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Efecto de la curcumina sobre la estabilidad de los microdominios de
membrana de trofozoítos de Giardia lamblia
Dr. en C. Rafael Cortés Zárate, Dr. en C. Mario Alberto Ramírez Herrera, Dra. en C. María Luisa Mendoza Magaña,
Dra. en C. Araceli Castillo Romero, QFB Sergio Sandoval Ávila, eQFB Filiberto Gutiérrez Gutiérrez
Resumen
La curcumina es un compuesto difenólico con acción antioxidante, antiinflamatoria y también antiparasitario. Tiene
efecto contra el parásito Giardia lamblia, altera la multiplicación, viabilidad, morfología y adhesión del trofozoíto. En este
trabajo se estudió el efecto de la curcumina sobre la estabilidad de los microdominios de membrana de trofozoítos de G.
lamblia. Los resultados demuestran la presencia de microdominios de membrana en trofozoítos de G. lamblia, que fueron
detectados mediante técnicas de inmunofluorescencia utilizando como marcador específico de microdominios a la
subunidad beta de la toxina colérica. Se logró la purificación de la fracción de microdominios mediante gradientes de
centrifugación. En trofozoítos de G. lamblia expuestos a curcumina se modificó el patrón de fluorescencia y de purificación
de los microdominios, en forma similar al efecto de la ciclodextrina compuesto que desestabiliza microdominios de
membrana. Estos resultados nos ayudan a entender el mecanismo de acción de la curcumina como antigiardiósico. Los
cambios morfológicos, la disminución de la viabilidad y la pérdida de la adhesión de los trofozoítos de G.lamblia expuestos
a curcumina se pueden interpretar como una alteración de la estabilidad de los microdominios afectando la señalización
celular, el control de la fluidez y permeabilidad de la membrana celular.
Palabras clave
Curcumina, Giardia lamblia, Microdominios de membrana, metil beta cilcodextrina.
Introducción
La Giardiosis es una de las parasitosis más común alrededor del mundo. En México se estima que
aproximadamente 9 millones de personas presentan esta parasitosis, siendo más vulnerable la población preescolar
(Cedillo-Rivera, 2009). Aun cuando por décadas se han probado diversos tratamientos farmacológicos contra esta
enfermedad, los efectos colaterales producidos por la mayoría de ellos y la aparición de cepas de G. lamblia
resistentes, provocan que hasta el momento no se tenga un tratamiento efectivo que permita erradicar esta parasitosis.
En la búsqueda de nuevas alternativas terapéuticas se han probado diferentes fitoquímicos, entre ellos la curcumina,
principal curcuminoide biológicamente activo de la turmérica. Este fitofármaco, ha demostrado tener actividad
antioxidante, antiinflamatoria, anticancerígena, anti-apoptótica, antiviral y antiparasitaria, entre otras (Aggarwal BB,
2008). En Giardia lamblia, la curcumina afecta la multiplicación, la forma, viabilidad y la adhesión de los
trofozoítos, su efecto es comparable al albendazol y metronidazol, pero con prácticamente nulos efectos secundarios
(Perez-Arriaga L, 2006.)
De los efectos de la curcumina sobre G. lamblia, los que más llaman la atención son las alteraciones morfológicas
mostradas en los trofozoítos de G. lamblia ya que se caracterizaron por deformaciones en la membrana con
abultamientos prominentes que provocaron el redondeamiento y posteriormente la destrucción del parásito,
encontrando formas esféricas y restos celulares a las 48 y 72 hs posteriores a la exposición de la curcumina. Estos
hallazgos hacen pensar en un efecto de la curcumina sobre la membrana celular del parásito. (Figura 1)
Los microdominios de membrana son regiones pequeñas, de baja densidad, enriquecidos en colesterol y
glucoesfingolípidos. Un aspecto funcional importante de los microdominios de membrana es que actúan como
plataformas para la organización de los sistemas de transducción de señales, en procesos de endocitosis y exocitosis,
en la unión y entrada de virus a sus células blanco, unión de bacterias y toxinas bacterianas, entre otras funciones
(Radeva y Sharom, 2004; Simons y Gerl, 2010).
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Figura 1.-Efecto de la curcumina sobre trofozoítos de G. lamblia. a: Control con etanol, b: curcumina 0.3 µM, c:
curcumina 30 µM, d: curcumina 100 µM
Los estudios de la función de los microdominios de membrana se han realizado utilizando metil beta
ciclodextrina (MCD), es un oligosacárido formado de 7 moléculas de glucosa organizadas en estructura cíclica, este
arreglo molecular genera una región exterior hidrofílica y un centro o cavidad hidrofóbica capaz de formar
complejos de inclusión con el colesterol y separarlo fundamentalmente de las membranas celulares y en particular de
los microdominios de membrana provocando con ello su desorganización. Se requieren alrededor de 2 moléculas de
MCD para capturar una molécula de colesterol (Zidovetzki y Levitan, 2007).
El células de mamífero los microdominios de membrana han sido ampliamente estudiados. Evidencias
recientes, relacionan a estas estructuras en el control de la virulencia, en los mecanismos de adhesión, invasión,
motilidad, tráfico vesicular y señalización celular, en una gran variedad de parásitos. (Goldston, et al, 2012). En
protozoarios parásitos como E. histolytica, los microdominios de membrana participan en los procesos de adhesión
del parásito ya que los trofozoítos tratados con MCD disminuyen su capacidad de adherirse a colágena y
fibronectina. La adhesión de E. histolytica depende de la presencia de lectinas como Gal/GalNAc y estas se localizan
en microdominios de membrana facilitando la interacción del trofozoíto con la colágena (Mittal y col., 2008).
En Trypanosoma cruzi en su fase de epimastigote, se han encontrado microdominios de membrana que
participan en los procesos de endocitosis de nutrientes localizados en el cistostoma/citofaringe del parásito (Correa y
col., 2007).
En células de mamífero, evidencias recientes señalan que la curcumina altera la formación de los
microdominios de membrana, afectando de manera indirecta la localización intracelular de moléculas clave en
diferentes procesos de señalización.
En Giardia lamblia, no se tiene un estudio que demuestre si la curcumina pudiera afectar la estabilidad de
los microdominios de membrana. En este trabajo se demostró que este fitoquímico afecta la estabilidad de los
microdominios de membrana de Giardia y pueden explicar los efectos de la curcumina sobre los trofozoítos del
parásito, como son la disminución de la viabilidad, la pérdida de la adhesión y los cambios morfológicos tan
drásticos observados en el parásito.
Experimento:
La localización de los microdominios de membrana se realizó por ensayos de fluorescencia utilizando como
marcador específico a la subunidad beta de la toxina colérica (BTC) acoplada a isotiocianato de fluoresceína (FITC),
la cual se une a los gangliósidos GM1 y por lo tanto se le considera un marcador de microdominios de membrana.
Para evaluar el efecto de curcumina en la organización de los microdominios de membrana, trofozoítos de
Giardia fueron incubados sin y en presencia de 30 µM de curcumina por 30, 60 y 120 minutos. El efecto de
curcumina en microdominios fue evaluado por ensayos de fluorescencia con BTC. Como control positivo de
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analizaron parasitos que habían estado expuestos durante 30, 60 y 120 minutos a 0.1, 0.05 y 0.025%, peso/volumen
de MCD.
Para evaluar el efecto de curcumina en la capacidad de adhesión de los trofozoítos, 50,000 trofozoítos/ml se
crecieron en presencia de 30 y 100 µM de curcumina, se tomaron muestras a las 24, 48 y 72 h. Cada 24 hrs se realizó
el conteo del número de parásitos antes de colocar los tubos en baño de hielo a 4°C, el resultado fue la población de
parásitos no adheridos o libres en el medio de cultivo. Posteriormente los mismos tubos se colocaron en baño de
hielo a 4°C durante 30 minutos para obtener la población total de trofozoítos (tanto parásitos libres como adheridos).
La diferencia entre la población total y la libre nos dio el número de parásitos que se encontraron adheridos en cada
uno de los tiempos de incubación y concentración de curcumina.
La purificación de microdominios de membrana se realizó de la siguiente manera: Trofozoítos se
resuspendieron en 2 ml de subunidad Beta de la toxina colérica conjugada con peroxidasa (BTC-HRP) diluida 1:500
en PBS frío y se mantuvo en agua-hielo durante 1 hora. Se lavaron en tres ocasiones con PBS frío. Al sedimento se
le agregó 1 ml de buffer de lisis frío, el cual contenía tritón X-100 al 1% e inhibidores de proteasas (aprotinina
1µg/ml y luepeptina 1µg/ml) en PBS. Se mantuvo en agua-hielo durante 30 minutos. Con este lisado se realizó un
gradiente de densidad con Optiprep de 0 a 35% y se centrifugaron a 100,000 x g durante 16 horas a 4ºC, en
ultracentrífuga Sorvall WX Ultra Series (Thermo Electron Corporation) y rotor oscilante AH-G27. La separación de
las fracciones se realizó con pipeta Pasteur en volúmenes de 1 mililitro. La detección de las fracciones con
microdominios de membrana se realizó mediante técnica de dot-blot y revelado con quimioluminiscencia.
Resultados:
Se identificaron microdominios de membrana en trofozoítos de G. lamblia, esta identificación se realizó
utilizando el marcador de microdominios, la subunidad beta de la toxina colérica marcada con fluoresceína. Se
localizó una marca fluoroquímica distribuida en segmentos o parches grandes de aspecto homogéneo, en toda la
superficie del cuerpo del trofozoíto. La unión selectiva de la BTC-FITC para gangliósidos de membrana, nos permite
inferir que esta señal fluoroquímica corresponde a la localización de microdominios de membrana en trofozoítos de
G. lamblia.
Para corroborar los resultados anteriores se realizó el experimento anterior pero con trofozoítos expuestos a
MCD y se evaluó el efecto sobre los microdominios de membrana. En los trofozoítos expuestos a MCD la marca
fluoroquímica de los microdominios de membrana se observó difusa y tenue, perdiéndose el patrón característico en
parches sobre la membrana celular (Figura 2). La disgregación de los microdominios de membrana con MCD, se
debe a que ésta depleta el colesterol de los microdominios provocando su desorganización.
Figura 2.- Identificación de microdominios y efecto de la MCD. Campo claro (a); microdominios marcados con
BTC-FITC (b); campo claro (c); microdominios expuestos con MCD 0.1%, durante 60 minutos.
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Para evaluar el efecto de la curcumina sobre la distribución de los microdominios de membrana, se expusieron
trofozoítos a 30 µM de curcumina durante 60 minutos y se realizó inmunofluorescencia con BTC-FITC. Se observó
un efecto similar al encontrado con MCD, con disminución de la marca fluorescente y pérdida del patrón
característico en parches (Figura 3).
Figura 3.- Identificación de microdominios y efecto de la curcumina. Campo claro (a); microdominios marcados con
BTC-FITC (b); campo claro (c); microdominios expuestos con curcumina 30 µM, durante 60 minutos.
Estos resultados nos indican que probablemente la curcumina tenga un efecto similar a la MCD, depletando
de colesterol los microdominios y provocando su disgregación.
La purificación de microdominios de membrana de trofozoítos de G. lamblia se realizó mediante gradientes de
densidad, utilizando para ello el kit de aislamiento de microdominios Optiprep (Sigma-Aldrich), el cual es una
solución de iodixanol al 60% en agua, diseñada para separación de fracciones sub-celulares por gradientes de
densidad.
Se obtuvieron 8 fracciones de 1 ml cada una. El análisis para la localización de las fracciones con
microdominios de membrana, se llevó a cabo mediante dot-blot y fue revelado con quimioluminiscencia. Se encontró
la señal para microdominios de membrana, en las fracciones 5, 6 y 7 del gradiente de densidad. Con esta
metodología se logró la separación de microdominios de membrana de trofozoítos de G. lamblia. (Figura 4)
Figura 4.- Separación de microdominios de membrana. Dot-blot con 10 µl de cada fracción recuperada del gradiente
de densidad con Optiprep de 0 al 35% y revelada con quimioluminiscencia.
Se evaluó el efecto de la curcumina y la MβCD sobre la purificación de microdominios de membrana. Se
expusieron los trofozoítos a 30 y 100 µM de curcumina, 1 y 5 µM de MβCD, durante 1 hora; posteriormente, se
realizó el procedimiento de separación de microdominios por gradiente de densidad. Se utilizó un control de
trofozoítos no expuestos y otro expuesto a saponina al 1%, agente que solubiliza membranas celulares. Se encontró
nuevamente que la curcumina altera el patrón de purificación de los microdominios en forma similar a la MβCD
(Figura 5)
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Figura 5.- Distribución de microdominios de membrana en las fracciones obtenidas del gradiente de densidad,
después de exponer trofozoítos de G. lamblia 1 h a curcumina y MβCD
Discusión y conclusiones:
Llama la atención que los efectos observados tras la exposición a la MCD, tanto en la distribución y co-
localización de los canales en microdominios de membrana, así como alteración del patrón de purificación de
microdominios son similares a los encontrados cuando se expusieron los trofozoítos a curcumina. Estos resultados
sugieren que la curcumina en G. lamblia pudiera actuar en forma directa o indirecta sobre el contenido de colesterol
en microdominios y modificar el microambiente de la membrana celular de los trofozoítos.
Coincidentemente, se ha reportado que la curcumina tiene un efecto hipocolesterolémico (Soni y Kuttan, 1992).
Se han propuesto algunas vías por las cuales la curcumina pudiera ejercer tal efecto. Se ha encontrado que la
curcumina aumenta la expresión del gen CYP7A1 de la enzima colesterol 7α-hidroxilasa, la cual convierte el
colesterol a ácidos biliares y es una de las principales vías de regulación del colesterol en los eucariotes superiores
(Kim M y Kim Y, 2010).
En G. lamblia la curcumina al depletar de colesterol los microdominios de membrana pudieran generar la señal
necesaria para el inicio del proceso de enquistamiento, de manera similar cuando se añaden sales biliares a los
medios de cultivo para disparar el proceso de enquistamiento. Sin embargo, en el caso de la curcumina al afectar los
microdominios se altera la vía de señalización y el parásito es llevado a una completa disfunción de la membrana
celular que le provoca las alteraciones morfológicas.
Por otro lado, se ha demostrado que la curcumina actúa en forma directa sobre las membranas celulares
modificando sus características biofísicas y con ello altera la distribución y funcionalidad de algunas proteínas
(Ingolfsson y col., 2007; Barry y col., 2009)
Se conoce poco de la dinámica y regulación del colesterol en los trofozoítos de G. lamblia (Rivero y col., 2011).
La curcumina pudiera actuar en diferentes niveles de esta vía metabólica. A nivel de membrana modificando las
características biofísicas y en la regulación de las vías de señalización. Nuestros resultados aportan nueva
información sobre la biología de este parásito y una posible alternativa terapéutica; la curcumina puede ser
considerada como un antiparasitario natural sin efectos adversos colaterales.
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Conclusiones:
1. La curcumina actúa sobre la membrana de los trofozoítos de G. lamblia.
2. La curcumina desorganiza los microdominios de membrana.
3. Se produce el abultamiento de la membrana y el hinchamiento de los trofozoítos, probablemente debido a
que la desestabilización de los microdominios de membrana provoca pérdida de los procesos de
señalización y permeabilidad.
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