ao mesmo tempo é capaz de se reproduzir
sexuadamente pela união de oogónios com anterídeos. Estas últimas estruturas reprodutivas
são respectivamente os gâmetas femininos e masculinos deste oomiceta. As formas de
reprodução assexuada também são estruturas de resistência de Phytophthora cinnamomi,
tendo a capacidade de germinar quando expostos a condições favoráveis ao seu
desenvolvimento.
É no contexto da grande patogenicidade, provocada por Phytophthora cinnamomi nas
espécies lenhosas características de Portugal como o sobreiro, que se insere o meu trabalho
de investigação, trabalho esse que visa “testar” diversos fungos, na sua grande maioria
micorrízicos, a fim de averiguar se a simbiose com a planta em si (sobreiro) ou com plantas
próximas no habitat e ecossistema, provoca algum tipo de interacção nefasta ao
desenvolvimento de Phytophthora cinnamomi, contribuindo assim para a preservação das
espécies alvo deste agente patogénico.
2.2 Phytophthora cinnamomi
2.2.1 Caracterização taxonómica
A espécie Phytophthora cinnamomi é um microrganismo pertencente ao reino
Chromista, filo Oomycota, classe Oomycetes, ordem Peronosporales, família
Peronosporaceae e género Phytophthora.
O reino Chromista é constituído por organismos eucariotas, e recentemente tem sido
considerado como um reino em separado mas já foi incluído no reino Protista. Para este
trabalho decidi tê-lo em conta como um reino em separado, de acordo com Encyclopedia of
Introdução
4
life (http://www.eol.org/). Este reino inclui também todas as algas cujos cloroplastos contêm
clorofila A e C. o organismos envolvidos por quatro membranas, e pensa-se que podem ter
como ancestral comum uma determinada alga vermelha. (Parfrey et al, 2006) O seu filo,
Oomycota, é composto por organismos que aparentam serem fungos mas não o são. Alguns
organismos Oomycota não são prejudiciais, mas outros são parasitas e destroem plantas
aquáticas e terrestres (como faz a Phytophthora cinnamomi).
Peronosporaceae é uma família que possui 17 géneros, entre eles a Phytophthora e
compreende mais de 600 espécies conhecidas. É também uma família maioritariamente
patogénica, penetrando os tecidos dos seus hospedeiros com um micélio intercelular e usando
estruturas chamadas haustorium para entrar nas células e sugar os nutrientes.
Assim se enquadra este agente patogénico (Phytophthora cinnamomi) na grande
árvore taxonómica.
2.2.2 Ciclo de vida Phytophthora cinnamomi é,
como foi referido, uma espécie
patogénica e, como tal envolve outros
seres no seu ciclo de vida. Assim, após
germinar a partir dos zoósporos que
penetram as raízes das plantas
hospedeiras, este organismo desenvolve
um micélio que percorre os tecidos da
raiz formando estruturas que absorvem
os minerais designados haustorium.
Após a morte da sua planta hospedeira,
volta então a desenvolver esporângios
ou clamidósporos, reiniciando um novo
ciclo e infectando novas plantas.
Figura 1 Ciclo de Vida da Phytophthora cinnamomi
(http://www.dwg.org.au/index.cfm?objectID=6065BA59-
C29E-198E-88F7DDA2C9C065C4)
Introdução
5
2.2.3 Patogenicidade
Phytophthora cinnamomi é bastante conhecida como o organismo a quem se atribui a
causa da doença da tinta do castanheiro.
É uma espécie vista como um dos mais significantes, versáteis e destrutivos
patogénios, possuindo um enorme espectro de acção geográfico e em termos de variedade de
hospedeiros.
2.2.4 Principais focos de contaminação
É a grande área de dispersão de Phytophthora cinnamomi que representa uma das suas
maiores forças, sendo que se trata de uma espécie espalhada praticamente por todo o globo,
desde as regiões temperadas às tropicais, coincidindo com a enorme gama de hospedeiros
nessas regiões.
Em 1980, Zentmyer enumerou cerca de 950 plantas hospedeiras, das quais uma
grande parte é australiana, mas hoje em dia pensa-se que existem certa de 1000 espécies que
servem de hospedeiro segundo um estudo de Hardy e Sivasithamparam,1988.
Muitas das plantas preferencialmente atacadas são tropicais, situadas em locais como
Sumatra, EUA, África do Sul e Malásia.
Em Portugal, este parasita ataca mais o castanheiro, no qual se chama à doença a
“Tinta do Castanheiro”, e a nogueira (Gomes, 1982), sendo que o sobreiro é outra das
espécies alvo mais ameaçadas.
2.2.5 Prevenção
No capítulo da prevenção, infelizmente não há grande informação, pois Phytophthora
cinnamomi é uma praga muito efectiva e versátil. É contudo nesse âmbito que se insere um
pouco este trabalho, tentando demonstrar que a presença prévia de micorrizas de determinado
fungo antagónico de Phytophthora cinnamomi pode valer um ganho de resistência, a nível
radicular, por parte da planta que está associada, impedindo o oomiceta de penetrar os seus
tecidos e destruir os seus vasos condutores.
Introdução
6
Figura 2 estruturas típicas de
basidiomicetes segundo Ernst Haeckel
(http://caliban.mpiz-
koeln.mpg.de/haeckel/kunstformen/Haeckel_K
unstformen.pdf)
2.3 Fungos micorrízicos
Os fungos micorrízicos são fungos especiais
pois têm a capacidade de se associarem a plantas,
numa relação simbiótica, formando estruturas
designadas por micorrizas. A associação entre o
fungo e a planta, como simbiose que é, traz
benefícios a ambos os intervenientes, o fungo ganha
maior protecção, humidade, alguns sais e
substâncias de reserva das plantas, como a sacarose,
e a planta ganha uma espécie de extensão da sua
área radicular, permitindo-lhe captar alguns
nutrientes e a degradação de algumas
macromoléculas, que sem a digestão extracelular
fúngica não lhes seria possível assimilar.
Os basidiomicetas são caracterizados por
produzirem os seus esporos dentro de estruturas em
forma de bastão designadas basídios. Na figura 2
estão representados alguns tipos de estruturas de frutificações características de
basidiomicetas, segundo a obra Kunstformen der Natur de Ernst Haeckel, 1904. Neste
trabalho, todos os fungos utilizados pertencem naturalmente ao reino Fungi e phylo
Basidiomycota.
Introdução
7
Pisolithus tinctorius
O Pisolithus tinctorius é um organismo
pertencente à classe Agaricomycetes, ordem
Boletales, família Sclerodermataceae e género
Pisolithus. É uma espécie de fungo capaz de
estabelecer simbiose com uma apreciável gama de
plantas desde gimnospérmicas como o pinheiro bravo
às angiospérmicas como o castanheiro ou sobreiro.
É contudo uma espécie muito utilizada para
diversos fins e de diferentes formas pois é uma das
espécies de fungos micorrízicos com maior taxa de
crescimento e com menor grau de exigência, aspectos
que o tornam um organismo fácil de desenvolver,
tanto em laboratório como in vivo.
Além do já referido, este fungo pode também
ser conhecido como a “trufa Bohemia” e em alguns
povos foi utilizado o seu exsudado muito característico como corante natural para tingir
roupas. Esse exsudado contém uma vasta gama de moléculas, entre outras, o ácido indol-3-
acético (IAA), (Frankenberger et al, 1987) que faz parte de um grupo de fitohormonas de
crescimento muito conhecidas as auxinas; e outras substâncias que se pensam ser
antimicrobianas ou mesmo inibidoras de crescimento para muitos outros concorrentes de
Pisolithus tinctorius no seu meio envolvente.
Neste trabalho foram justamente estas duas questões que foram abordadas, primeiro
inoculando plantas com diferentes fungos, entre eles o Pisolithus tinctorius e acompanhando
o seu crescimento, tentando demonstrar e acompanhar a simbiose entre o fungo e a planta.
Relativamente ao exsudado do Pisolithus tinctorius como agente inibidor,
combinando-o com meios nutritivos nos quais foi inoculada Phytophthora cinnamomi,
averiguou-se se esta era ou não inibida pela presença de exsudado, obtendo-se resultados que
serão discutidos mais à frente.
Introdução
8
Boletus aereus
O Boletus aereus pertence à classe
Agaricomycetes, ordem Boletales, família
Boletaceae e género Boletus, no qual
também se insere o seu parente mais
conhecido devido ao seu uso na indústria
alimentar o Boletus edulis. Segundo o
artigo A phylogenetic study of Boletus
section Boletus in Europe de D.C.M.
Beugelsdijk et al, 2008, o Boletus aereus é
conhecido na Europa como micorrízico de
plantas do género Quercus, como por exemplo o sobreiro Quercus suber. A sua cor é
acastanhada, com o mais claro e o chapéu mais escuro à semelhança do que vemos na
figura 4. É um cogumelo comestível, sendo bastante aproveitado nos países Bascos e Itália. É
sem dúvida, de entre os fungos escolhidos para este trabalho, aquele que é mais difícil de
manter em cultura pura, não só devido à sua exigência nutricional, como também pela
necessidade da presença de um hospedeiro.
Cortinarius variicolor
O Cortinarius variicolor é um fungo que,
pertence também à classe Agaricomycetes, no
entanto distingue-se a partir da ordem Agaricales,
familila Cortinariaceae e género Cortinarius. O
género Cortinarius possui inúmeras espécies,
algumas conhecidas pela sua comestibilidade,
como o Cortinarius caperatus.
Figura 4 Cogumelo de Boletus aereus
(http://www.dipbot.unict.it/funghi_etna/photogallery/Bol
etus%20aereus.jpg)
Figura 5 Vários planos do cogumelo de
cortinarius variicolor, sendo o de baixo um
corte longitudinal
(http://it.wikipedia.org/wiki/File:Cortinarius_vari
ecolor_01.jpg)
Introdução
9
Paxillus involutus
O Paxillus involutus é um fungo
da classe Agaricomycetes, ordem
Boletales, família Paxillaceae, e por fim
género Paxillus. Este fungo, apesar de
ser tradicionalmente comido em alguns
locais da Europa, não o deve ser pois
pensa-se que esteja relacionado com o
aparecimento de anemia hemolítica
imune. No entanto pensa-se que
poderá ter esse efeito após consumo
durante anos.
É encontrado junto a coníferas especialmente Pinus e forma frutificações apenas no
outono até meados do inverno.
Lactarius acerrimus O Lactarius acerrimus é outro
fungo micorrízico da classe
Agaricomycetes, sendo que a sua ordem é
também uma das mais representadas neste
trabalho - Russulales (a ordem da qual são
características as Russulas como por
exemplo Russula virescens), família
Russulaceae e género Lactarius. O nome
Lactarius vem do latim e significa “que dá
leite”, contudo esta particular designação
tem a sua razão de ser pois muitos fungos deste mesmo género segregam por baixo das
lâminas dos seus cogumelos umas gotas de látex. Isso acontece nos Lactarius visto que é uma
das características morfológicas distintivas do género e pode notar-se isso na figura 7.
Figura 6 Cogumelo de Paxillus involutus
(http://hiddenforest.co.nz/fungi/family/paxillaceae/paxil01.h
tm)
Figura 7 Cogumelo de Lactarius acerrimus
(http://www.flickr.com/photos/pepebarambio/3261129886/
in/set-72157615763907386)
Introdução
10
Amanita ponderosa
A Amanita ponderosa é um dos
fungos mais sonantes do trabalho pelo
facto de ser do mesmo género de Amanita
muscaria, fungo que produz cogumelos
bastante conhecidos devido ao facto de
serem altamente venenosos. No entanto, a
Amanita ponderosa curiosamente não é
venenosa e o seu cogumelo distingue-se
muito bem do seu parente, muito melhor
até que outros fungos comestíveis bem
mais distantes taxonomicamente. Pertence igualmente à classe Agaricomycetes e tal como
cortinarius e macrolepiota, pertence à ordem Agaricales. A família não poderia deixar de ser
representativa das amanitas, sendo Amanitaceae e o género obviamente Amanita. Esta
espécie de fungo também é conhecida como silarca e é bastante comum e consumido em
praticamente toda a região ibérica, com maior incidência na Espanha do que em Portugal.
Xerocomus subtomentosus
Este é mais um fungo da classe
Agaricomycetes que pertence à ordem
Boletales, novamente a classe mais
representada neste trabalho, na qual estão
inseridos igualmente o Pisolithus
tinctorius, o Paxillus involutus, e a
Scleroderma cepa. Relativamente à
família ela é Boletaceae e o género como
não poderia deixar de ser, Xerocomus. É
micorrízico de plantas do género
Quercus, mas também pode ser de Fagus, Carpinus e Betula.
(http://boletales.com/genera/xerocomus/x-subtomentosus/)
Figura 8 - Cogumelos de Amanita ponderosa
(http://javier-bermejo-
castano.blogspot.com/2011/04/amanita-ponderosa.html)
Figura 9 - Cogumelo de Xerocomus subtomentosus
(http://www.treknature.com/gallery/photo32510.htm)
Introdução
11
Scleroderma cepa Scleroderma cepa é também outro
organismo da classe Agaricomycetes. A sua
ordem é Boletales que, como já foi referido
é a ordem mais representada neste trabalho
sendo também ela uma ordem muito
característica de fungos micorrízicos. A
família é Sclerodermataceae e o género
Scleroderma. Desenvolve uma frutificação,
como na figura 10 que aparece geralmente
em zonas com relva e entre as árvores e é característico do verão em zonas temperadas, após
precipitação. O seu cogumelo tem a forma de um bolbo com uma massa mais escura no seu
interior, tratando-se de uma massa enorme de esporos em desenvolvimento.
Russula virescens
Russula virescens é um fungo
igualmente da classe Agaricomycetes, e é
mais um da ordem Russulales, a família é
Russulaceae e o género Russula. Este
fungo foi utilizado neste trabalho, nunca
em cultura pura pois o material celular
(cogumelo) foi fornecido à parte e foi feita
extracção de DNA e sequenciação para
confirmar que se tratava de facto de
Russula virescens. Porém, foram inoculadas algumas plantas de sobreiro no viveiro, que mais
tarde se irão analisar quanto à presença de micorrizas deste organismo. Este é também um
fungo comestível e que se encontra na Europa e Ásia. Aparece nas florestas mistas e forma
micorrizas especialmente com espécies do género Quercus.
Figura 10 - Cogumelo de Scleroderma cepa
(http://www.mykoweb.com/CAF/species/Scleroderma_c
epa.html)
Figura 11 - Russula virescens
(http://www.mtsn.tn.it/russulales-
news/tx_photos.asp?index=6457)
Introdução
12
2.4 Fungos sapróbios
Macrolepiota procera
A inclusão duma espécie sapróbia
(decompositora) neste trabalho deve-se ao
facto de ser uma espécie comum em
locais não degradados no ecossistema de
montado.
É comum em solos irrigados nas
regiões temperadas. É um fungo muito
popular, especialmente na Europa devido
à sua frequência sazonal, ao seu grande
tamanho quando totalmente desenvolvido,
e versatilidade na cozinha europeia. Tem também, como se pode ver na figura 12, um aspecto
muito semelhante a um guarda-sol clássico, sendo também distinguido por isso.
A utilização deste fungo no âmbito do trabalho é ligeiramente diferente do resto dos
fungos pois, por não ser micorrízico, o objectivo passa apenas por averiguar se é antagónico
ou não da Phytophthora cinnamomi no contexto da protecção das plantas face a este invasor.
Caso se verifique antagonismo, este fungo pode eventualmente ser inoculado no terreno
circundante das plantas a proteger, criando assim uma barreira à livre proliferação da
Phytophthora cinnamomi. nos outros fungos utilizados, por serem micorrízicos, o ideal é
prevenir a contaminação com Phytophthora cinnamomi com a introdução de plantas
previamente micorrizadas por esses fungos antagónicos.
2.5 Testes de confronto
Quando falamos em testes de confronto neste âmbito, estamos a falar de ensaios
laboratoriais, nos quais se põe em confronto, dentro da mesma caixa de Petri com um
respectivo meio de cultura, dois ou mais inóculos a fim de ser averiguar qual o mais forte, o
mais inibidor, o mais inibido, o mais rápido a colonizar o resto da caixa, o mais resistente,
etc. No entanto, ainda que em todas estas situações sejam sempre tiradas conclusões com
Figura 12 - Cogumelos de Macrolepiota procera
(http://www.pilzepilze.de/piga/zeige.htm?name=macrolepi
ota_procera)
Introdução
13
grande grau de credibilidade, essas conclusões podem não corresponder ao que acontece na
realidade na natureza in vivo e in situ, devido à presença de inúmeros factores que não se
conseguem ou simplesmente não se conhecem para serem simulados laboratorialmente.
Contudo, é um teste viável e prático e que põe à prova a real força de cada um dos
inóculos introduzidos, com o mínimo de vantagens ou desvantagens entre eles possíveis.
Por exemplo, a escolha do meio nutritivo deve sempre ser uma aproximação às carências
nutritivas de cada um dos inóculos presentes e satisfazer aproximadamente esses inóculos da
mesma forma, evitando assim favorecer mais um do que o outro.
Neste trabalho foram somente usados testes de confronto com dois inóculos na mesma
placa de Petri, um de Phytophthora cinnamomi e outro com os variados fungos a testar
descritos acima.
2.5.1 Com tempos de inoculação distintos
Os testes de confronto entre os fungos micorrízicos (e Macrolepiota procera) e
Phytophthora cinnamomi, como já foi referido, tiveram de se realizar tentando colocar os
organismos em confronto sempre em de igualdade relativamente a condições de
crescimento. Acontece que Phytophthora cinnamomi não é um fungo, mas sim um cromista,
e especificamente um oomiceta, logo é um organismo consideravelmente afastado dos outros
fungos e pela sua morfologia celular e grande capacidade de dispersão, é sem dúvida o mais
rápido dos organismos testados neste trabalho a crescer e colonizar a placa de Petri. Devido a
essa diferença substancial de taxa específica de crescimento entre os fungos testados e a
Phytophthora cinnamomi, foi necessário inocular inicialmente os fungos na placa e deixá-los
atingir determinada área da placa e só depois inocular a Phytophthora cinnamomi.
Contudo, este desfasamento temporal nas inoculações pode ser algo realista quando
pensamos que na natureza quando a Phytophthora cinnamomi aparece, se as plantas
supostamente já estão micorrizadas, já lá está presente o fungo e isso pode valer-lhes a
resistência e falamos então, não em remediação, mas sim em prevenção. Caso a Phytophthora
cinnamomi e um fungo micorrízico antagónico apareçam em simultâneo num determinado
local arborizado, o processo de micorrização não será certamente tão rápido como a entrada
do patogénico nas plantas, levando à sua destruição, daí que seja necessário que haja
micorrização prévia.
Mesmo assim, neste teste ainda falta um factor essencial a planta (ou hospedeiro),
pois é nele que in vivo e in situ se vai dar o palco do confronto entre os fungos e a
Introdução
14
Phytophthora cinnamomi. Ainda assim, é necessário antes de um teste com plantas, pré
seleccionar os fungos que, à partida se mostram antagónicos da Phytophthora cinnamomi,
sendo essa a principal utilidade da realização de testes de confronto em placas de Petri.
2.5.2 Com tempos de inoculação simultâneos
Apesar de se ter constatado que Phytophthora cinnamomi é, em condições normais,
o organismo mais rápido a desenvolver-se, quando comparado com os seus opositores de
confronto deste trabalho, houve alguns fungos testados que conseguiram tornar esse
diferencial de crescimento mínimo. Esses fungos foram nomeadamente 3 estirpes
identificadas como sendo de Pisolithus tinctorius e uma de Macrolepiota procera e, como tal,
foram seleccionados para testes simultâneos pois podem tratar-se dos mais importantes e
cirúrgicos fungos antagónicos para micorrizar plantas ameaçadas ou solo circundante pois
este grupo de fungos consegue crescer relativamente rápido e ao mesmo tempo inibir
Phytophthora cinnamomi, como veremos nos resultados.
2.6 Ensaios com exsudado de Pisolithus tinctorius
O Pisolithus tinctorius é um fungo que liberta um exsudado, como foi descrito na
sua caracterização, que estimula o crescimento das plantas e durante o trabalho verificou-se
que em todos os testes de confronto com Pisolithus tinctorius havia uma inibição da
Phytophthora cinnamomi, e que saltava à vista o escurecimento do meio provocado pela
libertação de exsudados por parte do fungo. Neste contexto surgiu a ideia de adicionar esse
exsudado ao meio nutritivo convencional e comparar o crescimento da Phytophthora
cinnamomi nesse meio contendo exsudados e num meio convencional.
De momento não foi possível encontrar bibliografia sobre este tipo de ensaio, no
entanto é uma forma de averiguar se o responsável pela inibição era o fungo em si ou sim o
seu exsudado. Sabe-se também que o exsudado acidifica bastante o meio, podendo ser esse
um dos factores pelos quais há inibição da Phytophthora cinnamomi, daí que posteriormente
tenham sido feitos testes deste tipo com soluções com pH ajustado para o valor normal
(aproximadamente 5,5) tentado perceber se, para além da acidez, existem outras substâncias
no exsudado responsáveis pela inibição da Phytophthora cinnamomi.
Introdução
15
2.7 Ensaios de micorrização in vitro com Xolantha guttatta e Cistus
ladanifer
Foram escolhidas estas plantas para experimentar micorrização in vitro pois são
plantas de rápida propagação e porque fazem parte do habitat característico do sobreiro,
assim como de outras espécies ameaçadas. Assim, caso consigamos que estas estabeleçam
micorrizas com os fungos antagónicos de Phytophthora cinnamomi, podemos plantá-las já
micorrizadas nos focos de contaminação com o patogénio e assim tentar remediar ou, no caso
de ainda não haver contaminação, prevenir o seu aparecimento. É também uma forma de
colmatar a possível incompatibilidade simbiótica entre as espécies ameaçadas por
Phytophthora cinnamomi e os fungos antagónicos, sendo então a micorrização feita nestas
plantas que geralmente se encontram próximas.
2.7.1 Xolantha guttata É uma planta angiospérmica que
pertence à classe Magnoliopsida, da
família das cistáceas ou Cistaceae. O seu
nome comum é tuberária-mosqueada e
estende-se ao longo do oeste europeu,
regiões mediterrânicas e macaronésia.
Surge como planta silvestre em matagais
naturais e terrenos não cultivados muitos
deles povoados por espécies de Quercus.
A sua flor aparece de Abril a
Julho. É uma herbácea como podemos constatar na figura 13 e é comum em Portugal.
Figura 13 - Xolantha guttata
(http://www.conocermoralzarzal.com/flora/turmera.htm)
Introdução
16
2.7.2
Cistus ladanifer
É, tal como a Xolantha guttata,
uma cistácea, mas esta é de maior porte,
dando origem a arbustos como se pode
notar na figura 14.
Conhecida como a esteva, esta
planta é nativa desde o sul de França até
ao sul de Portugal e também no noroeste
africano.
O seu tipo de fruto é a cápsula, a
qual possui muitos compartimentos onde
dentro deles estão encerradas as sementes. À sua superfície produz um tipo de resina
aromática que se designa por láudano e que é muito usado em perfumes, para efeitos de
fixador. Em Portugal, encontra-se mais a sul nas matas e florestas mistas, coexistindo com
espécies de Quercus, entre outras.
2.8 Inoculações in vivo na estufa
2.8.1 Sobreiro (
Quercus suber
) O Sobreiro é uma árvore de médio
porte que pode atingir os 20 metros de
altura. Tem uma copa larga, não muito
densa. O seu tronco possui uma casca
grossa, acinzentada e fendida, a qual é
responsável por uma das maiores e mais
características indústrias portuguesas a
cortiça. A sua folhagem é perene.
Quanto à época de floração, ela
situa-se de Abril a Junho e parcialmente
no Outono.
Possui as flores masculinas na extremidade dos ramos do ano anterior e as flores
femininas nas extremidades dos ramos do ano. Ambas as florescências aparecem em
Figura 14 - Cistus ladanifer
(http://pt.treknature.com/gallery/Europe/Portugal/photo80
344.htm)
Figura 15 Planície típica com povoamento de
Sobreiro (Quercus suber)
(http://2.bp.blogspot.com/_UnstlMwGL7c/TNrpqXHDr_I/
AAAAAAAAEbg/sTvyfXAFSa4/s1600/SOBREIROS-
LIMPAR.jpg)
Introdução
17
amentilhos. O seu fruto, a bolota, é também bastante conhecido e usado na pecuária, sendo
por exemplo uma peça chave na alimentação do porco de raça alentejana e do “pata negra”.
É uma árvore que requer muita luminosidade, e tolera baixos graus de pluviosidade do
ar e do húmus. Vive bem em solos com pH’s ácido-neutros, evitando solos calcários e tem
uma longevidade de mais de 300 anos. Em Portugal, é uma árvore bastante abundante,
abundância essa mais vincada a sul do Tejo onde habita em povoamentos únicos de sobreiro
ou mistos com azinheira (Quercus rotundifolia) ou carvalho (Quercus faginea). Actualmente
está ameaçado por Platypus cylindrus, uma espécie parasita que ataca o sobreiro
principalmente após o descortiçamento, quando a árvore fica mais susceptível, e por
Phytophthora cinnamomi que lhe pode causar uma morte súbita ou pelo contrário um
declínio pouco perceptível.
2.8.2 Produção de inóculo e inoculação
No viveiro, permaneciam dezenas de plantinhas de sobreiro retidas em contentor, com
irrigação e exposição a luz natural, as quais tinham como objectivo para este trabalho a
indução de micorrizas para posterior instalação em povoamentos. Assim, foi necessária a
produção de inóculo de determinados fungos micorrízicos com fim obter-se quantidade
suficiente para a micorrização de grande número de plantas no viveiro.
O inóculo faz mais sentido e tem mais eficácia, caso esteja numa suspensão, pois
infiltra-se mais facilmente no solo e atinge as raízes dos jovens sobreiros. Nesse contexto, o
inóculo produzido teve de ser todo ele desenvolvido através do crescimento dos fungos em
meio líquido com agitação (proporcionando um crescimento e 3 dimensões) e posterior
moagem do conteúdo biológico, até os fragmentos do fungo ficarem muito pequenos com
uma consistência homogénea. O procedimento em si será melhor detalhado no capítulo dos
métodos.
2.8.3 Recolha, observação e análise de micorrizas
Para tornar possível a avaliação do sucesso da inoculação em viveiro com diferentes
fungos é necessário conhecer o “estatuto” micorrízico das plantas antes da inoculação. Assim,
foram recolhidas algumas plantas e observados os seus sistemas radiculares.
Introdução
18
2.9 A técnica de PCR e sequenciação
A reacção de PCR (Polimerase Chain Reaction) amplifica uma sequência específica
de DNA a partir de uma cadeia molde inicial. Através de uma reacção exponencial é
produzido um número elevado de moléculas de DNA, sendo determinado em função da
seguinte fórmula:
Mf - número de moléculas formadas
Mi - número inicial de moléculas molde
N - número de ciclos realizados
As enzimas que catalisam a reacção são as polimerases. A reacção é ainda composta
por uma mistura de constituintes: os primers, sequências de DNA conhecidas (geralmente
com 9 a 20 bases), que ladeiam a região específica do DNA a amplificar a partir dos quais as
polimerases iniciam a síntese; o Mg2+ funciona como cofactor da enzima, os dNTP’s
(desoxinucleótidos trifostato) englobando dATP, dCTP, dGTP e dTTP, nucleótidos
necessários para a construção da nova cadeia e o tampão de PCR, tamponiza a reacção para
que possa ocorrer nas condições óptimas de pH.
O processo envolve cinco etapas com diferentes temperaturas de incubação, em que
três delas que se repetem, ciclicamente, por 20 a 50 vezes. A primeira etapa é constituída pela
desnaturação inicial da dupla cadeia, a 94ºC. Os ciclos incluem: desnaturação,
emparelhamento dos primers com as cadeias simples livres a uma temperatura variável (40 a
65ºC) e extensão dos primers na qual a polimerase prolonga a sequência destes, geralmente a
72ºC. A última etapa compreende a extensão final, onde ocorre a completa síntese de todas as
moléculas de DNA recém formadas.
A técnica de sequenciação é uma ferramenta útil permitindo obter a sequência de
bases nucleotídicas de um determinado fragmento de DNA. Os resultados permitem estudos
comparativos, ou seja, possibilita alinhamentos entre as sequências obtidas com outras
existentes em bases de dados. Esta análise permite obter um enquadramento taxonómico da
espécie em estudo, como identificação de espécies, e ainda analisar alterações pontuais ou
regionais nas sequências.
Material e Métodos
19
2.10 Objectivos
O objectivo central deste trabalho foi estudar e distinguir fungos micorrízicos quanto à
sua resistência quando confrontados com Phytophthora cinnamomi. Depois, ao estabelecer
micorrização, poder conseguir que essa simbiose no sobreiro (Quercus suber) e em outras
espécies vegetais, tais como a esteva (Cistus ladanifer) e Xolantha guttata, possa ser
sinónimo de protecção. Assim procura-se encontrar um lote de fungos antagónicos de
Phytophthora cinnamomi que após micorrização possam proporcionar um ganho de
resistência por parte das plantas face ao ataque do oomiceta.
Para escolhermos os fungos adequados para micorrizar plantas ameaçadas, não
poderíamos deixar de saber previamente como estes se comportam na presença de
Phytophthora cinnamomi e para isso foram realizados testes de confronto entre várias estirpes
de fungos micorrízicos e uma estirpe de Phytophthora cinnamomi, com o objectivo de
encontrar estirpes que mostrem mais apetência como antagónicos de Phytophthora
cinnamomi.
Achados esses fungos o objectivo passa pela sua inoculação. Inoculações
directamente no sobreiro, procura-se criar imunidade na planta propriamente dita, enquanto
que as inoculações em Cistus ladanifer e Xolantha guttatta, (ambas plantas pertencentes às
cistáceas), que fazem parte da vegetação natural circundante do sobreiro, têm como objectivo
evitar que haja proliferação de Phytophthora cinnamomi no solo em que se desenvolvem os
sobreiros.
Assim, com a micorrização e com o(s) fungo(s) apropriado(s) espera-se que possa ser
possível prevenir contaminações com Phytophthora cinnamomi nas plantas alvo deste
patogénio contribuindo assim para a preservação dessas espécies.
Material e Métodos
20
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Lista de material
As listas de materiais utilizados para as diferentes tarefas, nos diferentes laboratórios
estão presentes no anexo 7.9.
3.2 Correspondência entre os códigos da estirpe, a espécie, ano de
isolamento, hospedeiro e local
Tabela 1 - Tabela com os organismos utilizados, o seu respectivo código, ano de isolamento, hospedeiro e
local de colheita
espécie
código
Ano de
isolamento
hospedeiro
local
Phytophthora
cinnamomi
PH1160
2011
Quercus suber
Grândola
Pisolithus tinctorius
PT025
2006
Quercus suber
Vendas Novas
Pisolithus tinctorius
PT005
1987
Eucalyptus globulus
Arouca
Pisolithus tinctorius
PT14HS
2002
Eucalyptus globulus
Aljustrel
Pisolithus tinctorius
PT034
2010
Cistus ladanifer
Mértola
Boletus aereus
MU29
2010
Quercus suber
Grândola
Boletus aereus*
(cogumelo
recolhido)
(colhido em 2011)
Quercus suber
Ribatejo
Macrolepiota
procera
TN3
2010
Quercus suber
Grândola
Lactarius
acerrimus
BS163
2010
Quercus suber
Grândola
Amanita ponderosa
AP2
2010
Quercus rotundifolia
Mértola
Cortinarius
variicolor
BS142
2010
Quercus suber
Grândola
Paxillus involutus
PX001
1989
Castanea sativa
Marvão
Russula virescens*
(cogumelo
recolhido)
(colhido em 2011)
Quercus suber
Ribatejo
Xerocomus
subtomentosus
M146
2010
Quercus suber
Grândola
Scleroderma cepa
M164
2010
Quercus suber
Grândola
Nota: os organismos assinalados com * foram identificados com base em características
macroscópicas, devendo a confirmação da espécie ser realizada após sequenciação
Material e Métodos
21
3.3 Estabelecimento das culturas in vitro
Foram repicadas diferentes estirpes e espécies de fungos, maioritariamente
micorrízicos, à excepção de Macrolepiota procera, com três diferentes objectivos: Manter as
culturas jovens e em crescimento constante; obter quantidade suficiente de fungo para
efectuar as inoculações nos testes de confronto e nos ensaios in vitro com Cistus ladanifer e
Xolantha Guttatta; e produzir inóculo para os balões com meio líquido em agitação para
depois serem inoculados nos sobreiros in vivo.
3.3.1 Tipos de meio de cultura usados no desenvolvimento das culturas
Foram produzidos e utilizados diferentes tipos de meio de cultura, consoante as
necessidades dos diferentes fungos em estudo. Entre eles destacam-se o MMN (anexo 7.1); o
meio BAF (anexo7.2); o meio ODDOUX (anexo7.3); o meio PDA (anexo7.4); e por fim o
meio MS (Murashige & Skoong modificado) (anexo7.5).
De entre os meios referidos, foram igualmente usados alguns, como o MMN, o BAF e
o ODDOUX em fase liquida (sem adição de ágar), para verificar se o estado físico do meio
influenciava o ritmo e o modo de crescimento dos diferentes fungos.
Material e Métodos
22
3.4 Testes de confronto
Os testes de confronto foram realizados, utilizando caixas de Petri de 9 cm’s de
diâmetro, nas quais foram traçados na base um risco diametral (eixo dos XX) e dois riscos
perpendiculares a este (dois eixos YY) equidistantes do centro da caixa, com uma distância
entre cada um de 3 cm’s, como está demonstrado na figura 16.
Depois de feito o traçado das caixas foi inserido
em cada uma delas meio nutritivo. O tipo de meio foi
escolhido conforme a exigência de cada um dos
microorganismos em confronto na caixa e para tal,
foram seleccionados meios que favorecessem de igual
forma o desenvolvimento de ambos, isto para não
beneficiar uns em detrimento de outros. Foi escolhido
então, na grande maioria dos testes o meio PDA (em
anexo 7.4) e em alguns casos o meio BAF (em anexo
7.2).
As placas de confronto foram utilizadas em
testes, cujas inoculações foram desfasadas, mas também
foram utilizadas em testes cujas inoculações foram simultâneas. Para os testes de confronto
desfasados foram utilizadas sete placas para cada confronto diferente, tentando realizar uma
amostragem relativamente grande. Já para os testes de confronto cujas inóculações foram
simultâneas (testes de confronto simultâneos), foram utilizadas apenas cinco placas para cada
confronto. Para ambos os testes foram realizadas medições de dois em dois dias (exceptuando
ao fim de semana em que era feitas à sexta-feira e na segunda-feira seguinte). Na tabela 5
estão as estirpes utilizadas para cada confronto e o respectivo meio de cultura em que foram
introduzidas nas placas de confronto.
Tabela 2 - Estirpes e meios utilizados nos diversos testes de confronto
Código
Espécie
Meio de crescimento
Tipo de teste de confronto
em que foi utilizado
PT005
Pisolithus tinctorius
PDA
Desfasado/simultâneo
PT025
Pisolithus tinctorius
PDA
Desfasado/simultâneo
PT14HS
Pisolithus tinctorius
PDA
Desfasado/simultâneo
MU29
Boletus aereus
BAF
Desfasado
TN3
Macrolepiota procera
PDA
Desfasado/simultâneo
BS163
Lactarius acerrimus
BAF
Desfasado
AP2
Amanita ponderosa
BAF
Desfasado
BS142
Cortinarius variicolor
PDA
Desfasado
PX001
Paxillus involutus
PDA
Desfasado
Figura 16 Esquema do traçado da caixa de
Petri para os testes de confronto. A vermelho
estão os dois locais onde se efectuam as
inoculações e estão, tal como os dois riscos
horizontais, a 3 cm’s um do outro e a 1,5 cm’s
do centro da caixa.
Material e Métodos
23
3.5 Preparação dos balões Erlenmeyer em agitação e inoculações in vivo
A preparação dos balões em agitação para a produção de inóculo compreende diversas
etapas que vão ser descritas sequencialmente.
1 Fazer o meio de cultura em estado liquida.
Os meios de cultura líquidos utilizados foram o MMN (em anexo 7.1); BAF (em anexo 7.2);
e OUDOUX (em anexo 7.3).
2 Esterilização do meio de cultura
Os meios foram colocados dentro de balões Erlenmeyer, em todos eles com 150mL de meio,
tapados com papel de prata dobrado. Após a autoclavagem deixaram-se arrefecer.
3 Inoculação dos balões de meio Em câmara de fluxo, os balões
foram inoculados com pedaços de fungo
proveniente das placas de Petri como
podemos ver na figura. Para cada cultura
foram sempre inoculados 6 balões. As
culturas utilizadas foram as três de
Pisolithus tinctorius (PT005, PT025 e PT
14HS) em MMN, AP2 (Amanita
ponderosa) em BAF e MU29 (Boletus
aereus) em ODDOUX. Usou-se um
bisturi para cortar igual número de pedaços de fungo (com tamanhos semelhantes) e colocar
dentro dos respectivos balões, indicando sempre nestes a estirpe que se estava a inocular.
4- Colocação dos balões num suporte com agitação continua
Após a inoculação de todos os balões,
estes foram colocados num suporte com agitação
para que mantenha o meio com oxigenação
contínua, permitindo o crescimento dos fungos
inoculados. O tempo de permanência dependeu do
fungo que se tratava mas rondou sempre de uma
semana a duas. As rotações utilizadas foram de
aproximadamente 145 por minuto numa estufa a
30ºC. A figura 18 representa este processo.
Figura 17 - Balões inoculados com material biológico
proveniente das respectivas placas
Figura 18 - Balões com inóculo em agitação
Material e Métodos
24
5 Filtragem dos balões
Após o tempo
necessário ao crescimento dos
fungos em meio líquido,
foram filtrados os balões,
retendo o conteúdo biológico
lá desenvolvido e descartando
o meio, meio esse que, no
caso das três estirpes de
Pisolithus tinctorius, ficou
bastante alterado nas suas
características e foi
conservado no frigorífico
para mais tarde ser
aproveitado para outra
experiência que iremos tratar.
O aspecto dos
bocadinhos de fungo que se
desenvolveram ficou a muito
semelhante a azeitonas para
PT14HS (na figura 20).
Contudo, num meio com
agitação seria de esperar que
as formas tendessem a ser
esféricas devido ao
movimento circular a que estavam sujeitas. O peso total do material biológico retido de todos
os balões (seis de cada estirpe) foi sempre por volta dos 70g que depois foram adicionadas a
um recipiente com 600mL de água destilada e esterilizada.
Figura 19 - Filtragem do conteúdo dos balões
Figura 20 - Conteúdo filtrado (PT14HS)
Material e Métodos
25
6- Trituração do material biológico filtrado
O material filtrado foi triturado em 600mL de água destilada e esterilizada com uma
varinha mágica para formar uma mistura com consistência aquosa capaz de ser inserida numa
seringa de 100mL para depois a quando da inoculação a mistura poder infiltrar-se facilmente
no solo em que está a planta.
7- Inoculação no viveiro
A etapa final foi, com uma
seringa de 100mL, sugar a mistura
triturada de dentro do seu recipiente
e inocular 30mL da solução em cada
planta junto da raiz, tal momo indica
a figura 22.
3.6 Ensaios com exsudado de Pisolithus tinctorius
Como forma de reaproveitar o exsudado do Pisolithus tinctorius resultante da
produção de inóculo nos balões Erlenmeyer, foi recolhido o líquido de suspensão (meio
MMN + exsudados resultantes do metabolismo do fungo) após a filtração do micélio em
suspensão neste.
Utilizei 200mL desse líquido como solvente em vez de água para um meio PDA
(modificação descrita no anexo de PDA) e fiz outros 200mL de PDA convencional.
O meio PDA alterado e o convencional foram igualmente esterilizados e plaquados
cada um em 9 placas de Petri de 9 cm’s.
Figura 21 - Inoculação de 30mL da solução em cada um dos
contentores do sobreiro
Material e Métodos
26
O objectivo de ter os dois tipos de meio é para se poder comparar posteriormente os
resultados do ritmo de crescimento da Phytophthora cinnamomi nos dois meios para se
averiguar se a presença de exsudados de Pisolithus tinctorius tem alguma influência
(tendencialmente negativa) no desenvolvimento deste
patogénico.
Assim, para se realizarem convenientemente
as medições do crescimento de Phytophthora
cinnamomi nas caixas foi necessário fazer-se um
traçado na base das placas de Petri com dois eixos
perpendiculares apenas em cada placa (um em X e
outro em Y) e com o centro da placa a coincidir com a
origem do eixo, local onde se inocularam rodelas de
5mm de Phytophthora cinnamomi, tal como está
representado na figura 22.
3.7 Ensaio da micorrização em Cistus ladanifer e Xolantha guttatta
3.7.1 Desenvolvimento do protocolo de germinação para
Cistus ladanifer
e
Xolantha guttatta
Para a germinação em sistema asséptico das sementes de Cistus ladanifer e Xolantha
guttatta usou-se o protocolo desenvolvido por Chilvers et al. 1986 e Águeda et al. 2008, do
qual vão ser citados de seguida os passos tomados.
1- Desinfecção de sementes
Após crivagem das sementes, estas foram colocadas dentro de um filtro, utilizado
também para filtrar nemátodos, que envolveu as sementes e que foi atado no cimo para que
estas não saíssem. No protocolo original, no lugar do filtro que foi utilizado estava a gaze,
mas devido ao pequeno tamanho das sementes, mesmo que a gaze fosse dobrada varias vezes,
as sementes acabavam por sair durante a lavagem.
Depois, as sementes foram mergulhadas num balão com água destilada a 90ºC durante
dez minutos.
Ao fim desses dez minutos as saquetas de filtro com as sementes foram mergulhadas
em álcool a 70% e de seguida mergulhadas em água destilada e esterilizada.
Figura 22 - Esquema do traçado da caixa
de Petri para os ensaios com exsudado de
Pisolithus tinctorius. A vermelho está o
local onde se efectua a inoculação que
corresponde ao centro da caixa.
Material e Métodos
27
Figura 23 - Sementes dentro dos seus filtros na solução de
hipoclorito de cálcio com agitação
Após isso, as saquetas de
sementes foram mergulhadas durante
dez minutos desta vez numa solução de
hipoclorito de cálcio e água, com 20g de
hipoclorito de cálcio em 200mL de água
destilada, sob câmara de fluxo laminar e
com agitação, como mostra a figura 23.
Decorridos os dez minutos,
passou-se então a outra lavagem com
agitação também, durante cinco horas
em água destilada e esterilizada. Durante essas cinco horas foi mudada a água do balão três
vezes, para remover o máximo de resíduos de hipoclorito possíveis.
No fim,
abriram-se se os filtros
dentro de placas de
Petri esterilizadas em
câmara de fluxo
laminar e libertaram-
se as sementes umas
das outras e do filtro
com água destilada esterilizada. Obtiveram-se as placas
de Petri com sementes demonstradas na figura 24.
2- Germinação
Preparou-se meio gelosado (6,5 g de agar, 1 g de
glucose, 1 L de água destilada) e autoclavou-se.
Depois distribuiu-se o meio por mais vinte
placas de Petri esterilizadas e deixou-se arrefecer.
Espalhou-se um numero significativo de
sementes em cada placa com meio e colocaram-se as
placas na estufa climatizada a 25ºC de dia e 18ºC de
noite, com fotoperíodo de 12 horas. Originalmente no
protocolo estava 15ºC de dia e 8ºC de noite mas eram
Figura 24 - Sementes desinfectadas de Xolantha guttatta (à esquerda) e de Cistus
ladanifer (à direita)
Figura 25 - estufa climatizada com as
plantas
Material e Métodos
28
certamente temperaturas de climas mais frios, e que não estavam tão próximas das
temperaturas óptimas para a germinação destas plantas que são de climas mais quentes.
3- Manutenção das plantas
Quando as plantas germinaram (sete dias depois) e as radiculas atingiram
aproximadamente 1cm (figura 26) de comprimento foram transferidas para caixas de
micropropagação com meio MS e outras com vermiculite + turfa (10/1) regadas com 50mL
de meio BAF. Estas caixas foram previamente autoclavadas com os respectivos meios. Para a
transferência das plantas para as caixas utilizou-se uma pinça muito fina e maleável de modo
a evitar lesões dos tecidos vegetais.
Para cada caixa de
micropropagação foram
transferidas 4 plantas. Com o
meio MS foram inoculadas
dez caixas e com
vermiculite/turfa + BAF
foram inoculadas 15 caixas,
Isto deu um total de
cinquenta caixas inoculadas.
As figuras 27 e 28
demonstram melhor o
procedimento realizado para
cada uma das plantas em
cada um dos meios.
Figura 26 - Cistus ladanifer (à esquerda) e Xolantha guttata (à direita) a germinarem sete dias depois
de irem para o meio gelosado
Figura 28 - Caixas de micropropagação com meio MS. Xolanthas
guttata (à esquerda) e Cistus ladanifer direita)
Figura 27 - Caixas de micropropagação com vermiculite e turfa
(10/1) + 50mLBAF. Xolantha guttata esquerda) e Cistus ladanifer
(à direita)
Material e Métodos
29
4- Inóculações com fungos micorrízicos
Vinte e dois dias depois de serem transferidas para as caixas de micropropagação e
depois de atingirem determinado grau de desenvolvimento, as plantas foram inoculadas com
fungos micorrízicos de acordo com a tabela 6. Para as inoculações foram utilizados pedaços
de agar contendo micélio, provenientes de placas de Petri que mantinham os fungos
destinados a estas inoculações, em crescimento.
Podemos ver na figura 39 como foram inoculados os fungos.
Tabela 3 - Inóculações dos diversos fungos consoante a planta em questão e o meio
Cistus ladanifer
Xolantha guttata
Meio MS
Vermiculite/turfa/BAF
Meio MS
Vermiculite/turfa/BAF
Amanita
ponderosa (AP2)
Amanita ponderosa (AP2)
Boletus aereus (MU29)
Amanita ponderosa (AP2)
Amanita
ponderosa (AP2)
Amanita ponderosa (AP2)
Boletus aereus (MU29)
Amanita ponderosa (AP2)
Amanita
ponderosa (AP2)
Amanita ponderosa (AP2)
Boletus aereus (MU29)
Amanita ponderosa (AP2)
Testemunha
Boletus aereus (MU29)
Amanita ponderosa
(AP2)
Boletus aereus (MU29)
Testemunha
Boletus aereus (MU29)
Amanita ponderosa
(AP2)
Boletus aereus (MU29)
Testemunha
Boletus aereus (MU29)
Amanita ponderosa
(AP2)
Boletus aereus (MU29)
Boletus aereus
(MU29)
Scleroderma cepa (M164)
Testemunha
Scleroderma cepa (M164)
Boletus aereus
(MU29)
Scleroderma cepa (M164)
Testemunha
Scleroderma cepa (M164)
Boletus aereus
(MU29)
Scleroderma cepa (M164)
Contaminada
Scleroderma cepa (M164)
Boletus aereus
(MU29)
Pisolithus tinctorius (PT034)
Contaminada
Pisolithus tinctorius
(PT034)
Pisolithus tinctorius (PT034)
Pisolithus tinctorius
(PT034)
Pisolithus tinctorius (PT034)
Pisolithus tinctorius
(PT034)
Testemunha
Testemunha
Testemunha
Testemunha
Testemunha
Testemunha
Material e Métodos
30
3.8 Extracção e observação de micorrizas de Sobreiro (Quercus Suber)
Antes de serem observadas quaisquer micorrizas decorrentes este trabalho, a Doutora
Marta Ferreira e o Rui Coelho vieram dar-me uma formação no âmbito da observação de
micorrizas e sua identificação.
Começámos por dirigir-nos ao viveiro, no qual a Doutora Marta Ferreira seleccionou
algumas plantas de sobreiro que, segundo ela aparentavam ter micorrizas, fruto de inóculo
natural (presente no solo e cujos esporos podem ter atingindo os contentores que estavam
flutuantes em relação a este). Alguns dos aspectos que davam a entender a presença de
micorrizas eram entre outros, a presença de raízes curtas ou o desaparecimento dos pêlos
radiculares. Claro que esta análise foi somente para seleccionar a olho as plantas mais
adequadas para levarmos para o
laboratório. Contudo, o
características todas elas reais da
presença de micorrizas. Depois
fomos para o laboratório, na zona
de recepção de material e
procedemos à lavagem cuidadosa
das raízes dos sobreiros
escolhidos para tirar o substrato
que estava a cobrir a raiz,
evitando destruir as micorrizas.
Figura 29 À esquerda uma caixa de micropropagação em que se pode ver a forma como o inóculo foi
colocado junto à raiz das quatro plantas e à direita um grande plano de uma planta e o seu inóculo em que já
vemos a raiz a penetrar o agar onde está o fungo.
Figura 30 - Raízes curtas vistas à lupa com ausência de pêlos
radiculares e presença de micélio em redor das estruturas
vegetais - uma prova concreta da presença de micorrizas.
Material e Métodos
31
Nota: As espécies assinaladas com * foram identificadas a partir das suas
características macroscópicas, após sequenciação será possível
confirmar a sua identidade.
Após a lavagem foram escolhidas à lupa ramificações das raízes que aparentavam ter
micorrização e transferimo-las para placas de Petri com água destilada.
Nessas placas com água observámos bastantes estruturas que indicavam presença de
micorrizas como podemos ver na figura 30.
Após a selecção dos melhores
exemplos de micorrizas, procedeu-se à sua
observação microscópica na qual se
garantiu que eram de facto micorrizas,
ainda observando-se ansas anastomosas
que indicavam que se tratava de facto de
basidimicetas. Como marcador foi utilizado
o azul de metila ou azul de algodão para
realçar as células fúngicas como podemos ver na figura 31.
Ainda depois disto cortaram-se secções de micorrizas utilizando um micrótomo de
congelação e obtiveram-se imagens de corte que demonstram o micélio a penetrar os tecidos
nos espaços intercelulares característica de ectomicorrizas. As imagens obtidas serão
incluídas nos resultados mais à frente.
3.9 Extracção de DNA
Tabela 4 - Estirpes utilizadas para extracção, PCR e sequenciação
Primeiramente foram
cortados com bisturi pedaços de
micélio das placas de Petri que
continham as estirpes da tabela 6
e colocados dentro de
Eppendorfs para serem
conduzidos ao laboratório de
bioquímica, no qual se procedeu
à extracção.
Para a extracção de DNA
fúngico, usou-se o DNeasy Plant
kit da Quiagen®.
Os passos tomados foram
os seguintes:
Suposta espécie
código
Phytophthora cinnamomi
PH1160
Pisolithus tinctorius
PT025
Pisolithus tinctorius
PT005
Pisolithus tinctorius
PT14HS
Boletus aereus
MU29
Boletus aereus*
(cogumelo recolhido)
Macrolepiota procera
TN3
Lactarius acerrimus
BS163
Cortinarius variicolor
BS142
Paxillus involutus
PX001
Russula virescens*
(cogumelo recolhido)
Figura 31 - Captura em microscópio de uma
micorriza. Preparação feita por esmagamento
Material e Métodos
32
1- Macerou-se o micélio em azoto líquido e colocou-se noutro Eppendorf o macerado.
2- À parte, juntou-se 600µL de tampão AP1 e 4µL de RNase a um Eppendorf e agitou-se no
vórtex.
3- Deixou-se a incubar a mistura durante 30 minutos a 65ºC. Misturou-se duas a três vezes a
incubação por inversão do Eppendorf.
4- Adicionou-se 130µL de tampão AP2 e agitou-se no vórtex seguindo-se uma permanência
no gelo durante 5 a 10 minutos.
5- Centrifugaram-se as amostras durante 15 minutos a 13000 rpm(rotações por minuto) a uma
temperatura de 8ºC e retirou-se o sobrenadante, colocando-o na coluna lilás. De seguida
centrifugou-se 2 minutos novamente a 13000 rpm, desta vez de 20ºC.
6- Transferiu-se o produto filtrado para um Eppendorf sem tocar e desmoronar o pellet.
7- Adicionou-se o tampão AP3 com 1,5 vezes mais volume que o filtrado e emulsionou-se
com a pipeta. Cada solução deve ficar a rondar os 900µL
8- Transferiu-se 750µL de cada mistura anterior (incluindo algum precipitado que tenha
formado) para uma respectiva coluna branca e centrifugou-se 1 minuto a 8000 rpm. Desta vez
deitou-se fora o líquido que passou para baixo pois o DNA ficou retido na coluna.
9- Repetiu-se o passo 8 até que não sobrasse mistura.
10- Colocou-se cada uma das colunas nos tubos sem tampa fornecidos no kit e adicionou-se a
cada um 500µL de tampão AW. A 20ºC centrifugou-se durante 1 minuto a 8000 rpm e
novamente deitou-se fora o que passou para baixo.
11- Juntou-se novamente 500µL de tampão AW, centrifugou-se 1 minuto a 12000 RPM e
deitou-se fora o líquido que passou para baixo mais uma vez.
12- Centrifugou-se novamente a 12000 rpm durante 1 minuto e bateu-se com os tubos no
papel para absorver os vestígios de mistura que ainda lá possam estar. Repetiu-se este passo.
13- Transferiu-se a coluna branca para um Eppendorf novo e juntou-se 50µL de tampão AE
(eluição), previamente aquecido a 65ºC. Incubou-se 5 a 10 minutos à temperatura ambiente e
de seguida centrifugou-se durante 1 minuto a 8000 RPM.
14- Realizou-se uma eluição, aproveitando o DNA ainda presente nas colunas (em
principio este DNA é mais linearizado). Retiraram-se as colunas brancas para outros
Eppendorfs e repetiu-se o passo 13.
15- E obtivemos duas eluições contendo DNA para cada amostra relativa a cada um dos
fungos da tabela 6.
Material e Métodos
33
3.10 PCR e optimização das suas condições
Foi necessário optimizar as condições de PCR, nomeadamente quanto à concentração
de cloreto de magnésio (MgCl2) e a quantidade de DNA, número de ciclos, temperaturas de
emparelhamento de primers. Muitas das vezes as condições de PCR para determinadas
amostras de fungos não eram as mesmas que para outras, então, repetiu-se o PCR para essas,
modificando as variáveis descritas, a fim de no fim obtermos amostras de PCR de todos os
fungos com boa qualidade. Na tabela 7 estão indicados os constituintes da master mix e as
respectivas concentrações que variaram conforme a amostra e concentração de DNA.
Tabela 5 - tabela dos reagentes, volumes e concentrações do master mix
Concentração stock
Volume (µL)
Buffer 10x
2,5
MgCl2 25mM
2,5 - 3
dNTP’s 20mM
0,25 - 0,375
10mM ITS1
1
10mM ITS4
1
Taq 5u/µL
0,125
H2O mQ
16,63 - 14,875
DNA molde
1 - 2
Volume total = 25 µL
Efectuou-se o PCR num termociclador Biometra com o seguinte programa:
Tabela 6 - Programa de PCR
Temperatura (ºC)
Tempo de duração
Nº de repetições
96 (desnaturação inicial)
5 minutos
1
96 (desnaturação)
30 segundos
55 (emparelhamento)
30 segundos
72 (extensão)
90 segundos
72 (extensão final)
7 minutos
1
30
Material e Métodos
34
3.11 Electroforese em gel de agarose
Para confirmar se ocorreu amplificação recorreu-se a electroforese em gel de agarose.
Para tal, preparou-se uma solução a 1% (p/v) de agarose em TAE.
Por cada 100mL de solução adicionou-se uma gota de Brometo de Etídio. Misturou-se
bem e aplicou-se 100mL na tina de electroforese e colocaram-se os pentes.
Carregaram-se no gel, 4µL do produto de PCR com loading buffer, aproximadamente
na razão de 1:1.
A electroforese decorreu com uma voltagem de 150V durante 20-30 minutos.
3.12 Purificação de DNA
Para a purificação do DNA foi usado o kit GENEJETTM
da FERMENTAS® e seguidos os seguintes passos para todas as
amostras obtidas em PCR:
1 Adicionar-se numa razão de 1:1 de binding buffer à mistura
PCR. Contudo como os tubos de PCR tinham todos 25µL e
destes retirou-se 4µL para a electroforese, ficaram com
aproximadamente 21µL, mas para aproveitar o máximo de
produto PCR possível adicionou-se 30µL de binding buffer.
Misturou-se bem a solução.
2 Transferiu-se a solução para colunas de purificação
GENEJETTM. Centrifugou-se durante 30 a 60 segundos a
13000 RPM e descartou-se o líquido que passou pela coluna.
3 Lavagem da coluna. Adicionou-se 700µL de wash buffer e
centrifugou-se novamente durante 30 a 60 segundos de novo a
13000 RPM. Descartou-se novamente o líquido que passou na
coluna e voltou-se a centrifugar a coluna durante 1 minuto a
13000 RPM.
4 Transferiu-se a coluna para um novo tubo de microcentrifugação de 1,5mL, fornecido no
kit. Adicionou-se 50µL de elution buffer à coluna e centrifugou-se novamente durante 1
minuto a 13000 RPM. Desta vez descarta-se a coluna, pois o DNA passou para o tubo de
microcentrifugação. Conservou-se o microtubo com DNA a uma temperatura de -20ºC.
Figura 32 - Esquema da
purificação de DNA
Material e Métodos
35
3.13 Sequenciação
O processo de sequenciação foi levado a cabo pela Stabvida, empresa encarregue de
sequenciar mostras de DNA.
Resultados e Discussão
36
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Testes de confronto
Para os gráficos dos testes de confronto, todas as estirpes que são designadas apenas
pelo seu código (correspondência entre o código e a espécie está na tabela 2 do material e
métodos) são as estirpes que estiveram em confronto na mesma placa. As estirpes cujo código
é seguido da palavra “test” tratam-se das respectivas testemunhas realizadas à parte cada uma
delas.
Para comparação dos ritmos de crescimento entre cada uma das estirpes em confronto
e o seu ritmo normal (sem estarem em competição uma com a outra), foi necessário
realizarem-se as testemunhas, tanto do fungo utilizado, como da Phytophthora cinnamomi
(PH1160).
Por vezes alguns gráficos não vão até ao fim, mas isso explica-se pois, tanto nas
testemunhas como nos confrontos propriamente ditos, para as estirpes crescerem mais
dependiam do espaço colonizado pela outra estirpe presente, sendo impossível em alguns
casos efectuar mais medições.
Também foi medido o crescimento relativo no eixo dos xx na zona entre cada um dos
núcleos de inoculação com o objectivo de estudar o comportamento de cada uma das estirpes
quando crescem uma na direcção da outra.
4.1.1 - Com tempos de inoculação distintos
Os fungos utilizados nestes confrontos tiveram todos a vantagem de serem inoculados
com antecedência na sua respectiva placa, tentando que a velocidade de crescimento da
Phytophthora cinnamomi (PH1160) fosse apaziguada quando confrontada com uma cultura
pré-existente.
As testemunhas dos fungos foram obtidas com base nas medições da área de
crescimento de fungos em placas de confronto cujas estirpes que foram inoculadas depois,
eram iguais a elas. as testemunhas de Phytophthora cinnamomi (PH1160), foram obtidas
pelas medições feitas ao crescimento de PH1160 inoculada numa placa em que previamente
existia a mesma estirpe em vez de um dos fungos. O tempo que separou a primeira da
segunda inoculação para as testemunhas foi sempre igual ao tempo que separou as
inóculações nas placas de confronto entre o fungo e a oomiceta, isto para que cada cultura e a
respectiva testemunha coincidam no tempo de inoculação, permitindo a sua comparação.
Resultados e Discussão
37
Pisolithus tinctorius PT005 vs Phytophthora cinnamomi PH1160 em meio PDA
Gráfico 1 Confrontação entre PT005 (azul) e PH1160 (vermelho) e com as respectivas testemunhas a
verde e a lilás respectivamente
Como podemos constatar no gráfico 1, primeiro que dizer que na mesma placa o
PT005 desenvolveu-se mais do que PH1160, mas mais importante que isso é que podemos
dizer que há uma grande inibição da PH1160 quando inoculada numa placa em que já estava
inoculado PT005, relativamente à sua testemunha, PH1160 test. Com isto pode verificar-se
claramente que a presença de PT005 é bastante inibitória para o desenvolvimento de PH1160,
sendo esta bastante afectada. Quanto ao fungo, este é apenas ligeiramente afectado devido a
ter menos espaço para ocupar a área máxima da placa. No gráfico 2 está representada a
evolução do crescimento no eixo de confrontação, no qual vemos claramente que PT005 é
superior.
Gráfico 2 - Gráfico obtido do crescimento de PT005 vs PH1160 na placa, segundo o eixo de confronto XX
de 3 centímetros entre cada núcleo de inoculação.
Resultados e Discussão
38
Na Figura 33 é possível ver que, desde uma fase muito prematura do crescimento do
oomiceta, a sua inibição e nota-se claramente o alastramento do exsudado pelo meio a
atingir a sua zona. Para além disso, podemos ver também na figura 34 que, numa fase mais
avançada, o PT005 engole a cultura pré-existente de PH1160 em áreas do meio que estão a
limitar o seu crescimento.
PT005 verificou-se
ser uma estirpe de
Pisolithus tinctorius
altamente prolífera, como
podemos observar nas
respectivas linhas de
crescimento demonstradas
no gráfico. É, portanto
uma estirpe que revelou
bastante antagonismo
quando confrontada com a
Phytophthora cinnamomi,
pois tem também a
capacidade de crescer em cima dela, entrelaçando as suas hifas e produzindo o seu exsudado
que é absorvido e incorporado nas suas hifas e swelings e pelo que se viu, pode causar
debilidade a este oomiceta patogénico.
Em anexo 7.6 apresentamos os dados utilizados para a obtenção dos gráficos e em
anexo 7.7 estão disponíveis mais fotos da observação microscópica da placa de confronto
entre estes dois organismos.
Figura 33 - Sucessão do desenrolar dos acontecimentos nas placas de confronto desfasado de
PH005 vs PH1160. Em 1º está a inoculação de PT005 e a sua libertação de exsudado; está a fase inicial da
inoculação de PH1160 e as suas dificuldades; 3º Uma fase mais avançada do confronto, em que o PT005 já está
a colonizar espaços que já tinham PH1160.
Figura 34 - Phytophthora cinnamomi com cristais do exsudado de
Pisolithus tinctorius e com a sua morfologia ligeiramente alterada. Foto
tirada por microscopia a 400X na zona de confronto da placa.
Resultados e Discussão
39
0
5
10
15
20
25
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
Área de crescimento (cm2)
Dias
PT025
Ph1160
PT025 test
PH1160 t est
Pisolithus tinctorius “PT025” vs Phytophthora cinnamomi “PH1160” em meio PDA
Na análise ao gráfico 3, em primeiro lugar há que salientar que PT025 cresceu
ligeiramente mais do que PH1160, tornando-se equiparável durante a fase final do ensaio, em
segundo lugar, mas não menos importante, é podermos dizer que se verifica inibição de
PH1160 quando comparamos a descida da taxa de crescimento na fase exponencial verificada
em PH1160 (inoculada no confronto), relativamente à sua testemunha - PH1160 test. Ainda
assim, depois da fase exponencial a velocidade de crescimento entre a PH1160 e a sua
testemunha é semelhante. Com isto pode verificar-se claramente que a presença de PT025 é
algo inibitória para o desenvolvimento de PH1160, sendo esta um pouco afectada.
Relativamente ao fungo ainda que cresça mais do que o oomiceta, este é afectado tanto como
ele, como se pode ver pela comparação da linha verde, correspondente à testemunha de
PT025, com a linha azul que corresponde ao fungo que esteve em confronto com PH1160.
Gráfico 4 - Gráfico obtido do crescimento de PT025 vs PH1160 na placa, segundo o eixo de confronto XX
de 3 centímetros entre cada núcleo de inoculação.
Gráfico 3 - Confrontação entre PT025 (azul) e PH1160 (vermelho) e com as respectivas testemunhas a
verde e a lilás respectivamente
Resultados e Discussão
40
Na figura 35 estão as etapas do desenvolvimento deste fungo no confronto com
Phytophthora cinnamomi (PH1160) e é possível ver que, o crescimento do oomiceta sofre
inibição e nota-se claramente que essa inibição dá-se mais na direcção do fungo. O gráfico 4
demonstra a evolução dos crescimentos dos 2 organismos no eixo de confrontação.
Constatou-se que
PT025 é uma estirpe de
Pisolithus tinctorius
altamente prolífera, como
podemos observar nas
respectivas linhas de
crescimento demonstradas
no gráfico 2. No entanto,
apesar de ser uma estirpe
antagónica de PH1160,
não é tão eficaz como a
estirpe PT005 pois
permite mais crescimento
do patogéneo. Porém dada a sua grande proliferação, tem capacidade de crescer em cima do
oomiceta, entrelaçando as suas hifas e produzindo o seu exsudado que é nitidamente
absorvido e incorporado nas hifas e swelings da Phytophthora cinnamomi, alterando a sua
conformação.
No anexo 7.7 apresentamos mais fotos da observação microscópica da placa de
confronto entre estes dois organismos, assim como em anexo 7.6 estão os dados utilizados
para a obtenção dos gráficos.
Figura 35 - Desenrolar dos acontecimentos nas placas de confronto desfasado de PH025 vs PH1160. Em 1º
está o período após inoculação de PT005 e a sua libertação de exsudado; 2º está a fase inicial da inoculação
de PH1160; 3º Uma fase mais avançada do confronto, em que o PT005 está a colonizar espaços que
tinham PH1160, atingindo o seu núcleo de inoculação.
Figura 36 Imagem do eixo de confrontação em que, estruturas
semelhantes à assinalada pela bolinha azul são de PH1160 com cristais de
exsudado absorvidos e estruturas assinaladas pelas bolinhas a vermelho
são ansas anastomosas que nos indicam a presença de basidiomicetas
(que neste caso é o PT025). Ampliação 400X.
Resultados e Discussão
41
0
5
10
15
20
25
30
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36
Área de crescimento (cm2)
Dias
PT14HS
Ph1160
PT14HS test
PH1160 t est
Pisolithus tinctorius PT14HS” vs Phytophthora cinnamomi “PH1160” em meio PDA
Pela análise do gráfico 5, podemos de imediato referir que, mesmo sendo inoculada
depois, PH1160 apresentou velocidades de crescimento tais que permitiram ultrapassar a área
se crescimento do PT14HS. No entanto, não foi propriamente a PH1160 que foi mais rápida,
mas sim o PT14HS que foi mais lento, quando comparado com as restantes estirpes de
Pisolithus tinctorius (PT005 e PT025). Ainda assim nota-se bastante equilíbrio entre os
crescimentos dos dois inoculados. Para além disso, tanto PH1160 como PT14HS mostraram
que são mais lentos a crescer em competição, comparativamente às suas testemunhas.
É importante referir que o abrandamento final na curva da testemunha da PH1160
(PH1160 test) se deve ao simples facto desta ter sido impossibilitada de crescer mais na sua
placa visto que previamente estava inoculada 18 dias antes a mesma estirpe, e como se trata
de uma estirpe muito prolífera, especialmente sem competição, não restou muito espaço para
a testemunha crescer. No entanto a sua curva acentuada até ao dia 28, relativamente à
PH1160 do confronto, é indicadora de que, sem o PT14HS, esta estirpe cresceria melhor.
Gráfico 6 - Gráfico obtido do crescimento de PT14HS vs PH1160 na placa, segundo o eixo de confronto
XX de 3 centímetros entre cada núcleo de inoculação.
Gráfico 5 - Confrontação entre PT14HS (azul) e PH1160 (vermelho) e com as respectivas testemunhas a
verde e a lilás respectivamente
Resultados e Discussão
42
PT14HS foi uma estirpe que deu bastante trabalho pois no início não estava a
desenvolver-se muito bem, porém após repicagens sucessivas a estirpe começou a
desenvolver-se mais rápido, mas nunca alcançando as velocidades de PT005 ou de PT025.
A estirpe PT14HS
é uma estirpe de
Pisolithus tinctorius
menos prolífera, como
está latente nos seus
gráficos de crescimento.
É, de resto a estirpe de
Pisolithus tinctorius
utilizada neste trabalho
menos antagónica de
Phytophthora cinnamomi.
Porém revela, tal
como foi característica de
todas as estirpes de Pisolithus tinctorius, capacidade de crescer em cima do oomiceta,
entrelaçando as suas hifas e produzindo um exsudado muito concentrado que é absorvido e
incorporado nas hifas e swelings da Phytophthora cinnamomi, alterando a sua conformação.
Este fungo não sendo muito inibidor da Phytophthora cinnamomi é certamente um fungo com
resistência a ela, resta saber se é suficiente para proteger a planta do oomiceta. Em anexo 7.7
estão mais fotos e dados utilizados para os gráficos.
Figura 37 Deferentes fases nas placas de confronto desfasado de PH14HS vs PH1160. Na
primeira imagem vemos a PH1160 já com bastante área colonizada, enquanto PT14HS
continua em crescimento lento. Na segunda imagem vemos que a PH1160 estagnou o
crescimento e com isso o PT14HS vai aos poucos colonizando espaços que já tinham PH116.
Figura 38 Zona de confronto, na qual à direita vemos PH1160 com
cristais de exsudado absorvidos e à esquerda uma “nuvem” de hifas de
PT14HS produzindo exsudado em massa. Ampliação 600X.
Resultados e Discussão
43
0
5
10
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20
25
30
0246810 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44
Área de crescimento (cm2)
Dias
TN3
Ph1160
TN3 test
PH1160 test
Macrolepiota procera “TN3” vs Phytophthora cinnamomi “PH1160” em meio PDA
Pela análise ao gráfico 7 devemos, desde logo, ressalvar que TN3 se trata de uma
estirpe ligeiramente mais lenta do que as estirpes analisadas até agora. No entanto ainda está
num patamar bastante satisfatório pois é capaz de crescer continuamente desde que é
inoculada, ainda que a um ritmo moderado. PH1160 consegue após, aproximadamente 20
dias de inoculação, ultrapassar a área de crescimento já alcançada por TN3 ao longo de 30/31
dias. Porém, como se nota no gráfico, a curva de crescimento da PH1160 é drasticamente
reduzida quando comparada com a sua testemunha PH1160 test, enquanto TN3 apenas sofre
uma pequena inibição relativamente à sua testemunha, sendo a parte final da sua curva mais
baixa do que a testemunha devido também à ocupação dos espaços pela PH1160 no
confronto, impossibilitando assim TN3 de continuar a crescer como a sua testemunha.
Gráfico 8 - Gráfico obtido do crescimento de TN3 vs PH1160 na placa, segundo o eixo de confronto XX de
3 centímetros entre cada núcleo de inoculação.
O gráfico 8 demonstra como TN3 se manteve praticamente no mesmo ritmo de
crescimento após inoculação de PH1160 e como esta se mostrou inibida com esse factor.
Gráfico 7 - Confrontação entre TN3 (azul) e PH1160 (vermelho) e com as respectivas testemunhas a
verde e a lilás respectivamente
Resultados e Discussão
44
Na figura 40 está
representada uma zona do eixo de
confronto, na qual um
emaranhado de hifas de TN3 (à
esquerda) parece bloquear a
progressão de PH1160 (à direita)
Na figura 41 está
representada uma estrutura
referente a PH1160 utilizada no
teste de confronto com TN3 e que
parece estar bastante afectada e as
hifas apresentam o conteúdo celular
colapsado e estão aparentemente
mortas. Pode ser uma resposta ao
stress do confronto com TN3. Sobre
TN3 podemos dizer que não parece
efectuar qualquer tipo de inibição por
exsudado, mas que provoca uma forte
inibição física, ou seja, onde existe
TN3 a PH1160 não cresce de modo
algum.
Figura 39 Várias etapas no desenvolvimento do confronto de TN3 com PH1160. A primeira foto é
TN3 uns dias após inoculação, a segunda é numa altura em que PH1160 estava vigorosa e a colonizar
toda a placa incluindo em redor do TN3 e na terceira foto a TN3 continua a crescer lentamente em
zonas já povoados por PH1160 mas sem grande eficácia já com a PH1160 em declínio.
Figura 40 - Fotografia tirada em microscopia da zona do eixo de
confronto. Ampliação com objectiva de 400X.
Figura 41 - Aspecto de PH1160 na placa de confronto com
TN3. Ampliação 400X.
Resultados e Discussão
45
Paxillus involutus PX001vs Phytophthora cinnamomi PH1160 em meio PDA
Gráfico 9 - Confrontação entre PX001 (azul) e PH1160 (vermelho) e com as respectivas testemunhas a
verde e a lilás respectivamente
Pela análise do gráfico 9 podemos dizer que este fungo não efectua qualquer tipo de
entrave ao crescimento de PH1160 por três grandes motivos: primeiro pois como se vê não é
um fungo muito prolífero; segundo porque cresceu muito menos na placa de confronto, sendo
ele o organismo mais inibido; e terceiro pois a PH1160 curiosamente até se desenvolveu
melhor em confronto do que na testemunha, embora que isso possa dever-se apenas ao espaço
concedido pela outra estirpe presente, e no caso na testemunha era a própria PH1160.
Apesar de se ter desenvolvido e produzido exsudado, tal como PT005, PT025 e
PT14HS, esse exsudado pareceu não fragilizar a cultura de PH1160. Contudo pela análise das
placas na figura 42 podemos dizer que a PH1160 apesar de ter um crescimento muito rápido,
o PX001 parece
oferecer grande
resistência física pois
funciona como um
castelo e a PH1160
não cresce onde
PX001.
Figura 42 Evolução do confronto, na qual vemos claramente o PX001
estagnado e a PH1160 a colonizar toda a placa. Vemos também muita presença
de exsudado tanto no meio como por cima do fungo.
Resultados e Discussão
46
Como podemos ver na figura 43,
a PH1160 não parece muito afectada, no
confronto, sendo que se mostra muito
ramificada e com muitos swelings.
Ainda que em todo o meio estivesse
espalhado exsudado, este parece não ter
sido absorvido pela PH1160, ao
contrário do exsudado de PT005, PT025
e PT14HS.
Na figura 44, podemos ter a confirmação
de que o exsudado não afecta a cultura de
PH1160, nem mesmo na zona de confronto, em
que vemos uma hifa de PX001 perfeitamente
identificável pela sua coloração com o próprio
exsudado e ao seu redor hifas de PH1160
normais, com sinais de vigor dada a presença de
ramificações e swelings.
O gráfico 10 confirma as debilidades demonstradas por PX001 para crescer, visto que
praticamente estagnou já antes de ser inoculada PH1160, crescendo esta normalmente.
Figura 43 - Esta figura demonstra como a PH1160 estava
vigorosa, com presença de muitos swelings. Como se
pode ver, a PH1160 não absorveu o exsudado do meio, ou
se o fez não tingiu como nos confrontos com PT’s.
Ampliação de 200X.
Figura 44 - Esta foto é da zona de confronto, na
qual vemos um hifa do PX001 corada com o seu
próprio exsudado e as estruturas correspondentes
a PH1160 continuma indiferentes. Ampliação de
400X.
Gráfico 10 - Gráfico obtido do crescimento de PX001 vs PH1160 na placa, segundo o eixo de confronto
XX de 3 centímetros entre cada núcleo de inoculação.
Resultados e Discussão
47
Lactarius acerrimus “BS163” vs Phytophthora cinnamomi PH1160 em meio PDA
Gráfico 11 - Confrontação entre BS163 (azul) e PH1160 (vermelho) e com as respectivas testemunhas a
verde e a lilás respectivamente
Pela análise do gráfico podemos, desde logo dizer que as culturas de BS163 do
confronto e das testemunhas não se desenvolveram como seria esperado. De antemão
sabíamos que era uma estirpe mais delicada para crescer e que necessitava de um meio
nutritivo mais rico. Foi por isso que se utilizou o meio BAF (em anexo 7.2). Contudo, o
crescimento desta estirpe identificada como sendo de Lactarius acerrimus não foi como seria
ideal para um teste de confronto com PH1160.
Ainda assim, apesar de o gráfico pouco apontar acerca do confronto com PH1160 por
escassez de dados, podemos tirar mais algumas conclusões tanto do gráfico do crescimento
no eixo de confrontação como das imagens das placas de confronto.
Gráfico 12 - Gráfico obtido do crescimento de BS163 vs PH1160 na placa, segundo o eixo de confronto
XX de 3 centímetros entre cada núcleo de inoculação.
Resultados e Discussão
48
Como podemos ver nos gráficos 11 e 12 e na figura 45, BS163 não mostrou apetência
para proliferar no meio, sendo rapidamente apanhado e encurralado pela PH1160, que cresceu
bastante como se pode ver. Esta estirpe, curiosamente pelo pouco que cresceu, emitiu uma
espécie de aglomerados de micélio para cima e que deram o aspecto de espinhos. No conjunto
geral, podemos definir esta estirpe, pelo menos nesta experiência, como uma estirpe de
crescimento muito lento, sem produção de exsudados nocivos para PH1160 e sem grande
inibição física, tendo em conta que a PH1160, como se na segunda imagem da figura 46,
cresce nitidamente em zonas anteriormente colonizadas por BS163. Sendo assim,
macroscopicamente não mostrou ser uma estirpe antagónica de Phytophthora cinnamomi.
Ainda assim foi analisado o
confronto ao microscópio e, da zona
de confronto pôde ver-se o que está
presente na figura 46, ou seja, uma
PH1160 saudável e bem ramificada
e hifas de BS163 que não parecem
consistir obstáculos para a sua
propagação. Apesar da imagem não
ser a melhor, dada a grande
densidade de hifas, nota-se que
uma mistura em que PH1160 parece
ser a estirpe mais dominadora.
Figura 45 - Imagens do confronto entre BS163 e PH1160. Note-se que o
crescimento de PH1160 em meio BAF não é idêntico ao do meio PDA, sendo que
neste meio BAF, a PH1160 tende a adoptar um aspecto mais felpudo e em relevo.
Figura 46 Foto do eixo de confrontação, no qual vemos
estruturas lisas e compridas relativas a BS163 e estruturas
ramificadas em swelings relativas a PH1160. Foto obtida com
ampliação de 600X.
Resultados e Discussão
49
0
5
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0246810 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70
Área de crescimento (cm2)
Dias
BS142
Ph1160
BS142 test
PH1160 t est
Gráfico 13 - Confrontação entre BS142 (azul) e PH1160 (vermelho) e com as respectivas testemunhas a verde
e a lilás respectivamente
Cortinarius variicolor BS142” vs Phytophthora cinnamomi “PH1160” em meio PDA
Pela observação das linhas de crescimento do gráfico 7, podemos rapidamente
concluir que BS142 é uma estirpe de crescimento lento, ainda que continuado. Podemos
também dizer que esta estirpe revela alguma indiferença, estando ou não na presença de
PH1160. É nesse contexto, a estirpe utilizada neste trabalho que revelou mais semelhanças
entre as testemunhas (BS142 test) e as estirpes usadas no confronto (BS 142). A estirpe
PH1160 utilizada no confronto cresceu mais e melhor, relativamente à sua testemunha pois
do outro lado estava uma estirpe de BS142 bastante lenta, daí que restassem muitos espaços
para colonizar a placa.
Na parte final do gráfico de crescimento da PH1160 no confronto observa-se quase
uma recta horizontal, pois a placa estava praticamente toda colonizada e daí que o
crescimento tenha estagnado. No entanto, o BS142 continuou a crescer ao seu ritmo lento e
foi capaz de lentamente ir colonizando espaços ocupados por PH1160, característica que se
revelou positiva neste teste de confronto.
Contudo, parece não haver um grande confronto pois as duas estirpes parecem estar
relativamente normais e indiferentes uma à outra.
Resultados e Discussão
50
O observado nas figuras 47 e
48 é indicativo da indiferença que a
PH1160 provoca, estando ou não no
meio com o fungo. Ainda assim,
podemos caracterizar este fungo
relativamente ao seu
comportamento versus PH1160
como resistente, embora não pareça
inibir com exsudados. Este fungo
também tem a capacidade de gerar
rizomorfos que estarão em anexo
7.7.
O gráfico traduz o que foi referido, em que o BS142 parece continuar o seu ritmo
lento de crescimento após confrontado com PH1160, enquanto este último parece reduzir o
seu ritmo à medida que compete com o fungo.
Figura 47 Evolução do confronto entre BS142 e PH1160, no qual podemos observar que BS142
não se sente ameaçado com a presença de PH1160 mas esta parece mostrar alguma inibição ao
aproximar-se do fungo.
Figura 48 - Fotografia tirada em microscopia do eixo de
confrontação. Ampliação de 200X
Gráfico 14 - Gráfico obtido do crescimento de BS142 vs PH1160 na placa, segundo o eixo de confronto
XX de 3 centímetros entre cada núcleo de inoculação.
Resultados e Discussão
51
Amanita ponderosa AP2” vs Phytophthora cinnamomi “PH1160” em meio BAF
Gráfico 15 - Confrontação entre AP2 (azul) e PH1160 (vermelho) e com a testemunha da PH1160 a verde.
Neste confronto, por falta de material biológico (micélio de AP2), não foi possível a
realização das testemunhas para este fungo. E mesmo assim o material utilizado para o teste
de confronto se desenvolveu em algumas placas, sendo as restantes não utilizadas para a
obtenção dos valores apresentados no gráfico. Outro dos problemas foi que não se pôde
realizar uma testemunha para PH1160 em meio BAF, mesmo sabendo de antemão que o
crescimento do oomiceta nos dois meios é diferente, embora rápido. Ainda assim coloquei a
curva de crescimento de PH1160 no meio PDA para comparar.
O fungo AP2
mostrou-se um fungo
muito lento no
crescimento e sem
produção de
exsudados visíveis e
com efeito inibidor
para PH1160. No entanto, numa fase em que a PH1160 se aproximou de AP2, este exibiu
grande resistência física, não deixando PH1160 colonizar os seus espaços.
Figura 49 Evolução do confronto entre AP2 e PH1160
Resultados e Discussão
52
Como as duas estirpes não
demonstraram grande oposição no
confronto, não se conseguiram
imagens mostrando interacções
físicas entre as duas. No entanto,
ambas foram fotografadas para
observar microscopicamente o
comportamento dos diferentes
intervenientes no confronto.
O gráfico 16 evidencia o diâmetro de crescimento no eixo de confrontação e podemos
dizer que AP2 apesar de ter um ritmo muito lento, começou a estagnar precisamente na altura
em que o crescimento de PH1160 começou a ser mais acelerado, o que pode ser um indicador
contra o uso deste fungo no combate à Phytophthora cinnamomi.
Boletus aereus MU29” vs Phytophthora cinnamomi “PH1160” em meio BAF
Quanto a MU29, a estirpe utilizada de Boletus aereus, não foi possível obter-se
qualquer resultado pois a estirpe não se desenvolveu e não foi possível averiguar o seu
antagonismo face à estirpe PH1160 de Phytophthora cinnamomi.
Figura 50 - Imagem capturada em microscopia com ampliação
de 600X das hifas de AP2 com presença de septos.
Gráfico 16 - Gráfico obtido do crescimento de AP2 vs PH1160 na placa, segundo o eixo de confronto
XX de 3 centímetros entre cada núcleo de inoculação.
Resultados e Discussão
53
0
5
10
15
20
25
30
35
0246810 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36
Área de crescimento (cm2)
Dias
PT005
PH1160
PT005 test
PH1160 test
4.1.2 - Com tempos de inoculação simultâneos
Pisolithus tinctorius PT005” vs Phytophthora cinnamomi “PH1160” em meio PDA
Pela observação do gráfico 17, podemos dizer que PT005 mostrou bastante
capacidade para inibir PH1160, visto que PH1160 foi bastante afectada no crescimento
relativamente à sua testemunha. No entanto, ambos efectuaram uma forte disputa pela
colonização da placa ficando praticamente iguais. Mesmo assim, PH1160 variou mais o seu
ritmo de crescimento do que PT005 que manteve sempre o mesmo ritmo. A partir do dia 30
colonizou áreas já ocupadas por PH1160. Mesmo inoculada em simultâneo com PH1160, esta
estirpe mostrou-se bastante antagónica. O gráfico 18 mostra como numa primeira fase a
PH1160 aproximou-se de PT005 mas ulteriormente abrandou e cedeu espaços, nos quais
PT005 cresceu.
Gráfico 17 Confrontação em simultâneo entre PT005 (azul) e PH1160 (vermelho) e respectivas
testemunhas a verde e a lilás respectivamente
Gráfico 18 - Gráfico obtido do crescimento de PT005 vs PH1160 na placa, segundo o eixo de
confronto XX de 3 centímetros entre cada núcleo de inoculação.
Resultados e Discussão
54
Pisolithus tinctorius “PT025” vs Phytophthora cinnamomi “PH1160” em meio PDA
Gráfico 19 - Confrontação em simultâneo entre PT025 (azul) e PH1160 (vermelho) e respectivas
testemunhas a verde e a lilás respectivamente
Neste confronto de PT025 com PH1160 em simultâneo, igualmente se obtiveram
resultados formidáveis. Primeiro, esta estirpe PT025 conseguiu inibir bastante o crescimento
de PH1160, mas mais interessante do que isso é que a competição com o oomiceta parece ter
estimulado o crescimento de PT025, sendo que cresceu mais e melhor do que se estivesse a
ser confrontado com ele próprio como acontece em PT025 test. Outro facto é que, o
exsudado libertado parece ter atrasado a fase exponencial no crescimento de PH1160, dando
tempo ao PT025 para se adiantar na colonização das placas e quando PH1160 finalmente
começou a crescer já não teve tanto espaço e acabou por não ultrapassar o fungo na sua área.
no gráfico 20 podemos claramente ver no eixo de confrontação que, numa fase
muito precoce a PH1160 cresceu a um ritmo elevado, mas assim que PT025 libertou
exsudado suficiente esse ritmo abrandou, ficando o fungo a crescer normalmente e a
colonizar zonas anteriormente colonizadas por PH1160.
Gráfico 20 - Gráfico obtido do crescimento de PT025 vs PH1160 na placa, segundo o eixo de
confronto XX de 3 centímetros entre cada núcleo de inoculação.
Resultados e Discussão
55
Pisolithus tinctorius “PT14HS” vs Phytophthora cinnamomi “PH1160” em meio PDA
Gráfico 21 - Confrontação em simultâneo entre PT14HS (azul) e PH1160 (vermelho) e respectivas
testemunhas a verde e a lilás respectivamente
O PT14HS era um dos fungos testados nos confrontos desfasados que não tinha
mostrado um ritmo tão elevado de crescimento como PT005 ou PT025, mas ainda assim tinha
algumas particularidades que o tornavam interessantes para este teste simultâneo.
Desde logo observa-se que o seu ritmo não foi tão lento como nos testes desfasados,
mas, no entanto não demonstrou capacidade para retardar nem impedir o desenvolvimento de
PH1160, apenas reduzindo a sua área colonizada pois esta não cresce mesmo onde haja
Pisolithus tinctorius, qualquer que seja a estirpe utilizada neste trabalho. No entanto, os
resultados do crescimento no eixo de confrontação revelam que o fulgor inicial de PH1160 se
foi apaziguando enquanto PT14HS continuou sempre no mesmo ritmo demonstrando
resistência. Encontraram-se e estagnaram mesmo a meio da distância entre os dois núcleos de
inoculação, ou seja, a 1,5 cms (ou 15mm).
Gráfico 22 - Gráfico obtido do crescimento de PT14HS vs PH1160 na placa, segundo o eixo de
confronto XX de 3 centímetros entre cada núcleo de inoculação.
Resultados e Discussão
56
Macrolepiota procera “TN3” vs Phytophthora cinnamomi “PH1160” em meio PDA
Gráfico 23 - Confrontação iniciada em simultâneo entre TN3 (azul) e PH1160 (vermelho) e respectivas
testemunhas a verde e a lilás respectivamente
No gráfico 23 podemos constatar que a competição estimulou, numa primeira fase o
crescimento de TN3, até que a velocidade de crescimento da PH1160 se sobrepôs, levando ao
abrandamento do ritmo por parte de TN3. Ainda assim, PH1160 não conseguiu crescer, nem
tão rápido nem tanto como na sua testemunha, isto devido à resistência que TN3 ofereceu
face à sua proliferação. Mais uma vez, no gráfico de crescimento no eixo de confrontação
nota-se a primeira fase, na qual PH1160 tem um ritmo mais elevado de crescimento, sendo
que depois, dada a aproximação TN3, esta começa a estagnar no crescimento enquanto o
fungo continua a crescer ocupando mais terreno nesse mesmo eixo e bloqueando a passagem
de PH1160.
Gráfico 24 - Gráfico obtido do crescimento de TN3 vs PH1160 na placa, segundo o eixo de confronto
XX de 3 centímetros entre cada núcleo de inoculação.
Resultados e Discussão
57
4.2 Inoculações em Cistus ladanifer e Xolantha guttata
Quanto aos resultados das inoculações em Cistus ladanifer e Xolantha guttatta
podemos dizer que até foram um sucesso pois praticamente em todas as plantas inoculadas e
não contaminadas, se observou ao microscópio crescimento de fungo e estabelecimento de
micorrizas.
Com Cistus ladanifer
observou-se micorrização com AP2
e MU29 em meio MS, aparecendo
vários arbúsculos nos espaços
intracelulares indicativos da
presença de endomicorrizas. em
vermiculite/turfa observou-se
também micorrizas de AP2, mas
também de M164 e PT034, sendo
que de MU29 em vermiculite não
se conseguiu observar nada que
pudesse sugerir presença de
micorrização.
Relativamente a Xolantha
guttata também se observaram
estruturas correspondentes a
micorrizas com AP2 e MU29 em
meio MS, com a presença de
arbúsculos. Em vermiculite/turfa
visualizaram-se também micorrizas
com AP2, PT034 e MU29, desta vez
bastante mais evidentes. No entanto,
M164, que foi a estirpe que
melhores resultados apresentou em Cistus ladanifer, parece não se ter desenvolvido tão bem
com Xolantha guttata. Estão mais fotografias tiradas em anexo 7.8 para complementar estes
resultados.
Figura 52 Arbúsculos em Xolantha guttata em meio MS
inoculada com MU29 (Boletus aereus). Ampliação de400X
Figura 51 - Cistus ladanifer em vermiculite/turfa inoculada com
M164 (Scleroderma cepa). Corte transversal na micorriza, em
que vemos hifas em redor e a entrar na raiz. Ampliação de
400X
Resultados e Discussão
58
4.3 Testes com exsudado de PT14HS
Para o teste realizado com meio PDA e PDA alterado (ambos em anexo 7.4), os
resultados foram os demonstrados na figura 54, em que na placa que continha exsudado de
PT14HS, a PH1160 não se desenvolveu tão rápido, apesar de também não mostrar grande
debilidade. As fotografias obtidas por microscopia destas duas placas estão disponíveis em
anexo 7.8.
Pela análise à figura 55 podemos dizer que PH1160 não foi nada semelhante no seu
comportamento nos dois meios, sendo que no MMN convencional cresceu normalmente,
embora mais lentamente do que no meio PDA (o seu meio de eleição). no MMN com
exsudado de PT14HS e neutralizado para o mesmo pH do MMN convencional
(aproximadamente 5,5), à primeira vista parece claramente que não houve qualquer
crescimento mas ao aproximarmo-nos, percebe-se que PH1160 cresceu mas com estruturas
muito finas e com aspecto frágil, como está bem latente nas fotografias no anexo 7.8.
Assim é possível dizer que o exsudado de PT14HS afecta o crescimento de PH1160.
Figura 53 - À esquerda uma placa de meio PDA convencional, e à direita uma placa com meio
PDA alterado (em anexo 7.5) contendo exsudado de PT14HS. Fotografias tiradas 8 dias após
a inoculação de PH1160 em ambas as placas.
Figura 54 - À esquerda uma placa de meio MMN convencional com PH1160, e à direita uma
placa com o meio MMN de cultura de PT14HS contendo o seu exsudado. Fotografia tirada 6
dias após a inoculação de ambas as placas.
Resultados e Discussão
59
4.4 Inoculações in vivo
Relativamente à produção do inóculo destinado às inoculações in vivo, somente as
estirpes de Pisolithus tinctorius se desenvolveram em meio líquido, sendo que MU29 e AP2
não se desenvolveram.
A verificação do desenvolvimento de micorrizas só será efectuada no final do mês de
Novembro pelo que estes resultados não serão apresentados neste relatório.
4.5 Sequenciação e análise de dados
A análise das sequências foi efectuada através de BLASTS® na base de dados do
NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), permitindo tirar as seguintes conclusões que se
seguem.
Para a estirpe PH1160, a sequenciação confirmou tratar-se da espécie Phytophthora
cinnamomi pois a sequência coincidia em 99-100% de identidade com outras sequências
publicadas como pertencentes a esta espécie.
Quanto a PT025, após o BLAST, verificou-se que a sequência coincidia em 96% com
uma cultura de Pisolithus tinctorius identificada. Nos 100 primeiros resultados, 44
correspondiam a sequências de Pisolithus tinctorius, e para além disso só houve no máximo 3
encontradas para outra qualquer espécie.
Para a estirpe PT005 obteve-se uma sequência de má qualidade quando tratada no
programa BIOEDIT® mas para a qual se encontrou homologia com culturas do género
Pisolithus, mas também com bastantes sequências de Pisolithus tinctorius com 96% de
identidade. Ainda assim podemos afirmar com segurança que se trata de uma estirpe de
Pisolithus tinctorius, pois das 100 primeiras sequências encontradas, 50 delas correspondiam
a Pisolithus tinctorius sendo que apenas 20 correspondiam a Pisolithus albus ainda que c