ArticlePDF Available

Abstract

Melanoma research has a two decade history in Hungary and is based on three groups located at the National Institute of Oncology (NIO), the University of Debrecen (DU) and Semmelweis University (SU). Previously we have summarized the achievements of the NIO group in this Journal, now this paper summarizes the recent results of their collaborations. The research group of DU revealed several novel genetic alterations in the melanoma genome which might have clinical relevance as prognosticators or predictors in light of the novel target therapies. Data indicating unique, perhaps melanoma-specific epigenetic changes during progression might be even more important, identifying novel genes otherwise not detected as genetically altered ones. The research group in Budapest extensively used experimental human melanoma models and demonstrated the host sex as a key factor in progression due to the specific function of NK cells. Identification of functional glucocorticoid receptor in human melanoma might lead to therapeutic exploitation similar to certain leukemias. Studies on extracellular matrix revealed collagen XVII and CD44 splice variants as progression associated factors of melanoma. Since the double wild type genotype of melanoma is lacking effective therapy, data on the use of FGFR2, c-met or cannabinoid receptor as target can be important. On the other hand, experimental data on the antitumoral effects of heparin derivatives or bisphosphonate in melanoma models can also be encouraging.
275
Magyar Onkológia 59:275–281, 2015
Összefoglaló közlemény
Hazai melanomakutatások:
reményt keltő eredmények
egy korábban reménytelen daganatban
Balázs Margit,
1,2
Vízkeleti Laura,
1,2
Ecsedi Szilvia,
1,2
Ádány Róza,
1,2
só Erzsébet,
3
Hegedűs Balázs,
4
Ladányi Andrea,
5
Tóvári József,
5
Tímár József
3,4
1
MTA-DE Népegészségügyi Kutatócsoport,
2
Debreceni Egyetem Népegészgügyi Kar, Megelőző Orvostani Intézet, Debrecen,
3
Semmelweis Egyetem II. Sz. Patológiai Intézet,
4
MTA-SE Molekuris Onkológia Kutatócsoport,
5
Országos Onkológiai Intézet, Budapest
A hazai melanomakutatások immáron két évtizedes múltra tekintenek vissza és három hazai kutatócsoportnak köszönhetőek, melyek az Or-
szágos Onkológiai Intézetben, aSemmelweis Egyetemen és aDebreceni Egyetemen dolgoznak. Korábban e folyóiratban már beszámoltunk
az Országos Onkológiai Intézetben született eredményekről, ajelen közlemény együttműködésük újabb eredményeit mutatja be. Adebreceni
kutatócsoport asokszorosan mutált melanomagenom klinikai jelentőséggel rendelkező új, eddig még nem ismert hibáit figyelte meg, amelyek
jelentősége minden bizonnyal felértékelődik az egyre szélesebb körben alkalmazott célzott kezelések fényében. Kutatásaik külön értéke, hogy
felhívták afigyelmet amelanoma progressziója során bekövetkező sajátos epigenetikai változásokra, melyek nem járnak agének struktúrájának
további károsodásával, de azokhoz hasonló funkcionális következményekkel járnak. Abudapesti kutatócsoport elsősorban kísérleti rendsze-
reken dolgozott, és kimutatta agazdaszervezet nemének meghatározó szerepét amelanoma progressziójában, aminek háttere az NK-sejtek
hormonfüggő működése. Érdekes lehet aglükokortikoidreceptorok szerepének kimutatása is, amely bizonyos leukémiákhoz hasonló szereppel
bírhat melanomában. Évtizedes múltra tekint vissza amelanomamatrix-kutatás, amelynek újabb eredményei aXVII kollagén és aCD44v3 va-
riánsainak progressziót elősegítő szerepét igazolták. Amelanoma ún. kettős vad genotípusa még nem rendelkezik hatékony kezeléssel, ezért
izgalmas lehet ebből aszempontból az FGFR, ac-MET vagy akannabinoidreceptorok expressziójának terápiás kiaknása, amit akísérletes
rendszereken szerzett eredmények támogatnak. Ugyanakkor nem lebecsülendők aheparinszármazékok vagy abiszfoszfonát alkalmazásával
kapott antitumorális hatások sem, amelyek kiegészíthetik ajövőben acélzott terápiákat. Magyar Onkológia 59:275–281, 2015
Kulcsszavak: melanoma, progresszió, molekuláris markerek, mikrokörnyezet
Melanoma research has atwo decade history in Hungary and is based on three groups located at the National Institute of Oncology
(NIO), the University of Debrecen (DU) and Semmelweis University (SU). Previously we have summarized the achievements of the NIO
group in this Journal, now this paper summarizes the recent results of their collaborations. The research group of DU revealed several
novel genetic alterations in the melanoma genome which might have clinical relevance as prognosticators or predictors in light of the
novel target therapies. Data indicating unique, perhaps melanoma-specific epigenetic changes during progression might be even more
important, identifying novel genes otherwise not detected as genetically altered ones. The research group in Budapest extensively used
experimental human melanoma models and demonstrated the host sex as akey factor in progression due to the specific function of NK
cells. Identification of functional glucocorticoid receptor in human melanoma might lead to therapeutic exploitation similar to certain
leukemias. Studies on extracellular matrix revealed collagen XVII and CD44 splice variants as progression associated factors of melanoma.
Since the double wild type genotype of melanoma is lacking effective therapy, data on the use of FGFR2, c-met or cannabinoid receptor
as target can be important. On the other hand, experimental data on the antitumoral effects of heparin derivatives or bisphosphonate in
melanoma models can also be encouraging.
Balázs M, Vízkeleti L, Ecsedi S, Ádány R, Rásó E, Hegedűs B, Ladányi A, Tóvári J, Tímár J. Melanoma research in Hungary: promising results
in apreviously orphan tumor. Hungarian Oncology 59:275–281, 2015
Keywords: melanoma, progression, molecular markers, tumor microenvironment
Levelezési cím: Dr. Tímár József, Semmelweis Egyetem II. Sz. Patológiai Intézet, 1091 Budapest, Üllői út 93.
Tel.: 06-20-825-9685, e-mail: jtimar@gmail.com
Közlésre érkezett: 2015. október 8. • Elfogadva: 2015. október 25.
276
© Professional Publishing Hungary
Balázs és mtsai
BEVEZETÉS
A malignus melanoma az onkológia egyik legnagyobb ki-
hívása, mert szemben alegtöbb gyakori szolid daganattal,
genetikailag kemo- és surterápia-rezisztens. Ezzel páro-
sul az, hogy biológiailag a legagresszívebb rosszindulatú
daganat, amely az ún. T1-es, milliméteres stádiumban is
nem elenyésző százalékban végül is áttétes betegséggé fej-
lődik. Bár az elmúlt évek paradigmaváltást hoztak ennek
adaganatféleségnek akezelésében is a molekurisan cél-
zott és az immunterápia bevezetésével, ezek eredményei
az esetek csak igen kis százalékában tartósak. Hazánkban
amalignus melanoma nem szerepel aleggyakoribb rosszin-
dulatú daganatok között, mégis adaganathalálozáshoz je-
lentős ahozzájárulása. Bizonyos értelemben árva (orphan)
daganatnak tekinthető, ezért arákkutatás figyelmének nin-
csen (vagy nem volt) aközéppontjában. Különösen igaz ez
hankban, ahol maga a rákkutatás sem prioritás, és így
amelanomakutatás sem. Ennek ellenére az ellt évtized-
ben jelentős melanomakutatás folyt a Semmelweis Egye-
temen, aDebreceni Egyetemen és az Orsgos Onkológiai
Intézetben, amelyek eredményei nemzetközi hírűek ma
r. Korábban az Orsgos Onkológiai Intézethez köthető
immunonkológiai és molekuris patológiai kutatásokról
beszámoltunk (1, 2), ajelen tanulny akutatócsoportok
azóta sletett eredményeit foglalja össze abban aremény-
ben, hogy ezek legalább egy része hamarosan klinikai fel-
haszsra kerülhet, amennyiben ezek akutatások további
mogatást kapnak.
A MELANOMA PROGRESSZJÁNAK
MOLEKULÁRIS MARKEREI
DEBRECENI EGYETEM
Humán melanomaszöveteknél is jól ismert aheterogenitás
mind sejt-, mind molekuris szinten egyant. Az eltérő
molekuláris összetételű sejtklónok jelenléte ugyanazon da-
ganaton belül különböző biológiai kimenetelhez vezethet, je-
lentősen befolyásolva mind az alkalmazott terápia hatékony-
gát, mind pedig a betegség prognózisát, adaganatsejtek
invav tulajdonságát és áttétpző hajlamát. Amelanoma
egy olyan komplex daganatos betegség, mely mind moleku-
ris, mind fenotípusszinten egyaránt megjelenik. Az egy-
re elterjedtebbé váló nagy felbontású array technikák és az
elmúlt két évtized robbasszerű bioinformatikai fejlődése
ma már lehetővé teszi alönböző biológiai viselkedésű és
molekuris altípusú melanomaminták közötti molekuris
eltérések feltérképezését, anagy mennyiségű adatból bio-
giailag releváns információk kinyerését. Az eltérések közül
jól ismert, hogy a melanomák 5070%-ában kimutatható
aBRAF onkogén aktivációs mutációja, mely 80–90%-ban
a 600-as aminosavkodonon elhelyezkedő valin-lizin kon-
verziót jelenti (V600E). ABRAF gén mutációja mellett az
NRAS aktiváló mutációi (melanomák ~13–25%-a) – leg-
inkább a Q61 és G12 aminosavpozícióban – is egyre je-
lentősebb szerepet kapnak, többek között, mint jelátviteli
„kerülő út” amutáns BRAF fehérje inhibitorral szemben ki-
alakult rezisztencia során. Akét génmutáció jelenléte azon-
ban kirólagos egyedi sejt szinten, mivel mindkét onkogén
aRas/MAP-kiz jelátviteli lánc része, együttesen így nem
fordulnak elő (3). Korábbi tanulnyok során már bizo-
nyítást nyert az is, hogy bár aBRAF- vagy NRAS-mutációk
atumorfejlődés korai szakaszában már megjelennek, egye-
düli jelenlétük nem elegendő adaganat kialakulásához.
Vizsgálataink egyik fókuszpontja aBRAF- vagy NRAS-
mutációt hordozó és dupla vad típusú primer melanomák
géneltérés-mintázatai közötti különbségek feltárása volt
array komparatív genomhibridiciós (aCGH) technika
segítségével (4). Eredményeink szerint a BRAF-mutációt
hordozó daganatokban szignifikánsan magasabb agenomi
kópia szám-eltérések száma a dupla (BRAF és NRAS) vad
típusú melanomaszövetekhez képest. Az aktiváló mutá-
ció pedig elsősorban a 10q23-q26 régió vesztével, vala-
mint az 1q23-q25 lókusz és a 7-es kromoszóma többleté-
vel társulnak. A leggyakoribb nagymértékű amplifikációt
a7q36.3 régióban figyeltük meg, ahol aPTPRN2 onkogén
lokalidik (4). Ennek a génnek a szerepét kiterjedten
vizsgálták más típusú daganatokban (pl. emlődaganatok),
melyekben a géntermék inhibíciójával sikeresen tudták
csökkenteni az áttétek számát. Ugyanakkor a 11q23-q25
szekvencia deléciója elsősorban az NRAS-mutációval mutat
összefüggést (4). Az itt elhelyezkedő OPCML gén terméke
a tirozinkiz-receptorok gátlán keresztül fejti ki hatá-
sát. A másik gyakori, NRAS-mutációhoz kapcsolt eltérés
a17p13.3 kromoszomális régió deléciója, ahol akét nemré-
gen azonosított tumorszuppresszor gén (HIC1 és OVCA1)
deléciója mellett a lókusz hemizigóta állapota sejtciklus-
deregulációt vált ki és tumorigenezist indukál (4). A6p22.3
(E2F3) többlete, valamint a9p21 (CDKN2A) régió vesztése
ugyanakkor gyakrabban fordul elő aBRAF- vagy NRAS-
mutációt hordozó melanomákban adupla vad típusúakkal
szemben, mely utóbbiakat leginkább a 17-es (17q24-q25-
amplifikác) és a 4-es (4q23-q25-hny) kromoszómák
gyakori kópiaszám-eltérései jellemzik (4). A9p21-es lókusz
familris melanomákban gyakori vesztését a sporadikus
melanomák progressziója során munkacsoportunk már egy
korábbi tanulnyában vizsgálta. Ateljes lókusz deléciója
avizsgált minták nagy százalékában (84%) jelent meg stá-
diumtól függetlenül és főként heterozigóciavesztés for-
jában (5). Vagyis aMAPK útvonal sérülése együtt a9p21-es
régió veszsével fontos lehet akedvezőtlen biológiai kime-
netel létrejötben.
277
Magyar Onkológia 59:275–281, 2015
Hazai melanomakutatás
Kután primer melanomákon végzett aCGH-vizsgálataink
aCCND1 onkogént kódoló 11q13-as régió gyakori kópia-
számtöbbletét is kimutatta. Ezért az onkogén szerepének
részletes vizsgálatát is elvégeztük. Agén amplifikációja ösz-
szefüggést mutatott amelanoma számos ismert klasszikus
prognosztikai markerével és a kedvezőtlen klinikai kime-
netelt eredményező klinikai paraméterrel, mint a primer
melanomaszövet felszíni kifekélyesedése vagy áttétképzése.
Megfigyeltük, hogy a CCND1-génamplifikációt tartalma-
zó mintákl a beteg 5 éves túlélési esélyei is rosszabbak,
valamint eredményeink szerint a többszörös áttétpző
(regionális és egy vagy több távoli szervi metaszzis) min-
kban kifejezettebb az amplifikáció jelenléte (6). Mivel
a napsugárs ultraibolya-tartománya jól ismert exogén
faktor a melanomák adott csoportjainak kialakusában,
ezért fontosnak tartottuk meghatározni aCCND1-eltérések
szerepét annak függvényében is, hogy atestfelület külön-
böző részein megjelenő melanomák milyen mértékben
vannak napsugárzásnak kitéve. Megfigyelésünk szerint
a CCND1-amplifikációval és fokozott mRNS-szinttel jel-
lemezhető minták a testfelület azon részén jelentek meg,
melyek krónikus napsugárs által voltak exponálva. Fon-
tos megjegyezni, hogy ezekben a mintákban csak ritn
fordultak elő aBRAF és/vagy NRAS onkogének mutációi.
ACCND1 onkogén fokozott expresszióját fehérjeszinten is
megfigyeltük aprogresszió előrehaladásával, bár ez kevés-
bé volt kifejezett (6). ACCND1 onkogén ugyanakkor egy
olyan amplifikációs klaszterben lokalizálódik, melyben öt
potenciális onkogén hatása is jelentkezhet. Vizsgálataink
szerint a13q14 amplifikációs klaszterben aCCND1 génnel
együtt több kandidáns gén (TAOS1, FGF3, FGF4, FGF19
és EMS1) ko-amplifikációja is előfordul (3). Megfigyeltük,
hogy ezeknek agéneknek az együttes amplifikációja első-
sorban a rosszabb prognózist eredményező daganatokra
jellemző. Ezek közül agének közül aCCND1 és TAOS1 gé-
nek együttes emelkedett géndózisa aminták kb. 15%-ában
mutatható ki. Akettős amplifikációt mutató minták dön
többségének a felszíne kifekélyesedett volt. A TAOS1 gén
asejtcikluskontrollban és asejtproliferáció szalyozában
játszik szerepet, és aCCND1-gyel kooperálva valószínűleg
egy agresszívabb fenotípus kialakításához járul hozzá (3).
Mivel agének, illetve az általuk kódolt fehérjék elsősor-
ban más molekukkal való interakciókon keresztül fejtik
ki hatásukat, az eltéréseket ajelátviteli útvonalak szintjén
is vizsltuk. A BRAF-mutációt hordozó daganatokban
leg gyak rabban az EGF/MAPK és JAK jelátviteli útvonalak
közötti interakcióban részt vevő fehérjéket kódoló gének sé-
lnek, de hasonló mintázat figyelhető meg aMAPK-IGF
és JAK-IGF útvonalak között is (4). Ezek közé agének közé
számos jól ismert (pl. EGFR, PI3K vagy JNKK2) és kevés
ismert (pl. PEA15, ELK4 vagy SHC1) onkogén tartozik. To-
vábbá aBRAF-mutáció jelenléte egy sajátos deléciós min-
zattal is társul, melyek közül a PTEN, JNK1 és HVH-3
gének együttes deléciója szembenő. Ellentétben aPTEN
tumorszuppresszor génnel, a JNK1 és HVH-3 gének
melanomaprogresszióban betöltött szerepéről viszonylag
kevés információ áll rendelkezésünkre.
Annak ellenére, hogy az NRAS és BRAF onkogének mu-
tációi egyazon jelátviteli útvonal konstans aktivációjában
vesznek részt, aprimer melanomák kialakulása és fejlődése
során eltérő genetikai alterációkkal kooperálnak (1. ábra).
Ez amelanoma progressziója során tapasztalt jelenség rend-
kívül figyelemre méltó, hiszen arra utalhat, hogy aBRAF- és
NRAS-mutációk egyfajta vezérlő szerepet töltenek be az al-
ternatív genetikai útvonalakat feltételező melanomagenezis
során. Ezeknek az eltéréseknek afelismerése új, célzott te-
rápiás célpontok azonosítására nyújt lehetőséget amutációk
hatának gyengítését célzó kezelések mellett, mint aközel-
múltban elfogadott mutáns BRAFV600E fehérje működését
célzó molekuris terápia (vemurafenib).
A mutáns BRAF-molekulát célzó gyógyszeres kezelés
egyik fő hátránya a korán (átlagosan 6 hónap) kialaku
rezisztencia. Ezért munkacsoportunk jelenleg folytat vizs-
latokat többek között arezisztencia hátterében álló elté-
rések feltérképesére. Saját eddigi és más kutatócsoportok
eredményei által már ismert, hogy az egyik elkerülő mecha-
nizmus aCRAF és NRAS molekuk érintettségén kívül az
EGFR onkogén (7p12) expressziójának extrém fokozódása
akorábban EGFR-negatív mintákban is. Egy korábbi tanul-
nyunkban már felfigyeltünk az EGFR kiemelkedő sze-
repére aprimer melanoma progressziója során, ahol agén
kópiaszámtöbblete és fokozott génexpressziója legbbször
rossz prognózissal társult (7). Agénkópiaszám és mRNS-
1. ábra. A BRAF- és NRAS-mutációs alcsoportokhoz tartozó
leggyakoribb kópiaszám-eltérések. Afelfelé mutató nyilak az
adott kromoszomális régió vagy génkópiaszám növekedését/
amplifikációját vagy csökkenését/delécióját jelzik (4)
BRAF
mut
NRAS
mut
7 chr
1q23-q25
EGFR, PI3K, JNKK2
10q
PTEN, HVH-3, JNK1
11q23.3-q25
17p13.3
6q25.3-q27
Kevésbé gyakori
7 chr többlet
9p21
8q24
278
© Professional Publishing Hungary
Balázs és mtsai
expressziós szintek között lineáris kapcsolat azonban nem
minden esetben volt kimutatható. Ennek számos oka lehet,
többek között az, hogy az EGFR-géntöbblet önmagában
nem feltétlenül bír erős prognosztikai jelentőséggel. Afoko-
zott genetikai instabilitásnak köszönhetően gyakran ateljes
7-es kromoszóma vagy akromoszóma egy jelentős része sé-
l aprogresszió során, melynek eredménye az lesz, hogy
az EGFR génnel együtt amplifidó gének hatása is ér-
nyesül. Eredményeink alapján az EGFR kópiaszámtöbblete
prognosztikai markere lehet az áttétképzésnek és aterápia
megválasztását is befolyásolhatja, de ugyanakkor fontos,
hogy az extra génkópiával rendelkező mintákban az mRNS-
és/vagy fehérjeszintek is meghatározásra kerüljenek (7).
A 7-es kromoszóma eltéréseinek elemse során a7p12-
es régió alterációi mellett a 7q31-es régió gyakori eltéré-
seit is megfigyeltük. Ez a DNS-szekvencia egy rendkívül
„génsűrű” szakasz, melyen a FRA7G „törékeny pont” he-
lyezkedik el. Eredményeink alapján ennek eltérései hoz-
zájárulnak a melanomák kedvezőtlen klinikai kimenete-
léhez (8). A fragilis DNS-régiók szerkezetükből kifolyólag
instabilak és gyakori célpontjai a progresszió során bekö-
vetkező kromoszomális töréseknek és átrendeződéseknek.
Az ezeken a szekvenciákon elhelyezkedő gének eltérései
mind deléció és/vagy amplifició, mind pedig normá-
lis kópiaszám melletti heterozigótaságvesztés (anyai vagy
apai allél elvesztése) formájában gyakori eltérések. Mun-
kacsoportunk ezért a FRA7G „törékeny pont” közvetlen
közelében lokalizált gének, mint a multifunkciós CAV1
(membránlipidtutajok alapköve) és a tumorszuppresszor
TES eltéréseit is vizsgálta. ATES, annak ellenére, hogy csök-
kent mRNS-szintje szignifikánsan jelenik meg atöbbszörös
áttétképző mintákban, az általunk vizsgált mintakohortban
nem mutatott jelentős prognosztikai szerepet. Eltérése fel-
tehetőleg afokozott kromoszomális/genominstabilitás mel-
lékhatának tekinthető. Ezzel szemben a CAV1 mRNS-
szintje a tumor vastagságának növekedésével fokozódott,
ez a kapcsolat fehérjeszinten is jelentkezett, ami a CAV1-
eltérést mutató daganatsejtek invázióban betöltött lehet-
séges szerepére utalhat, így segítve elő az áttétképzést (8).
Ezt támasztják alá amunkacsoportunk által jelenleg sejtvo-
nal modellrendszeren végzett vizsgálatok is, melyek során
aCAV1 fokozott expresszióját mind mRNS-, mind fehérje-
szinten kimutattuk.
A nagy felbonsú genomarray (array CGH) vizsgála-
tok mellett génexpressziós csip elemzéseket is végeztünk.
Génexpressziós vizsgálataink alapján megállapítottuk, hogy
afelszíni kifekélyesedéssel jellemezhető primer mela noma-
mintákban egy 987 génből álló downreguciós klaszter fi-
gyelhető meg. Ezeknek agéneknek mindössze 15%-a (150
gén) mutat valamilyen mértékű deléciót, melyek többsége
a6q és 10q kromoszómaszekvenciákon lokalilódik, befo-
lyásolva asejt-sejt és sejt-mátrix kapcsolatokat, valamint az
apoptózis szabályozását is. További 11 (~1%) génnél agének
alulszabályozásának hátterében epigenetikai folyamatok,
géncsendesítés áll (9). Az „alulszabályozott” génklaszter
mellett 93 génre jelentős mRNS-expressziós szintbeli növe-
kedést is megfigyeltünk. Ezek közül alegnagyobb változást
az oszteopontin (OPN) mutatta, melyet fehérjeszinten is
sikerült megerősíteni (9). Afehérje kifejeződését avizsgált
primer melanomák 90%-ában kimutattuk. Klinikai ada-
tokkal történt korrelációs analízisünk szerint a fokozódó
OPN-expressziós szintek kedvezőtlenül befolyásolják abe-
tegség kimenetelét (10).
EPIGENETIKAI ELTÉRÉSEK
MELANOMÁKBAN DEBRECENI EGYETEM
A genetikai eltéréseken kívül a daganatok kialakulásában
és progressziójában igen fontos szerepet játszhatnak az
epigenetikai változások, melyek közül alegjobban tanul-
nyozott és legstabilabb, öröklődő forma a DNS-metiláció.
A gének promoterrégióin gyakori ún. CpG-szigeteken
elő forduló hipermetiláció direkt módon akadályozhat-
ja a génátíst, ezért jelenleg intenzív kutatások tárgya.
Amela no mák hipermetilációjának vizsgálata eddig mind-
össze kandidáns gén megközelítéssel vagy olyan globá-
lis, de indirekt módszerekkel történt, melyek során első-
ként vizsgálták a teljes genom génexpresszióját, majd egy
agresszív demetilációs kezelést követően újra elemezték
a n expressziós mintázatot, ezzel közvetve azonosították
az eredeti állapotban hipermetilt géneket. Mivel a ge-
nom nagyobb részét analiló korábbi metilációs tanul-
nyok amelanomák és aszomszédos norlis szövetek
vonat kozásában végeztek összehasonlító vizsgálatokat,
munka csoportunk arra a kérdésre kereste a laszt, hogy
amela nomagenom epigenetikai mintázata változik-e ada-
ganatprogresszió különböző szakaszaiban.
Lokalilt DNS-metilációs eredményeink értékelése so-
n részletesen tanulmányoztuk az ismert klinikai para-
tereket (Breslow-vastagság, áttétpzés, ulceráció és szöveti
altípus) jellemző metilációs mintázatot. Összesen 111 egye-
di gént érintett az egyes csoportok között felismert eltérő
metilációs mintázat. Eredményeink szerint a progresszió
folyamatát leginkább ametiláció csökkenése jellemzi, DNS-
hipermetilációra lényegesen kevesebb példát találtunk.
Megállapítottuk, hogy akülönböző klinikai paramétereket
jellegzetesen egyedi meticiós mintázat jellemzi (11).
Terápiás jelentősége miatt részletesen vizsgáltuk
a BRAFV600E mutáció és a DNS-metiláció kapcsolatát.
A mutációval asszoclódó megváltozott metilációjú gé-
nek többsége hipermetilódott, és a sejtkommunició-
ban, továbbá az extracelluláris mátrix receptor interakció-
279
Magyar Onkológia 59:275–281, 2015
Hazai melanomakutatás
ban játszott szerepet, ugyanakkor kevés átfedést mutatott
a négy klinikai paraterrel összefüggő, összesen 111
metilt génnel (ld. fentebb). A jelenség így a mutáció
egyedi vezérlő szerepét veti fel aDNS-metiláció szabályo-
ban, mely jelenleg további vizslatok tárgyát képezi
(11). Vizsgáltuk továbbá aDNS-metiláció és amelanomás
betegek 5 éves túlélése közötti kapcsolatot. Aklinikai pa-
raméterekre korrigálva egyetlen génnél, aKIT génnél lát-
tunk példát arra, hogy ahipermetiláció csökkent túlélési
eséllyel társul (11).
Párhuzamos génkópiaszám-vizsgálatainkkal kimu-
tattuk, hogy a metilációs mintázatot fenntartó enzimet
(DNMT1) kódoló gént tartalmazó 19p13.2-es szakasz
a vastagabb daganatokban (Breslow-vastagság >4 mm)
deléciót szenved. Eredményeink alapján valószínűsíthető,
hogy a DNMT1 gén deléciója hozzájárul a korábban em-
lített transzpozon, továbbá génpromoter-régiókat érintő
hipo meti lációs tendenciához. A Knudson-féle „two-hit”
hipotézis értelmében a megváltozott génexpressziós min-
zathoz egyszerre több szomatikus DNS-változás is szük-
séges. Promotermetilációs eredményeinket génkópiaszám-
adatainkkal integlva megállapítottuk, hogy a 6q23-as
szakaszon lokalizálódó MYB és az EYA4 géneknél a két
lönböző szomatikus DNS-alteráció (deléció és DNS-
hipermetiláció) afent említett hipotézis értelmében együt-
tesen alakítja ki amelanomák megltozott génexpressziós
fenotípusát. A6q23-as szakasz delécióját FISH-vizslattal
is megerősítettük (11).
A lokalilt hipermetició mellett máig alábecsült az ún.
genomszintű hipometiláció jelensége, melyet sokáig akar-
cinogenezis passzív következményeként írtak le. Később
azonban emlődaganatokban sikerült bizonyítani, hogy egy
akv és inyított folyamat, mely atumorigenezis korai sza-
kaszában is jelentkezhet, ezért további vizsgálatokra érde-
mes kandidáns diagnosztikai markerként értelmezhetk.
Agenomszintű hipometiláció – kialakunak okától füg-
getlenül – hozzájárul a valamennyi daganattípust jellem-
ző genetikai instabilitáshoz az ún. ismétlődő szekvenciák
demetilációja által. Ezek az ismétlődő szekvenciák olyan
mozgékony genetikai elemek, melyek az evolúció során
épültek ahun genomba, ahol ateljes genetikai anyag több
mint 40%-át képviselik. Ahumán genomban metiltguk
révén maradhatnak védve a génátíródástól, metilációjuk
megszűnése egyúttal aktivációjukat is jelenti, mely erős
homológiájukat tekintve rekombinációs események soro-
zatát indítja el. Ez utóbbi további deléciókat és inszerciókat
kialakítva jelentősen hozzájárul akariotípusos instabilitás-
hoz. Vizslataink során a LINE1 transzpozonszekvencia
promoterrégióján talható 6 CpG pontmetilációját hatá-
roztuk meg Na-biszulfit piroszekvenással. Eredményeink
alapján az 5 éven belül áttétet képző melanomákat markáns
transzpozonális demetiláció jellemezi. Ez ajelenség képez-
heti ajövőben egy LINE1 transzpozonmetilációt célzó diag-
nosztikai vagy predikciós teszt kidolgozását (12).
A GAZDASZERVEZET NEMÉNEK SZEREPE
AMELANOMA PROGRESSZIÓJÁBAN
SEMMELWEIS EGYETEM, ORSZÁGOS
ONKOLÓGIAI INTÉZET
Klinikailag ismert, hogy anői nem kedvező prognosztikai
tényező malignus melanoma esetében, bár ennek alapjai
nem ismertek. Korábban felmerült kísérleti modellekben,
hogy anemi hormonok befolyásolhatják amelanoma bio-
lógiai viselkedését, de akísérleti adatok ellentmondásosak
voltak. Humán melanoma májmetaszzis állatkísérleti mo-
delljében (SCID egér) korábban már megfigyeltük, hogy az
áttétképzés hatékonysága gyengébb anőstény hordozókban
(13). A kérdést tovább vizslva kiderült, hogy a jelenség
csak amájáttétpzésre vonatkozik, más szervek esetében
nem észlelhető. Felmerült az, hogy amelanomasejtek funk-
cionálisan aktív nemihormon-receptorral rendelkeznek.
Vizsgálataink szerint emberi melanomákban az ösztrogén-
és androgénreceptorok fehérjeszinten nem, vagy csak igen
alacsony szinten expresszálódnak, így asexhormonok nem
hatnak közvetlenül adaganatsejtekre, ezért agazdaszerve-
zet egyes sejtjeire terelődött az antimetasztatikus aktivitás
gyanúja. Vizslataink amáj Kupffer- és NK-sejtjeire irá-
nyultak, és igazoltuk, hogy kísérleti állatokban mindket-
tőnek van jelentős antimetasztatikus aktivitása, de csak az
NK-sejtek szerepe függ anemtől, ezek asejtek aktívabbak
anőstényekben. Ezt amegfigyelést NK-sejt nélküli kísérleti
állatokban is igazolni lehetett. Bár e megfigyeléseinknek nem
lett nagyobb nemzetközi visszhangja, az immunonkológiai
kezelési protokollok bevonulása amindennapi klinikai gya-
korlatba megltoztathatja ezt a helyzetet. Feltételezhető,
hogy acélzott immunstimulációs kezelések (anti-CTLA4 és
anti-PD-1 antitestek) klinikai aktivitását abeteg neme befo-
lyásolhatja. Hogy ez csak amájáttétpzésre vagy más szer-
vi áttétekre is vonatkozik, további klinikai kutatások tárgya
kell, hogy legyen (13).
Munkacsoportunk e vizsgálatok során felfigyelt az embe-
ri melanomasejtekben agkokortikoidreceptor(ok) mRNS-
és fehérjeszintű kifejeződésére. AGCR funkcioná lisan ak-
vnak bizonyult, az emberi melanomasejtek érzékenynek
bizonyultak dexametazonra, amelynek proli feráció gátló,
de főleg apoptózisindukáló hatása volt. Ag ko kor tikoidok
sokféle módon képesek befolyásolni a daganat és a gaz-
daszervezet kölcsönhatásait. Egyrészt ismert az immun-
szuppresszív hatásuk, amit főleg az autoimmun betegségek-
ben akznak ki. Másrészt azonban számos daganatellenes
terápiás protokoll része a szteroidkezelés. Felmerül, hogy
280
© Professional Publishing Hungary
Balázs és mtsai
melanoma esetében a dexametazonkezelés citosztatikus
hatású lehetne, aminek jelentőségét nem lehet alábecsülni
ebben a kemorezisztens daganatban. Ezzel kapcsolatban
fontos lehet, hogy in vitro a DTIC-kezelés antiproliferatív
hatásait dexametazonnal fokozni lehetett (14).
EXTRACELLULÁRIS MÁTRIX FEHÉRJÉK
VAGY RECEPTORAIK PROGNOSZTIKUS
SZEREPE SEMMELWEIS EGYETEM
A transzmembrán kollagén XVII (cXVIIwt) a bőrhám
fontos mátrixreceptora, amely a msejtekben van jelen.
Kiderült, hogy bár nyugvó melanocitákban nincsen je-
len ez a fehérje, proliferáló sejtekben megjelenik. Emberi
melanomákban acXVII gén mutációt szenved el, amely az
ektodomént érinti. Emiatt diszplasztikus naevusokban és
melanomákban csak acitoplazmatikus része van jelen afe-
hérjének, ami alkalmassá teszi felhasznását amindenna-
pi rutin patológiai diagnosztikában. Legalább ilyen fontos
megfigyelés az is, hogy a citoplazmatikus cXVII szakasz
elleni antitesttel emberi melanomákban in vitro apoptózis
indukálható (15).
Néhány gént úgy ismerünk, mint az áttétképzés onko génje
(metasztázisgén), ezek közül elsőként azonosították ilyen-
nek aCD44 proteoglint, amely kondroitin- és heparán-
szulfáttal (HS) glikalódhat. A CD44-nek 10 variábilis
exonja van, és a hasítási variabilitás eredményeként igen
sokféle fehérjét kódolhat, amely mátrixreceptorként vagy
segítő növekedési faktor receptorként szolgálhat. Korábbi
vizsgálatainkban aHS variáns CD44v3 exon expresszióját
észleltük emberi melanomában, és kimutattuk kedvezőtlen
prognosztikus szerepét (16). Újgenerációs szekvenás segít-
ségével ateljes CD44-variabilitást elemeztük különféle da-
ganatokban, közöttük emberi melanomában, és jellegzetes
melanomahasítási mintázatot detektáltunk. In vivo spontán
áttétképzési modellben megállapítható volt, hogy az áttét-
képző emberi melanomasejtekben jelentősen emelkedik
a melanoma CD44-expressziója, amelyben a v3-tartal
variánsok vannak jelen döntően. E megfigyeléseink arra
utalnak, hogy melanoma esetében a CD44 HS-tartal
hasítási varnsai metaszzisképződést elősegítő szereppel
rendelkeznek.
ÚJ MELANOMAKEZELÉSI LEHETŐSÉGEK
PREKLINIKAI MODELLEKBEN
SEMMELWEIS EGYETEM, ORSZÁGOS
ONKOLÓGIAI INTÉZET
Ismert aheparin daganatellenes hatása klinikai körül-
nyek között, de ennek pontos mechanizmusa, az ezért fe-
lelős kémiai struktúra nem. 4–22 tagú, heparineredetű
poliszacharidok biológiai hatásait teszteltük in vitro és in
vivo emberi melanomasejteken. A legtöbb fragmens je-
lentős antimigrációs hatásúnak bizonyult, míg csak egy,
a dp18 rendelkezett antiproliferatív hatással is. Feltű
volt, hogy az antimigrációs hatás a melanoma CD44v3
receptorán keresztül valósult meg. Ami talán még érde-
kesebb, hogy in vivo körülmények között a dp4 és dp18
heparinfragmensek antimetasztatikus hatának bizonyul-
tak kísérleti állatokban. Ezek a vizsgálatok arra utalnak,
hogy aheparinsrmazékoknak jelentős daganatellenes ha-
sai lehetnek emberi melanoma esetében (17).
Az EGF- és az FGF-receptorok működéséhez elen-
gedhetetlen a heparánszulfát-tartalmú segédreceptorok,
mint a CD44 segítő szerepe. Normális melanocitákban,
de mela noma sejtekben is jelen van és működhet az EGF-
és FGF-receptor. Ugyanakkor a melanomáknak három
nagy molekuris alcsoportját ismerk, aBRAF-, NRAS-
mutánsokat és a kettős vad genotípust. Kérdéses ugyan-
akkor, hogy a molekuláris altípusok befolyásolják-e e re-
ceptorok működését. Kísérleti rendszerekben kimutattuk,
hogy mind az EGF, mind pedig az FGF2 stimulálja az em-
beri melanomasejteket, de aBRAF- vagy NRAS-mutációs
státusz lecsökkenti ezt a realóképességet. Feltűnő volt,
hogy az EGF és FGF2 elsősorban motilitási választ ge-
nerált emberi melanomasejtekben, melynek fő jelpályája
aMAPK útvonal volt. Ahogyan az várható volt, EGFR és
FGFR tirozinkiz-inhibitorok csak a kettős vad státuszú
daganatsejtekben hatottak, míg a mutánsok rezisztensnek
bizonyultak. Ezek amegfigyelések ráinyítják afigyelmet
amelanomák legkisebb, mintegy 20–30%-át adó moleku-
ris altípus lehetséges új célzott terápiájára (18).
A kannabinoidok esetleges orvosi alkalmasa ma in-
ten zív kutatások tárgya. Miután a melanociták neuro-
ektodermális eredetűek, felmerült, hogy daganataik,
a mela nomák, esetleg rendelkeznek endokannabinoid-
recep torral. Vizsgálataink szerint különböző moleku-
ris alcsoportba tartozó emberi melanoma-sejtvonalakban
expresszá lódik aCNR1 gén és fehérjeterméke, aCB1-recep-
tor, amelyet asejtmembránban is ki lehet mutatni. ACB1-
receptor funkcionálisan aktívnak bizonyult, és természetes
vagy mesterséges ligandumai antiproliferatív, antimigrációs
és proapoptotikus hatást váltottak ki in vitro emberi
melanoma-sejtvonalakban. Ami ennél még biztatóbb, az az,
hogy in vivo az egyik mesterséges ligandum, az ACEA, gá-
tolni volt képes amelanoma májáttétpző képességét. Ezek
akísérletes eredmények azokat amegfigyeléseket erősítik,
hogy a kannabinoidoknak ismert fájdalomcsillapító hatá-
suk mellett specifikus daganatellenes hatásuk is lehet (19).
A RAS-mutáns daganatok ma a legnagyobb kihívást
jelentik az onkológiában, mert acélzott terápiára rezisz-
tensek: ez ahelyzet az NRAS-mutáns melanoma esetében
281
Magyar Onkológia 59:275–281, 2015
Hazai melanomakutatás
is. Számos próbálkozás történt aRas fehérje funkciójának
blokkolására, de ezek nem bizonyultak sikeresnek. Az
egyik ilyen elpzelés az volt, hogy aRas fehérje memb-
nhoz történő kihorgonyozódását biztosító farnezilációt
blokkolják, azonban alternatív prenilációs mechaniz-
musok ezt megakadályozták. A klinikai gyakorlatban
manapság kiterjedten haszlnak egy prenilációgátlót,
az aminobiszfoszfonátot, amelynek biológiai hatása-
it elemeztük emberi melanoma-sejtvonalakban. Az
aminobiszfoszfonát-kezelés elsősorban az NRAS-muns
melanomasejtekben indukált apop tózist, és gátolta
a klonogén túlélő képességet, míg a BRAF-mutáns vagy
dupla vad sejtekre alig volt hatással. Ezek az eredmények
arra utalnak, hogy szemben más rendszerekkel, az NRAS-
mutáns melanoma sejtek érzékenyek a preni láció gát lással
szemben, ami felveti annak a lehetőségét, hogy ezen az
úton elindulva célzott terápiákat lehessen fejleszteni erre
amolekuris altípusra is (20).
A CMET onkogén fehérje terméke, a c-met protein
manapság válik egy lehetséges daganatellenes terápia cél-
pontjává. Ismeretes, hogy melanociták migrációs képes-
ségét a c-met szabályozza/mediálja. Emberi melanoma-
sejtvonalakban aCMET vad típusú, a korábban publilt
tirozinkiz- vagy extracelluris domén génhibák egyikét
sem tartalmazták. Ennek ellenére ezekben a sejtvonalak-
ban a c-met proteinkináz konstitutívan aktívnak bizo-
nyult. A specifikus met-kináz-gátló SU11274 blokkolta
ac-met protein autofoszforilációját, és antiproliferatív ha-
nak bizonyult, amit elsősorban apoptózisindukcióval
lehetett magyarázni. Ezen túlmenően, a c-met gátsa
amelanomasejtek in vitro migrációját is gátolta. ASU11274
akvnak bizonyult in vivo humán melanoma kísérletes
májáttétképzési modelljében, ahol mind aprimer, mind pe-
dig az áttéti daganatra hatott (21).
IRODALOM
1. Rásó E, Barbai T, Győrffy B, Tír J. Amalignus melanoma prognosz-
tikus és predikv markerei. Magyar Onkológia 57:79–83, 2013
2. Ladányi A. A tumort infiltráló immunsejtek prognosztikai értéke
melanomában. Magyar Onkológia 57:85–95, 2013
3. zár V, Ecsedi S, Szöllősi AG, et al. Characterization of candidate gene
copy number alterations in the 11q13 region along with BRAF and NRAS
mutations in human melanoma. Mod Pathol 22:1367–1378, 2009
4. Lázár V, Ecsedi S, Vízkeleti L, et al. Marked genetic differences be-
tween BRAF and NRAS mutated primary melanomas as revealed by array
comparative genomic hybridization. Melanoma Res 22:202–214, 2012
5. kosy Z, Vízkeleti L, Ecsedi S, et al. Characterization of 9p21 copy
number alterations in human melanoma by fluorescence in situ hybrid-
ization. Cancer Genet Cytogenet 182:116121, 2008
6. Vízkeleti L, Ecsedi S, Rákosy Z, et al. The role of CCND1 alterations
during the progression of cutaneous malignant melanoma. Tumor Biol
33:2189–2199, 2012
7. Rákosy Z, Vízkeleti L, Ecsedi S, et al. EGFR gene copy number altera-
tions in primary cutaneous malignant melanomas are associated with
poor prognosis. Int J Cancer 121:17291737, 2007
8. Vízkeleti L, Ecsedi S, Rákosy Z, et al. Prognostic relevance of the ex-
pressions of CAV1 and TES genes on 7q31 in melanoma. Front Biosci
(Elite Ed) 4:1802–1812, 2012
9. kosy Z, Ecsedi S, Tóth R, et al. Integrative genomics identifies gene
signature associated with melanoma ulceration. Plos One 8:e54958, 2013
10. Kiss T, Ecsedi S, Vizkeleti L, et al. The role of osteopontin expression
in melanoma progression. Tumour Biol 36:7841-7847, 2015
11. Ecsedi S, Hernandez-Vargas H, Lima SC, et al. DNA methylation
characteristics of primary melanomas with distinct biological behaviour.
PlosOne 9: e96612, 2014
12. Ecsedi S, Hernandez-Vargas H, Lima SC, et al. Transposable hypo-
methylation is associated with metastatic capacity of primary melano-
mas. Int J Clin Exp Pathol 6:2943–2948, 2013
13. Dobos J, Mohos A, Tóvári J, et al. Sex-dependent liver colonization of
human melanoma in SCID mice – role of host defense mechanisms. Clin
Exp Metastasis 30:497–506, 2013
14. Dobos J, Kenessey I, Tír J, Ladányi A. Glucocorticoid receptor ex-
pression and antiproliferative effect of dexamethasone on human mela-
noma cells. Pathol Oncol Res 17:729–734, 2011
15. Krenacs T, Kiszner G, Stelkovics E, et al. Collagen XVII is expressed in
malignant but not in benign melanocytic tumors and it can mediate anti-
body induced melanoma apoptosis. Histochem Cell Biol 138:653667, 2012
16. Raso-Barnett L, Banky B, Barbai T, et al. Demonstration of amelano-
ma-specific CD44 alternative splicing pattern that remains qualitatively
stable, but shows quantitative changes during tumour progression. PloS
One 8:e53883, 2013
17. Kenessey I, Simon E, Futosi K, et al. Antimigratory and antimetastatic
effect of heparin-derived 4-18 unit oligosaccharides in apreclinical human
melanoma metastasis model. Thromb Haemost 102:12651273, 2009
18. Garay T, Molnar E, Juhasz E, et al. Sensitivity of melanoma cells to
EGFR and FGFR activation but not inhibition is influenced by oncogenic
BRAF and NRAS mutations. Pathol Oncol Res 21:957-968, 2015
19. Kenessey I, Bánki B, Márk Á, et al. Revisiting CB1 receptor as drug
target in human melanoma. Pathol Oncol Res 18:857–866, 2012
20. Garay T, Kenessey I, Molr E, et al. Prenylation inhibition-induced
cell death in melanoma: reduced sensitivity in BRAF mutant/PTEN wild-
type melanoma cells. PloS One 10:e0117021, 2015
21. Kenessey I, Keszthelyi M, Krámer Z, et al. Inhibition of c-Met with
the specific small molecule tyrosine kinase inhibitor SU11274 decreases
growth and metastasis formation of experimental human melanoma.
Curr Cancer Drug Targets 10:332–342, 2010
ResearchGate has not been able to resolve any citations for this publication.
Article
Full-text available
While targeted therapy brought a new era in the treatment of BRAF mutant melanoma, therapeutic options for non-BRAF mutant cases are still limited. In order to explore the antitumor activity of prenylation inhibition we investigated the response to zoledronic acid treatment in thirteen human melanoma cell lines with known BRAF, NRAS and PTEN mutational status. Effect of zoledronic acid on proliferation, clonogenic potential, apoptosis and migration of melanoma cells as well as the activation of downstream elements of the RAS/RAF pathway were investigated in vitro with SRB, TUNEL and PARP cleavage assays and videomicroscopy and immunoblot measurements, respectively. Subcutaneous and spleen-to-liver colonization xenograft mouse models were used to evaluate the influence of zoledronic acid treatment on primary and disseminated tumor growth of melanoma cells in vivo. Zoledronic acid more efficiently decreased short-term in vitro viability in NRAS mutant cells when compared to BRAF mutant and BRAF/NRAS wild-type cells. In line with this finding, following treatment decreased activation of ribosomal protein S6 was found in NRAS mutant cells. Zoledronic acid demonstrated no significant synergism in cell viability inhibition or apoptosis induction with cisplatin or DTIC treatment in vitro. Importantly, zoledronic acid could inhibit clonogenic growth in the majority of melanoma cell lines except in the three BRAF mutant but PTEN wild-type melanoma lines. A similar pattern was observed in apoptosis induction experiments. In vivo zoledronic acid did not inhibit the subcutaneous growth or spleen-to-liver colonization of melanoma cells. Altogether our data demonstrates that prenylation inhibition may be a novel therapeutic approach in NRAS mutant melanoma. Nevertheless, we also demonstrated that therapeutic sensitivity might be influenced by the PTEN status of BRAF mutant melanoma cells. However, further investigations are needed to identify drugs that have appropriate pharmacological properties to efficiently target prenylation in melanoma cells.
Article
Full-text available
In melanoma, the presence of promoter related hypermethylation has previously been reported, however, no methylation-based distinction has been drawn among the diverse melanoma subtypes. Here, we investigated DNA methylation changes associated with melanoma progression and links between methylation patterns and other types of somatic alterations, including the most frequent mutations and DNA copy number changes. Our results revealed that the methylome, presenting in early stage samples and associated with the BRAFV600E mutation, gradually decreased in the medium and late stages of the disease. An inverse relationship among the other predefined groups and promoter methylation was also revealed except for histologic subtype, whereas the more aggressive, nodular subtype melanomas exhibited hypermethylation as well. The Breslow thickness, which is a continuous variable, allowed for the most precise insight into how promoter methylation decreases from stage to stage. Integrating our methylation results with a high-throughput copy number alteration dataset, local correlations were detected in the MYB and EYA4 genes. With regard to the effects of DNA hypermethylation on melanoma patients' survival, correcting for clinical cofounders, only the KIT gene was associated with a lower overall survival rate. In this study, we demonstrate the strong influence of promoter localized DNA methylation changes on melanoma initiation and show how hypermethylation decreases in melanomas associated with less favourable clinical outcomes. Furthermore, we establish the methylation pattern as part of an integrated apparatus of somatic DNA alterations.
Article
Full-text available
It is well demonstrated that CCND1 amplification is a frequent event in the acral subtype of cutaneous malignant melanoma; however, its role in the other subtypes of the disease is still controversial. The objectives of this study were to evaluate genetic and expression alterations of CCND1 with a focus on primary cutaneous melanomas, to define BRAF and NRAS mutation status, and correlate the data with clinical–pathological parameters. CCND1 amplification was associated with ulceration and the localization of the metastasis. After correction for the mutation state of BRAF and NRAS genes, CCND1 amplification in samples without such mutations was associated with ulceration and sun exposure. The cyclin D1 (CCND1) mRNA level decreased in lesions with multiple metastases and was correlated with both the mRNA levels and mutation state of BRAF and NRAS genes. Primary melanomas with BRAF V600 or NRAS Q61 mutations exhibited lower CCND1 mRNA level. CCND1 protein expression was associated with Breslow thickness, metastasis formation, and shorter survival time. These observations suggest that CCND1 alterations are linked to melanoma progression and are modified by BRAF and NRAS mutations. Our data show that CCND1 amplification could have a prognostic relevance in cutaneous melanoma and highlight that altered CCND1 gene expression may influence the metastatic progression, survival, and the localization of metastases.
Article
Full-text available
Background: Despite the extensive research approaches applied to characterise malignant melanoma, no specific molecular markers are available that are clearly related to the progression of this disease. In this study, our aims were to define a gene expression signature associated with the clinical outcome of melanoma patients and to provide an integrative interpretation of the gene expression -, copy number alterations -, and promoter methylation patterns that contribute to clinically relevant molecular functional alterations. Methods: Gene expression profiles were determined using the Affymetrix U133 Plus2.0 array. The NimbleGen Human CGH Whole-Genome Tiling array was used to define CNAs, and the Illumina GoldenGate Methylation platform was applied to characterise the methylation patterns of overlapping genes. Results: WE IDENTIFIED TWO SUBCLASSES OF PRIMARY MELANOMA: one representing patients with better prognoses and the other being characteristic of patients with unfavourable outcomes. We assigned 1,080 genes as being significantly correlated with ulceration, 987 genes were downregulated and significantly enriched in the p53, Nf-kappaB, and WNT/beta-catenin pathways. Through integrated genome analysis, we defined 150 downregulated genes whose expression correlated with copy number losses in ulcerated samples. These genes were significantly enriched on chromosome 6q and 10q, which contained a total of 36 genes. Ten of these genes were downregulated and involved in cell-cell and cell-matrix adhesion or apoptosis. The expression and methylation patterns of additional genes exhibited an inverse correlation, suggesting that transcriptional silencing of these genes is driven by epigenetic events. Conclusion: Using an integrative genomic approach, we were able to identify functionally relevant molecular hotspots characterised by copy number losses and promoter hypermethylation in distinct molecular subtypes of melanoma that contribute to specific transcriptomic silencing and might indicate a poor clinical outcome of melanoma.
Article
Full-text available
The role of CD44 in the progression of human melanoma has mostly been characterised by qualitative changes in expression of its individual variable exons. These exons however, may be expressed to form a number of molecules, the alternative splice variants of CD44, which may be structurally and functionally different. Using real-time PCR measurements with variable exon specific primers we have determined that all are expressed in human melanoma. To permit comparison between different tumours we identified a stable CD44 variable exon (CD44v) expression pattern, or CD44 ‘fingerprint’. This was found to remain unchanged in melanoma cell lines cultured in different matrix environments. To evaluate evolution of this fingerprint during tumour progression we established a scid mouse model, in which the pure expression pattern of metastatic primary tumours, circulating cells and metastases, non-metastatic primary tumours and lung colonies could be studied. Our analyses demonstrated, that although the melanoma CD44 fingerprint is qualitatively stable, quantitative changes are observed suggesting a possible role in tumour progression.
Article
Full-text available
The hepatocyte growth factor/scatter factor (HGF/SF) tyrosine kinase (TK) receptor c-Met plays a crucial role in the development of the invasive phenotype of tumors and thus represents an attractive candidate for targeted therapies in a variety of malignancies, including human malignant melanoma (MM). In contrast to what has been shown previously, we were not able to detect any genetic alterations, either in the juxtamembrane- or in the TK-domain of c-Met, in the studied MM cell lines. Nevertheless, c-Met was constitutively active in these cell lines without exogenous HGF/SF stimulation. The active receptor was localized to the adhesion sites of the cells. Addition of the c-Met TK inhibitor SU11274 specifically decreased the phosphotyrosine signal at the focal adhesion sites, which was accompanied by a decrease in cell proliferation as well as an increase in apoptotic cells. In addition, non-apoptotic concentrations of SU11274 significantly reduced the in vitro migratory capacity of MM cells in the modified Boyden-chamber assay. Administration of SU11274 significantly decreased primary tumor growth as well as the capacity for liver colony formation of MM cells in SCID mice. Our study provides the first evidence for an in vivo antitumor activity of SU11274 in a human melanoma xenograft model, and suggests c-Met as a valid target for the therapy of MM. Consequently, SU11274 treatment might represent a useful strategy for controlling melanoma progression and metastasis in patients with MM.
Article
Full-text available
The 180 kDa transmembrane collagen XVII is known to anchor undifferentiated keratinocytes to the basement membrane in hemidesmosomes while constitutively shedding a 120 kDa ectodomain. Inherited mutations or auto-antibodies targeting collagen XVII cause blistering skin disease. Collagen XVII is down-regulated in mature keratinocytes but re-expressed in skin cancer. By recently detecting collagen XVII in melanocyte hyperplasia, here we tested its expression in benign and malignant melanocytic tumors using endodomain and ectodomain selective antibodies. We found the full-length collagen XVII protein in proliferating tissue melanocytes, basal keratinocytes and squamous cell carcinoma whereas resting melanocytes were negative. Furthermore, the cell-residual 60 kDa endodomain was exclusively detected in 62/79 primary and 15/18 metastatic melanomas, 8/9 melanoma cell lines, HT199 metastatic melanoma xenografts and atypical nests in 8/63 dysplastic nevi. The rest of 19 nevi including common, blue and Spitz subtypes were also negative. In line with the defective ectodomain, sequencing of COL17A1 gene revealed aberrations in the ectodomain coding region including point mutations. Collagen XVII immunoreaction-stained spindle cell melanomas, showed partly overlapping profiles with those of S100B, Melan A and HMB45. It was concentrated at vertical melanoma fronts and statistically associated with invasive phenotype. Antibody targeting the extracellular aa507-529 terminus of collagen XVII endodomain promoted apoptosis and cell adhesion, while inhibiting proliferation in HT199 cells. These results suggest that the accumulation of collagen XVII endodomain in melanocytic tumors is associated with malignant transformation to be a potential marker of malignancy and a target for antibody-induced melanoma apoptosis.
Article
BRAF and NRAS are the two most frequent oncogenic driver mutations in melanoma and are pivotal components of both the EGF and FGF signaling network. Accordingly, we investigated the effect of BRAF and NRAS oncogenic mutation on the response to the stimulation and inhibition of epidermal and fibroblast growth factor receptors in melanoma cells. In the three BRAF mutant, two NRAS mutant and two double wild-type cell lines growth factor receptor expression had been verified by qRT-PCR. Cell proliferation and migration were determined by the analysis of 3-days-long time-lapse videomicroscopic recordings. Of note, a more profound response was found in motility as compared to proliferation and double wild-type cells displayed a higher sensitivity to EGF and FGF2 treatment when compared to mutant cells. Both baseline and induced activation of the growth factor signaling was assessed by immunoblot analysis of the phosphorylation of the downstream effectors Erk1/2. Low baseline and higher inducibility of the signaling pathway was characteristic in double wild-type cells. In contrast, oncogenic BRAF or NRAS mutation did not influence the response to EGF or FGF receptor inhibitors in vitro. Our findings demonstrate that the oncogenic mutations in melanoma have a profound impact on the motogenic effect of the activation of growth factor receptor signaling. Since emerging molecularly targeted therapies aim at the growth factor receptor signaling, the appropriate mutational analysis of individual melanoma cases is essential in both preclinical studies and in the clinical trials and practice.
Article
Despite the strong progress has been made in the field of melanoma epigenetics, the importance of genome-wide demethylation or hypomethylation remains underestimated. However, this phenomenon might also reflect important epigenetic alterations due to its ability to cause genetic instability. Furthermore, no methylation-based distinction has been drawn among the diverse primary melanoma subtypes. To assess global methylation we measured the methylation level on the 6 CpG sites of LINE1 sequences in 46 primary melanomas in association with patients' survivals and the clinicopathological characteristics of specimens. We demonstrate that LINE1 hypomethylation is accompanied by the shortened relapse-free survival of melanoma patients; however, Cox regression analysis shows a direct relationship between the overall loss of 5-methylcytosine and metastatic potential of primary melanomas, which is confirmed by Kruskal-Wallis tests with Dunn's Multiple Comparison Post-test showing that not only the presence but the number of metastases during the 5-year follow-up period is associated with the transposon demethylation. In this study, we demonstrate the strong influence of global DNA demethylation in the metastatic formation of primary melanomas during the follow-up period.
Article
The possibility that endocrine factors may influence the clinical course of malignant melanoma is suggested by the superior survival data of women. In preclinical models we observed a higher rate of colony formation by human melanoma cells in male compared to female SCID mice, but only in the case of the liver and not in other organs. The gender difference could be seen at an early phase of colony formation. On the other hand, in our human melanoma cell lines we failed to detect steroid receptor protein expression, and treatment with sex hormones did not considerably influence their in vitro behavior. Investigating the possible contribution of host cells to the observed gender difference, we performed in vivo blocking experiments applying pretreatment of the animals with Kupffer cell inhibitor gadolinium chloride and the NK cell inhibitor anti-asialo GM1 antibody. While Kupffer cell blockade enhanced melanoma liver colonization equally in the two sexes, a more prominent increase was observed in female than in male mice in the case of NK cell inhibition. Further supporting the importance of NK cells in the lower liver colonization efficiency of melanoma cells in females, gender difference in colony formation was lost in NSG mice lacking NK activity. Although in humans no organ selectivity of gender difference in melanoma progression has been observed according to data in the literature, our results possibly indicate a contribution of natural host defense mechanisms to gender difference in survival of patients with melanoma or other tumor types as well.