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Diagnóstico imuno-histoquímico de pitiose cutânea em equinos

Authors:
Pedro Miguel OCAMPOS Pedroso
Pedro Miguel OCAMPOS Pedroso
Pedro Soares Bezerra Jr at Federal University of Pará, Castanhal, Brazil
Pedro Soares Bezerra Jr
  • Federal University of Pará, Castanhal, Brazil
Caroline Pescador at Federal University of Mato Grosso
Caroline Pescador
André Gustavo Cabrera Dalto at Federal University of Rio Grande do Sul
André Gustavo Cabrera Dalto
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DIAGNÓSTICO HISTOPATOLÓGICO E IMUNOISTOQUÍMICO DE PITIOSE CUTÂNEA EM
EQÜINOS
PEDRO MIGUEL OCAMPOS PEDROSO1; PEDRO SOARES BEZERRA JÚNIOR1; ANDRÉ GUSTAVO
CABRERA DALTO1; AYRTON SYDNEI CAVALHEIRO2; JANIO MORAIS SANTURIO2; DAVID
DRIEMEIER1
ABSTRACT: PEDROSO, P.M.O.; BEZERRA JÚNIOR, P.S.; DALTO, A.G.C.; CAVALHEIRO, A.S.;
SANTURIO, J.M.; DRIEMEIER, D. Histopathological and Immunohistochemical diagnosis of cutaneous
pythiosis in horses. Pythiosis is a cosmopolitan disease caused by Pythium insidiosum that has been observed in
tropical, subtropical and temperate regions of the world. Pythium infection typically affects skin and subcutis of
horses, cattle, sheep, dogs and human, but it also can affect the intestinal tract of horses, dogs and cats. A
retrospective study (2000 to 2006) of equine cutaneous pythiosis was performed by analysis of diagnostic files at the
Veterinary Pathology Sector, UFRGS. The aim of this survey was to describe macroscopic, histologic and
immunohistochemical findings of five cases occurred form 2000 to 2006. Microscopic examination of hematoxylin
and eosin (HE) stained tissues sections revealed necrotic foci infiltrated and surrounded by eosinophils, neutrophils,
and macrophages. Examination of Grocott’s methenamine silver-stained sections showed branching, septate hyphae.
Tissue sections were also examined by immunohistochemistry which confirmed the diagnosis of equine cutaneous
pythiosis. Immunohistochemical methods on formalin fixed material can be useful for diagnosis in retrospective
surveys or when materials for cultivation are not more available.
KEY WORDS: Equine, Pythium insidiosum, immunohistochemistry.
INTRODUÇÃO
A pitiose é uma enfermidade cosmopolita, de ocorrência em áreas temperadas, tropicais e subtropicais1,2 . O agente
causador da pitiose pertence ao Reino Stramenopila, Classe Oomycetes, Ordem Pythiales, Família Pythiaceae,
Gênero Pythium e espécie P. insidiosum2 . É uma doença que afeta a pele e subcutâneo de eqüinos1,3, bovinos4,
ovinos5 caninos6,7 e humanos8 e pode afetar também o trato intestinal de eqüinos9, caninos10 e felinos11. Nos eqüinos
não há predisposição de raça, sexo ou idade e a forma clínica mais comum é a cutânea2 sendo caracterizada por
lesões ulcerativas granulomatosas, formando grandes massas teciduais , com massas necróticas branco-amareladas
semelhantes a “corais”, chamadas de “Kunkers”2,12. O objetivo deste trabalho é relatar os achados patológicos e
imunoistoquímicos de casos de pitiose em eqüinos diagnosticados na rotina laboratorial do Setor de Patologia
Veterinária da UFRGS (SPV-UFRGS).
MATERIAL E MÉTODOS
O material deste estudo foi obtido de 4 biópsias e 1 necropsia de eqüinos submetidos ao SPV-UFRGS durante o
período de 01 de janeiro de 2000 a 01 de maio de 2006. Os dados gerais dos animais foram informados pelos
veterinários requisitantes. Todas as amostras foram fixadas em formalina tamponada a 10%, processadas
rotineiramente para exame histopatológico, incluídas em parafina, cortadas a 5µm de espessura e coradas pela
hematoxilina-eosina (HE) e pela Prata Metenamina de Grocott (GMS)13. Adicionalmente fragmentos de tecidos
foram submetidos à técnica de imunoistoquímica2 (IHQ) utilizando-se anticorpo primário policlonal anti-P.
insidiosum produzido em coelho na diluição de 1:100 em Phosphate Buffered Saline (PBS), empregando-se o
método complexo streptavidina-biotina. Como cromógeno foi utilizado o VECTOR®NovaRED.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os dados referentes à idade, sexo, raça e localização anatômica das lesões estão representados na Tabela 1.
Macroscopicamente as amostras analisadas neste estudo apresentavam tecido conjuntivo fibroso juntamente com
material necrótico de coloração amarelada que se desprendiam facilmente do tecido circunjacente (“Kunkers”). No
exame histopatológico, o aspecto geral das lesões foi semelhante em todos os casos. Observaram-se focos necróticos
1 Setor de Patologia Veterinária (SPV) / Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS) – Avenida Bento Gonçalves, 9090, CEP 91540-
000, Bairro: Agronomia, Porto Alegre, RS – E-mail: davetpat@ufrgs.br
2 Laboratório de Pesquisas Micológicas – Dep. de Microbiologia -UFSM 97105-900 Santa Maria RS
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Medicina de Eqüinos
Rev. Univ. Rural, Sér. Ci. Vida. Seropédica, RJ, EDUR, v. 27, suplemento, 2007.
associados com imagens negativas tubuliformes de hifas fúngicas, circundados por infiltrado de eosinófilos,
neutrófilos e macrófagos e abundante tecido conjuntivo fibroso. Na coloração de Grocott as hifas foram evidenciadas
nas áreas de necrose como estruturas septadas e ramificadas e de coloração marrom-escuras (Figura 1). Foi enviado
para exame micológico somente uma amostra de tecido, e isolou-se P. insidiosum. As demais amostras não puderam
ser encaminhadas para este exame, pois o material recebido já estava fixado em formalina tamponada a 10%, não
permitindo a cultura. O diagnóstico de pitiose nos casos descritos pelo SPV-UFRGS foi confirmado pela técnica de
imunoistoquímica, através de marcação das estruturas semelhantes a hifas septadas com anticorpo anti-P. insidiosum
(Figura 2). A técnica de imunoistoquímica14, bem como a de anticorpos fluorescentes15 foi um importante passo para
identificação de Pythium insidiosum em amostras histopatológicas. A técnica de imunoistoquímica tem sido utilizada
com bons resultados no diagnóstico de pitiose em eqüinos9,16 , caninos7,17,18,19,20 , bovinos2, ovinos5 e humanos21 . O
diagnóstico definitivo da pitiose normalmente requer o cultivo e isolamento do agente. Nos casos em que o material
é enviado para diagnóstico em formol a técnica de imunoistoquímica é de grande valia para a confirmação da
doença, permitindo um diagnóstico específico2,14,22.
Tabela 1. Casos de pitiose cutânea em eqüinos diagnosticados pelo SPV-UFRGS durante o período
de 2000-2006.
Eqüino n0. Idade
(anos) Sexo Raça Loc. Anat. GMS IHQ
1 * M Quarto de Milha Lábio superior + +
2 6 anos M Puro Sangue Inglês NI + +
3 6 anos F Mestiço Lábio + +
4 * * * Narina + +
5 * * * Membro anterior + +
*: Não Informado; +:Positivo; M: Macho; F: Fêmea.
Figura 1: Hifas longitudinais de P. insidiosum com estruturas ramificadas e septadas e de coloração
marrom-escuras. Coloração pela Prata Metenamina de Grocott. Obj.100. Figura 2: Marcação
positiva para P. insidiosum em imunoistoquímica. Obj. 100.
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... All samples for histopathology were fixed in 10% formalin, routinely processed for histological examination, and stained with hematoxylineosin (HE) and Grocott Methenamine Silver stains (GMS). Selected sections of the soft palate were immunostained with a polyclonal antibody primary anti-Pythium insidiosum produced at the Mycological Research Laboratory of the Federal University of Santa Maria (UFSM), according to cases previously reported in the literature (Pedroso et al., 2009;Bezerra Júnior et al., 2010). ...
... http://dx.doi.org/10.1590/1678-4162-9568 The diagnosis of pythiosis was based on the macroscopic and microscopic findings and confirmed through immunohistochemical technique, and was similar to the diagnoses described in the literature (Pedroso et al., 2009;Bezerra Júnior et al., 2010). ...
Pythiosis with atypical location in the soft palate in a horse in Southern Brazil
Article
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  • Mar 2018
  • ARQ BRAS MED VET ZOO
RESUMO A pitiose é uma enfermidade piogranulomatosa causada pelo oomiceto aquático Pythium insidiosum, que acomete várias espécies domésticas, assim como a humana. O presente relato refere-se à descrição de um caso de pitiose em um equino, fêmea, da raça Crioula, criado na região Sul do Brasil com história clínica de emagrecimento progressivo, disfagia e dificuldade respiratória. Macroscopicamente, o palato mole estava aumentado de tamanho e deslocado caudalmente, resultando em obstrução física da nasofaringe. Ao corte, essa massa era branca-amarelada, fibrosa e com áreas de ulceração. Na análise histopatológica, havia inflamação piogranulomatosa, com focos necróticos associados a imagens negativas tubuliformes de hifas fúngicas. A coloração de Grocott demonstrou inúmeras hifas septadas e ramificadas, as quais foram marcadas positivamente para anticorpos contra P. insidiosum na imuno-histoquímica. O diagnóstico de pitiose foi baseado nos achados macro e microscópicos e confirmado pela técnica de imuno-histoquímica.
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... Para a colheita é necessário ser realizada a limpeza e antissepsia da lesão, com possibilidade de sedação do animal e anestesia local, podem ser realizadas incisões para a retirada de amostras de tecidos e dos 'kunkers' (MÁRQUEZ et al, 2010). As amostras podem ser fixadas em formalina a 10% tamponada por 24 horas, conservadas em álcool 70% e coradas pela coloração hematoxilina-eosina e Grocott para o exame histológico, o qual vai apresentar grave dermatite com infiltração de neutrófilos e eosinófilos, macrófagos e tecido fibroso na coloração hematoxilina-eosina, e na coloração de Grocott observam-se estruturas ramificadas ocasionalmente septadas de cor café, paredes lisas e paralelas no interior das áreas de necrose (PEDROSO et al., 2009;CARDONA;VARGAS;PERDOMO, 2012). ...
... Outro método de identificação é a imunohistoquimica, um método que marca especificamente as hifas de P. insidiosum e possui como vantagem a possibilidade de ser utilizada em tecidos previamente fixados além de apresentar maior especificidade que o método de Grocott metanamina (REIS JR;NOGUEIRA, 2002;PEDROSO et al., 2009). A probabilidade de falsos negativos é baixa, pois as hifas P. insidiosum apresentam moléculas antigênicas específicas do reino Chromista, e estes não são encontrados nas hifas dos fungos zigomicetos (MENDOZA et al., 1997;REIS JR;NOGUEIRA, 2002). ...
PITIOSE EQUINA: REVISÃO DE LITERATURA
Article
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  • Feb 2018
a pitiose é uma enfermidade que afeta diversas espécies animais, sendo a espécie equina geralmente a mais acometida. É causada por um oomiceto que se desenvolve principalmente em regiões subtropicais e tropicais em áreas alagadiças. As lesões frequentemente são únicas, bastante exsudativas, com prurido moderado a intenso e tendem a se localizar nas regiões do corpo que mais entram em contato com as áreas alagadas. Os meios de diagnostico e tratamento vêm sendo estudados surgindo assim cada vez mais técnicas e alternativas. Por ser uma doença que pode causar diversos impactos econômicos, seja por gastos com o tratamento ou até perda da função ou morte do animal, é uma doença que merece atenção no mercado de equinos no Brasil e no mundo. Este trabalho tem por objetivo abordar as principais características da pitiose, seu diagnóstico, tratamento e possíveis impactos.
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... The epidemiology and the clinical, gross and histopathological findings in the seven studied horses were highly suggestive of Pythium insidiosum infection, which was confirmed by IHC in three animals. This technique is an effective and advantageous method when culture or isolation of the agent cannot be performed (Pedroso et al. 2009, Grooters 2013), but has the disadvantage that, because the hyphae are only found within the kunkers or into Splendore-Hoeppli foci (Mendoza et al. 1996), tissue sampling must be thorough. It had been observed that, in advanced stages of the disease, the exuberant formation of fibroplasia and granulation tissue made focal areas of necrosis distant from one another, making it difficult to obtain biopsies containing a sufficient quantity of kunkers for IHC diagnosis (Mendoza et al. 1996, Reis & Nogueira 2002. ...
Equine pythiosis in the eastern wetlands of Uruguay 1
Article
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  • Jul 2019
  • PESQUISA VET BRASIL
Equine pythiosis is an ulcerative and granulomatous disease of the skin, caused by the oomycete Pythium insidiosum (Pythiaceae). The objective of this study was to describe seven cases of equine pythiosis that occurred from 2012 to 2017 in the eastern region of Uruguay. Six of the seven cases occurred in the eastern wetland ecosystems of the Merin basin, and the remaining case occurred in the wetland fluvial plains of the Tacuarembó River. Lesions consisted of a large, rapidly growing ulcerated tumor with abundant granulation tissue, serosanguineous secretion, and fistulous tracts containing large concretions or kunkers. The animals presented intense pruritus, claudication and loss of body condition, with death or euthanasia in extremis in six cases. The main histological lesions consisted of an eosinophilic and pyogranulomatous inflammatory process, with numerous foci of eosinophilic necrosis (kunkers), collagenolysis, and a Splendore-Hoeppli reaction. In all cases, silver coloration (Grocott) showed intralesional hyphae compatible with P. insidiosum, which was confirmed by immunohistochemistry in three cases. A horse in the terminal phase of the disease was treated with triamcinolone acetonide (50mg IM every 15 days), and fully recovered after 1 year. It is concluded that equine pythiosis is prevalent in the wetland ecosystems of eastern Uruguay and that treatment with triamcinolone is auspicious.
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... insidiosum foi diluído em concentração de 1:1000. O cromógeno utilizado foi permanente vermelho (Dako) e contra corado com Hematoxilina de Mayer (Pedroso et al., 2009a). As principais informações relacionadas aos dois surtos relatados neste trabalho estão apresentados resumidamente no Quadro 1. ...
Surtos de conidiobolomicose ovina por Conidiobolus lamprauges no Estado da Bahia, Nordeste do Brasil
Article
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  • Nov 2017
  • REV BRAS MED VET
O presente trabalho descreve a ocorrência de dois surtos de conidiobolomicose em ovinos da raça Santa Inês, no Estado da Bahia. O primeiro surto (PS) ocorreu em uma propriedade localizada no município de Santo Estevão, acometendo três animais, e o segundo surto (SS) em uma propriedade no município de Entre Rios, acometendo um ovino. Em ambos os surtos o quadro clínico caracterizou-se por emagrecimento progressivo, dispneia e descarga nasal serossanguinolenta. No PS observou-se ainda assimetria craniofacial unilateral, associada à exoftalmia e epífora direitas. As necropsias realizadas nos três ovinos do PS evidenciaram grande massa predominantemente branco-amarelada, com áreas vermelho enegrecidas de superfície irregular, finamente granular, úmida e friável localizada na região etmoidal, que invadia a nasofaringe, as coanas, os seios nasais, a região retro bulbar, e se infiltrava na placa cribiforme e alcançava as meninges. Em dois ovinos do PS a massa atingia a porção frontal do cérebro. No ovino do SS verificou-se, na mucosa do vestíbulo nasal pequenos nódulos multifocais a coalescentes, vermelho enegrecidos, com superfície erodida, bem como hiperemia das conchas nasais com secreção catarral hemorrágica e, na porção mais rostral da cavidade nasal, a mucosa encontrava-se com superfície irregular úmida, hemorrágica, vermelha enegrecida com áreas acinzentadas e amarronzadas, exibindo destruição focal parcial das conchas nasais. O exame microscópico das lesões granulomatosas revelou, em geral, múltiplas áreas de necrose de coagulação contendo intensa reação de Splendore-Hoeppli, associadas a imagens negativas de hifas fúngicas e inflamação granulomatosa. Em todos os casos a coloração pelo GMS e PAS evidenciou diversas hifas largas, raramente septadas com dilatação balonosa em uma das extremidades. Por meio da técnica de PCR caracterizou-se Conidiobolus lamprauges, realizada nas amostras de soro de dois ovinos e nas lesões emblocadas em parafina de um ovino. As análises imunohistoquímicas resultaram positivas para C. lamprauges em todos os animais. Comprova-se, pela primeira vez, a ocorrência de conidiobolomicose nasofaríngea/rinocerebral e rinofacial por C. lamprauges no Estado da Bahia.
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... Microscopicamente, verificam-se áreas de necrose constituídas principalmente de eosinófilos, em cuja periferia observam-se imagens negativas tubuliformes correspondentes às hifas de Pitium. insidiosum (Driemeier et al. 2009). O sarcóide, "tumor" mais comum de pele dos equinos, localiza-se preferencialmente nos membros e cabeça; ao exame histológico, as lesões são caracterizadas por proliferação fibroblástica, constituída por grande quantidade de células fusiformes na forma de ninhos ou feixes distribuídos em diferentes direções recobertos por epitélio, em geral acantótico (Brum et al. 2010). ...
Surtos de dermatite ulcerativa causados por espinhos de Mimosa setosa, M. debilis e M. pudica (Fabaceae) em equinos
Article
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  • Oct 2016
Mechanic natural skin lesions in horses caused by thorns of Mimosa spp. are described. Between the three plant species identified as responsible for the lesions, Mimosa setosa was present in greater quantity (80%) in the pasture, whilst M. debilis and M. pudica existed in lower proportion. Three ulcerative dermatitis outbreaks were observed during rainy periods of April to May 2013, December 2013 to February 2014 and April to May of the same year. Twenty-five horses from the Sector of Animal Reproduction, Federal Rural University of Rio de Janeiro, showed ulcerative skin lesions with irregular borders, hemorrhagic exudate, sometimes covered with scabs, located mainly in the regions of the pastern, fetlock, scapular-humeral joints, upper and lower lips, nose, nostrils, cheeks and chamfer. Seven horses were biopsied and histopathological examination revealed ulceration of the skin with inflammatory infiltrate by macrophages and neutrophils, delimited by granulation tissue. In some cases, microspicules of these plants (hirsute trichomes) were found throughout the inflammatory reaction. The diagnosis of skin dermatitis, caused by traumatic action of the plants, was based on the presence of Mimosa spp. in the pasture, on the characteristic clinic-pathological features and on recovery of the horses after their removal from the pasture. This appears to be the first report of the occurrence of ulcerative dermatitis caused by Mimosa setosa, as dermatitis caused by the others has been described before.
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Pitiose em equinos
Article
Full-text available
  • Jan 2014
Resumo A pitiose é uma doença piogranulomatosa, causada pelo oomiceto Pythiuminsidiosum. É de ocorrência mundial, sendo mais frequente em regiões de clima temperado, tropical e subtropical. Já foi relatada em vários estados brasileiros, sendo o Pantanal considerado o local com maior frequência de pitiose no mundo. A espécie equina é mais atingida pela doença, havendo vários relatos da doença no Brasil. Seu diagnóstico pode ser realizado pelo aspecto clínico, histopatológico, cultura e isolamento do P. insidiosum, imuno-hitoquímica, ELISA e por meio métodos moleculares. Os métodos terapêuticos mais utilizados para o tratamento da pitiose são: cirurgia, químico, imunoterapia e a combinação destes, sendo a imunoterapia o mais promissor dos tratamentos. Palavras-chave: Equino, ficomicose, tratamento.
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Equine Skin Pythiosis: a review
Article
  • Jan 2013
Equine cutaneous pythiosis is a skin disease of horses grazing on flooding areas of tropical and subtropical regions. It is caused by the Oomycete Pythium insidiosum. The lesions are characterized by a crater-shaped and granulomatous appearance with presence of pruritus, sinus tracts, bloody fibrinous secretions and caseous necrotic material excretions called "kunkers". This review provides detailed and updated information about the disease, addressing the general concepts of its presentation, pathophysiological mechanisms, diagnostic and therapeutic methods frecuently used.
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Primer reporte de Pythiosis en área rual de Florencia- Caquetá
Article
Full-text available
  • Sep 2016
In the village "Canelos" in the municipality of Florencia-Caqueta, is reported to the Clinic Large Animals at the University of the Amazonia, the case of a horse of race Colombian Creole, with 8 years old and used as a working animal in the "El Sinai" ranch with a granulomatous injury in the chest from about two years ago, treating repetitively with acetonide traimcinolona as glucocorticoid anti-inflammatory, used commonly to treat habronemiasis, which was the initial presumptive diagnosis during the complementary examinations performed histopathology and structures identifies as compatible with Oomycetes, which Grocott staining is identified as Pythium spp., and 45 days pregnancy is diagnosed, condition unlikely given the treatment with glucocorticoid. Treatment homeopathic immunostimulation and surgical resorption is initiated by techniques with heat copper materials over the injury, planned in several stages, after 6 surgical sessions with recurrences of "kunkers" and abortion of uterine product, it proceeds to perform euthanasia to avoid therapeutic obstinacy. At necropsy are in addition granulomatous skin ulcer, fibrous lesions in the pectoral muscle fascia but without the presence of hyphae or some other structure compatible with pythiosis.
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Antigenic relationship between the animal and human pathogen Pythium insidiosum and nonpathogenic Pythium sp
Article
Full-text available
  • Dec 1987
Identification of the newly named pathogenic oomycete Pythium insidiosum and its differentiation from other Pythium species by morphologic criteria alone can be difficult and time-consuming. Antigenic analysis by fluorescent-antibody and immunodiffusion precipitin techniques demonstrated that the P. insidiosum isolates that cause pythiosis in dogs, horses, and humans are identical and that they were distinguishable from other Pythium species by these means. The immunologic data agreed with the morphologic data. This indicated that the animal and human isolates belonged to a single species, P. insidiosum. Fluorescent-antibody and immunodiffusion reagents were developed for the specific identification of P. insidiosum.
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Outbreaks of Pythiosis in Two Flocks of Sheep in Northeastern Brazil
Article
Full-text available
  • Aug 2004
Two outbreaks of cutaneous pythiosis caused by Pythium insidiosum were diagnosed in two herds of crossbred hair wool sheep of different ages in the semiarid region of Northeastern Brazil. In one herd of 120 sheep, 40 were affected. The other outbreak affected six sheep out of 80. Local swellings with ulcerative lesions were observed in the limbs and abdominal and prescapular regions. Three sheep were necropsied. Two of them had lung metastasis characterized by multifocal nodules measuring 0.5-2 cm. In one animal, the prescapular lymph node was also affected. In another, the cutaneous lesion extended to the sesamoid bone. Microscopically, there were multifocal granulomas with intralesional P. insidiosum hyphae and Splendore-Hoeppli material surrounding the hyphae. The diagnosis was based on the histologic lesions, immunohistochemical identification, and culture of the etiologic agent. One sheep treated with potassium iodide recovered. Standing in swampy water for long periods in a warm aquatic environment seems to be the reason for the high prevalence of the disease.
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Human subcutaneous pythiosis
Article
  • Jul 1993
Two cases of subcutaneous infection caused by the primitive aquatic hyphal organism Pythium are described. Pythium is an important pathogen of horses in the U.S.A. and Australia. Cases of human subcutaneous pythiosis have been cited in the literature, but clinical and histopathological features have not been described previously. Both cases occurred in young immunocompetent males in the periorbital region and showed rapid growth, clinically mimicking a tumor and requiring operative biopsy. In both cases there was a history of exposure to either swampy water or horses. The tissue reaction was distinctive, closely resembling that seen in equine pythiosis, comprising well-defined granular eosinophilic islands bordered by macrophages, multinucleate giant cells, fibrosis and numerous eosinophils. Hyphae were well demonstrated with the Grocott stain but only poorly with the PAS method. Identity of the organisms was confirmed with an immunoperoxidase technique employing a polyclonal antiserum to Pythium. Both patients responded well to amphotericin B.
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View
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