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Carmen Mueller-Karger, Sara Wong, Alexandra La Cruz (Eds.): CLAIB 2007, IFMBE Proceedings 18, pp. 663–666, 2007
www.springerlink.com © Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2007
El grado de glicosilación del colágeno óseo regula la adhesión y la capacidad
de biomineralizar de las células óseas
A. Bello, A.H. Márquez y K. Noris-Suárez
Universidad Simón Bolívar/Departamento de Biología Celular, Caracas, Venezuela
Abstract— In the bone tissue, collagen is the most abundant
protein, conforming 90% of the organic matrix of this mineral-
ized structure. Different works indicate that in postmeno-
pausal osteoporosis, the early degradation of the bone tissue
seems to be due to the presence of bone collagen in a condition
of overglycosylation, especially in the trabecular bone. To
understand the role of the glycosylation of the collagen mole-
cule and how it can regulate functions of the bone cells, such as
cellular adhesion and biomineralization, is the main objective
of the present work. 8 rats were ovariectomized and another 8
were sham-operated (control group). After 45 days the rats
were sacrificed, femurs were extracted and the bones were
decalcified in order to obtain the collagen matrix mineral free.
Primary cultures of bone cells were obtained from calvaria of
neonatal rats. The adhesion and differentiation (alkaline phos-
phatase activity and biomineralization) of these cells were
evaluated on the collagen bone matrix obtained of the ovariec-
tomized and control rats. The results of this work show a
greater adhesion of the osteoblastic cells on the bone collagen
for the control group in comparison with the adhesion found
for the ovariectomized group, in the first two hours. Addition-
ally, cell FA activities and mineralization on material differ
between control and ovariectomized animals bone collagen
samples. In conclusion, in the present work we present evi-
dence that suggest that bone cells can recognize differences in
the degree of glycosylation of the collagen matrix in ovariec-
tomized animals in comparison with the control group, and the
cellular response is different as a consequence of these varia-
tions of the extracellular material.
Palabras claves— Glicosilación del colágeno, matriz ósea,
osteoporosis postmenopausal, osteoblastos.
I. INTRODUCCIÓN
El colágeno tipo I, proteína fundamental de la matriz
ósea, está sometida a modificaciones posttraduccionales,
entre las cuales está la glicosilación de residuos específicos
de hidroxilisina. Las modificaciones posttrasduccionales
difieren para cada tipo de colágeno, e incluso en el mismo
tipo de colágeno, en el caso del hueso se ha reportado que
existen diferencias en el grado de glicosilación si este
corresponde al hueso trabecular o al cortical. Siendo esta
proteína la mas abundante de la matriz orgánica del hueso
(representa el 90 %) se estudia en el área de la bioingeniería
de tejidos con el fin de entender mejor la relación entre la
estructura y la función de la misma. Se sabe además que
alteraciones en la disposición espacial (dada por el grado de
glicosilación) puede alterar las propiedades de resistencia de
las fibrillas de colágeno así como la deposición del mineral
del tejido. En alteraciones como la osteoporosis
postmenopausal, donde la deprivación de estrógenos causa
un incremento en la tasa de degradación ósea versus la
formación, ha sido reportado que el grado de glicosilación
de la matriz colagénica del hueso trabecular se ve
incrementado en comparación con individuos no-
osteoporóticos [1-3]; Sin embargo hasta la fecha no se han
realizado estudios in vitro que permitan verificar si
efectivamente el grado de glicosilación de la matriz
colagénica del hueso puede ser reconocida por las células
óseas, respondiendo de forma diferente como consecuencia
a estas variaciones.
En el presente trabajo se evaluó si los osteoblastos
(responsables de formar tejido óseo y regular el
metabolismo del hueso) eran capaces de reconocer
diferencias en el grado de glicosilación del colágeno,
mostrando respuestas celulares diferentes ante el material.
II. MATERIALES Y MÉTODOS
A. Preparación de matrices colagénicas del modelo animal
Para la preparación de matrices colagénicas se emplearon
16 ratas Sprague-Dowley adultas de 100 días de edad,
hembras, 8 fueron sometidas bajo anestesia a una
ovariectomia y las 8 restantes fueron sometidas a falsa
operación (SHAM-operated). Fueron sacrificadas a los 45
días luego de la operación tiempo en el cual desarrollaron la
condición de osteoporosis. Los huesos largos fueron
extraídos, lavados y desmineralizados, empleando el
tratamiento descrito por Noris-Suárez et al [2]. Una vez
descalcificadas las muestras óseas, se separó el colágeno de
la región ósea cortical y el de la región ósea trabecular. Las
muestras fueron cortadas, liofilizadas y conservadas a -20oC
para posteriores análisis
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2 h 4 h
B. Cultivo de células osteoblásticas
Los osteoblastos fueron extraídos y cultivados siguiendo
el método descrito por Noris-Suárez et al [4]. Las células
fueron mantenidas a 37 oC en atmósfera húmeda y 5% CO2.
C. Evaluación de la adhesión celular
En placas de 96 pocillos se colocaron muestras de
colágeno óseo de 2 x 2 mm aproximadamente. Se
emplearon 6 muestras de colágeno de cada condición,
cortical y trabecular de animales ovarietomizados (OVX) y
sometidos a falsa operación (SHAM). Todas las muestras a
estudiar fueron colocadas en la placa de cultivo. La
adhesión celular se evaluó colocando una suspensión de
30.000 cel/ml en cada uno de los pocillos que contenían las
muestras de colágeno. A las 2 y 4 hrs. se contaron las
células remanentes (no adheridas) empleando un
hemocitómetro, previamente teñidas con la tinción vital de
azul de tripano y se calcularon las células adheridas al
material.
D. Determinación de actividad de fosfatasa alcalina (FA)
Para determinar la actividad FA se tomaron 10 μL de
cada medio recolectado a los diferentes días de tratamiento.
La actividad se determinó siguiendo el método descrito por
Bowes et al [5]. Brevemente, empleando a concentraciones
finales de 50mM buffer dietanolamina/HCL (DEA) pH 9,6
y 10 mM p-nitrofenil fosfato como sustrato, se incubó la
reacción a 37ºC por 10 min. Finalmente se detiene la
reacción con 50 μL de NaOH 1M. La absorbancia se leyó
empleando un lector de ELISA (Bio-Teck) a 405 nm. Previo
a la determinación de fosfatasa alcalina se realizó la curva
de calibración con p-nitrofenol.
E. Mineralización
El proceso de biomineralización se indujo suplementando
el medio de cultivo con 1x10-7 M dexametasona (DXM), 50
μg/ml ac. ascórbico, 10 mM β-glicerofosfato (β-GP) y 10%
suero fetal bovino (SFB) por un total de 14 días de
tratamiento. El medio fue cambiado cada 3-4 días hasta
completar el estudio. Los controles (pocillos sin matriz
colagénica) fueron tratados solo con 50 μg/ml ác. ascórbico,
10 mM β-GP. La cantidad de calcio precipitado en forma de
mineral (cristales de hidroxiapatita) fue determinada usando
la tinción con Rojo de Alizarina siguiendo el procedimiento
descrito por Stanford et al [6] Se realizó tanto la evaluación
cualitativa (registro fotográfico) como la cuantitativa.
III. RESULTADOS
Los resultados de adhesión celular se muestran en la
figura 1. Se encuentra que a las primeras dos horas de
incubación de las células con las diferentes matrices, se
tiene un predominio de adhesión de las células sobre la
matriz proveniente de los animales control (SHAM) sin
diferencias importantes entre el tipo de tejido óseo (cortical
o trabecular). Sin embargo fue posible verificar que a las 4
hrs. de incubación, esta tendencia se invierte, aumentando
de forma significativa la adhesión de las células en las
matrices provenientes de los animales OVX en comparación
con los animales control (SHAM), encontrándose que para
las 4 hrs de incubación células-material hubo un 72% y 73%
de células adheridas sobre la matriz cortical y trabecular,
respectivamente en los animales OVX. Mientras, que para
la matriz proveniente de los animales control (SHAM-op) la
adhesión fue de 57% y 62 % para el hueso cortical y
trabecular, respectivamente.
Fig. 1.- Adhesión celular observada para los cultivos control
y experimentales a las 2 y 4 horas expresadas en porcentaje
con respecto a las células sembradas inicialmente (n=6)
Para ello se trataron las células con un esteroide sintético,
llamado Dexametasona (DXM), el cual ha sido
ampliamente reportado como un compuesto que orienta las
células preosteoblásticas a diferenciarse en células
osteoblásticas maduras (capaces de expresar actividad de
fosfatasa alcalina, entre otras actividades específicas) en una
primera fase y en células osteocíticas, en una fase final de
diferenciación in vitro, donde se alcanza la formación de
nódulos de mineralización o biomineralización completa del
material.
Para evaluar el proceso de diferenciación de los cultivos
se decidió determinar la actividad de fosfatasa alcalina (FA)
en el medio de cultivo a los diferentes días de tratadas las
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células en cultivo, así como la cantidad de mineral
depositado al final del periodo del tratamiento con DXM.
En el caso de la determinación de FA, se estandarizó el
procedimiento ya que se debía verificar que el rojo fenol
presente en el medio de cultivo no interfiriera con la
reacción colorimétrica. Por ello, previamente, se determinó
la actividad FA presente en la fracción citosólica, la
fracción particulada (correspondiente a membranas
celulares) y en un medio de cultivo luego de 4 días. En este
caso se empleó medio de cultivo fresco, como control
negativo. Se encontró que la actividad FA es detectable en
el medio de cultivo de las células, en cantidades similares a
la determinada en la fracción citosólica. Adicionalmente se
confirmó que el rojo fenol no interfiere con la
determinación colorimétrica.
Los resultados de la actividad de FA para los cultivos
control (células óseas crecidas en la placa de cultivo en
ausencia de matriz colagénica) se reportan en la Tabla 1,
como unidad de actividad enzimática (UAE). Se puede ver
que la actividad de FA en el cultivo control responden al
tratamiento de diferenciación con DXM, encontrándose una
elevada actividad al inicio del tratamiento con una
progresiva disminución a medida que avanza los días de
tratamiento con DXM, siendo indetectable en el medio para
el día 14 de tratamiento.
En base a estos resultados se evaluó la actividad de FA
de las diferentes matrices colagénicas obtenidas de los
animales OVX y SHAM-op.
Tabla 1.- Actividad fosfatasa alcalina en cultivos control
Tiempo UAE
24 h 0,07
4 días 0,017
14 días 0
En la figura 2 se muestran en un grafico de barras la
actividad FA medida en el medio de cultivo, proveniente de
los cultivos a las 48 hrs., 4 y 14 días de tratamiento con
DXM. Resulta evidente en la figura una mayor actividad FA
a las 48 hrs de cultivo con las matrices en comparación con
los restantes lapsos de tratamiento. Resalta además el hecho
que las células sembradas en la matriz proveniente de los
animales OVX fueron las que mostraron la mayor actividad
de FA, con el tratamiento de DXM.
Una vez completados los 14 días del tratamiento con
DXM, se determinó el grado de biomineralización en las
diferentes matrices estudiadas, trabecular y cortical de
animales control (SHAM-op) y cortical de animales OVX.
Como control de biomineralización, para este ensayo se
utilizó un cultivo de células osteoblásticas sin material
colagénico al cual se le realizó el mismo tratamiento con
DXM que al resto de las muestras. Los resultados de
biomineralización se pueden ver en la figura 3. Se observa
que las células óseas fueron capaces de biomineralizar las
matrices colagénicas. Encontrándose que se produjo la
deposición de mineral en todos los casos, tanto en cultivos
con y sin DXM (ver figura 3, inserto).
La determinación cuantitativa permitió evidenciar que
mientras el tratamiento con DXM parece inducir una
limitada mineralización del colágeno óseo cortical, sin
diferencias evidentes entre el colágeno de animales control
y OVX, en el caso de los cultivos sin DXM si se encuentra
una diferencia en la cantidad de mineral depositado, siendo
hasta 4 veces mayor el grado de mineralización de la matriz
proveniente de animales control en comparación con el
mineral depositado en la matriz de animales OVX.
Fig. 3.- Estudio cuantitativo con rojo de alizarina para determinar
calcio depositado sobre las matrices óseas. a) Matrices Corticales
de OVX y SHAM-op, b) matriz trabecular SHAM-op.
c) Estudio cuantitativo: control (derecha), tejido cortical
teñido con rojo de alizarina (izquierda)
Fig. 2 Actividad FA de las células con matriz ósea c/ DXM
( barras blancas ) y s/DXM (barras negras) de Tejido trabecular
del grupo SHAM-op, tejido Cortical del grupo SHAM-op , Tejido
Trabecular del grupo OVX a los 4 y 14 días de tratamiento.
a b
c
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IV. DISCUSION
Trabajos previos demostraron que el grado de
glicosilación del colágeno óseo se incrementa en animales
ovariectomizados, especialmente en el tejido óseo
trabecular, donde ocurre la pérdida de tejido óseo en forma
más pronunciada [1-3]. Siendo esta proteína la más
abundante en el tejido óseo y debido al papel tan importante
que ella ejerce el mantenimiento de este tejido, resulta de
gran importancia entender como el grado de glicosilación de
la matriz colagénica puede regular las funciones celulares
de las células que componen el hueso.
Al evaluar la adhesión se encontró que existen diferencias
en el reconocimiento temprano de la matriz (2 hrs) donde la
adhesión se hizo más pronunciadas en las matrices cortical y
trabecular de los animales control al compararlo con los
OVX. A pesar de que en el tiempo la tendencia de adhesión
se invierte, se puede decir que el grado de glicosilación de la
matriz rige este evento celular primario, como es la adhesión,
la cual a su vez es limitante para los siguientes eventos
celulares (proliferación y diferenciación).
Los resultados de evaluación de la actividad de FA
indican un proceso inicial mas marcado de diferenciación de
las células sembradas en presencia de colágeno óseo de
animales OVX, sin embargo pareciera, por los resultados
obtenidos de la deposición de mineral, que ese efecto
temprano de diferenciación no es determinante en el
proceso total de biomineralización.
La determinación cuantitativa de calcio realizada con Rojo
de alizarina en los cultivos sin tratamiento con DXM reveló
una cantidad mucho mayor de mineral depositado para las
tres tipos de matrices en estudio (cortical OVX, trabecular y
cortical SHAM). Esto es consecuente con lo reportado por
Wong et al [7] quienes hallaron un efecto estimulador de los
glucocorticoides (compuestos esteroideos) cuando éstos
están presentes desde el inicio del cultivo de células óseas,
pero un efecto inhibidor si son añadidos tras un período de
crecimiento celular in vitro. Se pudiera considerar incluso
que las células respondieron mejor en ausencia del esteroide
sintético (DXM) encontrándose en presencia del material. Sin
embargo las diferencias notables entre la matriz derivada de
animales OVX en comparación con los control (SHAM-op)
sugiere que el grado de glicosilación de la matriz pudiera estar
influenciado la efectividad del proceso de mineralización en
si mismo.
V. CONCLUSIONES
En conclusión, en el presente trabajo se muestran
evidencias que sugieren que las células óseas reconocen
diferencias en el grado de glicosilación de las matriz
colagénica de animales ovariectomizados en comparación
con los animales control y presentan respuestas celulares
diferentes como consecuencia de estas variaciones.
RECONOCIMIENTOS
La presente investigación fue financiada parcialmente
por fondos otorgados por el Decanato de Investigación y
Desarrollo de la Universidad Simón Bolívar, y por fondos
otorgados por el FONACIT (Proyectos G-2005000173,
G200100900 y LAB-2000001152). Agradecemos al
personal del bioterio de la Universidad Simón Bolívar,
especialmente al Sr. Luis Hidalgo.
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Autor de correspondencia:
Autor: Karem Noris-Suárez.
Instituto: Universidad Simón Bolívar.
Carretera Nacional de Baruta.
Ciudad: Caracas.
País: Venezuela.
E-mail: mailto:knoris@usb.ve
