ArticlePDF Available

Use of fine needle aspiration biopsy and flow cytometry in diagnosis of non-Hodgkin lymphoma. ZNACZENIE DIAGNOSTYKI CYTOMETRYCZNEJ CHŁONIAKÓW. Opracowanie oparte na ponad 6000 biopsji cienkoigłowych z cytometrią przepływową

Authors:
  • Maria Sklodowska-Curie National Research Institute of Oncology Warsaw, Poland
Article

Use of fine needle aspiration biopsy and flow cytometry in diagnosis of non-Hodgkin lymphoma. ZNACZENIE DIAGNOSTYKI CYTOMETRYCZNEJ CHŁONIAKÓW. Opracowanie oparte na ponad 6000 biopsji cienkoigłowych z cytometrią przepływową

CYTOMETRIA POLSKA

  ://.///
   ://.///
Redaktor Naczelny
Prof. dr hab. n. med. Piotr Smolewski
  - 
. C    –   
Janusz Skierski
. W    –    
Jarosław Baran
. O     
Cezary Watała, Joanna Rywaniak, Karolina Siewiera, Hassan Kassassir, Radosław Sychowski,
Magdalena Łabieniec-Watała
. C     
Juzwa Wojciech, Myszka Kamila, Konieczny Piotr, Czaczyk Katarzyna
. W        -
      
 +  +  -
Bartłomiej Tykałowski, Andrzej Koncicki
. R  :   NKT
   
Agnieszka Bojarska-Junak
. A     
 
Anna Pituch-Noworolska
. W     
   
Ewa K. Zuba-Surma, Anna Łabędź-Masłowska, Elżbieta Kamycka, Zbigniew Madeja, Mariusz Z. Ratajczak
. D     
Anna Pituch-Noworolska
. Z   
O       
 
Grzegorz Rymkiewicz
. A    
Dorota Jesionek-Kupnicka
. C  P R  M L  D 
C M   A  C R (-)
Zbigniew Darzynkiewicz
Cytometria Polska
4
tom 1, zeszyt nr 1, 2012


 

 
 
 

A M
A M

 - 
 
 
 
 
 
 
 
 - 
 
 - 
 - 
 
 
 
 
 
 
 - 

  
   
.  , - , 
:  --, :  --
: cytometria.polska@wp.pl
5
Cytometria Polska tom 1, zeszyt nr 1, 2012
Szanowni Państwo,
Mamy wielką przyjemność i zaszczyt oddać w Państwa ręce pierwszy numer
Cytometrii Polskiej, kwartalnika Polskiego Towarzystwa Cytometrii. Potrzeba wymia-
ny doświadczeń i integracji różnych środowisk cytometrycznych w naszym kraju jest
niewątpliwa. Wydaje się, że inicjatywa stworzenia tego czasopisma stanowi ważny krok
w tym celu.
Cytometria Polska” jest obecnie czasopismem w formie elektronicznej, dostęp-
nym na stronie internetowej Polskiego Towarzystwa Cytometrii. W pierwszym nume-
rze znajdziecie Państwo prace, których autorami są wykładowcy II Zjazdu Polskiego
Towarzystwa Cytometrii (Kazimierz n. Wisłą, 7-8 września 2012). Zeszyt kończy nota
biograczna autorstwa prof. Zbigniewa Darzynkiewicza (Dyrektor Brander Cancer Re-
search Institute, New York Medical College, Valhalla, NY, USA), podsumowująca wie-
loletnią współpracę polskich naukowców z jego ośrodkiem.
Serdecznie zapraszamy do lektury pierwszego numeru „Cytometrii Polskiej” oraz
następnych, już przygotowywanych. Prosimy także o czynny współudział w tworzeniu
i umacnianiu rangi czasopisma poprzez nadsyłanie artukułów, zarówno poglądowych
jak i oryginalnych.
W imieniu Zespołu Redakcyjnego Cytometrii Polskiej,
Prof. Piotr Smolewski
Redaktor Naczelny
Prezes Polskiego Towarzystwa Cytometrii
Cytometria Polska
6
tom 1, zeszyt nr 1, 2012


W artykule przedstawiono w skrócie historię rozwoju cytometrii przepływowej od lat trzy-
dziestych dwudziestego wieku do chwili obecnej.
Początki cytometrii przepływowej sięgają lat trzy-
dziestych dwudziestego wieku, kiedy to Moldavan
(w 1934 roku) opisał pierwsze urządzenie służące do
pomiaru krwinek w przepływie. Urządzenie to skła-
dało się z kapilary, przez którą płynęły krwinki lub
komórki drożdży zabarwione czerwienią obojętną,
umieszczonej na stoliku mikroskopu. Okular mikro-
skopu był połączony z licznikiem fotoelektrycznym.
Poważnym problemem technicznym było uzyska-
nie stabilnego przepływu krwinek w wąskim kana-
le, gdyż agregaty komórek blokowały przepływ. Po-
dobne urządzenie zostało opisane w 1941 roku przez
Kielland’a.
Przełomem i rozwiązaniem problemu prze-
pływu komórek w wąskich kanałach było opraco-
wanie przez Crosland-Taylor’a w 1953 r. szerokiej
komory przepływowej, w której do szybko płynącej
cieczy wstrzykiwano ze znacznie mniejszą prędkoś-
cią zawiesinę komórek. Strumień komórek ulegał
zawężeniu do jednokomórkowej cylindrycznej war-
stwy umieszczonej dokładnie w środku kanału (tzw.
ogniskowanie hydrodynamiczne), a znaczna szero-
kość komory zmniejszała prawdopodobieństwo jej
blokady przez agregaty komórkowe. Zasada ta legła
u podstaw wszystkich obecnie produkowanych cyto-
metrów.
Równolegle rozwijaną techniką, potrzeb
hematologom, było liczenie stężenia i szacowanie
wielkości komórek. U podstaw tej techniki legł pa-
tent zgłoszony w 1949 roku przez Coultera. Zasadą
tej techniki było przepuszczanie zawiesiny komórek
przez wąską dyszę i pomiar zmian impedancji na
dyszy. Każda komórka przechodząc przez dyszę ge-
nerowała impuls elektryczny, którego wielkość zale-
żała od rozmiarów tej komórki. Tak powstał Licznik
Coultera, służący do liczbowej oceny morfologii krwi
nawet do dzisiaj.
Powstanie mikroskopii uorescencyjnej sięga
1904 roku, a w późniejszych latach stworzono pod-
stawy mikrospektrofotometrii. W układach optycz-
nych opartych na mikroskopie uorescencyjnym
naturalnym źródłem światła była wysokociśnieniowa
lampa rtęciowa np. typu HBO-100. Zaletą tej lampy
była emisja prawie ciągłego widma sięgającego od
nadoletu do czerwieni. Pierwsze mikrospektro-
uorymetry powstały w latach 1950-tych (Mellors,
1950). Pierwotnie służyły one do identykacji komó-
rek nowotworowych w rozmazach z szyjki macicy na
zasadzie wyższej zawartości kwasów nukleinowych
wkomórkach dzielących się. Pojawiły się próby za-
stosowania analizy obrazu do identykacji komórek,
ale zbyt niskie moce obliczeniowe ówczesnych kom-
puterów nie doprowadziły do powstania aparatury
zdatnej do praktycznego zastosowania.
Pierwszym cytometrem przepływowym
umożliwiającym rejestrację parametrów rozprosze-
nia światła na komórce oraz natężenia światła uore-
scencji lub pochłaniania światła wzbudzającego było
urządzenie opracowane przez Louis’a Kamentsky’ego
we wczesnych latach 60-tych. Po latach usprawnień
koncepcja Kamentsky’ego znalazła urzeczywistnienie
w cytometrze „Cytograf” rmy Ortho.
W latach 70-tych Dittrich i Gohde opraco-
wali komorę przepływową, w której odpowiednio
ltrowane światło lampy rtęciowej wzbudzało uo-
rescencję w układzie „epi” ze strumieniem komórek
skierowanym na wprost obiektywu. Komórki płynę-
ły przez płaszczyznę ostrości obiektywu i po jej mi-
nięciu były kierowane w bok. Taki układ optyczny
powodował równomierny rozkład natężenia światła
wzbudzającego i znaczne zmniejszenie współczynni-
ka zmienności rejestrowanego natężenia światła u-
orescencji. Przy pomiarach DNA i znakowaniu tego
kwasu nukleinowego przy pomocy barwnika DAPI
osiągnięto precyzję oznaczania zawartości DNA
pozwalającą na rozróżnienie plemników z chromo-
somem X od plemników z chromosomem Y, a tak-
że komórek somatycznych XX i XY. Tak powstał
J S
7
Cytometria Polska tom 1, zeszyt nr 1, 2012
w Niemczech Phywe Impulscytophotometer pro-
dukowany później w USA przez Ortho pod nazwą
ICP22.
Poniższa rycina przedstawia schemat optycz-
ny tego cytometru. Pozwalał on na pomiar natęże-
nia uorescencji do trzech barwników o maksimach
uorescencji w zakresie zieleni, żółcieni i czerwieni
przy zastosowaniu ltra wzbudzającego 488 nm (nie-
bieskiego) lub uorescencji niebieskiej i czerwonej
przy wzbudzeniu w UV.
Rozwój techniki laserowej spowodował, że
to źródło światła stało się podstawowym źródłem
iwyparło w praktyce lampę rtęciową. Zastosowanie
lasera uprościło układ optyczny, który przestał przy-
pominać mikroskop uorescencyjny, a zastosowanie
układu ortogonalnego (przepływ komórek prosto-
padły do wiązki światła lasera) uprościło uzyskiwanie
sygnałów rozproszenia (side i forward scatter).
Cytometria Polska
8
tom 1, zeszyt nr 1, 2012
Pierwsze cytometry (np. Cytouorograf rmy Ort-
ho) były wyposażone w laser argonowy 488 nm i dru-
gi, również argonowy UV. Lasery te miały ówcześnie
niską sprawność i przy mocy optycznej kilkuset mili-
watów pobierały moc kilku kilowatów, co nastręczało
problemy z efektywnym ich chłodzeniem. Problem
ten utrzymywał się do lat 90-tych, gdzie dwuwiązko-
wy laser argonowy (480 nm + UV) o mocy optycznej
250 mW dla światła niebieskiego + 50 mW UW wy-
magał chłodzenia wodnego i klimatyzacji w pomiesz-
czeniu cytometru. Nie bez znaczenia był również fakt
niskiej trwałości i bardzo wysokiej ceny laserów.
Od późnych lat 60-tych datuje się synteza
i zastosowanie różnych barwników uorescencyj-
nych i przeciwciał poli- i monoklonalnych sprzężo-
nych z tymi barwnikami. Laser argonowy o długości
fali emisji 488 nm okazał się być idealny do wzbu-
dzania uoresceiny i jej pochodnych (FITC), jodku
propidyny (PI), oranżu akrydyny (AO), fykoerytryny
(PE) i innych. Popularne stały się również barwniki
wzbudzane w świetle czerwonym lasera helowo-ne-
onowego. Laser ten, zastąpiony współcześnie czerwo-
ną diodą laserową stał się powszechnie stosowanym
drugim źródłem światła wzbudzającego. Ogromny
rozwój biotechnologii sprawił, że lista dostępnych
przeciwciał monoklonalnych sprzężonych (lub nie)
z dowolnymi barwnikami uorescencyjnymi sięga
tysięcy.
Dążenie do zwiększenia liczby parametrów
mierzonych na jednej komórce w tym samym mo-
mencie (niezwykle istotne w diagnostyce hemato-
logicznej) doprowadziło w ostatnim dziesięcioleciu
do rozwoju cytometrii wielokolorowej. Typowym,
mało rozbudowanym cytometrem stał się cytometr
trójkolorowy, rejestrujący uorescencję w zakresie
zielonym, pomarańczowym i czerwonym, a cytome-
try sześciokolorowe przestały być rzadkością. Istnie-
je kilka modeli pozwalających na jednoczesny po-
miar kilkunastu sygnałów uorescencyjnych. Coraz
częściej stosuje się lasery emitujące światło zielone.
Szczytem obecnych możliwości cytometrów badaw-
czych jest LSR Fortessa opracowana przez rmę Bec-
ton-Dickinson, która może być wyposażona w 4 lase-
ry (355 nm, 405 nm, 488 nm i 640 nm) z możliwością
montażu do 7 laserów. Aparat ten może rejestrować
do 18 różnych barw. Taka ilość rejestrowanych para-
metrów wymaga jednak znacznego wysiłku intelek-
tualnego przy interpretacji uzyskanych danych.
Przy analizie danych dotyczących wielokolo-
rowej uorescencji istotnym problemem jest kształt
widma emisyjnego uorochromów. Z podstaw zy-
ki wynika, że widmo to ma mniej lub bardziej ostro
ukształtowany pik i „ogon” ciągnący się w stronę fal
długich (czerwieni i podczerwieni). Tym samym
już dla dwóch podstawowych barwników, jakimi są
FITC i PE w „kanale” pomarańczowym (PE) może
być kilkanaście procent sygnału pochodzącego z u-
oresceiny. Ten problem jest rozwiązywany metodami
elektronicznymi zwanymi macierzą kompensacji.
Ryc. 1 powyżej (zaczerpnięta ze strony www.bdbiosciences.com/eu/research /multicolor/spectrum_viewer) przedstawia powyższy
problem dla 4 popularnych barwników i jednego lasera wzbudzającego (488 nm).
Pewnym sposobem ominięcia niektórych proble-
mów dotyczących zachodzenia na siebie fragmen-
tów widm emisyjnych jest rozdzielenie przestrzenne
iczasowe wiązek światła wzbudzenia jak również od-
powiednich wiązek światła emisji. Realizowane jest
to przez równoległe usytuowanie wiązek poszcze-
gólnych laserów tak, że komórka przechodzi kolejno
przez poszczególne wiązki, a światło uorescencji
jest przechwytywane przez osobne detektory.
Warto zaznaczyć ogromny wpływ rozwoju
techniki komputerowej na możliwości analizy danych
uzyskiwanych z cytometrycznego pomiaru zawiesi-
9
Cytometria Polska tom 1, zeszyt nr 1, 2012
ny komórkowej. Pierwsze cytometry były sterowane
przez minikomputery (np. PDP11), których moc ob-
liczeniowa była porównywalna do dzisiejszego tele-
fonu komórkowego. Lata 80-te to rozpowszechnienie
komputerów osobistych typu IBM PC. Powstała za-
tem platforma umożliwiająca implementację podsta-
wowych metod analizy cyto- i histogramów. W roku
1989 rma Phoenix Flow Systems opracowała pierw-
szy program do analizy histogramu DNA, pozwalają-
cy rozłożyć ten histogram na składowe cyklu komór-
kowego – fazę G1, fazę S i G2+M, nawet w obecności
drugiego, aneuploidalnego cyklu komórkowego. Po-
dobnym programem obecnie popularnym i sprzeda-
wanym z aparatami B-D jest ModFit.
Sortowanie komórek. Już na samym począt-
ku rozwoju cytometrii (1969 r.) wynikła potrzeba
rozdziału badanej populacji komórkowej na subpo-
pulacje deniowane według określonej cechy (np.
zawartości DNA lub obecności na powierzchni okre-
ślonego antygenu). Koncepcja zmiany toru komórki
w polu elektrycznym po nadaniu jej odpowiednie-
go ładunku elektrycznego zależnego od spełnienia
kryterium sortowania doprowadziła do powstania
w 1973 roku aktywowanego uorescencją sortera
komórek, w skrócie FACS, która to nazwa stała się
synonimem cytometrów rmy Becton-Dickinson.
Przy zachowaniu odpowiednich warunków czystości
jest możliwe sterylne sortowanie i następnie hodow-
la tkankowa uzyskanych subpopulacji. Istotniejszym
zastosowaniem sortowania jest jednak wzbogacanie
badanej populacji w komórki występujące w niej
wbardzo niewielkim odsetku (np. komórki macie-
rzyste).
Zupełnie innym typem cytometru, powra-
cającym do źródeł, czyli mikroskopu uorescencyj-
nego, jest laserowy cytometr skaningowy (LSC) pro-
dukowany przez CompuCyte, a opracowany przez
Kamentsky’ego (1991 r.) i szeroko testowany przez
Darżynkiewicza w New York Medical College. W cy-
tometrze tym preparat umieszczony na szkiełku jest
omiatany wiązką lasera lub laserów a wartość uo-
rescencji jest rejestrowana wraz ze współrzędnymi
położenia tej komórki na szkiełku. Interesująca była
niezwykła precyzja pozycjonowania, pozwalająca
na wyjęcie szkiełka z aparatu, włożenie go ponow-
ne i odnalezienie żądanych komórek. Pozwalało to
na wielokrotną analizę tych samych komórek, nawet
stosując odbarwianie i ponowne barwienie preparatu
np. innymi przeciwciałami.
W miarę technicznego dojrzewania aparatury
zmieniał się również sposób jej obsługi. Jeszcze w la-
tach 90-tych przygotowanie do pracy cytometru typu
Cytometria Polska
10
tom 1, zeszyt nr 1, 2012
FACS Vantage lub jego odpowiednika rmy Coulter
wymagało kilkudziesięciu minut bardzo precyzyjne-
go regulowania osi optycznej tego przyrządu oraz sta-
bilizowania pracy laserów. Wymagało to znacznego
doświadczenia poprzedzonego czasochłonnym szko-
leniem. Obecny sprzęt, a szczególnie aparaty mające
certykat kliniczny (IVD) są regulowane lub tylko
sprawdzane przez serwis fabryczny a ich techniczna
obsługa poza samymi pomiarami jest sprowadzona
do minimum.
Wszystkie ryciny pochodzą z : Steen H.B. Characteristics of
ow cytometry w: Flow Cytometry and Sorting second edition
Melamed MR, Lindmo T, Mendelsohn ML. Wiley-Liss, New
York 1990
11
Cytometria Polska tom 1, zeszyt nr 1, 2012
Jarosław Baran
Zakład Immunologii Klinicznej, Polsko-Amerykański Instytut Pediatrii, Collegium Medicum UJ w Krakowie

Jarosław Baran
Zakład Immunologii Klinicznej, Polsko-Amerykański Instytut Pediatrii UM CM
ul.Wielicka 265
30- 663 Kraków
e-mail: mibaran@cyf-kr.edu.pl

Apoptoza oraz poznanie czynników wpływających na ten proces zarówno w warunkach in vitro jak i in vivo
jest wciąż aktualnym problemem badawczym. Fizjologicznie, apoptoza towarzyszy rozwojowi embrionalne-
mu (np. rozwojowi systemu nerwowego, siatkówki oka, nabłonka krypt jelitowych, organów płciowych) ale
również u osobników dorosłych zbędne komórki ulegają eliminacji na szlaku apoptozy, równoważonej przez
proliferację w celu zachowania stałej ich liczby. Zaburzenia w regulacji tego procesu, prowadzące do zbyt
nasilonej lub ograniczonej apoptozy są przyczyną różnego typu schorzeń, np. nowotworowych, neurodege-
neracyjnych czy autoimmunizacyjnych. Pomimo różnorodności czynników endogennych i środowiskowych
mogących prowadzić do apoptozy różnych typów komórek, uważa się, iż apoptoza może zachodzić na dwóch
centralnych szlakach: zewnętrznym, związanym z istnieniem błonowych receptorów śmierci oraz wewnętrz-
nym, zwanym również mitochondrialnym. Niezależnie od źródła sygnału inicjującego, proces apoptozy jest
precyzyjnie regulowany i wymaga współdziałania szeregu elementów prowadząc do powstania swoistej ka-
skady reakcji biochemicznych. W rezultacie dochodzi do aktywacji enzymów z grupy proteaz cysteinowych
(kaspaz) i proteolitycznej degradacji DNA komórki, prowadzącej do jej samounicestwienia.
Cytometria przepływowa dzięki swoim możliwościom oceny zarówno cech morfologicznych (względ-
na wielkość i ziarnistość), fenotypowych (obecność różnych białek błonowych i cytoplazmatycznych), jak
ifunkcjonalnych komórek (np. aktywność enzymatyczna) stała się podstawową metodą badania apoptozy
wróżnych modelach eksperymentalnych. Na tym polu, pionierskie badania prof. Zbigniewa Darzynkiewicza
ijego zespołu przyczyniły się do opracowania szeregu testów służących do detekcji apoptozy. W pracy przed-
stawione zostaną wspólczesne metody oceny apoptozy komórek oparte o cytometrię przepływową. Omówio-
ne zostaną m.in.: badania zmian morfologicznych, detekcja charakterystycznych markerów fenotypowych,
zaburzeń funkcji mitochondriów, ocena aktywności kaspaz oraz sposoby identykacji fragmentacji DNA
komórek apoptotycznych.

apoptoza, cytometria przepływowa, szlak zewnętrzny i wewnętrzny apoptozy, kaspazy

Apoptosis and recognition of factors aecting this process both in vitro and in vivo, are still current research
problems. Under physiological conditions apoptosis accompanies the embryonic development (e.g. deve-
lopment of the nervous system, retina, intestinal epithelium and sex organs), but also in adulthood redundant
cells are eliminated by apoptosis, which is precisely balanced by cell proliferation to maintain their constant
number. Disturbed regulation of the process, leading to pronounced or decreased apoptosis is a cause of




Cytometria Polska
12
tom 1, zeszyt nr 1, 2012

apoptosis, ow cytometry, extrinsic and intrinsic apoptotic pathway, caspases

Apoptoza (gr. apoptosis – opadanie liści), to rodzaj
śmierci komórkowej, w tym również śmierci pro-
gramowanej, często związany z czynnikami stymu-
lującymi, które prowadzą do określonych zmian
morfologicznych komórki. W procesie tym kaskada
swoistych reakcji biochemicznych wiedzie do kon-
densacji jądra i cytoplazmy, aktywacji endonukleaz
komórkowych i w konsekwencji do degradacji włas-
nego DNA, najpierw na duże fragmenty (50.000 -
300.000 par zasad), a następnie na oligonukleosomy
o długości ok. 180-200 par zasad (1). W przeciwień-
stwie do martwicy (nekrozy), dla której typowy jest
silny obrzęk organelli cytoplazmatycznych z następo-
wym rozpadem komórek i indukcją zapalenia, apop-
toza nie prowadzi do reakcji zapalnej, nie dochodzi
bowiem do uszkodzenia błony komórkowej i uwol-
nienia do otoczenia zawartości komórek. Apoptoza
jest więc procesem, w którym umierająca komórka
aktywnie uczestniczy w „samodestrukcji”. Komór-
ki rozpadają się na tzw. „ciałka apoptotyczne”, które
rozpoznawane przez makrofagi i niedojrzałe komór-
ki dendrytyczne za pomocą wielu typów receptorów
błonowych są następnie fagocytowane i degradowa-
ne (2). W warunkach in vitro, przy braku fagocytów,
komórki apoptotyczne ulegają „wtórnej martwicy”
irozproszeniu.
Pomimo, iż pojęcia apoptozy i programo-
wanej śmierci komórki bywają używane zamiennie
nie są to pojęcia jednoznaczne. Termin „programo-
wana śmierć komórki” został wprowadzony w 1964
r. wcelu podkreślenia, iż śmierć komórek w trakcie
rozwoju organizmu (embriogeneza) nie ma cha-
rakteru śmierci patologicznej, ale przebiega według
ściśle określonego schematu i prowadzi do samo-
destrukcji zbędnych komórek (3). Podczas rozwoju
embrionalnego wiele komórek jest bowiem produko-
wanych wdużym nadmiarze i są one następnie eli-
minowane na drodze apoptozy zapewniając właściwy
rozwój organów i tkanek. I tak, apoptoza towarzyszy
np. rozwojowi systemu nerwowego (ponad 50% neu-
ronów ulega eliminacji), rozwojowi siatkówki oka,
nabłonka krypt jelitowych, czy rozwojowi organów
płciowych. Również u osobników dorosłych komórki
ulegają eliminacji na szlaku apoptozy równoważonej
przez proliferację w celu zachowania stałej ich liczby.
Worganizmie człowieka, w każdej sekundzie życia
ok. 100.000 komórek jest produkowanych w wyni-
ku podziałów komórkowych (mitoz) i podobna ich
liczba jest eliminowana w tym samym czasie w dro-
dze apoptozy (4). Mimo, że programowana śmierć
komórki często zachodzi w drodze apoptozy, należy
podkreślić, że inne nieapoptotyczne rodzaje śmierci,
np. autofagia (5, 6) mają również charakter progra-
mowany i odgrywają istotną rolę w embrio- i organo-
genezie (7).
Szlaki prowadzące do apoptozy zostały ewo-
lucyjnie ukształtowane ponad miliard lat temu i są
kluczowe dla takich procesów jak wzrost, prolifera-
cja, różnicowanie i śmierć organizmu. Zaburzenia
disorders of many types, e.g. malignancies, neurodegenerations and autoimmunities. Despite of diversity of
endogenic and environmental factors which may lead to cell apoptosis, it is regarded that apoptosis occurs
through two central pathways: extrinsic, related to membrane death receptors, and intrinsic, named also
mitochondrial. Regardless of the source of initializing signal, apoptosis is precisely regulated, and requires
interactions of many components, leading to specic cascade of biochemical reactions. Finally, enzymes from
cysteine proteases family (caspases) are ctivated, and proteolytic degradation of cellular DNA occurs, leading
to self-destruction of the cell.
anks to the abilities of the measurement of morphological parameters (relative size and granula-
rity), phenotype (membrane and cytoplasmic markers), as well as cell functions (e.g. enzyme activity), ow
cytometry became a standard technique for the study of apoptosis in dierent experimental models. On this
eld, pioneering research by Prof. Zbigniew Darzynkiewicz and co-workers markedly contributed to the de-
velopment of several assays for apoptosis analysis. In this review current ow cytometry–based methods for
the measurement of apoptosis will be presented. Described will be tracking morphological changes, detection
of phenotype markers, alterations in mitochondria functions, caspase activity measurement and identica-
tion of DNA strand breaks of apoptotic cells.
13
Cytometria Polska tom 1, zeszyt nr 1, 2012
wregulacji tego procesu, prowadzące do zbyt nasilo-
nej lub ograniczonej apoptozy są przyczyną różnego
typu schorzeń. Zahamowanie apoptozy jest przyczy-
ną chorób nowotworowych i autoimmunizacyjnych,
np. autoimmunizacyjnego zespołu proliferacji lim-
focytów (ALPS – autoimmune lymphoproliferative
syndrome) (8). Z kolei, nasilona apoptoza jest przy-
czyną chorób neurodegeneracyjnych (Alzheimera,
Parkinsona, Huntingtona) (9), towarzyszy rozwojowi
AIDS (śmierć zakażonych limfocytów CD4) (10), za-
każeniom wirusami półpaśca i cytomegalii (11, 12),
a upośledzona eliminacja komórek apoptotycznych
odgrywa istotną rolę w patomechanizmie tocznia
układowego (SLE - systemic lupus erythematosus)
(13, 14). Apoptoza jest również przyczyną zaniku
kory nadnerczy i grasicy po podaniu kortykosteroi-
dów (15, 16), na drodze apoptozy giną neurony wna-
stępstwie zawału mózgu czy kardiomiocyty w następ-
stwie zawału serca, zapalenia mięśnia sercowego oraz
odrzutu serca po przeszczepie (17, 18, 19).
Apoptoza jest także istotnym elementem
rozwoju iregulacji swoistej odpowiedzi immunolo-
gicznej (20). Większość rozwijających się limfocy-
tów ginie na drodze apoptozy podczas rearanżacji
iformowania receptora antygenowego, zapewniając
generowanie komórek efektywnie reagujących z an-
tygenami obcymi ale nie z autoantygenami. Dotyczy
to zarówno autoreaktywnych klonów limfocytów T
w grasicy (21), jak i „niedopasowanych” do antyge-
nu limfocytów B w węzłach chłonnych (22). Również
większość swoistych limfocytów efektorowych po
eliminacji antygenu ginie na drodze apoptozy, po-
zostaje tylko nieliczna populacja komórek pamięci
(22). Także komórki fagocytujące i prezentujące an-
tygen, stanowiące istotny element zarówno swoistych
jak i nieswoistych mechanizmów odporności ulegają
apoptozie. Na tej drodze usuwane są populacje krót-
kożyjących granulocytów krwi obwodowej, które są
uzupełniane przez komórki produkowane w szpiku
kostnym (23). Podobnie, dłużej żyjące monocyty,
które najpierw same biorą udział w usuwaniu apo-
ptotycznych granulocytów, aby później podzielić ich
los. Te z kolei są pochłaniane przez długożyjące ma-
krofagi tkankowe (24).

Pomimo mnogości czynników endogennych i śro-
dowiskowych mogących prowadzić do apoptozy
różnych typów komórek (np. w wyniku związania
receptorów powierzchniowych, uszkodzenie DNA
za pomocą leków lub promieniowania jonizujące-
go, braku czynników wzrostowych, działania cyto-
kin, infekcji bakteryjnych i wirusowych), uważa się,
iż apoptoza może zachodzić na dwóch centralnych
szlakach: zewnętrznym, związanym z istnieniem
błonowych receptorów śmierci oraz wewnętrznym,
zwanym również mitochondrialnym. Niezależnie
od źródła sygnału inicjującego, proces apoptozy jest
precyzyjnie regulowany i wymaga współdziałania
szeregu elementów prowadząc do powstania swoistej
kaskady reakcji biochemicznych. W rezultacie do-
chodzi do aktywacji kaspaz i proteolitycznej degra-
dacji DNA komórki.

Cytometria przepływowa dzięki swoim możliwoś-
ciom wieloparametrowej analizy pojedynczych
komórek stała się metodą „z wyboru” stosowaną
wbadaniach apoptozy i ilościowej ocenie tego pro-
cesu. Używane w tym celu metody sprowadzają się
do potwierdzenia charakterystycznych dla apoptozy
markerów biochemicznych i/lub molekularnych to-
warzyszących zmianom morfologicznym komórki.
Ze względu na możliwość braku występowania nie-
których cech apoptozy w różnych systemach komór-
kowych zaleca się zawsze potwierdzenie tego procesu
z wykorzystaniem technik mikroskopowych i wyka-
zanie charakterystycznych zmian morfologicznych,
co w dalszym ciągu stanowi „złoty standard” w bada-
niach apoptozy (25). Metody cytometryczne stoso-
wane do oceny apoptozy komórek obejmują analizę
zmian morfologicznych (do pewnego stopnia), zmia-
ny w konformacji i przepuszczalności błon komór-
kowych, detekcję zaburzeń funkcji mitochondriów,
ocenę aktywności kaspaz oraz identykacji fragmen-
tacji DNA komórek apoptotycznych.
-

Zmiany morfologii komórek apoptotycznych można
do pewnego stopnia rejestrować z użyciem cytometru
przepływowego w oparciu o zmiany intensywności
parametrów rozproszenia światła – Forward (FSC)
i Side scatter (SSC). Komórki apoptotyczne stają się
mniejsze i słabiej rozpraszają światło w kierunku
biegu promienia lasera -generują niższy FSC. Rów-
nocześnie, ze względu na wzrost kondensacji chro-
matyny jądrowej i fragmentację DNA wzrasta rozpro-
szenia światła lasera pod kątem 900 (rośnie parametr
SSC), korelujący ze stopniem ziarnistości komórek.
Zmiany te jednak są mniej wyraźne w porównaniu
ze spadkiem FSC (26). W późnej fazie apoptozy oba
parametry ulegają wyraźnemu spadkowi (Ryc. 1).
Cytometria Polska
14
tom 1, zeszyt nr 1, 2012
Apoptoza monocytów krwi obwodowej po fagocytozie bakterii Staphylococcus aureus mierzona w cytometrze przepływo-
wym parametrami rozproszenia światła (FSC i SSS).
Monocyty kontrolne i monocyty ze sfagocytowanymi bakteriami hodowano przez 6 godz. Zmiany w morfologii monocytów to-
warzyszące apoptozie oceniano metodą cytometrii przepływowej w oparciu o parametry rozproszenia światła FSC i SSC. Bramką
zaznaczono obszar komórek apoptotycznych (J.Baran dane niepublikowane).
-

Jednym z najwcześniejszych markerów apoptozy są
zmiany konformacyjne błony komórek i utrata asy-
metrii fosfolipidów błony. Fizjologicznie, warstwa
fosfolipidowa znajduje sie po wewnętrznej stronie
błony komórkowej, podczas gdy w komórce apopto-
tycznej ulega ona dyslokacji na zewnątrz. W ten spo-
sób fosfatydyloseryna (główny składnik fosfolipidów
błony) pojawia się na powierzchni komórki, gdzie
może być identykowana za pomocą znakowanego
uorescencyjnie białka - aneksyny V (znanej również
jako antykoagulant łożyskowy) (Ryc. 2).
Zmianom błonowym na ogół towarzyszy
utrata charakterystycznych dla danego typu komór-
ki markerów powierzchniowych, np. antygenu CD14
przez ulegające apoptozie monocyty (Ryc. 3).
Schemat wiązania aneksyny V przez reszty fosfatydyloseryny błony komórkowej komórek apoptotycznych (za Mark Klein;
Center for Molecular and Cellular Intervention, University Medical Center Utrecht).
Apoptoza monocytów krwi obwodowej indukowana przez komórki nowotworowe. Wiązaniu aneksyny V towarzyszy spa-
dek ekspresji antygenu CD14 na monocytach.
Monocyty krwi obwodowej hodowano w medium (A) lub z komórkami nowotworowymi linii raka trzustki -HPC-4 (B) bądź raka
jelita grubego – DeTa (C) przez 4 godz. Komórki znakowano przeciwciałami anty-CD14 sprzężonymi z PE i sortowano metodą
cytometrii przepływowej. Wyizolowane monocyty hodowano przez kolejne 18 godz., a następnie oceniano wiązanie aneksyny V
znakowanej FITC. Wykresy przedstawiają stopień wiązania przez monocyty aneksyny V (FL1) i poziom ekspresji CD14 (FL2)
(B.Mytar, J.Baran i wsp., 2002).
15
Cytometria Polska tom 1, zeszyt nr 1, 2012
Wiązanie aneksyny V jest zależne od obecności jo-
nów Ca2+, stąd inkubację komórek należy prze-
prowadzać w buforze o odpowiednim stężeniu tych
jonów (27). W ocenie wiązania aneksyny V istotne
jest użycie odpowiednich próbek kontrolnych w celu
określenia stopnia nieswoistego wiązania się znako-
wanej aneksyny V. W tym celu najlepiej jest przy-
gotować próbkę badanych komórek, gdzie wiązanie
aneksyny V znakowanej uorescencyjnie zostanie
poprzedzone zablokowaniem reszt fosfatydyloseryny
przez dodaną w nadmiarze nieznakowaną aneksynę
V. Kolejna inkubacja komórek z aneksyną V, tym ra-
zem znakowaną uorescencyjnie, pozwoli na ocenę
poziomu nieswoistego wiązania się tego białka (swo-
iste wiązanie zostało zablokowane przez aneksynę
V nieznakowaną). Alternatywną kontrolą może być
również próbka komórek inkubowanych ze znako-
waną uorescencyjnie aneksyną V, ale w buforze bez
jonów Ca2+. Taka próbka da nam również informację
o stopniu nieswoistego wiązania aneksyny V z bada-
nymi komórkami.

We wczesnej apoptozie utrata asymetrii fosfolipi-
dów zachodzi bez uszkodzenia błony komórkowej.
W późniejszych fazach apoptozy obserwowany jest
jednak pewien wzrost przepuszczalności błony ko-
mórek dla barwników uorescencyjnych wiążących
się z kwasami nukleinowymi, np. jodek propydyny
(PI), 7-aminoaktynomycyna D (7-AAD), bromek
etydyny (EB). Na przykład, użycie 7-AAD pozwala
na wyodrębnienie z populacji: komórek nekrotycz-
nych (bądź późno- apoptotycznych) - intensywnie
barwiących się tym barwnikiem; komórek żywych
- niebarwiących się; oraz komórek apoptotycznych -
słabo barwiących się 7-AAD (28). Również połącze-
nie któregoś z tych barwników z barwnikiem Hoech-
sta 3342 pozwala na dyskryminację komórek żywych
(Hoechst słabo dodatnich i np. 7-AAD ujemnych)
od apoptotycznych (Hoechst wysoce dodatnich i np.
7-AAD ujemnych) i nekrotycznych (Hoechst ujem-
nych i np. 7-AAD dodatnich). Na takie rozróżnie-
nie pozwala również analiza komórek barwionych
aneksyną V znakowaną np. na zielono i którymś z
wymienionych barwników interkalujących pomię-
dzy zasady DNA, np. PI. Komórki apoptotyczne będą
aneksyno-dodatnie i PI ujemne, komórki żywe będą
aneksyno-ujemne i PI ujemne, a komórki nekrotycz-
ne (i późno-apoptotyczne) będą aneksyno-dodatnie i
PI dodatnie (Ryc. 4).
Detekcja wczesnej i późnej apoptozy z wykorzystaniem
aneksyny V sprzężonej z zielonym znacznikiem uorescencyj-
nym i barwnika wiążącego DNA (PI) (www.imgenex.com).

a) Badanie potencjału elektrycznego błon mitochon-
drialnych.
Spadek potencjału elektrycznego błon mitochon-
drialnych jest wczesnym etapem apoptozy przebie-
gającej na „szlaku wewnątrznym” z udziałem rodni-
ków tlenowych [29]. W efekcie dochodzi do otwarcia
kanałów mitochondrialnych uwolnienia cytochromu
c i innych białek proapoptotycznych z wnętrza mi-
tochondriów i aktywacji kaspaz. Spadek potencjału
błon mitochondrialnych można wykazać cytome-
trycznie, stosując lipolne barwniki uorescencyjne
(np. JC-1, DIOC6(3), Rodaminę 123, CMXRos) aku-
mulujące się w błonach mitochondriów. Spadek ich
akumulacji, odzwierciedlony spadkiem intensywno-
ści uorescencji, jest miarą spadku potencjału mito-
chondrialnego komórek apoptotycznych (Ryc. 5).
  Spadek potencjału mitochondrialnego monocytów w
następstwie apoptozy indukowanej fagocytozą bakterii.
Kinetyczny pomiar intensywności uorescencji CMXRos od-
zwierciedlający spadek potencjału mitochondrialnego w mo-
nocytach kontrolnych (zielona linia) i monocytach ze sfago-
cytowanymi bakteriami S.aureus (linia czerwona). Monocyty
apoptotyczne charakteryzują się spadkiem intensywności u-
orescencji. Markerem zaznaczono intensywność uorescencji
komórek żywych (J.Baran i wsp., 2004).
Cytometria Polska
16
tom 1, zeszyt nr 1, 2012
W przypadku barwnika JC-1, przy wysokim poten-
cjale mitochondrialnym (wysoka akumulacja) tworzy
on czerwono uoryzujące aggregaty („J-aggregates”),
natomiast przy niskich wartościach potencjału (niska
akumulacja), barwnik występuje w formie mono-
merycznej, emitując uorescencję zieloną. Stosunek
uorescencji czerwonej do zielonej (ratio) jest mia-
rą spadku potencjału błon mitochondrialnych. Jako
wynik analizy można podawać odsetek komórek
oniskim potencjale (zielonej uorescencji). Analizę
potencjału mitochondrialnego można łączyć z bada-
niem wiązania aneksyny V i oceną integralności bło-
ny komórkowej.
b) Zaburzenia struktury i integralności błony mito-
chondriów.
Z kolei zmiany w strukturze i zaburzenia integralno-
ści wewnętrznej błony mitochondrialnej spowodo-
wane otwarciem megakanałów mitochondrialnych
można badać cytometrycznie w teście wbudowy-
wania pochodnej oranżu akrydyny - nonylooranżu
akrydyny (NAO). Barwnik ten w sposób ilościowy
wiąże kardiolipinę wewnętrznej błony mitochon-
drialnej (2 cząsteczki barwnika:1 cząteczka kardioli-
piny) (30), tak więc spadek uorescencji dokumen-
tuje zaburzenie struktury i integralności tejże błony.
Efektem końcowym zaburzenia funkcji mitochon-
driów jest uszkodzenie ich błony zewnętrznej i uwol-
nienie do cytoplazmy cytochromu c oraz innych
białek proapoptotycznych, np. Smac/Diablo. Ich
„ucieczka” z mitochondriów może być również oce-
niana cytouorymetrycznie z wykorzystaniem swoi-
stych przeciwciał monoklonalnych, po utrwaleniu i
permeabilizacji komórek (31).

Kaspazy odgrywają kluczową rolę w indukcji i eg-
zekucji procesu apoptozy. Ich aktywacja może za-
chodzić wskutek związania któregoś z receptorów
śmierci na błonie komórkowej i inicjację szlaku ze-
wnętrznego apoptozy lub na szlaku wewnętrznym,
zapoczątkowanym zmianami funkcjonalnymi mi-
tochondriów. Oba szlaki prowadzą do aktywacji ka-
spazy-3, kluczowej kaspazy wykonawczej w procesie
apoptozy. Stąd też wiele testów cytometrycznych
służących detekcji apoptozy opartych jest o ocenę
aktywności kaspazy-3 in situ w komórkach. Histo-
rycznie pierwszym badaniem tego typu była ocena
degradacji enzymu PARP (polimeraza poli-ADP
rybozy), jednego z wielu substratów komórkowych
kaspazy-3. Stosując przeciwciała monoklonalne skie-
rowane przeciwko zdegradowanej formie tego białka
można było wykazać pośrednio aktywację kaspazy-3.
Obecnie, w celu wykazania aktywności kaspazy-3
metodą cytometrii przepływowej najczęściej stosu-
je się acetylowany czteroaminokwasowy uorogen-
ny substrat Ac-DEVD-AMC, który trawiony przez
kaspazę-3 uwalnia uorescencję (Ryc. 6). Niektórzy
producenci oferują również znakowane uorescen-
cyjnie przeciwciała monoklonalne skierowane prze-
ciwko epitopom dla aktywnej formy kaspazy-3. Daje
to jeszcze jedną możliwość detekcji aktywacji tego
enzymu.
 Aktywność kaspazy-3 w apoptotycznych monocytach.
Monocyty kontrolne (linia przerywana) i monocyty apoptotycz-
ne po fagocytozie bakterii (S.aureus) (linia czerwona) inkubo-
wano przez 1 godz. z uorogennym substartem dla kaspazy-3,
po czym analizowano w cytometrze przepływowym. Markerem
zaznaczono obszar intensywności uorescencji komórek z ak-
tywną kaspazą-3. (J.Baran i wsp., 2001)
Stosując uorogenne substraty dla kaspazy-3, -6, -8
i 9 można określić czy apoptoza w badanych komór-
kach zachodzi na szlaku zależnym od receptorów
śmierci (zewnętrznym) czy na szlaku mitochondrial-
nym. Możliwość badania aktywacji poszczególnych
kaspaz in situ, w pojedynczych komórkach, daje
również opracowana przez zespół prof. Darzynkie-
wicza metoda FLICA (uorochrome labeled inhibi-
tors of caspases), wykorzystująca znakowane FITC
bądź karboksyuoresceiną (FAM) inhibitory kaspaz
(32). W metodzie tej swoisty, czteroaminokwasowy
inhibitor kaspazy sprzężony jest z resztą uoromety-
letonową (FMK), co warunkuje jego penetrację przez
błonę komórkową do wnętrza komórki i nieodwra-
calne wiązanie się swoistej sekwencji aminokwasowej
z centrum aktywnym danej kaspazy. Niezwiązany in-
hibitor zostaje wypłukany. W efekcie znakowane są
tylko komórki, w których doszło do aktywacji bada-
nej kaspazy. Ten sam zespół opracował również me-
todę kinetycznego pomiaru apoptozy, określaną jako
17
Cytometria Polska tom 1, zeszyt nr 1, 2012
statmo-apoptozę (33). W metodzie tej wykorzystuje
się znakowany uorescencyjnie uniwersalny inhibi-
tor kaspaz – FAM-VAD-FMK, co pozwala z jednej
strony na detekcję wszystkich komórek apoptotycz-
nych, niezależnie od fazy tego procesu, a z drugiej,
pozwala zahamować dalszy przebieg apoptozy i nal-
ny rozpad komórek (25).

a) detekcja pęknięć i fragmentacji DNA in situ w ko-
mórkach apoptotycznych.
Konsekwencją aktywacji kaspaz efektorowych jest
aktywacja endonukleaz i degradacja własnego DNA
komórki, najpierw na duże fragmenty (50.000 -
300.000 par zasad), a następnie na oligonukleoso-
my o długości ok. 180-200 par zasad (1). Daje to w
rozdziale elektroforetycznym DNA charakterystycz-
ny dla apoptozy obraz „drabinki” („lader pattern”).
Poprzedzające degradację pęknięcia DNA można
identykować w utrwalonych komórkach poprzez
wbudowanie do odsłoniętych reszt hydroksylowych
(3’OH) uszkodzonych nici znakowanych nukleoty-
dów dUTP, w obecości terminalnej dezoksynukleo-
transferazy (TdT) (metoda TUNEL – „terminal de-
oxynycleotidyl transferase dUTP nick end labeling”)
lub polimerazy DNA (metoda „nick translation”). Ze
względu na większą czułóść i szybszą kinetykę wbu-
dowywania trójfosforanu dezoksyurydyny (dUTP)
metoda TUNEL zdominowała ten rodzaj badań apo-
ptozy. Początkowo, w metodzie TUNEL dezoksynu-
Cytouorymetryczna detekcja pęknięć DNA w monocy-
tach fagocytujących bakterie metodą TUNEL z użyciem bioty-
nylowanych dezoksynukleotydów dUTP.
Wbudowane w obecności terminalnej dezoksytransferazy
(TdT) dezoksynukleotydy dUTP wykrywano z użyciem strep-
tawidyny znakowanej PE (FL2). W przeważajacej większości
komórki TUNEL- dodatnie stanowiły monocyty fagocytujące
bakterie znakowane FITC (FL1) (42,3% wszystkich monocy-
tów) (J.Baran i wsp., 1997).
kleotydy dUTP znakowane były biotyną, a ich wbu-
dowanie w DNA uwidaczniano stosując znakowaną
uorescencyjnie streptawidynę (34) (Ryc.7).
Obecnie dostępne są komercyjne zestawy
do metody TUNEL, w których dUTP są znakowane
uorescencyjnie. Do chwili obecnej opracowano sze-
reg modykacji metody TUNEL, pozwalających na
zwiększenie jej czułości, np. poprzez wykorzystanie
BrdUTP (trójfosforan bromodezoksyurydyny), na-
stępnie przeciwciał anty-BrdU znakowanych bioty-
ną i wreszcie streptawidyny znakowanej uorescen-
cyjnie. Metoda TUNEL cieszy się dużym uznaniem
wśród badaczy apoptozy, zwłaszcza apoptozy komó-
rek nowotworowych indukowanej różnymi lekami,
gdyż można ją kojarzyć z analizą cyklu komórkowego
(prolu DNA), co pozwala na określenie wrażliwości
komórek nowotworowych na apoptozę w poszcze-
gólnych fazach cyklu (35). Pewną odmianą klasycz-
nej metody TUNEL jest wykorzystanie didezoksy-
nukleotydów ddUTP w miejsce dUTP. Zamiana ta
pozwala na stechiometryczne ich wbudowanie w
pęknięcia DNA (stosunek 1:1), co na podstawie róż-
nic w intensywności uorescencji badanych komó-
rek ddUTP-dodatnich umożliwia wnioskowanie o
różnicach w ilości pęknięć DNA (36).
b) Identykacja komórek apoptotycznych w analizie
prolu DNA.
Identykacja komórek apoptotycznych jest również
możliwa w trakcie analizy prolu DNA po utrwaleniu
i wybarwieniu np. jodkiem propydyny (37). Komór-
ki apoptotyczne charakteryzują się zmniejszoną bar-
wliwością, ze względu na mniejszą zawartość DNA
niż komórki w fazie G1 cyklu komórkowego, tworzą
one tzw. Frakcję hipodiploidalną lub sub-G1 (Ryc. 8).
Ta zmniejszona zawartość DNA spowodowane jest
„ucieczką” drobnych fragmentów DNA z komórki w
trakcie procedury przygotowywania próbki (utrwa-
lanie i płukanie).
Detekcja komórek apoptotycznych w analizie prolu DNA
po wybarwieniu jodkiem propydyny (www.cyto.purdue.edu).
Cytometria Polska
18
tom 1, zeszyt nr 1, 2012

Cytometria przeplywowa ze swoimi możliwościami
wieloaspektowej analizy wydaje się metodą z wy-
boru w badaniach apoptozy i jej mechanizmów na
poziomie komórkowym. Należy jednak pamiętać,
iż potwierdzenie apoptozy powinno być dokonane
przynajmniej dwoma metodami, najlepiej z przed-
stawieniem charakterystycznych zmian morfolo-
gicznych z obrazu mikroskopowego, co w przypad-
kach wątpliwych „nietypowej apoptozy” jest wciąż
„złotym standardem. W tym aspekcie, szczególnie
przydatne będzie wykorzystanie laserowej cytometrii
skaningowej, która oprócz możliwości klasycznej cy-
tometrii przepływowej pozwala na rejestrację praw-
dziwego obrazu komórki (38).
1. Cohen GM, Sun XM, Fearnhead H, MacFar-
lane M, Brown DG, Snowden RT, Dinsdale D.
Formation of large molecular weight fragments
of DNA is a key committed step of apoptosis in
thymocytes. J.Immunol. 1994; 153: 507-516.
2. Savill J, Dranseld I, Gregory C, Haslett C. A
blast from the past: clearance of apoptotic cells
regulates immune responses. Nat.Rev.Immunol.
2002; 2: 965-975.
3. Lockshin RA, Beaulaton J. Programmed cell
death. Life Sci. 1964; 15: 1549-1565.
4. Vaux DL, Korsmeyer SJ. Cell death in deve-
lopment. Cell 1999; 96: 245-254.
5. Klionsky DJ, Emr SD. Autophagy as a regulated
pathway of cellular degradation. Science 2000;
290: 1717-1721.
6. Leist M, Jaattela M. Four deaths and a funeral:
from caspases to alternative mechanisms. Nat.
Rev.Mol.Cell Biol. 2001; 2: 589-598.
7. Lockshin RA, Zakeri Z. Apoptosis, autophagy,
and more. Int.J.Biochem.Cell Biol. 2004; 36:
2405-2419.
8. Le Deist F, Emile JF, Rieux-Laucat F, Benkerrou
M, Roberts I, Brousse N, Fischer A. Clinical,
immunological, and pathological consequences
of Fas-decient conditions. Lancet 1996; 348:
719-723.
9. Mattson MP. Apoptosis in neurodegenerative di-
sorders. Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 2000; 1: 120-129.
10. Gougeon ML, Laurent-Crawford AG, Hovan-
essian AG, Montagnier L. Direct and indirect
mechanisms mediating apoptosis during HIV
infection: contribution to in vivo CD4 T cell
depletion. Semin.Immunol. 1993; 5: 187-194.
11. Pignata C, Fiore M, de Filippo S, Cavalcanti M,
Gaetaniello L, Scotese I. Apoptosis as a mecha-
nism of peripheral blood mononuclear cell death
aer measles and varicella-zoster virus infec-
tions in children. Pediatr.Res. 1998; 43: 77-83.
12. Froberg MK. Review: CMV escapes! Ann.Clin.
Lab Sci. 2004; 34: 123-130.
13. Emlen W, Niebur J, Kadera R. Accelerated in vi-
tro apoptosis of lymphocytes from patients with
systemic lupus erythematosus. J.Immunol. 1994;
152: 3685-3692.
14. Denny MF, Chandaroy P, Killen PD, Caricchio
R, Lewis EE, Richardson BC, Lee KD, Gaval-
chin J, Kaplan MJ. Accelerated macrophage
apoptosis induces autoantibody formation and
organ damage in systemic lupus erythematosus.
J.Immunol. 2006; 176: 2095-2104
15. Kerr JF, Searle J. Deletion of cells by apoptosis
during castration-induced involution of the rat
prostate. Virchows Arch.B Cell Pathol. 1973; 13:
87-102.
16. Wyllie AH, Kerr JF, Macaskill IA, Currie AR.
Adrenocortical cell deletion: the role of ACTH.
J.Pathol. 1973; 111: 85-94.
17. Rosenblum WI. Apoptosis and stroke pathoge-
nesis. Stroke 1999; 30: 1154-1155.
18. Olivetti G, Abbi R, Quaini F, Kajstura J, Cheng
W, Nitahara JA, Quaini E, Di Loreto C, Beltrami
CA, Krajewski S, Reed JC, Anversa P. Apoptosis
in the failing human heart. N.Engl.J.Med. 1997;
336: 1131-1141.
19. Miller LW, Granville DJ, Narula J, McManus BM.
Apoptosis in cardiac transplant rejection. Car-
diol.Clin. 2001; 19: 141-154.
20. Roliński J. Apoptoza w układzie odpornościo-
wym – rola Fas, bcl-2 i interleukiny 2. Postępy
Biologii Komórki 1997; 24: 561-574.
21. Murphy KM, Heimberger AB, Loh DY. In-
duction by antigen of intrathymic apoptosis of
CD4+CD8+TCRlo thymocytes in vivo. Science
1990; 250: 1720-1723.
22. Cohen JJ, Duke RC, Fadok VA, Sellins KS. Apo-
ptosis and programmed cell death in immunity.
Annu.Rev.Immunol. 1992; 10: 267-293.
23. Haslett C, Lee A, Savill JS, Meagher L, Whyte
MK. Apoptosis (programmed cell death) and
functional changes in aging neutrophils. Modu-
lation by inammatory mediators. Chest 1991;
99: 6S.
24. Gregory CD. CD14-dependent clearance of
apoptotic cells: relevance to the immune system.

19
Cytometria Polska tom 1, zeszyt nr 1, 2012
Curr.Opin.Immunol. 2000; 12: 27-34.
25. Smolewski P, Darzynkiewicz Z. Współczesne
metody badania apoptozy. Acla Haematol.Pol.
2003; 34: 35-47.
26. Darzynkiewicz Z, Bruno S, Delbino G, Gorczy-
ca W, Hotz MA, Lassot P, Traganos F. Features
of apoptotic cells measured by ow cytometry.
Cytometry 1992; 13: 795-808.
27. Vermes I, Haanen C, Steens-Nakken H, Reu-
telingsperger C. A novel assay for apoptosis.
Flow cytometric detection of phosphatidylserine
expression on early apoptotic cells using uore-
scein labelled Annexin V. J.Immunol.Methods
1995; 184: 39-51.
28. Schmid I, Krall WJ, Uittenbogaart CH, Braun J,
Giorgi JV. Dead cell discrimination with 7-ami-
no-actinomycin D in combination with dual
color immunouorescence in single laser ow
cytometry. Cytometry 1992; 13: 204-208.
29. Susin SA, Zamzami N, Castedo M, Daugas E,
Wang HG, Geley S, Fassy F, Reed JC, Kroemer
G. e central executioner of apoptosis: multiple
connections between protease activation and
mitochondria in Fas/APO-1/. J.Exp.Med. 1997;
186: 25-37.
30. Petit PX, Lecoeur H, Zorn E, Dauguet C, Mig-
notte B, Gougeon ML. Alterations in mitochon-
drial structure and function are early events of
dexamethasone-induced thymocyte apoptosis.
J.Cell Biol. 1995; 130: 157-167.
31. Ng H, Smith DJ, Nagley P. Application of ow
cytometry to determine dierential redistribu-
tion of cytochrome c and Smac/DIABLO from
mitochondria during cell death signaling. PLOS
one 2012; 7: e42298.
32. Bedner E, Smolewski P, Amstad P, Darzynkie-
wicz Z. Activation of caspases measured in situ
by binding of uorochrome-labeled inhibitors of
caspases (FLICA): correlation with DNA frag-
mentation. Exp.Cell.Res. 2000; 259: 308-313.
33. Smolewski P, Grabarek J, Phelps DJ, Darzynkie-
wicz Z. Stathmo-apoptosis: arresting apoptosis
by uochrome-labeled inhibitor of caspases.
Int.J.Oncol. 2001; 19: 657-663.
34. Gorczyca W, Bruno S, Darzynkiewicz RJ, Gong J,
Darzynkiewicz Z. DNA strand breaks occurring
during apoptosis: their early in situ detection by
the terminal deoxynucleotidyl transferase and
nick translation assays and prevention by serine
protease inhibitors. Int.J.Oncol. 1992; 1:639-648.
35. Gorczyca W, Bigman K, Mittelman A, Ahmed T,
Gong J, Melamed MR, Darzynkiewicz Z. In-
duction of DNA strand breaks associated with
apoptosis during treatment of leukemias. Leuke-
mia 1993, 5: 659-670.
36. Baskin DS, Widmayer MA, Sharpe MA. Quan-
tication of DNase type I ends, DNase type II
ends, and modied bases using uorescently
labeled ddUTP, terminal deoxynucleotidyl trans-
ferase, and formamidopyrimidine-DNA glycosy-
lase. Biotechniques 2010; 49: 505-512.
37. Nicoletti I, Migliorati G, Pagliacci MC, Grignani
F, Riccardi C. A rapid and simple method for
measuring thymocyte apoptosis by propidium
iodide staining and ow cytometry, J.Immunol.
Meth. 1991; 139: 271-279.
38. Darzynkiewicz Z, Bedner E, Li X, Gorczyca W,
Melamed MR. Laser-scanning cytometry: a new
instrumentation with many applications. Exp.
Cell Res. 1999; 249: 1-12.
Cytometria Polska
20
tom 1, zeszyt nr 1, 2012
Cezary Watała1, Joanna Rywaniak1, Karolina Siewiera1, Hassan Kassassir1,
Radosław Sychowski1, Magdalena Łabieniec-Watała2
1 Zakład Zaburzeń Krzepnięcia Krwi, Katedra Diagnostyki Laboratoryjnej, Uniwersytet Medyczny w Łodzi
2 Uniwersytet Łódzki, Wydział Biologii i Ochrony Środowiska, Katedra Termobiologii

Cezary Watała
Zakład Zaburzeń Krzepnięcia Krwi
Uniwersytet Medyczny w Łodzi
ul. Żeromskiego 113
90-549 Łódź
tel./faks: 42 6393471/42 6787567
email: cezary.watala@umed.lodz.pl
www.interhemostaza.pl

W pracy skupiono uwagę na wybranych zastosowaniach cytometrii przepływowej w naukach podstawowych:
(a) badaniach czynności i żywotności płytek krwi człowieka i gryzoni laboratoryjnych, (b) oznaczaniu po-
wierzchni prokoagulacyjnej komórek, oraz (c) badaniach mitochondriów i liposomów. Zwrócono szczegól-
ną uwagę na metodyczne oraz techniczne uwarunkowania protokołów badawczych, które mogą prowadzić
potencjalnie do przekłamywania zbieranych wyników i/lub przywodzić do niesłusznych wniosków. Wyniki
zbierane przy wykorzystaniu techniki cytometrii przepływowej zestawiono z alternatywnymi metodami sto-
sowanymi w badaniach naukowych poszczególnych obiektów. W szczególności, opisano rozróżnianie akty-
wacji, reaktywności i agregacji płytek krwi. Wskazano na znaczenie oznaczeń żywotności płytek, jako para-
metru, który może interferować w badaniach czynności tych komórek i często wpływa na płynące z badań
wnioski. Opisano metody służące do badania powierzchni prokoagulacyjnej płytek krwi, akcentując zagroże-
nia zbieraniem artefaktów, jakie towarzyszą stosowaniu poszczególnych protokołów badawczych. Zwrócono
uwagę na odmienności badania płytek krwi innych ssaków niż człowiek, w szczególności, w modelu my-
sim, najpowszechniej stosowanym. Praca przedstawia także wykorzystanie cytometrii przepływowej w dość
nietypowych zadaniach badawczych, w których przydatność tej techniki wydawałaby się wręcz niemożliwa,
amianowicie oznaczenia obiektów subkomórkowych i parakomórkowych, jakimi są mitochondria i liposo-
my. W szczególności, opisano sposoby badania parametrów funkcjonalnych mitochondriów, z wyraźnym za-
akcentowaniem tych, znajdujących zastosowanie w śledzeniu procesu apoptozy. Na przykładzie płytek krwi
zwrócono uwagę na badanie parametrów opisujących zachodzenie apoptozy w komórkach bezjądrzastych.

aktywacja i reaktywność płytek krwi, mikropłytki, agregaty płytkowe, selektyna P, receptory błonowe, reakcja uwalniania, żywotność
płytek, płytki gryzoni laboratoryjnych, apoptoza płytek, liposomy, potencjał mitochondrialny, polarograa, spektrouorymetria

e paper is focused on chosen applications of ow cytometry in basic sciences: (a) investigations of blood
platelet function and viability in humans and rodents, (b) determination of procoagulant activity in blood
platelets, and (c) investigations of mitochondria and liposomes. e particular attention was paid to metho-



21
Cytometria Polska tom 1, zeszyt nr 1, 2012
dological and technical aspects of research protocols, which could potentially lead to distortions in the collec-
ted results and/or drive to raising of false conclusions. e results obtained with ow cytometry were compa-
red to those obtained with use of alternative techniques applied in scientic research of particular objects. We
discuss in this paper proper distinguishing of platelet activation, reactivity and aggregation. Also, protocols
for estimating blood platelet viability – the parameter, which can potentially interfere with functional assays
and have an impact on nal conclusion of an experiment, are critically reviewed. e article also describes
the methods of platelet procoagulant activity and emphasizes the risk of collecting artifacts in calcium-rich
environment. Another raised topic is the selection of an approach for studying blood platelets from other
mammals (especially in mouse model, which is commonly used by researchers) and the discussion of dif-
ferences between investigation on human and mouse platelets. e last, our paper describes possibilities of
using ow cytomery in research applications, which – at the rst side, appear quite unusual for this techni-
que, i.e. investigations of subcellular and paracellular objects, like mitochondria and liposomes. In particular,
the characterization of parameters explored in functional mitochondria and applications of such methods to
study cell apoptosis is presented. e latter is also referred to anucleate cells, like blood platelets.

platelet activation and reactivity, microplatelets, platelet aggregates, P selectin, platelet membrane receptors, release reaction, pla-
telet viability, platelets of laboratory rodents, platelet apoptosis, liposomes, mitochondrial transmembrane potential, polarography,
spectrouorometry

O sukcesie cytometrii przepływowej w na-
ukach doświadczalnych zadecydowała m.in. wszech-
stronność jej zastosowań oraz plastyczność, z jaką
badacz może adaptować standardowe protokoły ru-
tynowych oznaczeń cytometrycznych do ustawiania
nowych metod badawczych. Panuje obecnie uzasad-
nione przekonanie, że metody cytometrii przepły-
wowej można zmniejszym lub większym powodze-
niem zaadoptować i zastosować wszędzie tam, gdzie
pomiary oparte są na zmianach uorescencji obiek-
tów. Cytometria ma właśnie tę olbrzymią przewagę
nad innymi metodami spektrouorometrycznymi, że
stosuje się ją w odniesieniu do obiektów rozprasza-
jących światło i zawiesin lub roztworów nie-rzeczy-
wistych (np. komórki, biopolimery wielkocząstecz-
kowe), czyli w przypadkach, gdzie klasyczne techniki
spektrofotometryczne i spektrouorometryczne nie
sprawdzają się, gdyż zbierają kumulatywny sygnał
pochodzący zarówno z obiektów (np. komórek), jak
i ośrodka, w którym te obiekty są zawieszone. To co
jest podstawowym ograniczeniem technik konwen-
cjonalnych (spektrouorymetria), tzn. obecność po-
liczalnych rozpraszających światło obiektów, stanowi
niejako warunek sine qua non stosowania cytometrii
przepływowej.
W miarę udoskonalania możliwości techniki
cytometrii rosły także apetyty badaczy na implanto-
wanie tej techniki do badania jak największej rozma-
itości procesów cytozjologicznych. W praktyce czę-
sto okazywało się, że pozornie proste aplikacje stawały
się zupełnie karkołomnym wyzwaniem w odniesieniu
do niektórych typów komórek, ale dzięki temu tech-
nika cytometrii rozwijała się na wielu płaszczyznach:
aparaturowej (np. stosowanie kilku różnych laserów
wzbudzających w tym samym urządzeniu), analitycz-
nej (różnicowanie sygnału pochodzącego z wnętrza
struktur komórkowych izpowierzchni nienaruszo-
nych komórek), czy wykorzystującej zaawansowane
techniki biologii molekularnej (badania ekspresji
wybranych fragmentów genomu, technika Flex-Set,
techniki FRET). Podane wybiórczo poniżej niektóre
zastosowania cytometrii przepływowej nie wyczer-
pują szerokich możliwości wykorzystania cytome-
trii w badaniach podstawowych i diagnostycznych:
analiza morfometryczna populacji obiektów (na
podstawie rozproszenia czołowego światła, For-
ward Scatter, FSC);
analiza morfologiczna struktur
wewnątrzkomórkowych (ziarnistość) na podsta-
wie rozproszenia światła na organellach wewnątrz-
komórkowych i błonie komórkowej (rozproszenie
boczne światła, Side Scatter, SSC);
analiza ekspresji i gęstości rozmieszczenia wybra-
nych antygenów powierzchniowych– metody fe-
notypowania komórek;
Cytometria Polska
22
tom 1, zeszyt nr 1, 2012
analiza intermediatów metabolizmu tlenowgo ige-
nerowania wolnych rodników;
analiza mobilizacji i transportu jonów (H+, Ca2+,
Mg2+, Na+, itp.);
badanie zmian potencjału błonowego komórek
iorganelli;
analiza zużycia i rozpadu komórek, procesów
mikrowezykulacji, apoptozy, nekrozy;
określanie asymetrii błon komórkowych i  płyn-
ność błon komórkowych;
• analiza zawartości i replikacji kwasów
nukleinowych, badanie ploidii komórek;
• analiza polimeryzacji białek cytoszkieletu;
szereg innych, m.in. zachodzenie fagocytozy ipi-
nocytozy, sekrecja komórkowa, adhezja iagregacja
komórek, chemotaksja komórek, opłaszczanie ko-
mórek przeciwciałami.
Fakt, iż cytometria przepływowa dostarcza
nam możliwości badania dużych i bardzo dużych po-
pulacji komórek w krótkim czasie oraz uśredniania
niektórych reprezentatywnych dla takiej populacji
parametrów strukturalnych i funkcjonalnych, np.
stopnia ekspresji określonych antygenów/recepto-
rów, nasilenia reakcji uwalniania komórek, mobili-
zacji określonych jonów w wewnątrzkomórkowych
kompartmentach, określania fazy cyklu komórkowe-
go, itp., stawia tę technikę niejako w opozycji do tech-
nik pozwalających na badanie zjawisk unikalnych
(np. mikroskopia uorescencyjna). Ten walor nume-
ryczny cytometrii, sprawia, że w opinii wielu badaczy
cytometrii trudno odmówić cech statystycznej wia-
rygodności. Z drugiej strony, w swej czystej postaci
cytometria nie pozwala badaczowi na zobrazowa-
nie pojedynczych rejestrowanych obiektów. Niekie-
dy może to prowadzić do przekłamywania zbiera-
nej informacji, o ile - przy wsparciu o inne metody,
nie przekonamy się o tym, czy rzeczywiście badamy
obiekty, które nas interesują. Dotyczy to zwłaszcza
szczególnych przypadków zastosowania tej techniki
w badaniach podstawowych i niediagnostycznych
(w rozumieniu: diagnostyki materiału badawczego,
najczęściej krwi, pochodzącego od ludzi). Z dru-
giej strony, wsparcie cytometrii o moduł sortowania
komórek pozwala na badanie mniejszych popula-
cji obiektów o szczególnej charakterystyce z całych
komórkowych populacji. Sama możliwość wysor-
towania określonych komórek/subpopulacji komó-
rek tworzy dla badacza bardzo atrakcyjny pomost
między cytometrią (jako narzędziem służącym do
przygotowania materiału badawczego) a technikami
hodowli komórkowych i dalszej analizy zmienionych
linii komórkowych. Ogólnie, problemy, jakim musi
sprostać badacz w celu wszechstronnego, ale i obiek-
tywnego wykorzystania techniki cytometrii prze-
pływowej można podzielić na dwie grupy. Pierwsza
dotyczy właściwego przygotowania materiału ba-
dawczego do pomiaru cytometrycznego, druga wiąże
się z doborem odpowiednich przeciwciał oraz znacz-
ników uorescencyjnych do badania pożądanych
zjawisk cytozjologicznych i/lub procesów bioche-
micznych. W niniejszej pracy staraliśmy się zilustro-
wać na wybranych przykładach niektóre z wyzwań,
jakie stoją przed badaczem zajmującym się mniej
typowymi zastosowaniami cytometrii przepływowej
niż aplikacje typowo diagnostyczne i medyczne (1).

-

Jak minimalizować ryzyko artefaktów pomiarowych
w badaniach czynności płytek krwi przy zastosowa-
niu cytometrii przepływowej?
Problemy, z jakimi może zmierzyć się badacz płytek
krwi, mogą dotyczyć:
• przygotowania materiału badawczego do pomiaru
iutrwalania komórek,
• doboru przeciwciał i stosowania przeciwciał izoty-
powych,
• rejestrowania tzw. „ekspresji antygenu” oraz liczby
kopii antygenu, badania frakcji mikro-płytek (mi-
krocząstek) i frakcji agregatów (2-4).
Przygotowanie materiału do badań cytometrycz-
nych
Jednym z krytycznych czynników decydu-
jących owiarygodności analizy cytometrycznej jest
moc rozdzielcza cytometru przepływowego. Stąd też,
zbyt małe rozmiary nawet właściwie przygotowane-
go preparatu komórek mogą znacząco ograniczyć
wiarygodną analizę cytometryczną. Dobrym testem
czułości cytometru może być badanie zdolności roz-
dzielczej kuleczek żywicowych o wielkościach w za-
kresie przystającym do zakresu wielkości badanych
obiektów lub komórek. Przy badaniu tak małych
komórek, jak płytki krwi, problemem może stać się
także występowanie bakterii w buforach użytych do
sporządzania zawiesin komórkowych, cząstki ku-
rzu, itp. Dlatego, też zaleca się ltrowanie roztworów
stosowanych do analizy cytometrycznej przez ltry
owielkości porów 0.2 m i przechowywanie ich w
23
Cytometria Polska tom 1, zeszyt nr 1, 2012
warunkach sterylnych (5). Ponieważ płytki krwi bar-
dzo łatwo ulegają aktywacji i/lub uszkodzeniu pod-
czas procedur ich izolowania i oczyszczania, nale-
żałoby czynności te zminimalizować oraz stosować
odpowiednie inhibitory spontanicznej/samoistnej
aktywacji. Jednakże, podejście takie sprawdza się
jedynie w doświadczeniach, gdy nie zależy nam na
monitorowaniu czynności płytek krwi, gdyż zastoso-
wanie inhibitorów będzie - w sposób oczywisty, prze-
kłamywało obraz odpowiedzi płytek krwi na bada-
ne czynniki. Pewnym kompromisem mogłoby tutaj
być zastosowanie niefrakcjonowanych próbek pełnej
krwi, bez uciekania się do izolowania płytek czy nawet
bogatopłytkowego osocza. To co sprawdza się znako-
micie w badaniach diagnostycznych lub klinicznych,
gdzie najczęściej badanym materiałem jest pełna
krew, może zawodzić w badaniach podstawowych,
gdy pozyskanie frakcji płytek krwi w osoczu (osocze
bogatopłytkowe) lub buforze (zawiesina płytek) jest
niezbędne do ich właściwego i skutecznego wyzna-
kowania (zob. niżej, np. badanie żywotności komó-
rek, mobilizacji czy transportu jonów) lub wproto-
kołach, gdzie zastosowanie pełnej, niepreparowanej
krwi wyklucza poprawne przeprowadzenie pomiaru
(zob. niżej, np. badanie płytek gryzoni laboratoryj-
nych). Często ryzyko samoistnej, niepożądanej (ar-
tefaktualnej) aktywacji płytek wzrasta niepomiernie
z czasem upływającym od momentu wynaczynie-
nia. Dlatego, też wskazane jest wykonywanie bada-
nia w czasie możliwie jak najkrótszym po pobraniu
materiału, jak również właściwe przetrzymywanie
materiału do czasu analizy (np. temperatura 37 C
jest o wiele bardziej korzystna dla płytek krwi niż
temperatura ok. 4 C, preferowana w przypadku
większości komórek). Niekiedy używa się komó-
rek utrwalonych, w innych przypadkach wymagane
jest badanie żywych komórek (3) (zob. też poniżej).
W różnych protokołach przygotowywania płytek
krwi do badań cytometrycznych znajdują zastosowa-
nie dwie strategie badania:
1. w celu orzekania o funkcjonowaniu i odpowiedzi
na bodźce komórek w ustroju stosuje się bardzo czę-
sto utrwalanie komórek i niejako „zamrażanie” ich
stanu funkcjonalnego; to podejście wykorzystuje się
z reguły do określania stanu aktywacji płytek krwi
krążących w łożysku naczyniowym;
2. barwienie i analiza przyżyciowa komórek pozwala-
ją na ocenę czynnościową komórek w testach in vitro,
np. przy badaniu reaktywności płytek krwi (2-4,6).
Sposób pierwszy stosuje się zwłaszcza w tych przy-
padkach, gdy badane komórki ulegają łatwej akty-
wacji w warunkach pozaustrojowych, co zaciemnia
wyniki pomiaru. Barwienie przyżyciowe jest wyma-
ganiem koniecznym do badania procesów cytozjo-
logicznych płytek krwi oraz testowaniu ich odpowie-
dzi na działanie czynników aktywujących.
 pomaga nie tylko „zamrozić” stan
funkcjonalny płytek krwi na badanym etapie procesu
cytozjologicznego, ale również jest często zasadni-
czym warunkiem permeabilizacji tych komórek dla
niektórych reagentów stosowanych w protokołach
badawczych i pomiarowych (1,7,8). Do utrwalania
najpowszechniej stosuje się formaldehyd lub pa-
raformaldehyd (w stężeniach 1-2% w PBS pH 7.0),
niekiedy etanol, rzadziej glutaraldehyd. Można było-
by spodziewać się, że alkohole są lepszym wyborem,
gdyż aldehydy reagując z różnorodnymi aminami
wkomórce mogą same w sobie warunkować powsta-
wanie uoryzujących pochodnych. Nie znajduje to
jednak odzwierciedlenia w metodologii badania pły-
tek krwi przy użyciu cytometrii, gdyż najpowszech-
niej stosuje się tu właśnie 1% paraformadehyd. Me-
chanizm utrwalania jest podobny dla większości
substancji utrwalających: powodują one denaturację
i/lub sieciowanie białek. Nie dziwi zatem, że w przy-
padku niektórych antygenów powierzchniowych na
płytkach krwi, proces utrwalania przyczynia się do
znaczącego spadku wiązanie przeciwciał z komórka-
mi. Często utrwalaniu może towarzyszyć tworzenie
agregatów komórkowych, co może być niepożądane
w sytuacjach gdy chcemy badać pojedyncze niezgru-
powane komórki, albo wnioskować o stopniu zjo-
logicznej agregacji w płynie biologicznym. W wielu
protokołach przygotowania materiału do pomiarów
cytometrycznych zaleca się stosowanie utrwalaczy
razem z detergentami, aby przyspieszyć penetra-
cję cząsteczek utrwalacza i ułatwić jego dystrybucję
wkomórkach. W badaniach płytek krwi stosowanie
detergentów nie znalazło szerszego zastosowania.
Warto pamiętać, że utrwalanie zmienia zdolności
refrakcyjne komórek: współczynnik refrakcji cy-
toplazmy wzrasta z ok. 1.35 w komórkach żywych
do ponad 1.5 w komórkach utrwalonych. Ponieważ
współczynnik ten decyduje o wartościach parametru
rozproszenia bocznego światła (SSC), należy pamię-
tać że komórki utrwalane będą się charakteryzowa-
ły znacznie podwyższonymi wartościami SSC, co
może przyczyniać się do ich lepszej dyskryminacji
w obrazie cytometrycznym. Jednak zwiększone roz-
praszanie boczne utrwalonych komórek może mieć
także wpływ na precyzję pomiarów uorescencji,
ponieważ zmiany konformacyjne struktur komórko-
Cytometria Polska
24
tom 1, zeszyt nr 1, 2012
wych na skutek utrwalania mogą wpływać na zmiany
amplitudy sygnałów uorescencji. Utrwalanie może
utrudniać interpretację wyników badań, gdyż czę-
sto zmienia wielkość komórek, a zatem proces ten w
jakimś stopniu przekłamuje zjologiczny obraz cyto-
metryczny płytek krwi. Pomimo wielu korzyści, ja-
kie niesie ze sobą utrwalanie komórek, w badaniach
antygenów powierzchniowych (np. ochrona przed
samoistną aktywacją), należy zaznaczyć, że działanie
utrwalaczy na białka komórkowe może się wiązać ze
zmianami konformacji tych białek na tyle rozległy-
mi, że wybrane epitopy antygenów powierzchnio-
wych przestają być rozpoznawane przez stosowa-
ne przeciwciała monoklonalne. Dlatego też, przed
podjęciem decyzji o utrwalaniu badanych komórek
wskazane jest udzielić sobie odpowiedzi na dwa za-
sadnicze pytania: (a) czy przeciwciała monoklonalne
pozostają związane z epitopem po utrwaleniu?, oraz
(b) czy epitop nie ulega istotnej zmianie na skutek
zmian struktury chemicznej wywołanych utrwala-
niem? Biorąc powyższe ograniczenia pod uwagę,
często warunkiem przeprowadzenia efektywnego
znakowania jest stosowanie żywych nieutrwalanych
komórek. Z uwagi na nieprzewidywalne często efekty,
jakie może pociągać za sobą utrwalanie materiału ba-
dawczego, należałoby stosować stały protokół utrwa-
lania i znakowania komórek w celu uzyskiwania w
pełni porównywalnych wyników. Obok różnych
opcji przygotowywania komórek do analizy (analiza
komórek utrwalonych lub nieutrwalonych), niekie-
dy utrwalanie stosuje się w stosunku do płytek krwi
uprzednio wyznakowanych odpowiednimi przeciw-
ciałami. Często prowadzi to do większej powtarzal-
ności zbieranych wyników, rzadziej, obserwujemy
znaczący spadek świecenia obiektów utrwalonych
(najprawdopodobniej na skutek obniżania trwałości
wiązania antygen-przeciwciało).
Dobór przeciwciał i stosowanie przeciwciał izotypowych
Z uwagi na olbrzymie zróżnicowanie powinowactwa
różnych przeciwciał w kierunku określonych anty-
genów, godna polecenia jest jak największa powta-
rzalność procedury znakowania, anawet stosowanie
przeciwciał z tej samej serii produkcyjnej w danej
serii doświadczeń. Oddzielnym problemem, z jakim
badaczowi płytek krwi metodą cytometrii przycho-
dzi się często zmierzyć, jest duża różnorodność ko-
mercyjnie dostępnych przeciwciał, z których żadne
nie są niestety dokładnie scharakteryzowane co do
rozpoznawanej determinanty antygenowej. Z tego
względu najbardziej pożądane byłoby zastosowanie
dopełniających do cytometrii narzędzi itechnik obra-
zowania (np. Image Stream) (9), po to, aby sprawdzić
specykę wiązania poszczególnych przeciwciał, któ-
re chcemy stosować później korzystając z cytome-
trii przepływowej (10). Werykacja taka umożliwia
potwierdzenie lub zaprzeczenie specyczności na
dwóch poziomach:
(a) czy przeciwciało wiąże się selektywnie do wy-
branego antygenu występującego na komórkach
określonego typu; w naszym przypadku oczekiwa-
libyśmy, że np. przeciwciało anty-CD61 będzie się
wiązać preferencyjnie do płytek, a nie do innych
komórek krwi (tutaj nie możemy wykluczyć zupeł-
nie wiązania np. do leukocytów, do których mogą
przylegać fragmenty błon komórkowych płytek,
lecz gęstość takich antygenów na krwinkach bia-
łych będzie bez porównania mniejsza niż na sa-
mych płytkach, co ujawni się w obrazach cytome-
trycznych),
oraz
(b) czy występuje współzawodnictwo wiązania prze-
ciwciał znakowanych i nieznakowanych do danego
antygenu.
Tak w przypadku badania płytek krwi, jak i w przy-
padku badania innych komórek, w celu wiarygod-
nego ustawienia markerów uorescencji oraz zde-
niowania położenia komórek antygeno-negatywnych
zaleca się dość powszechnie wykonywanie tzw. próby
kontrolnej, tzn. znakowania kontrolnymi przeciwcia-
łami izotypowymi, dla każdej serii oznaczeń (11,12).
W próbie takiej zamiast przeciwciał monoklonal-
nych stosowanych do wykrywania określonego an-
tygenu powierzchniowego wykorzystuje się prze-
ciwciała IgG klasy takiej jak stosowane przeciwciała
monoklonalne, po to, aby przekonać się jakie jest
wiązanie niespecyczne przeciwciał do powierzch-
ni komórek (tzn. „wiązanie” nie wynikające z selek-
tywnego rozpoznawania epitopu badanego anty-
genu przez przeciwciało monoklonalne, a jedynie z
przylegania/opłaszczania komórek przez cząsteczki
białkowe). Zakłada się przy tym, że zarówno charak-
terystyka wiązania niespecycznego, jak i własno-
ści biochemiczne przeciwciał izotypowych są takie
same jak przeciwciał monoklonalnych stosowanych
do badania określonego antygenu. Założenie takie
nie zawsze okazuje się prawdziwe (przeciwciała izo-
typowe i przeciwciała monoklonalne mogą się np.
różnić strukturą ciężkiego łańcucha immunoglo-
bulin), dlatego też położenie populacji wiążących
niespecycznie przeciwciała izotypowe i przeciw-
ciała monoklonalne może się nieco różnić (Ryc. 1).
25
Cytometria Polska tom 1, zeszyt nr 1, 2012
Wykresy kropkowe ludzkich płytek spoczynkowych znakowanych przeciwciałami izotypowymi klasy IgG (A, B) dla prze-
ciwciał rozpoznających antygen CD62P (FL2) i dla przeciwciał PAC-1 (FL1)(C, D). Płytki nieutrwalone we krwi pełnej wybram-
kowano na obecność antygenu CD61 rozpoznawanego przez przeciwciała wyznakowane Per-CP.
Stwierdzono, że takie niespecyczne ‚‚wiązanie”
przeciwciał zachodzi przy udziale receptora FcRII
(CD32). Ponieważ wiązanie immunoglobulin do
receptora FcRII jest wyższe w komórkach pobudzo-
nych (na skutek wyższej ekspresji receptora) (5), na-
leżałoby blokować receptor FcRII lub wykonywać
osobną próbę kontrolną dla komórek stymulowanych
(13). Ponieważ różne serie komercyjnie dostępnych
przeciwciał izotypowych oraz przeciwciał swoistych
zawsze w jakimś stopniu się różnią pod względem
stechiometrii wyznakowania uoroforem (zob. t
niżej), zbierając wyniki w dłuższym interwale czasu
(a więc ze znikomą szansą zastosowania tej samej se-
rii przeciwciał) musimy mieć świadomość, że zmien-
Cytometria Polska
26
tom 1, zeszyt nr 1, 2012
ność blokowa kolejnych eksperymentów będzie
zwiększona. Mając to na uwadze, bardzo uzasadnio-
ne jest korzystanie przy analizie danych pochodzą-
cych z rozciągniętego w czasie eksperymentu zme-
tod dwuczynnikowej analizy wariancji w modelu
zrównoważonych bloków (bez interakcji). Idealnie,
przeciwciała swoiste powinny być wyznakowane u-
oroforem ze stechiometrią zgodną z wyznakowaniem
stosowanych w pomiarach przeciwciał izotypowych.
Jak wiemy, często tak nie jest. Toteż inną ważną im-
plikacją faktu, iż stechiometria znakowania przeciw-
ciał izotypowych jest inna niż przeciwciał swoistych,
jest uświadomienie sobie kierunku „przekłamywa-
nia” wyniku rzeczywistego naszego pomiaru. Jeżeli
stosowane przeciwciała izotypowe są wyznakowane
„gęściej” (tzn. świecą intensywniej) niż przeciwciała
swoiste, to mierzona populacja płytek krwi (lub ogól-
nie: obiektów badanych) będzie z reguły zubożona
osubpopulacje słabo wyznakowane. W przeciwnym
przypadku, mierzona populacja będzie „bogatsza
oobiekty, które nie są wcale płytkami krwi (cząstki
kurzu, bakterie, itp.). Problemy takie skłaniają niektó-
rych badaczy do stosowania innych sposobów stan-
daryzacji pomiaru (np. immunokompetycja między
przeciwciałami swoistymi znakowanymi i nieznako-
wanymi uorescencyjnie lub arbitralne określanie re-
gionów płytek antygeno-pozytywnych) (2-4,6).
Warto zwrócić uwagę, że odtwarzalność sta-
łej stechiometrii wiązania uoroforu do przeciwciała
nie jest jednakowa dla wszystkich znaczników uo-
rescencyjnych i niekiedy może się dość znacznie wa-
hać w zależności od rodzaju i serii przeciwciał, czasu
i warunków ich przechowywania, itp. Znacznikiem,
którego stechiometria wiązania z immunoglobuli-
nami jest wysoce odtwarzalna (jest ona bliska sto-
sunkowi 1:1) w różnych preparatach przeciwciał jest
koerytryna. Z drugiej strony, stechiometria innego
powszechnie stosowanego w cytometrii uoroforu –
uoresceiny, a właściwie jej pochodnej FITC, może
się wahać w zakresie 1.5-4 (1). Niestety, dostępne
komercyjnie przeciwciała nie są scharakteryzowane
pod względem ilości przyłączonego do nich znaczni-
ka. Można pokusić się o ustalenie takiej stechiometrii
wiązania we własnym zakresie, np. na podstawie zna-
jomości wydajności kwantowej uoroforu i stężenia
białka. Z powyższych względów, zaleca się, aby do
potrzeb kalibracji starać się dobierać najlepiej prze-
ciwciała znakowane koerytryną.
Badanie „ekspresji antygenu” oraz liczby kopii an-
tygenu
Na podstawie rejestrowanej emisji uorescencji oce-
niamy zarówno powszechność występowania an-
tygenu powierzchniowego błon płytkowych (na ilu
komórkach występuje, parametr wyrażany w %),
jak i gęstość powierzchniową (w ilu kopiach lub jak
licznie występuje on na powierzchni komórek). Pa-
rametr zwany ekspresją receptora w płytkach określa
w rzeczywistości frakcję komórek „postrzeganych”
przez cytometr jako płytki antygeno-pozytywne
(8,14). Ponieważ próg czułości techniki cytometrii
przepływowej wyznacza liczbę 800-1000 kopii anty-
genu jako dolną granicę antygenopozytywności (tzn.
płytka krwi posiadająca przynajmniej 800-1000 roz-
poznawalnych przez przeciwciała epitopów antyge-
nowych na swojej powierzchni będzie rejestrowana
przez cytometr jako płytka antygeno-pozytywna),
wszelkie uktuacje liczby epitopów antygenowych
na powierzchni pojedynczej płytki poniżej tej grani-
cy, będą „niezauważalne” dla aparatury pomiarowej.
Analogicznie, płytki krwi eksponujące na swej po-
wierzchni mniej niż 800 kopii danego antygenu zo-
staną zdyskryminowane jako płytki antygeno-nega-
tywne. Obtość występowania danego antygenu na
powierzchni błon komórkowych płytek (liczba kopii
antygenu) wyrażana jest albo jako liczba cząsteczek
antygenu przypadająca na jedną komórkę - wtedy
gdy mamy możliwość kalibracji wiązania znakowa-
nych przeciwciał do komórek, albo częściej - jako
mediana intensywności uorescencji. Podczas gdy
pomiar „ekspresji antygenu” odzwierciedla zmiany
występowania określonego antygenu w badanych
procesach cytozjologicznych (np. pojawianie się an-
tygenów nieobecnych w płytkach niepobudzonych,
lecz prezentowanych na powierzchni płytek po akty-
wacji), drugi parametr pozwala pozwala rejestrować
powszechność występowania antygenu w błonie cy-
toplazmatycznej. Do kalibracji gęstości rozmieszcze-
nia antygenu w błonie płytkowej stosuje się zestawy
znakowanych uorescencyjnie kuleczek żywicowych
(lub z tworzyw sztucznych) orozmiarach odpowia-
dających zakresom rozmiarów pojedynczych płytek
oraz ich agregatów (zob. niżej) iznanej gęstości czą-
steczek znacznika przypadających na kulkę. Dyspo-
nując szeregiem kalibratorów z różną liczbą przy-
łączonych cząsteczek uoroforu można wyznaczyć
krzywą standaryzacyjną i w oparciu o nią dokonać
bezwzględnej oceny ilościowej liczby kopii antygenu
przypadającej średnio na powierzchnię jednej bada-
nej płytki krwi. Taki sposób kalibracji sprawdza się
dobrze dla antygenów licznie lub bardzo licznie wy-
stępujących w błonie płytkowej (np. CD61 – 40-100
tys., CD42b – 25 tys.). Więcej problemów może do-
27
Cytometria Polska tom 1, zeszyt nr 1, 2012
świadczyć badacz usiłujący ocenić liczbę kopii anty-
genu mniej powszechnie reprezentowanego, np. PAR-
1 (około 500-2000 kopii). W płytkach aktywowanych
trombiną receptor ten zostaje trawiony i jego gęstość
rozmieszczenia w błonie maleje (15-19). Rejestrując
zmiany liczby kopii PAR-1 w błonie płytek, możemy
uzyskać dichotomiczny rozkład zbieranych wyników
(jest – gdy liczba kopii > 800-1000, lub brak – gdy
liczba kopii < 800). W sytuacji takiej wygodnie jest
zastosować różne rodzaje przeciwciał, rozpoznające
formę nietrawioną oraz formę trawioną receptora
PAR-1 (18-23). Dodatkowo, mając świadomość fak-
tu, iż niektóre uorofory charakteryzują się wyższą
wydajnością kwantową uorescencji, najkorzystniej
byłoby stosować przeciwciała tak właśnie wyznako-
wane w badaniach antygenów mało licznych w bło-
nie krwinek płytkowych. Sygnał uorescencji można
także dodatkowo zwiększać stosując „obcie” wyzna-
kowane przeciwciała skierowane przeciwko samemu
uoroforowi, np. uoresceinie czy FITC (24-26).
Fenotypowanie płytek krwi na podstawie określenia
ekspresji i liczebności kopii antygenów powierzch-
niowych
W przypadku analizy powierzchniowych
markerów antygenowych płytek krwi warto zwrócić
uwagę na dwa typy antygenów powierzchniowych,
których badanie oraz interpretacja wyników może
napotykać pewne problemy, zwłaszcza u niedoświad-
czonych badaczy.
Receptory/ antygeny konstytutywne to takie mar-
kery powierzchniowe, które zawsze występują na
powierzchni komórki, a ich ekspresja w komórkach
funkcjonalnych wynosi zawsze (przynajmniej zzało-
żenia) 100%. Są to antygeny, które stanowią dla nas
najczęściej markery służące do „bramkowania” re-
gionu określonej populacji/subpopulacji komórek.
Jest zatem mały sens badania zmian ekspresji takich
antygenów w funkcjonalnych pobudzanych komór-
kach, skoro ich występowanie jest warunkiem sine
qua non poprawnej i wiarygodnej dyskryminacji da-
nego typu komórek od innych obiektów. Można na-
tomiast badać liczbę kopii takiego typu antygenu, np.
jako względne zmiany natężenia uorescencji wmia-
rę wzrostu aktywacji komórek. Dynamika takich
zmian uorescencji jest tożsama ze zmianami licz-
by kopii antygenu konstytutywnego w następstwie
zadziałania bodźca. Przykładem takiego konstytu-
tywnego antygenu w płytkach krwi jest np. antygen
CD61, ulokowany na glikoproteinie IIIa płytek krwi.
Przyjmuje się, że występowanie tego antygenu jest
immanentną cechą płytek krwi – przyjęło się wręcz,
iż obiektów, które nie wykazują na swojej powierzch-
ni obecności antygenu CD61 nie klasykujemy jako
płytki krwi (27). Antygen ten, pomimo, że na stałe
obecny w błonie cytoplazmatycznej płytek nawet
wstanie niepobudzonym, może zwiększać swoją li-
czebność około dwukrotnie w następstwie aktywacji
komórek, kiedy z ziarnistości uwalniane są dodatko-
we kopie kompleksu glikoprotein IIb/IIIa. Sytuacja
taka dotyczy wszystkich przypadków z wyjątkiem
pacjentów ze skazą krwotoczną zwaną trombaste-
nią Glanzmanna. U osób takich płytki nie zawiera-
ją funkcjonalnego receptora GPIIb/IIIa (lub którejś
zjego składowych), lub zawierają drastycznie obni-
żoną liczbę kopii tego receptora, albo też jedynie nie-
liczne frakcje płytek zawierają obniżoną liczbę jego
kopii (28-30). W przypadkach takich, ekspresja anty-
genu CD61 określana metodą cytometrii przepływo-
wej istotnie będzie się kształtowała poniżej 100%. Na
tym polega właśnie prosty test diagnostyczny na wy-
krywanie tej skazy krwotocznej metodą cytometrii –
silnie obniżona ekspresja CD61 w płytkach w stanie
spoczynkowym oraz minimalne zmiany pod wpły-
wem działania czynników aktywujących wskazują,
że mamy do czynienia z trombastenią Glanzmanna.
Oczywiście, w celu wiarygodnej diagnostyki należy
wybrać inny antygen „bramkujący” (np. CD36 lub
CD42b) charakterystyczny dla płytek krwi w taki
sposób, aby objąć analizą możliwie najpełniejszą
populację płytek. Ponieważ w tym przypadku, ża-
den inny antygen powierzchniowy nie występuje na
płytkach tak uniwersalnie jak CD61, spełnienie tego
ostatniego warunku nigdy nie jest całkowicie możli-
we (2-4,6).
Antygeny zmieniające ekspresję powierzchniową
to takie, które pojawiają się lub giną na powierzch-
ni płytek aktywowanych. Najpowszechniej bodaj
monitorowany antygen aktywacji płytek krwi, selek-
tyna P (GMP-140, CD62P), to białko występujące
w płytkach niepobudzonych w ziarnistościach alfa
ipojawiające się w błonach powierzchniowych wna-
stępstwie egzocytozy po aktywacji komórek. Jest to
typowy marker aktywacji płytek: występuje w mini-
malnych ilościach w błonach powierzchniowych pły-
tek w stanie niepobudzonym (poniżej progu detekcji
metodą cytometrii), zaś jego masywne uwalnianie do
błon komórkowych występuje w następstwie aktywa-
cji płytek krwi. Najbardziej użytecznym parametrem
wskazującym na stopień aktywacji płytek na podsta-
wie reakcji uwalniania jest pomiar ekspresji (a nie
liczby kopii !) selektyny P (28,31,32) (Ryc. 2).
Cytometria Polska
28
tom 1, zeszyt nr 1, 2012
 Analiza cytometryczna ekspresji selektyny P w ludzkich płytkach spoczynkowych (A, B), płytkach aktywowanych 10 M
ADP (C, D), 10 g/ml kolagenem (E, F) lub 10 M TRAP-14 (G, H). Płytki we krwi pełnej wybramkowano na obecność antygenu
CD61 (FL1) i wyznakowano przeciwciałami skierowanymi przeciw antygenowi CD62P (FL2). Umownie zaznaczone regiony P2,
P4 i P5 odnoszą się odpowiednio do mikropłytek, normopłytek i agregatów płytkowych
29
Cytometria Polska tom 1, zeszyt nr 1, 2012
Ponieważ receptory antygenu CD62P znajdują się
wbłonach monocytów i neutroli, wzrostowi jej eks-
presji towarzyszy najczęściej wzrost frakcji agrega-
tów płytek krwi z monocytami i neutrolami. Inne
powszechnie analizowane antygeny aktywacji płytek
krwi to białko ziarnistości gęstych, CD63, antygen
CD40L lub aktywna forma receptora dla brynoge-
nu. Antygeny internalizowalne to takie, które pa-
radoksalnie zmniejszają swoją ekspresję w procesie
aktywacji komórek, ulegając na przykład redystrybu-
cji do błon struktur wewnątrzkomórkowych (np. an-
tygen CD42b na glikoproteinie GPIb alfa wpłytkach
krwi). W tym przypadku malejąca ekspresja takiego
antygenu może być markerem postępującej aktywa-
cji komórki (6,33-35). W sytuacjach takich należy
mieć na uwadze ryzyko błędnej interpretacji wyni-
ków – zmniejszanie ekspresji antygenu(ów) nie musi
bowiem wynikać jedynie z aktywacji komórek, ale
może także wskazywać na zużycie komórek i degra-
dację niektórych antygenów na ich powierzchni. Aby
ustrzec się takiego błędu, pożądane są zwykle rów-
noległe monitorowanie kilku markerów aktywacji
ianaliza równoległości zmian (Tabela 1).
Badanie funkcji płytek jako komórek ulegających
łatwej spontanicznej aktywacji w warunkach
in vitro – aktywacja i reaktywność płytek krwi
Badania funkcji płytek krwi opierają się
głównie na pomiarach ich aktywacji oraz zdolności
do adhezji iagregacji. Płytki krwi są komórkami wy-
jątkowo wrażliwymi na działanie czynników akty-
wujących (np. izolowania czy przemywania) (36,37).
Dlatego, też badania zmierzające w kierunku obiek-
tywnej oceny funkcji płytek krwi napotykają poważ-
ne trudności metodologiczne, gdyż praktycznie nie
jest możliwe określenie stanu aktywacji płytek in
vivo. Podstawowe testy diagnostyczne do badania
funkcji płytek krwi mają wiele ograniczeń metodycz-
nych inie pozwalają na jednoczesne określanie akty-
wacji i reaktywności płytek krążących jako parame-
trów użytecznych w badaniach klinicznych (38,39).
Badania płytek we krwi pełnej metodą cytometrii
przepływowej, pozwalającą badać jednocześnie ak-
tywację płytek krwi (stan pobudzenia) oraz reak-
tywność (odpowiedź na aktywację), pozbawione są
większości ograniczeń i mogą być przeprowadzone
przy użyciu minimalnej objętości krwi. Z oczywi-
stych względów, aktywację płytek najwygodniej jest
śledzić stosując przeciwciała monoklonalne, które
wiążą się i rozpoznają selektywnie płytki podakty-
wowane, lecz nie wiążą się do płytek w stanie spo-
czynkowym. W grupie przeciwciał rozpoznających
różne formy receptora dla brynogenu znajdują
się na przykład takie, które rozpoznają (a) zmiany
konformacyjne receptora wynikające z odsłonięcia
miejsc wiążących dla ligandu (PAC-1) (40), (b) zmia-
ny konformacyjne receptora wynikające ze związania
ligandu (LIBS1, LIBS6, AP-6) (41), czy (c) zmiany
konformacyjne ligandu (brynogenu) po jego zwią-
zaniu z receptorem. Alternatywnym podejściem jest
stosowanie przeciwciał, które wiążą się w niewielkim
stopniu do płytek w stanie spoczynkowym, lecz wią-
zanie to nasila się wmiarę wzrostu aktywacji płytek
(np. anty-CD36 wiążące się z glikoproteiną GPIV)
(42).
Możliwość stosowania metody cytometrii
przepływowej do badania płytek w pełnej krwi, bez
potrzeby izolowania krwinek płytkowych lub boga-
topłytkowego osocza, istotnie ogranicza ryzyko ar-
tefaktów pomiarowych. Ocena aktywacji czy reak-
tywności płytek pod wpływem różnych czynników
aktywujących opiera się na określeniu frakcji płytek
antygeno-pozytywnych pod względem obecności
wybranych glikoprotein błony płytkowej stanowią-
cych markery aktywacji (np. selektyny P (CD62),
GPIb (CD42b) czy antygenu miejsca wiążącego -
brynogen w kompleksie GPIIb/IIIa (PAC-1)), oraz
frakcji mikropłytek i agregatów (2-4,6,16,43) (Ryc.
2). Przy nieobecności zewnętrznych czynników
pobudzających płytki (agonistów) pomiar techni-
ką cytometrii przepływowej we krwi pełnej określa
stan aktywacji płytek krążących na podstawie liczby
związanych przeciwciał monoklonalnych. Obecność
i liczebność takich antygenów powierzchniowych jak
selektyna P, glikoproteina Ib alfa (składnik receptora
dla czynnika von Willebranda), czy aktywny kom-
pleks glikoprotein IIb i IIIa (receptor dla brynoge-
nu), na powierzchni błony komórkowej płytek zależy
od stanu aktywacji płytek. Zawartość taka, wyrażona
jako frakcja płytek wykazujących dodatnią ekspresję
określonego antygenu powierzchniowego, może sta-
nowić dogodny wskaźnik aktywacji płytek występu-
jących w krążeniu. Warto zwrócić uwagę, że badane
markery aktywacji komórek mogą mieć charakter
neoantygenów (tzn. nie są zasadniczo obecne na
powierzchni komórek w stanie spoczynkowym, ale
pojawiają się jedynie w wyniku uwalniania z ziarni-
stości wewnątrzkomórkowych pobudzonych komó-
rek, np. selektyna P) lub antygenów konstytutywnych
(obecnych zawsze na powierzchni komórek, nawet
w stanie niepobudzonym, ale zmieniających dra-
matycznie swoją liczebność w następstwie aktywa-
cji, np. antygen CD42b na glikoproteinie Ib alfa, lub
Cytometria Polska
30
tom 1, zeszyt nr 1, 2012
aktywna forma GPIIb/IIIa) (6,33-35,40). Zarówno
jedne, jak i drugie antygeny powierzchniowe mogą
być użytecznymi markerami procesów cytozjolo-
gicznych: wiadomo na przykład, że zarówno poja-
wianie się nowych antygenów, jak i zmiany obtości
występowania antygenu w błonach komórkowych są
wynikiem uruchomienia reakcji uwalniania zawarto-
ści ziarnistości wewnątrzkomórkowych. W procesie
tym błona pęcherzyków wewnątrzpłytkowych ulega
fuzji z błona cytoplazmatyczną, a glikoproteiny obec-
ne w błonach ziarnistości wewnątrzkomórkowych
przedostają się do błony cytoplazmatycznej i są eks-
ponowane na powierzchni płytek.
Poprzez dodatkowe zastosowanie
zewnętrznych (egzogennych) czynników aktywu-
jących komórki metoda cytometrii pozwala także
analizować reaktywność płytek krwi w warunkach
ex vivo w ich zjologicznym środowisku, jako spe-
cyczną odpowiedź funkcjonalną przejawiającą się
w zmianach ekspresji powierzchniowych recepto-
rów błonowych płytek krwi. Tak rozumiana reak-
tywność płytek jest funkcją zużycia i wyczerpania
płytek krążących. Zatem wyniki aktywacji płytek
dają badaczowi pojęcie na temat tego czego komórki
„doświadczyły” w krążeniu (śladem epizodów akty-
wacji w krążeniu będą zmiany ekspresji antygenów-
-markerów, np. selektyny P). Z drugiej strony, wyni-
ki reaktywności pozwalają wnioskować o tym, „na
co komórki jeszcze stać” i jak dalece są one jeszcze
funkcjonalne i zdolne do pełnienia określonej roli
w organizmie (obniżona reaktywność na działanie
bodźców oznacza obniżoną funkcjonalność i więk-
sze zużycie komórek). Cytometryczna analiza funk-
cji płytek powinna być zawsze wieloparametrowa,
dokonywana z pełnym zrozumieniem cytozjologii
i patozjologii poszczególnych markerów dobranych
jako wyznaczniki aktywacji tych komórek. Analiza
jedno- lub dwuwymiarowa może bowiem często pro-
wadzić do przekłamań wyników analizy i przywodzić
badaczy do błędnych wniosków. Na przykład, badacz
rejestrujący niewielkie wartości ekspresji markerów
aktywacji płytek nie jest upoważniony do orzeka-
nia niewielkiej aktywacji płytek krążących, dopó-
ki nie wykona oznaczeń reaktywności (cytometria)
oraz stężenia rozpuszczalnych antygenów aktywacji
(immunochemia). Dlaczego? Ponieważ wiele spo-
śród tych antygenów aktywacji (np. CD62P, CD40L,
CD42b) występuje w błonie komórkowej płytek
przejściowo, a następnie ulega złuszczeniu do oso-
cza krwi (sCD62P, sCD40L, glikokalicyna) (44-49).
Niewykrywanie antygenów aktywacji w błonach
powierzchniowych płytek nie jest świadectwem, iż
epizody aktywacji nie miały miejsca w łożysku na-
czyniowym. Wykrycie podwyższonych stężeń tych
antygenów w osoczu może być dla badacza użytecz-
ną wskazówką, pozwalającą na sprecyzowanie dwóch
wniosków. Po pierwsze, brak podwyższonej ekspre-
sji antygenów-markerów aktywacji płytek w błonie
komórkowej oraz wykrycie podwyższonych stężeń
ich rozpuszczalnych form wosoczu, świadczyć może
otym, że doszło kiedyś do epizodu aktywacji komó-
rek, ale było to na tyle dawno, że antygeny błonowe
uległy złuszczeniu iznalazły się w osoczu. To może
przemawiać za okazjonalnością epizodów aktywacji,
gdyż jeżeli występowałyby często to najprawdopo-
dobniej zostałyby wykryte zarówno w błonach pły-
tek, jak iw osoczu. Pomiary reaktywności, czyli od-
powiedzi płytek na działanie agonistów w warunkach
ex vivo, dostarczają nam dodatkowych argumentów.
Słaba odpowiedź płytek na działanie agonistów to po-
średni dowód na zużycie płytek krążących w łożysku
naczyniowym. Takie płytki podlegały najprawdopo-
dobniej częstym epizodom aktywacji w krążeniu,
aich słaba odpowiedź na aktywatory może wynikać,
z wyczerpania zasobów wewnątrzpłytkowych (płytka
jako komórka bezjądrzasta nie dysponuje sprawnym
aparatem biosyntezy białka de novo) (Tabela 1) (2-4).
Odpowiedź płytek krwi na różne aktywatory
(agonistów) zależy od wielu czynników zjologicz-
nych czy patozjologicznych, lecz także tych wynika-
jących z różnic w metodyce i protokole badania, m.in.
(a) tego, czy płytki krwi badamy we krwi pełnej, czy
w osoczu bogatopłytkowym czy w zawiesinie wyizo-
lowanych płytek w buforze, (b) tego, jaki marker ak-
tywacji pragniemy monitorować, (c) tego, czy bada-
my komórki na świeżo czy w próbach utrwalonych, a
nawet (d) tego, na jaki antykoagulant została pobra-
na krew do badań. Mając to na uwadze, powinniśmy
unikać stosowania różnych protokołów do badania
wybranych parametrów aktywacji czy reaktywności
płytek, czy nawet przeciwciał różnych producentów
(zagrożenie takim postępowaniem może mieć miej-
sce np. w projektach wieloośrodkowych). Na przy-
kład, płytki izolowane w buforze mogą odpowiadać
słabiej niż we krwi pełnej, płytki w próbach utrwa-
lonych mogą zawierać większe frakcje agregatów,
wreszcie, niektórych agonistów nie sposób stosować
bez modykacji protokołów oznaczeń. Do silnych
agonistów powszechnie zalicza się trombinę, peptydy
TRAP, czy kolagen, do słabych – ADP, kwas arachi-
donowy, epinefrynę (Ryc. 3).
31
Cytometria Polska tom 1, zeszyt nr 1, 2012
Przykładowa interpretacja wyników cytometrycznej analizy aktywacji i reaktywności płytek krwi.
aktywacja
płytek spoczynkowych we
krwi krążącej
reaktywność in vitro stężenie rozpuszczalnych
form antygenów w osoczu
wniosek
podwyższona podwyższona niskie płytki podaktywowane (artefaktualnie?),
o normalnej funkcjonalności, brak oznak
częstych epizodów aktywacji w krążeniu
podwyższona niska wysokie płytki podaktywowane (naturalnie?), o
małej funkcjonalności, zużyte na skutek
częstych epizodów aktywacji w krążeniu
niska podwyższona niskie płytki o pełnej funkcjonalności i
wysokim potencjale hemostatycznym
niska podwyższona wysokie płytki o pełnej funkcjonalności, w
przeszłości nieokazjonalne epizody
aktywacji w krążeniu
Wykresy kropkowe zależności czołowego rozproszenia światła (FSC) od bocznego rozproszenia światła (SSC) (A, B, D, F) oraz uore-
scencji w kanale FL1 (PAC-1, aktywny kompleks GPIIb/IIIa) od uorescencji w kanale FL2 (anty-CD62P-PE, selektyna P) (C, E, G) dla ludzkich
płytek spoczynkowych (B, C) oraz płytek aktywowanych 10 M ADP (D, E) lub 10 g/ml kolagenem (F, G). Płytki w nieutrwalonej krwi pełnej
wybramkowano na antygen CD61 przy użyciu przeciwciał anty-CD61 znakowanych Per-CP. Kropki czerwone odpowiadają obiektom barwionym
na CD62P, kropki zielone – obiektom z przyłączonymi przeciwciałami PAC-1. Wykres A przedstawia rozkłady wielkości kulek polistyrenowych.
Pionowe linie przerywane na wykresach kropkowych płytek oznaczają wielkości obiektów oznaczone na podstawie średnich wielkości subpo-
pulacji kulek. Obrysy regionów występowania mikropłytek, normopłytek i agregatów płytkowych oznaczono linią przerywaną, odpowiednio
wkolorach zielonym, czerwonym i niebieskim.
Cytometria Polska
32
tom 1, zeszyt nr 1, 2012
Ogólnie, stopień zmian ekspresji danego antygenu,
na podstawie którego wnioskujemy o stopniu akty-
wacji płytek, jest w oczywisty sposób uzależniony od
biologii badanego antygenu – markera aktywacji. Na
przykład, zmiany ekspresji aktywnej formy recepto-
ra dla brynogenu (w płytkach ludzkich wykrywane
przy użyciu przeciwciał PAC-1, w płytkach mysich
– JON/A) będą bardziej widoczne w płytkach akty-
wowanych ADP niż zmiany w ekspresji selektyny P.
Płytki krwi pobranej na 3.2% cytrynian sodu będą od-
powiadały mniejszymi zmianami ekspresji selektyny
P czy aktywnej formy receptora dla brynogenu niż
płytki w próbach pobranych na hirudynę. Wreszcie,
w celu zastosowania niektórych agonistów musimy
zmodykować protokół znaczeń, np. stosując trom-
binę w próbkach krwi pełnej czy bogatopłytkowego
osocza (lecz nie w zawiesinach izolowanych płytek)
musimy suplementować próby dość wysokimi stęże-
niami peptydu H-Gly-Pro-Arg-Pro-NH2 (0.5 mM),
aby zapobiec polimeryzacji i stabilizacji tworzącego
się w obecności trombiny włóknika (50).
Badania zużycia i rozpadu (niszczenia) komórek
oraz ich agregacji – charakterystyka mikropłytek
iagregatów płytkowych
Chociaż frakcja agregatów komórkowych
powstałych w warunkach krążenia in vivo może być
oceniana jako niezależny parametr przy użyciu cyto-
metrii przepływowej, to aby obiektywnie przypisać
temu parametrowi znaczenie funkcjonalne, należy
mieć świadomość, że technika ta nie pozwala nam
określić ilości antygenu przypadającej na pojedyn-
czą komórkę „uwięzioną” w agregacie złożonym
zwielu komórek. Dzieje się tak dlatego, że cytome-
tria umożliwia pomiar uorescencji przypadającej
na jeden obiekt (cząstkę), niezależnie od tego czy
obiekt ten jest pojedynczą komórką czy agregatem
wielu komórek. Wynika stąd, że duża liczba agre-
gatów może istotnie fałszować rzeczywiste wartości
uorescencji odpowiadającej badanemu antygenowi
powierzchniowemu i przypadającej na pojedynczą
komórkę. Metodyka przygotowania materiału biolo-
gicznego do badań cytometrycznych powinna zatem
być spójna ze strategią minimalizowania liczby agre-
gatów komórkowych wynikających z błędów meto-
dycznych przy pobieraniu i preparatyce krwi. Biorąc
powyższe pod uwagę, można założyć, że cytometria
pozwala na przybliżone oszacowanie frakcji agrega-
tów jako obiektów większych od pojedynczych ko-
mórek (tzn. bardziej rozpraszających czołowo świat-
ło – większe wartości FSC) w zbiorowości badanych
obiektów (np. komórek krwi) (3). Należy jednak mieć
świadomość, że pojedynczy obiekt o większych roz-
miarach liniowych rejestrowany przez cytometr jako
agregat jest zbiorowiskiem od kilku do kilkunastu
czy wyjątkowo nawet kilkudziesięciu komórek. Za-
tem stwierdzenie występowania np. 2% frakcji agre-
gatów komórkowych nie oznacza wcale, że 2% komó-
rek badanej populacji jest uwięzione w agregatach;
w rzeczywistości, komórek występujących w formie
agregatów jest o wiele więcej. Metoda taka jest jed-
nak zupełnie wystarczająca w badaniach porównaw-
czych, chociaż wyznaczenie przedziałów wielkości
(wartości parametru FSC) dla agregatów jest w dużej
mierze umowne. Dodatkowe zastosowanie kuleczek
kalibracyjnych o różnej średnicy umożliwia określe-
nie sferycznych wymiarów agregatów komórkowych,
zaś dodatkowe zastosowanie przeciwciał rozpozna-
jących odpowiednie markery powierzchniowe (np.
anty-CD61/FITC dla płytek krwi, anty-CD11b/18/
PE dla neutrolów czy anty-CD14/PE dla monocy-
tów) pozwala ocenić udział poszczególnych typów
komórek w agregatach międzykomórkowych (37).
Podobnie, zjawisko czołowego rozpraszania
światła wykorzystuje się przy badaniu zawartości
frakcji mikrocząstek (np. mikropłytek) (36,43,51-54).
Mikrocząstki komórkowe (włączając mikropłytki)
to małe obiekty (0.05-1 m), obejmujące egzosomy
(mniejsze, 50-100 nm; często mylnie klasykowane
do tej samej kategorii co mikropłytki), mikrocząstki
(mikropęcherzyki > 100 nm), ciałka apoptotyczne,
itp., które zawierają wewnątrz białka ziarnistości we-
wnątrzkomórkowych (tak jak w egzosomach), lub
eksponują markery powierzchniowe macierzystych
komórek w błonach (tak jak np. w mikropłytkach).
W przypadku płytek krwi mikrocząstki mogą
być uwalniane z ziarnistości płytkowych (egzoso-
my) lub na skutek złuszczania błon komórkowych w
procesie mikrowezykulacji (właściwe mikropłytki)
(55,56). Biologia i zjologia mikropłytek właściwych
i egzosomów jest odmienna, lecz ponieważ bardzo
trudno - ze względów metodycznych, zdyskrymino-
wać poprawnie te dwa typy obiektów, często określa
się je łącznie mianem mikropęcherzyków. We krwi
krążącej mikropłytki występują licznie w osoczu (sta-
nowią aż do 70-90% całej puli mikrocząstek w oso-
czu) także w stanie zjologicznym. Są one wygod-
nym markerem zużycia i/lub rozpadu komórek, aich
zwiększone miana mogą towarzyszyć niektórym
chorobom (57,58) i często są uważane za ich swoi-
ste markery diagnostyczne (np. mikropłytki w pro-
cesach zakrzepicy, czy mikrocząstki śródbłonkowe w
33
Cytometria Polska tom 1, zeszyt nr 1, 2012
niewydolności zastoinowej serca) (52-54).
W przypadku płytek krwi, mikrocząstki,
posiadające na swej powierzchni liczne kopie anty-
genów CD41/CD61, mogą wykazywać bardzo dużą
aktywność biologiczną (prokoagulacyjną) dzięki PS
eksponowanej w błonach (choć nie wszystkie mi-
kropłytki ją posiadają) i dlatego stanowią wygodny
wskaźnik reaktywności i/lub nadwrażliwości ko-
mórek w różnych stanach chorobowych (59,60).
Chociaż mikropłytki mogą być badane także z za-
stosowaniem innych technik, jak mikroskopia sił ato-
mowych, elektrochemiczna spektroskopia impedan-
cyjna, technika dynamicznego rozpraszania światła,
techniki ELISA, czy testy funkcjonalne, wykorzysta-
nie standardowej techniki cytometrii ma szereg wa-
lorów w badaniu tych obiektów, a najważniejsze to
możliwości enumeracyjne i możliwość wybarwiania
wieloma znacznikami (polichromatyczność). Nie-
stety, zakres rejestrowania mikrocząstek jest jeszcze
bardziej umowny niż w przypadku określania frak-
cji agregatów (61). Warto zaznaczyć, że zarówno
techniki izolowania mikropłytek, jak i ich liczenia
i w końcu, wybarwiania, przedstawiają sobą szereg
ograniczeń metodycznych i stanowią nie lada wy-
zwanie dla badaczy, głównie w kontekście: (a) dobie-
rania właściwych sił odśrodkowych przy wirowaniu,
w zależności od ośrodka (osocze, bufor), (b) enume-
racji mikrocząstek niewybarwionych, (c) modulacji
intensywności uorescencji mikrocząstek wybarwio-
nych przeciwciałami, czy (d) analizy polichromatycz-
nej różnych subpopulacji mikropłytek. Pierwszemu
zwymagań przypisuje się szczególnie duże znaczenie
w przypadku mikrocząstek płytkowych, najprawdo-
podobniej dlatego, że płytki krwi są komórkami bar-
dzo małymi. Optymalnie, w celu pozyskania osocza
pozbawionego komórek powinno się je poddawać
dwustopniowej procedurze oczyszczania, w której
najpierw pozyskuje się osocze całkowicie wolne od
płytek (1200-1500 x g, 10-20 min), a następnie, oso-
cze ubogopłytkowe wiruje się jeszcze raz przy znacz-
nie większych siłach odśrodkowych (10000-13000 x
g, 30 min). Tak uzyskane osocze zawiera mikropłytki,
lecz nie zawiera wolnych płytek, nawet tych starych
(i małych) (62). Niestety, wraz z płytkami tracimy
także mikrocząstki pochodzące z erytrocytów i in-
nych krwinek (63). Najpowszechniej w celu detekcji
mikropłytek metodą cytometrii stosowana jest ana-
liza FSC (względny rozmiar obiektu) ze skalą linio-
wą vs. SSC (ziarnistość) ze skalą logarytmiczną. Jak
dotąd nie ustalono standardu i nie przyjęto jakiegoś
konsensusu, jak wyznaczyć próg czułości, aby nie
pomijać odpowiednio małych obiektów. W literatu-
rze istnieją propozycje jak dokonać tego względnie
obiektywnie, np. na podstawie barwienia na typowe
antygeny powierzchniowe (duże ryzyko artefaktów,
patrz niżej) lub w oparciu o szum tła (64). Zasad-
nicze pytanie dotyczy tego, jaki szum tła należałoby
przyjąć za odcinający. Aby zmierzyć się z tym prob-
lemem, można np. wykorzystać ultra czysty roztwór
soli zjologicznej (np. PBS sączony dwukrotnie przez
ltr o wielkości porów 0.2 m), który będzie stanowił
odnośnik dla progowej liczby obiektów szumu tła re-
jestrowanych w jednostce czasu przy danej wartości
przepływu. Dobranie szczegółowych warunków pro-
gu odcięcia oraz wzmocnienia instrumentu pomia-
rowego zależy od konkretnego celu badawczego (np.
wielkości subpopulacji mikropłytek, jakie chcemy re-
jestrować), należy jednak pamiętać, iż powszechnie
przyjmuje się 0.3 m za graniczną wartość wielkości
mikrocząstek, które mogą wiarygodnie rejestrować
nowoczesne cytometry (60,65). Ogromnym uła-
twieniem dla identykacji mikropłytek mogłoby być
równoległe śledzenie rozproszenia czołowego światła
i uorescencji mikrocząstek po wyznakowaniu (jeże-
li to możliwe) przeciwciałem rozpoznającym antygen
typowy dla komórek ‘macierzystych. Technikę taką
można na przykład z powodzeniem zastosować przy
badaniach mikropłytek, które silniej niż normopłytki
wiążą aneksynę V (z uwagi na silne właściwości pro-
koagulacyjne) (66). Chociaż barwienie mikropłytek
mogłoby się wydawać wymarzonym sposobem omi-
nięcia problemów związanych z wiarygodną identy-
kacją tych obiektów, bezkrytyczne stosowanie tej
techniki związane jest z największą bodaj częstością
zbierania artefaktów w badaniach mikropłytek, czy
ogólnie mikrocząstek komórkowych. Jest tak z kilku
powodów. Po pierwsze, różne subpopulacje mikro-
płytek przenoszą na swej powierzchni różne antyge-
ny aktywacji płytek, a znakowanie na którykolwiek
z nich pojedynczo nie gwarantuje nam wybrania
wszystkich subpopulacji mikropłytek. Jedynie nie-
wielu badaczy barwi mikropłytki na kilka antygenów
jednocześnie. Po drugie, bardzo rzadko znamy miano
mikropłytek w badanej próbie, a miano takie podle-
ga niezwykle dużej zmienności biologicznej i osobni-
czej, zależnej od wielu czynników, jak płeć, wiek, stan
zjologicznego czy patozjologiczny organizmu, nie
sposób zatem założyć jakiejkolwiek standaryzacji za-
leżnej od objętości badanego płynu ustrojowego czy
zawiesiny. W sytuacjach takich dobrym wyborem jest
enumeracja mikrocząstek przy zastosowaniu znako-
wanych kulek żywicowych (63) oraz dobranie właś-
Cytometria Polska
34
tom 1, zeszyt nr 1, 2012
ciwej ilości przeciwciał lub uoroforu do znakowania
zawiesiny o znanym mianie mikropłytek (62) (Ryc.
2, 3). Zdrugiej strony, należy pamiętać, że zastoso-
wanie kuleczek określonych rozmiarów (o zakresie
wielkości podobnym do wielkości badanych mikro-
cząstek) do kalibracji jest bardziej kłopotliwe z uwagi
na nieliniowość zależności wartości parametru FSC
i średnicy kulek dla małych zakresów wielkości. Al-
ternatywnie, stosuje się także metodę pomiaru szyb-
kości przepływu z odpowiednią kalibracją (kuleczki
Trucount™) (67). Ogólnie, wzmocnienie cytometru
powinno być dobrane w ten sposób, aby wystarcza-
jąca była rozdzielczość obiektów. Należy pamiętać,
że zbyt małe wzmocnienie sprawia, że niewidoczne
będą obiekty słabo świecące/rozpraszające światło,
natomiast zbyt duże wzmocnienie powoduje, że reje-
strowane będą także obiekty pochodzenia niekomór-
kowego (śmieci, kurz). Wybór właściwego wzmoc-
nienia także można sprawdzić stosując kuleczki
żywicowe o określonych wymiarach, wyznakowane
odpowiednim uoroforem w taki sposób, aby różne
subpopulacje kulek miały różną gęstość znacznika
uorescencyjnego na swojej powierzchni.
Badanie mobilizacji i transportu jonów w płytkach
krwi – uwalnianie jonów wapnia w cytoplazmie
Zmiany stężenia jonów wapnia w cytoplazmie
płytek krwi stanowią fundamentalny warunek prze-
kazywania sygnałów wewnątrz komórki oraz między
cytoplazmą płytki a środowiskiem zewnętrznym.
Jony te mogą być uwalniane ze zmagazynowanych
w ziarnistościach zasobów wewnątrzkomórkowych
lub mogą przenikać do cytoplazmy przez błonę ko-
mórkową z zewnątrz. Wiadomo, że proces mobiliza-
cji jonów wapnia nasila się w następstwie aktywacji
płytek krwi. Tak więc, zmiany stężenia wewnątrz-
komórkowego wapnia można postrzegać jako cha-
rakterystyczny przejaw pobudzenia płytek przez
bodziec zewnętrzny. Do pomiarów zmian stężenia
Ca2+ w komórkach stosuje się techniki wykorzystują-
ce znaczniki uorescencyjne, które można podzielić
na dwie grupy: (a) takie, które zmieniają intensyw-
ność emisji gdy stężenie Ca2+ w cytoplazmie rośnie
(np. Fluo-3, Quin-2, Rhod-2) (68-70), oraz (b) takie,
które charakteryzują się przesunięciem widma wzbu-
dzenia lub emisji (np. odpowiednio, Fura-2, Indo-1)
(71,72) (Tabela 2a). Na podobnej zasadzie jak ozna-
czanie jonów wapnia, można prowadzić inne ozna-
czenia opierające się na wahaniach stężenia jonów
w określonych kompartmentach wewnątrzkomór-
kowych, np. mobilizację jonów magnezu, sodu czy
potasu (Tabela 2b), jak również zmiany pH czy po-
tencjału (Tabela 2c) (73).
nazwa uoroforu Kd (µM) wzbudzenie
(nm)
emisja
(nm)
Fura-2 0.224 340/380 510
Indo-1 0.250 350 405/485
BTC 7 465/400 530
Fluo-3/Fura Red 0.390/1.6 488 530/670
Calcium Green-1/
Lucifer yellow
0.19 420/488 515
  Fluorofory stosowane do racjometrycznego ozna-
czania wewnątrz-komórkowego stężenia wapnia
  Fluorofory stosowane do racjometrycznego ozna-
czania innych kationów jedno- lub dwuwartościowych
nazwa uoro-
foru
Kd
(µM)
wzbudze-
nie (nm)
emisja
(nm)
oznaczany
jon
Mag-Fura-2 1.9 340/380 500 magnez
Mag-Indo-1 2.7 340 420/480 magnez
SBFI 11.3 340/380 510 sód
PBFI 44 340/380 510 potas
Fluorofory stosowane do racjometrycznego oznacza-
nia pH lub potencjału
nazwa
uoroforu
zakres
pH
wzbudze-
nie (nm)
emisja
(nm)
zasto-
sowa-
nie
LysoSensor™
Yellow/Blue
3.5-6 340/400
lub 365
520
lub
450/510
pH
BCECF <7 440/490 530 pH
SNARF-5F 6.8–7.4 488
lub 514
580/640 pH
SNARF-1 7-8 488
lub 514
580/640 pH
di-4-ANEPPS 440/505 630 poten-
cjał
di-8-AN EPPS 475
lub 488
560/620
lub
540/610
poten-
cjał
35
Cytometria Polska tom 1, zeszyt nr 1, 2012
Powszechnym problemem napotykanym przy sto-
sowaniu powyższych znaczników jest ich duża
polarność utrudniająca przenikanie przez błonę
komórkową i wnikanie do wnętrza komórek (74).
Aby ominąć tę przeszkodę, stosuje się często ze-
strykowane formy znaczników, które są ponownie
uwalniane w postaci wolnej przez cytoplazmatycz-
ne esterazy. Z uwagi na obniżoną polarność estry
znaczników łatwo przenikają dwuwarstwę lipidową
błon płytkowych, a ich jonizacja w cytoplazmie w
następstwie hydrolizy wiązań estrowych, umożliwia
wiązanie jonów dwuwartościowych, m.in. jonów
wapnia. Istotne jest, że uorescencja zjonizowanych
form znaczników jest o kilka rzędów wielkości więk-
sza niż pochodnych estrowych, toteż efektywna hy-
droliza znaczników wcytoplazmie komórki jest wa-
runkiem ich użyteczności do badania zmian stężenia
jonów w płytkach krwi. Aby ułatwić taką hydrolizę
i jonizację znaczników stosuje się często specjalne
zabiegi mające przyspieszyć dyspersję znacznika w
kompartmentach komórkowych i udostępnić go dla
działania esteraz. Z drugiej strony, nadmiernie szybki
transport znacznika i jego redystrybucja w komór-
ce (np. na skutek zbyt wysokiego stężenia znaczni-
ka), może sprawić, że przenika on także przez błony
ziarnistości wewnątrzkomórkowych (rezerwuarów
jonów wapnia) istaje się w ten sposób bezużyteczny
w monitorowaniu uwalniania jonów wapnia z tych
ziarnistości do cytoplazmy komórki. Warunkiem
właściwej adaptacji metody do badania określone-
go typu komórek jest zatem dobranie optymalnych
warunków stężenia znacznika oraz czasu inkubacji.
 Widma niektórych znaczników uorescencyjnych stosowanych w technice racjometrycznego oznaczania stężenia wewnątrzkomórko-
wego wapnia. (A) Widmo emisji Fura-2 przy 510 nm dla wzbudzenia przy różnych długościach fali (zwykle przy 340 nm i 380 nm). Zależnie od
stężenia wapnia zmieniają się intensywności uorescencji dla emisji przy 340 nm i przy 380 nm. (B) Widmo emisji Indo-1 wzbudzanego przy
338 nm. Emisja wzrasta przy około 400 nm i spada przy około 500 nm wraz ze wzrostem stężenia wapnia. (C) Kombinacja dwóch znaczników:
Fluo-3 i Fura Red wzbudzanych przy 488 nm. Intensywność Fluo-3 wzrasta przy około 520 nm, natomiast intensywność Fura Red maleje przy
około 660 nm wraz ze wzrostem stężenia wapnia. (D) Widmo emisji nieracjometrycznego znacznika Calcium Green wzbudzanego przy 488 nm.
Emisja przy około 510 nm wzrasta po związaniu wapnia; pomiar racjometryczny nie jest dla tego znacznika możliwy. Źródło: e Molecular
Probes® Handbook—Online Edition.
Cytometria Polska
36
tom 1, zeszyt nr 1, 2012
Zbyt krótki czas inkubacji i/lub zbyt niskie stężenie
znacznika ogranicza/spowalnia transport znacznika
do cytoplazmy płytek i powoduje jego niecałkowitą
hydrolizę. Niskie stężenie znacznika w cytoplazmie
komórki sprawia, że układ jest słabo wrażliwy na
duże zmiany stężeń wapnia w cytoplazmie, ponie-
waż cała pula dostępnego zjonizowanego uoroforu
szybko nasyca się jonami wapnia występującymi w
ogromnej przewadze. Zdrugiej strony, nadmiernie
długi czas inkubacji i/lub za wysokie stężenie uo-
roforu grozi jego zbyt równomierną dystrybucją w
komórce; zmiany uorescencji znacznika na skutek
uwalniania jonów wapnia z ziarnistości wewnątrz-
płytkowych do cytoplazmy nie będą rejestrowane,
gdyż cała pula znacznika (także ta w ziarnistościach)
jest równomiernie wysycona jonami wapnia. O wie-
le więcej problemów sprawiają znaczniki, które nie
mają zdolności przenikania przez błony komórkowe.
Można to zadanie ułatwić na drodze elektroporacji
błony (np. w przypadku znakowania fallotoksyna-
mi) (75), ale perforacja błon płytkowych (tzw. per-
meabilizacja komórek) niesie ryzyko zmiany/utraty
niektórych funkcji komórki. Innym sposobem jest
modykacja chemiczna znaczników (np. ich estry-
kacja). W takich przypadkach, efektywny transport
znacznika do płytek jest jednocześnie dowodem do-
świadczalnym na funkcjonalność komórek i zacho-
wanie integralności błon cytoplazmatycznych. Sko-
ro bowiem zamiana nieuoryzującej pochodnej w
chromogen wymaga obecności aktywnych enzymów
wkomórce (esteraz, oksydaz, itp.), świecenie znako-
wanych komórek może stanowić miarę aktywności
charakterystycznych enzymów wewnątrzkomórko-
wych. Niektóre znaczniki mogą powodować foto-
uczulanie i uszkadzanie komórek w następstwie ich
wystawienia na działanie światła lasera lub nawet na
wielogodzinne działanie światła podczas wykonywa-
nia procedur pozyskiwania czy oczyszczania płytek,
ich znakowania, itp.
Słowa komentarza wymaga także dobór od-
powiedniego uoroforu czułego na zmiany stężenia
jonów wapnia. Wiele uoroforów pozostaje niedo-
stępnych dla standardowej aparatury cytometrycznej
dysponującej jedynym źródłem światła (najczęściej
488 nm) (Tabela 2a). Optymalnie do monitorowania
zmian stężenia jonów wapnia dobiera się dwa róż-
ne uorofory w taki sposób aby uorescencja jed-
nego malała, zaś drugiego wzrastała w miarę zmian
stężenia jonów wapnia (Ryc. 4). Szersze możliwości
techniczne cytometru pod względem długości fali
wzbudzenia i tutaj oddają nieocenione usługi.
W odniesieniu do cytometrii zastosowanie znaczni-
ków drugiej grupy, tzn. takich które charakteryzu-
ją się przesunięciem widma wzbudzenia lub emisji
przy zmianach stężenia Ca2+ jest raczej ograniczone,
gdyż przesunięcia te są zwykle na tyle niewielkie, że
przypadają na ten sam kanał pomiarowy. Dlatego też,
chętniej stosuje się znaczniki charakteryzujące się
zmianami intensywności uorescencji wraz ze wzro-
stem stężenia wapnia. Zmiany te można rejestrować
albo jako zmiany uorescencji względnej albo jako
zmiany frakcji komórek uoryzujących. Korzyst-
nie, dobiera się dwa różne znaczniki, których emi-
sja zmienia się przeciwstawnie (jednego rośnie, zaś
drugiego maleje) w miarę wzrostu stężenia jonów
wapnia. Jeden ze znaczników stanowi wtedy układ
odniesienia. Należy podkreślić, iż pomimo pozornej
wygody stosowania, metody nieracjometryczne nio-
są ze sobą wiele zagrożeń i potencjalnych przekłamań
wyników (zwłaszcza w odniesieniu do komórek nie-
sferycznych, tworzących wypustki, pseudopodia, itp.,
jak np. komórki nerwowe czy właśnie płytki krwi),
stąd wielu badaczy unika ich stosowania (76).
Decydując się na badanie transportu jonów
w płytkach krwi metodą cytometrii przepływowej
badacz musi stawić czoła kilku problemom natury
metodologicznej. Ponieważ znaczniki zjonizowane
w cytoplazmie płytki są anionami, istnieje ryzyko
ich usuwania przez transportery anionów w błonach
komórkowych płytek. W ten sposób stężenie „ak-
tywnego” znacznika zmniejsza się w miarę upływu
czasu i jedynie zastosowanie blokerów tego transpor-
tera za pomocą np. probenecidu lub sulnopirazolu
może zadecydować o przeprowadzeniu pomiarów
i uzyskaniu wiarygodnych wyników. Niekorzyst-
nie, liczne znaczniki (np. rodamina 123, pochodne
SNAFL) charakteryzują się dużą szerokością widma
emisji uorescencji, co sprawia, że emitowane świat-
ło może traać do kilku kanałów pomiarowych. Nie
stanowi to problemu jeżeli badamy jednorodną po-
pulację wyizolowanych płytek, bez potrzeby bram-
kowania określonych subpopulacji komórkowych
wpełnej krwi przeciwciałami przeciwko markerom
powierzchniowym. W przypadku badania pełnej
krwi, należałoby zadbać o właściwą kompensację
interferującego sygnału „przeciekającego” z innych
kanałów. Liczne znaczniki charakteryzują się także
toksycznością dla płytek, co powoduje stopniowy
wyciek uoroforów ze znakowanych komórek. Do-
brą metodą upewnienia się o zachodzeniu takiego
wycieku może być dodanie do buforu, w którym za-
wieszone są komórki, jonów Mn2+. Jony te mają zdol-
37
Cytometria Polska tom 1, zeszyt nr 1, 2012
ność gaszenia uorescencji licznych znaczników: je-
żeli występuje wyciek jonów przez uszkodzoną błonę
komórkową płytek, to przenikają one do cytoplazmy
płytek i - współzawodnicząc z jonami wapnia, wiążą
się z cząsteczkami znacznika w komórce i gaszą jego
świecenie. Z powyższego powodu stworzono meto-
dę racjometryczną, która dostarcza danych przeli-
czonych jako stosunek intensywności uorescen-
cji znacznika przy dwóch różnych długościach fali.
W celu kalibracji metody, niezbędnej w przypadku
bezwzględnej oceny wielkości zmian stężenia jonów
wapnia w płytkach, można zastosować odpowiednie
jonofory, ułatwiające przenikanie jonów przez błonę
płytkową i modulujące stężenie badanego jonu na ze-
wnątrz komórki (74).
Ocena żywotności płytek krwi
Można zaryzykować stwierdzenie, iż zainte-
resowanie metodami wiarygodnego badania żywot-
ności tych szczególnych komórek, jakimi są płytki
krwi, jest odwrotnie proporcjonalne do znaczenia,
jakie ten typ badania powinien odgrywać w każdym
teście funkcjonalnym wybieranym w celu określenia
czynności płytek krwi. Przeświadczenie takie płynie
z prostego przełożenia zmian zachodzących w ku-
wecie pomiarowej na interpretację wyniku. Metody
agregometryczne to najpowszechniej stosowane me-
tody do badania funkcji płytek w rutynowej diagno-
styce iwpracy badawczej. Zależnie od wyboru tech-
niki klasycznej, turbidymetrycznej (optycznej) lub
przewodnościowej (impedancyjnej, w pełnej krwi),
spadek miana płytek krwi w zawiesinie może być
interpretowany albo jako wzrost agregacji (i wzrost
transmitancji zawiesiny) w metodzie optycznej lub
jako spadek agregacji (i spadek oblepiania elektrod
przez adherujące i agregującę płytki) (Tabela 3). To-
też, wcelu uniknięcia artefaktów pomiarowych, po-
miarom wpływu nieznanych, nowo badanych czyn-
ników na agregację płytek, powinny towarzyszyć
pomiary żywotności płytek, zwłaszcza w sytuacjach,
gdy wyniki uzyskiwane metodą optyczną oraz impe-
dancyjną nie są spójne (Tabela 3).
Klasyczne metody oceny żywotności komó-
rek są niestety mało użyteczne w przypadku badania
płytek krwi. Źródła metodycznych ograniczeń oceny
żywotności płytek krwi w warunkach pozaustrojo-
wych upatruje się przede wszystkim w zjologicznej
funkcji płytek krwi oraz w ich morfologii. Po pierw-
sze, płytki krwi są wysoce reaktywne i bardzo łatwo
może dochodzić do ich niepożądanej, artefaktualnej
aktywacji w warunkach in vitro podczas procedury
badawczej zwłaszcza, jeśli ta zakłada wielokrotne wi-
rowanie badanego materiału. Po drugie, ze względu
na brak jądra komórkowego, powszechnie stosowa-
ne metody oceny żywotności komórek jądrzastych
(m.in. metody oparte na pomiarze aktywności me-
tabolicznej komórki, jak testy MTT, XTT, WST-1,
PrestoBlue™, lizie komórki bądź uszkodzeniu błony
plazmatycznej, jak testy dehydrogenazy mleczanowej
lub barwienie błękitem trypanu, metody oparte na
analizie fragmentacji DNA) najczęściej nie mogą być
zaadaptowane na potrzeby badań płytek krwi (77,78).
metoda
agregometryczna
zmiany
w ośrodku
podłoże/
mechanizm
interpretacja
 (Borna,
turbidymetryczna)
(osocze bogatopłytkowe
lub zawiesina płytek)
miano płytek spada
(efekt cytotoksyczny)
miano płytek spada (agregacja)
transparencja
wzrasta (rozpraszanie
światła maleje)
transparencja wzrasta
(rozpraszanie światła
maleje)
wzrost agregacji (fałszywa)
wzrost agregacji (słuszna)

(krew pełna)
adhezja do elektrod spada
(efekt cytotoksyczny)
adhezja do elektrod spada (maleje
agregacja)
przewodność wzrasta
przewodność wzrasta
spadek agregacji (fałszywa)
spadek agregacji /efekt
przeciwagregacyjny (słuszna)
W jaki sposób obserwowany spadek miana płytek krwi może wpływać na interpretację badania agregometrycznego?
Cytometria Polska
38
tom 1, zeszyt nr 1, 2012
Najlepszą z ogólnie dostępnych metod badawczych,
umożliwiających ocenę żywotności płytek krwi, jest
metoda cytometryczna wykorzystująca barwienie
płytek krwi estrem kalceiny (79). Należy podkreślić,
że głównym atutem stosowania cytometrii przepły-
wowej jest możliwość oceny cytotoksycznego wpły-
wu związków nie tylko w osoczu bogatopłytkowym,
czy zawiesinie płytek izolowanych, ale również we
krwi pełnej. Acetometoksylowy ester kalceiny (kal-
ceina AM) jest to nieuorescencyjny lipolny zwią-
zek, który łatwo przenika przez błonę plazmatyczną
żywych komórek, gdzie pod wpływem cytoplazma-
tycznych esteraz ulega hydrolizie do hydrolowego,
silnie uoryzującego związku – kalceiny (80). Wolna
kalceina jest sprawnie zatrzymywana wewnątrz ży-
wych komórek z nienaruszoną błoną plazmatyczną,
natomiast jej wyciek do środowiska zewnątrzkomór-
kowego obserwowany jest w przypadku utraty przez
komórki integralności błony plazmatycznej (81). Po-
dobnie, jak w przypadku wielu protokołów cytome-
trycznych, również w tym przypadku należy zwrócić
szczególną uwagę na przygotowanie optymalnych
kontroli negatywnych i pozytywnych. Polecanym
związkiem do pozyskania kontroli pozytywnej jest
formaldehyd (Ryc. 5). Przed przystąpieniem do -
nalnych oznaczeń cytometrycznych, należy wpierw-
szej kolejności ustalić optymalne stężenie kalceiny
oraz czas inkubacji ze znacznikiem. Jeżeli pracu-
jemy na krwi pełnej konieczne jest użycie przeciw-
ciał bramkujących, np. CD61-PE lub CD61-PerCP.
Sama analiza zmian intensywności zielonej uore-
scencji wybrakowanych płytek krwi może być mylna
lub zafałszowana z powodu faktu, że w przypadku
aktywacji płytek krwi obserwuje się pojawienie się
frakcji obiektów wykazujących wzrost intensywności
zielonej uorescencji, co prawdopodobnie związane
jest powstawaniem agregatów płytkowych. Dlatego
też, najbardziej miarodajnym parametrem umożli-
wiającym rozróżnienie płytek krwi żywych, od tych
z naruszoną integralnością błony plazmatycznej
jest ustawienie odcięcia na histogramie (FITC) lub
wykresie kropkowym (FITC/PE lub FITC/PerCP)
obiektów CD61-pozytywnych poniżej wschodzące-
go „ramienia” intensywności zielonej uorescencji i
rejestrowanie stopnia pojawiania się obiektów kalce-
ino-negatywnych (81).
 Cytometryczna ocena wpływu kolagenu i formaldehydu na żywotność ludzkich płytek krwi. Płytki w osoczu bogatopłyt-
kowym wybramkowano na antygen CD61PE (FL2) i wyznakowano estrem acetoksymetylowym kalceiny, świecącej na zielono
(FL1). Żywotność komórek oceniano na podstawie frakcji płytek kalceino-ujemnych, która była znikoma w płytkach natywnych
(A, większość komórek wybarwionych kalceiną) i rosła pod wpływem 10 g/ml kolagenu (B, frakcja kalceino-ujemna wzrasta), a
zwłaszcza pod wpływem 1% formaldehydu (C, większość komórek kalceino-ujemna).
39
Cytometria Polska tom 1, zeszyt nr 1, 2012
-

Badanie asymetrii rozmieszczenia fosfolipidów w
błonach komórkowych
Proces aktywacji wielu komórek związany
jest z symetryzacją rozmieszczenia cząsteczek fo-
sfolipidów błonowych. Naturalnie fosfolipidy błon
rozmieszczone są nierównomiernie w obu półwar-
stwach błony komórkowej, w taki sposób, że w pół-
warstwie zewnętrznej dominują fosfatydylocholina
i sngomielina, zaś w wewnętrznej – fosfatydylose-
ryna i fosfatydyloetanoloamina. Przemieszczanie fo-
sfolipidów w procesie aktywacji komórek, np. płytek
krwi, w obecności jonów wapniowych prowadzi do
przejściowego gromadzenia się dużych ilości ujemnie
naładowanego fosfolipidu – fosfatydyloseryny (PS) –
wzewnętrznej półwarstwie błon. Z fosfolipidem tym
wiąże się preferencyjnie anneksyna V, białko izolo-
wane z łożyska, rozpoznające grupy aminofosforowe
i wiążące się do nich z dużym powinowactwem (82).
Stopień wyznakowania komórek przez anneksynę
może być zatem wskaźnikiem aktywacji komórek, za-
chodzącej symetryzacji ich błon cytoplazmatycznych
oraz ekspozycji na zewnątrz ujemnie naładowanych
fosfolipidów błon. W warunkach naturalnych, w ży-
wych komórkach, zjologiczna asymetria rozmiesz-
czenia fosfolipidów dwuwarstwy jest utrzymywana
dzięki działaniu enzymu translokazy (ippazy) (naj-
prawdopodobniej z grupy ATPaz typu P, klasa IV,
ang. P4-ATPases) (83,84), a utrzymywanie asymetrii
fosfolipidów błonowych jest warunkiem niezbędnym
do aktywności prokoagulacyjnej płytek krwi (85-88).
Przywracanie asymetrycznego rozmieszczenia fosfo-
lipidów w błonie związane jest z mikrowezykulacją
błon i z wytwarzaniem mikropłytek o dużej aktyw-
ności prokoagulacyjnej (89).
W płytkach krwi metoda ta znajduje uznanie
jako – w założeniu, prosta technika monitorowania
właściwości prokoagulacyjnych komórek, ponieważ
symetryzacji błon płytkowych towarzyszy nasilenie
wiązania kompleksu protrombinazy z płytkami krwi
oraz aktywowanie kaskady krzepnięcia (83,84,90).
Stosowanie anneksyny V ma szereg zalet. Wiąże się
ona do podaktywowanych płytek krwi, które odzna-
czają się zmniejszoną asymetrią rozmieszczenia fosfo-
lipidów błonowych. Jej wiązanie zależy od agonisty:
jest umiarkowane dla agonistów takich, jak trombina
czy TRAP oraz bardzo silne np. dla kolagenu (82).
Wiązanie anneksyny V do PS nie jest do końca spe-
cyczne, białko to wiąże się także np. do sgomieli-
ny i kinazy białkowej C, stopień wiązania jest także
bardzo zależny od zastosowanego stężenia wapnia
w procedurze znakowania. W metodzie tkwi jednak
„haczyk”. Przede wszystkim, wiązanie anneksyny V
do powierzchni komórek wymaga pobierania krwi
na antykoagulant nie chelatujący jonów wapniowych
(najczęściej stosowana jest niskocząsteczkowa hepa-
ryna, np. Clexane). Po drugie, w celu poprawnego
i wydajnego wiązania anneksyny V przez ujemnie
naładowane (na skutek przedostawania się do ze-
wnętrznej półwarstwy dwuwarstwy lipidowej bło-
ny komórkowej) cząsteczki fosfatydyloseryny (PS,
główny składnik) i kwasu fosfatydowego (w mniej-
szości), protokół znakowania wymaga dodawania
egzogennych jonów wapnia w stężeniach milimolo-
wych (91). Znakowanie anneksyną V wymaga dość
długich inkubacji nieutrwalonych płytek, co także
może sprzyjać niepożądanej aktywacji. To, co sprzy-
ja wymaganiom metodycznym pracy z anneksyną V,
jest „wyzwalaczem” niekontrolowanej, artefaktual-
nej spontanicznej aktywacji płytek krwi, dla których
wapń jest naturalnym aktywatorem. Zmiany te za-
znaczają się nawet w tzw. płytkach spoczynkowych,
tzn. badanych bez dodatku agonisty. Jeżeli pragniemy
badać eksponowanie powierzchni prokoagulacyjnej
w obecności powszechnie stosowanych agonistów
płytek, jak ADP czy kolagen (a na tym w końcu naj-
częściej polega idea samego doświadczenia doty-
czącego aktywności prokoagulacyjnej płytek krwi)
(Ryc. 6, 7), to obecność jonów wapniowych jeszcze
bardziej sprzyja artefaktualnej aktywacji, tworzeniu
mikropłytek i agregatów w aktywowanych płytkach
(Ryc. 8, panele 2A-C). Nie dziwi zatem, że nawet w
płytkach spoczynkowych, w nieobecności agonistów,
znakowanie komórek anneksyną V prowadzi do bar-
dzo znacznego wzrostu frakcji agregatów płytkowych
(Ryc. 8, 1A i 2A). Powstawanie frakcji agregatów na-
silone jest szczególnie w obecności kolagenu, TRAP
lub ADP. Kolagen nasila także powstawanie mikro-
płytek (Ryc. 6D). Te ostatnie, odznaczają się szcze-
gólnie wysoką aktywnością prokoagulacyjną, zatem
silne barwienie mikropłytek przez anneksynę V nie
powinno dziwić (Ryc. 8, 2B). Obecność działających
aktywująco jonów wapnia w otoczeniu płytek samo
w sobie sprzyja tworzeniu powierzchni prokoagula-
cyjnej (83,85-88,92), co więcej – przemieszczanie się
fosfolipidów błonowych wymaga mobilizacji jonów
wapnia. Wszystkie te powiązania między natural-
Cytometria Polska
40
tom 1, zeszyt nr 1, 2012
nymi procesami zjologicznymi, a nienaturalnymi
zmianami związanymi ze znakowaniem anneksyną V,
sprawiają, iż granica między stanem zjologicznym
i tym, wymuszonym metodologią, zaciera się. Mie-
rzymy wprawdzie jakiś stopień aktywności prokoa-
gulacyjnej, i nawet możemy orzec , że wzrasta on po
Analiza cytometryczna mikropłytek i agregatów płytkowych w preparatach ludzkich płytek spoczynkowych (A), w płytkach
aktywowanych ADP (B), płytkach spoczynkowych wyznakowanych anneksyną V (C) oraz płytkach aktywowanych kolagenem
wyznakowanych anneksyną V (D). Oznaczenie wykonano w próbkach pełnej krwi z wybramkowaniem płytek krwi na antygen
CD61. Krew pobrana na Clexane 0.1 mg/ml. Płytki aktywowano ADP lub kolagenem w końcowych stężeniach, odpowiednio, 20
M i 25 g/ml. Regiony obramowane na czerwono i zielono odpowiadają arbitralnie przyjętym regionom mikropłytek i agregatów.
Obiekty zaznaczone na niebiesko oznaczają płytki wybarwione anneksyną V.
dodaniu agonistów, lecz nie sposób określić, na ile
jest on wynikiem tego co działo się z płytkami krwi
w łożysku naczyniowym, a na ile tym, co zaistniało
podczas procedury znakowania (na skutek dodania
egzogennego wapnia do buforu).
41
Cytometria Polska tom 1, zeszyt nr 1, 2012
 Analiza cytometryczna rozkładu wielkości płytek krwi spoczynkowych (C i D), płytek aktywowanych 10 M TRAP (E i
F) oraz płytek aktywowanych 10 g/ml kolagenem (G i H). Płytki w ludzkiej krwi pełnej wybramkowano podwójnie, na obecność
antygenu CD61 (FITC) oraz na wiązanie anneksyny V (markera aktywności prokoagulacyjnej płytek). Wykresy A i B przedstawiają
rozkłady wielkości i uorescencji w kanale FL1 kulek polistyrenowych wyznakowanych znacznikiem Yellow Green. Pionowe linie
przerywane na wykresach kropkowych płytek oznaczają wielkości obiektów oznaczone na podstawie średnich wielkości subpopu-
lacji kulek. Mikropłytki, normopłytki i agregaty płytkowe oznaczono odpowiednio kolorami zielonym, czerwonym i niebieskim.
Wybrane umownie regiony, w jakich je oznaczano, obrysowano przerywanymi liniami w tych samych kolorach.
Cytometria Polska
42
tom 1, zeszyt nr 1, 2012
Analiza cytometryczna (FSC) tworzenia mikropłytek i agregatów płytkowych w preparatach ludzkich płytek spoczynkowych (A),
aktywowanych 25 g/ml kolagenem (B) i aktywowanych 20 M ADP (C) w próbkach pełnej krwi wyznakowanych przeciwciałami anty-
-CD62P (1A-C), anneksyną V (2A-C) lub merocjaniną 540 (3A-C). Markerami M1 i M2 oznaczono bramki dla mikropłytek i agregatów.
Alternatywne metody określania powierzchni pro-
koagulacyjnej
Asymetryzacja fosfolipidów dwuwarstwy
i przedostawanie się ujemnie naładowanej PS po-
woduje jeszcze inne zmiany w błonie, jak zmiana
potencjału powierzchniowego błony lub uporządko-
wania lipidów błonowych (płynność błony). Dzięki
temu, do badania zmiany asymetryzacji fosfolipi-
dów wykorzystuje się także ujemnie naładowane u-
orofory, które są wstanie wykrywać zmiany w roz-
mieszczeniu ładunku elektrycznego pochodzącego
od ujemnie naładowane cząsteczki PS w zewnętrz-
nej półwarstwie błony. Przykładem znacznika, któ-
ry alternatywnie próbowano stosować do badania
asymetrii błon płytkowych jest merocjanina 540
(MC540). Merocjanina 540 jest anionowym lipo-
lnym uoroforem nie przenikającym przez błony
do komórek. Ten ujemny ładunek MC540 sprawia,
że merocjanina wiąże się wydajnie do płytek niepo-
budzonych, gdzie w błonach przypowierzchniowo
dominuje dodatnio naładowana fosfatydylocholina
(PC), zaś jej wiązanie dramatycznie spada w sto-
sunku do płytek po aktywacji, które odznaczają się
aktywnością prokoagulacyjną i eksponują ujemnie
naładowaną PS. W obecności kolagenu, silnego ak-
tywatora płytek, wiązanie MC540 do płytek silnie
spada (Ryc. 8, 3B), czego nie widać w takim stopniu
w płytkach aktywowanych ADP (Ryc. 8, 3C), uważa-
nym za słaby aktywator płytek. Dyskryminatywność
między wiązaniem iniewiązaniem MC540 zależy od
stężenia uoroforu, toteż należy dokładnie wyzna-
czyć optymalne stężenie dla określonych warunków
doświadczalnych (10-100 M) (Ryc. 9) (93). Wiąza-
nie MC540 do płytek wfunkcji ich aktywacji itwo-
rzenia powierzchni prokoagulacyjnej jest wrażliwe,
podobnie jak w przypadku anneksyny V, na poten-
cjał aktywacyjny agonistów płytkowych, jony wana-
danowe (inhibitor translokazy fosfolipidów błon),
tapsigarginę (inhibitor zależnej od wapnia ATPazy
błon systemu kanalikularno-tubularnego płytek):
podczas gdy wiązanie anneksyny V wzrasta, wiązanie
MC549 maleje w miarę aktywacji. Wiązanie MC540
nie zależy natomiast zupełnie od chelatorów jonów
wapniowych, np. EGTA, które całkowicie blokują od-
działywanie błon z anneksyną V. Stosowanie MC540
wiąże się z mniejszym niż wprzypadku anneksyny
V niszczeniem płytek oraz mniejszym odsetkiem
agregatów płytkowych (Ryc. 10). Wykazano także, że
precyzja pomiarowa i wiarygodność diagnostyczna
nie są gorsze od tych charakteryzujących stosowa-
nie anneksyny V, chociaż różnice między płytkami
spoczynkowymi i komórkami po aktywacji mogą
się wydawać mniejsze w przypadku MC540 (93).
43
Cytometria Polska tom 1, zeszyt nr 1, 2012
 Analiza cytometryczna wiązania merocjaniny 540 oraz powstawania mikropłytek i agregatów w ludzkich płytkach spoczyn-
kowych (A) i płytkach aktywowanych 25 g/ml kolagenem (B) wyznakowanych merocjaniną 540 w stężeniach: 1 M (1), 10 M
(2), 50 M (3) lub 100 M (4). Znaczniki bramkowania M, M1 i M2 oznaczają odpowiednio frakcje płytek MC540-dodatnich (FL2,
szare pola na histogramach), mikropłytek lub agregatów płytkowych (FSC, wykresy kropkowe).
Cytometria Polska
44
tom 1, zeszyt nr 1, 2012
Analiza cytometryczna ludzkich płytek krwi wyznakowanych anneksyną V (A) lub merocjaniną 540 (B). Poziome mar-
kery (M) na wykresach histogramowych oznaczają zakresy obiektów dodatnich pod względem wiązania anneksyny V/PE (A) lub
wiązania MC540 (B) w preparatach płytek spoczynkowych (obrys) lub aktywowanych 25 g/ml kolagenem (szare pole). Znaczniki
M1 i M2 w wykresach wstawkowych oznaczają, odpowiednio, zakresy mikropłytek i agregatów.
45
Cytometria Polska tom 1, zeszyt nr 1, 2012
Od czego zależy wiązanie merocjaniny 540 do błon
płytek krwi?
Jak wspomniano wyżej, przemieszczanie się
fosfolipidów o różnych ładunkach cząstkowych mię-
dzy półwarstwami dwuwarstwy lipidowej błony wiąże
się ze zmianami potencjału powierzchniowego błony
oraz zmianami tzw. parametru uporządkowania dwu-
warstwy (płynnością lipidową błony). Z uwagi na bu-
dowę chemiczną cząsteczki merocjaniny 540, wiąże
się ona preferencyjnie do powierzchni błon komór-
kowych w sposób odwrotnie proporcjonalny do ilo-
ści występującej tam PS. Związana z błonami MC540
istnieje w dwóch formach: monomerycznej oraz di-
merycznej. Jedynie forma monomeru MC540 uory-
zuje (94). Zmiany w wiązaniu MC540 do błon mogą
wynikać ze zmian związanej MC540 lub zmian roz-
mieszczenia monomerów i dimerów znacznika. Po-
nieważ znacznik wiąże się z dużym powinowactwem
do płynnych, słabo upakowanych domen fosfolipido-
wych błony ubogich w cholesterol, spadek płynno-
ści błon płytkowych, obserwowanych np. w procesie
aktywacji płytek krwi, będzie skutkował zmniejszo-
nym wiązaniem MC540. Modelowe badania z wyko-
rzystaniem liposomów o różnej zawartości PC i PS
pokazały, że wiązanie MC540 zmniejszało się wraz ze
wzrostem udziału PS w pęcherzykach liposomalnych
(Ryc. 11). Ponieważ, w odróżnieniu od anneksyny
V, która rozpoznaje dość swoiście polarne reszty PS,
wiązanie MC540 zależy nie tylko od powierzchnio-
wego ładunku błon, lecz także od potencjału prze-
zbłonowego (transmembrane potential, TMP) oraz
rozmieszczenia fosfolipidów w dwuwarstwie, znako-
wanie MC540 mogłoby się w niektórych warunkach
okazać mało specyczne. W badaniach modelowych
na liposomach zawierających różne proporcje PS:PC
w błonach pokazano, że wiązanie MC540 zmienia-
ło się proporcjonalnie do obniżania zawartości PS w
błonach (Ryc. 11) oraz do wzrostu różnicy potencja-
łów między wnętrzem liposomów i buforem, wktó-
rym były one zawieszone (potencjał przezbłonowy,
TMP) (Ryc. 12), jednak udział ujemnie naładowa-
nych fosfolipidów błon przyczyniał się do zmian wią-
zania znacznika w o wiele większym stopniu (95).
Analiza cytometryczna wiązania merocjaniny 540 (MC540) do liposomów. Wykresy histogramowe obrazują MC540-do-
datnie liposomy zawierające 5 mol% (szare pole), 10 lub 20 mol% PS (obrysy od prawej ku lewej). Wstawkowe wykresy kropkowe
odnoszą się do liposomów zawierających odpowiednio 5 mol% (A), 10 mol% (B) lub 20 mol% PS (C). Przerywaną linią pionową
zaznaczono położenie markera specycznego barwienia liposomów MC540.
Cytometria Polska
46
tom 1, zeszyt nr 1, 2012
 Analiza cytometryczna liposomów PS/PC z enkapsulowanym jodkiem 3,3’-dipentyloksakarbocyjaniny (DiOC5(3)), pod-
danych działaniu wzrastających stężeń jonów potasu w buforze [K+]zewn. Liposomy zawierające 5 mol% PS zawieszono w buforze
FF0 (8 mM NaCl, 0.01 mM CaCl2, bez K+, z dodatkiem 1 M walinomycyny) (szare pole), FF150 (z 150 mM KCl) (szary obrys) lub
FF300 (z 300 mM KCl) (czarny obrys). Szarą pionową przerywaną linią oznaczono marker specycznego wyznakowania liposo-
mów znacznikiem DiOC5(3). Wstawkowe wykresy gęstości pokazują rosnącą akumulację znacznika w miarę wzrostu różnicy po-
tencjałów w pęcherzykach inkubowanych w buforach z różnymi stężeniami jonów potasowych: 0 (A), 150 mM (B) i 300 mM (C).
-

Wykorzystanie techniki cytometrii przepły-
wowej w badaniach czynności płytek krwi u gry-
zoni laboratoryjnych, takich jak myszy i szczury, to
odrębny rozdział w metodologii badań cytometrycz-
nych. Odmienności w stosunku do badania płytek
krwi człowieka odnoszą się nie tyle do wyszukanych
wymagań instrumentalnych aparatury pomiarowej,
co do istotnych różnic w protokołach pobierania i
przygotowywania materiału do badań, utrwalania
czy znakowania komórek przeciwciałami. Sprawia to,
iż bezpośrednie ekstrapolowanie doświadczenia pły-
nącego z badania płytek krwi u ludzi i wykorzystywa-
nie analogicznych procedur postępowania z płytka-
mi gryzoni, najczęściej nie wróży badaczowi sukcesu
uzyskania wiarygodnych i powtarzalnych wyników.
Jest to problem ważny, gdyż wykorzystywanie zwie-
rząt laboratoryjnych w badaniach przedklinicznych
stało się praktyką niemalże powszechną i codzien-
ną, a wyniki badań modelowych z wykorzystaniem
zwierząt traktuje się wielokrotnie jako zachętę do
rozpoczęcia badań klinicznych (96-98).
Badając płytki gryzoni, np. mysie lub szczu-
rze, warto pamiętać o różnicach jakie je cechują
w porównaniu do płytek krwi ludzkiej. Płytki my-
sie są na przykład o wiele mniejsze od płytek krwi
człowieka. Średnica płytek wynosi około 0.5 µm (u
człowieka 1-4 µm), jednak jest ich ponad dwukrotnie
więcej, średnio około 1 miliona w mikrolitrze krwi.
Podobną charakterystykę przedstawiają płytki krwi
szczura, dla których górny zakres miana wartości
referencyjnych wynosi około 1.3 mln/µl. Duże uła-
twienie przy dokładnym określeniu wielkości płytek
krwi mogą stanowić komercyjnie dostępne kulki o
różnej średnicy, pokryte znacznikiem uorescencyj-
nym (Ryc. 13). Kulki takie, dodane do próby, mogą
ułatwiać określanie zakresów referencyjnych oraz
oszacowanie wielkości, jakie mogą osiągać płytki w
stanie spoczynkowym (Ryc. 13A) oraz agregaty płyt-
kowe po aktywacji agonistą (Ryc. 13B)
47
Cytometria Polska tom 1, zeszyt nr 1, 2012
Wykres kropkowy kulek polistyrenowych oraz mysich izolowanych płytek krwi w stanie spoczynkowym (A) oraz po
stymulacji trombiną 0.25 U/ml (B). Zastosowano kulki o wielkościach 0.5 m, 1 m, 2 m i 6 m, pokryte znacznikiem uorescen-
cyjnym Yellow Green. Mysie płytki krwi zostały wyizolowane na złożu sefarozowym i wyznakowane przeciwciałami sprzężonymi
z izotiocyjanianem uoresceiny, skierowanymi przeciwko antygenowi konstytutywnemu CD41/61.
Należy pamiętać, iż mimo pewnych podobieństw an-
tygenów powierzchniowych płytek krwi ssaków, nie
możemy oczekiwać, że do oznaczeń cytometrycznych
będziemy mogli używać przeciwciał skierowanych
przeciwko płytkom krwi człowieka i za ich pomocą
znakować komórki myszy lub szczura. Może to być
dla badacza szczególny problem, gdyż oferta komer-
cyjnie dostępnych przeciwciał monoklonalnych skie-