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Rev. Inst. Adolfo Lutz,
53 (112):21-26, 1993.
AVALIAÇÃO DO TEOR DE COLESTEROL COMO PARÂMETRO DE CONTROLE
DE QUALIDADE PARA MASSAS COM OVOS*
Neura BRAGAGNOLO"
Délia B. RODRIGUEZ-AMAYA"
RIALA6n42
BRAGAGNOLO, N.
&
RODRIGUEZ-AMAYA, D. B. Avaliação do teor de colesterol como
parâmetro de controle de qualidade para massas com ovos.
Rev. Inst. Adolfo Lutz,
53(112):21-26,1993.
RESUMO: O teor de colesterol tem servido como índice da quantidade de ovos em massas
com ovos. A resolução
12n8
da Comissão Nacional de Normas e Padrões para Alimentos do
Ministério da Saáde (CNNPA-MS) estabelece três ovos por kg de massa, correspondendo a 0,450
g de colesterol por kg de massa. O método seguido pelos laboratórios de fiscalização é o
colorimétrico do Instituto Adolfo Lutz (IAL). No presente trabalho, foi realizada uma avaliação
comparativa de dois métodos colorimétricos, o do 1AL (que utiliza ácido acético, anidrido acético e
ácido sulfürico concentrado) e o de BOHAC
et alii
(que emprega ácido acético saturado com
sulfato ferroso e ácido sulfdríco concentrado), e um método que euvolve cromatografia Jfquida de
alta eficiência (CLAE) para determinar o teor de colesterol em massas com ovos. Para o
ültímo
método foi utilizada uma coluna CIS, fase móvel acetonitrilia-isopropanol (75:25) e detector de
conjunto de diodos, a quantificação foi feita por padronização externa. Os métodos colorimétricos
superestimaram os valores de colesterol e, conseqüentemente, a quantidade de ovos adicionada às
massas. Já o método por CLAE revelou que as cinco amostras de massas analisadas continham
quantidades de ovos abaixo do mínimo exigido pela legislação vigente.
DESCRITORES: massa com ovos, colesterol, método colorimétrico, controle de qualidade,
CLAE.
INTRODUÇÃO fonte de informação não tenha sido citada, este valor
aparentemente foi calculado considerando que cada
ovo contém 150 mg de colesterol. O método oficial,
usado pelos laboratórios de fiscalização, é o
colorimétrico do Instituto Adolfo Luti (IAL), que
gera muita controvérsia, uma vez que não é
específico para o colesterol, mas para qualquer
esterol presente. Outras substâncias que tenham o
núcleo do esterol também podem ser quantificadas,
superestimando desta forma a concentração de
colesterol. Entre os diferentes métodos para massas
com ovos, os dois mais recentes envolvem
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)4 e
cromatografia gasosa
(CGt.
O teor de colesterol tem sido utilizado como
parâmetro de qualidade no controle de massas com
ovos. A resolução
12n8
da Comissão Nacional de
Normas e Padrões para Alimentos do Ministério da
Saúde (CNNPA-MS)3 e comunicado 37/80 da
Divisão Nacional de Alimentos do Ministério da
Saúde (DINAL-MS) de 16 de dezembro de 1980
estabelecem que "massas com ovos" devem conter no
mínimo três ovos por kg de massa, correspondendo a
0,450 g de colesterol por kg de massa. Embora a
*
Parte da dissertação de Mestrado da I' autora realizada junto ao Curso de Pós-Graduação em Ciência de Alimentos
da Faculdade de Engenharia de Alimentos (FEA) da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP).
**
Departamento de Ciência de Alimentos, FEA, UNlCAMP, Caixa Postal 6121, CEP 13081-970, Campinas, SP,
Brasil.
21
BRAGÀGNOLO, N.
&
RODRIGUEZ-AMAYA, D. B. Avaliação do teor de colesterol como parâmetro de controle de
qualidade para massas com ovos. Rev. Inst. Adolfo Lutz; 53(1;2):21-26, 1993.
No presente trabalho, foi realizada uma avaliação
comparativa de dois métodos colorimétricos, o de
IAL (que utiliza ácido acético, anidrido acético e
ácido sulfúrico concentrado) e o de Bohac et alii
1
(que envolve ácido acético saturado com sulfato
ferroso e ácido sulfúrico concentrado) e um método
por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE),
estabelecido no nosso laboratório, para determinar os
teores de colesterol em massas com ovos.
MATERIAL E MÉ1ODOS
Material
As amostras foram adquiridas, ao acaso, em
diferentes quitandas e supermercados de Campinas,
em novembro de 1991.
Analisaram-se cinco amostras de massas com ovos
de marcas diferentes. As massas foram trituradas em
um moinho até a obtenção de um pó que passasse por
um tamis de 40 mesh.
Na tentativa de reconfirmar a confiabilidade dos
dados, foi preparada uma massa caseira com 3 ovos,
1 kg de farinha e 200 m! de água. Após secagem em
estufa a l00·C por urna hora a amostra foi triturada
como as anteriores.
MÉTODOS
Os procedimentos dos métodos avaliados estão
apresentados esquematicamente nas Figuras 1, 2, e 3.
A medida da absorbância foi feita em um
espectofotômetro Perkin-Elmer lambda 6,
computadorizado.
A curva padrão utilizada para o método do
IAL
s
foi de
O
a 100 mg!l, com colesterol purificado
("Sigma", EUA), demonstrando !inearidade na faixa
das amostras analisadas.
O método de Bohac et alii", utilizado para
determinação de colesterol em carnes, foi adaptado
às condições do laboratório por Bragagnolo
&
Rodriguez-Amaya' e usado como um método
alternativo. A curva padrão foi feita de
O
a 900
ug.
Para o método por CLAE, a extração dos lipídios
foi semelhante à do método colorimétrico do IAL
s.
A
saponificação foi realizada de acordo com Bohac et
ali/o
Foi utilizado um crornatógrafo marca Varian, com-
injetor de válvula rotatória adaptado com amostrador 10
JAl,
"Solvent Delivery System" modelo 9010, detector de
conjunto de diodos (190-367 nm), modelo 9065
Polichrom computadorizado acoplado a integrador
modelo 4400 e resgistrador Hewlett-Packard modelo
2225 D+. A coluna utilizada foi Spherisorb ODS-l, 5
!-l.ID,
150 x 4,6 mm (Alltech Associates, EUA),
precedida por coluna
eIS
de guarda Micropak
MClI-lO, 10 um, de30 x 4,6mm. A fase móvel foi
acetonitrila-isopropanol (75:25) num fluxo de 1,2
rnl/min com pressão de 73 atm. Todos os soIventes
22
usados foram de grau cromatográfico, filtrados (0,45
um) e degaseificados antes do uso. Alíquotas do
extrato de massa com ovos foram evaporados sob N2,
redissolvidas em 1 rnl de fase móvel e filtradas (0,45
um)
antes da injeção. O pico do colesterol foi
monitorado a 205 nm.
Para a escolha da fase móvel testou-se previamente as
seguintes misturas de solventes: acetonitrila-metanol
(50:50 e 60:40), hexano-isopropanol (99:1) e
acetonitrila-isopropanol (50:50, 60:40, 65:35; 70:30;
75:25 e 80:20).
A identificação do colesterol foi realizada por
comparação dos tempos de retenção e dos espectros
de absorbância (Figuras 4 e 5) obtidos pelo detector
conjunto de diodos do padrão, da amostra, e ainda
por co-cromatografia (spiking). Para a quantíflcação,
utilizou-se o método de padronização externa. Os
níveis utilizados para a curva padrão foram de 5 a 40
ug/injeçâo ( 10
JAl).
FIGURA!
Fluxograma para determina'f0 de colesterol em
massas com ovos, segundo IAL .
105·C por 20
Extração
dos
lipídios
secar em
minutos
adicionar 10 m! de clorofórmio
deixar em repouso por 24 horas
aquecer em chapa elétrica até a
ebulição
deixar sedimentar
filtrar
receber o filtrado em uma proveta de
25m!
esperar o papel de filtro secar, cortar
as beiradas amarelas do papel
iuntar ao resíduo
colocar mais clorofórmio
aquecer, filtrar e cortar o papel
repetir esta operação até que o papel
de filtro não se apresente amarelado
e o volume não ultrapasse 15 m!
Reação
de
cor
adicionar à proveta contendo a
solução c1orofórmica, 1 rnl de ácido
acético glacial, 2 m! de anidrido
acético, 0,2 ml de ácido sulfúrico
completar o volume a 20 m! com
clorofórmio
arrolhar o tubo
agitar bem
resfriar a 23·C, em lugar escuro, por
25 minutos
lerem 625 nm
BRAGAGNOLO, N.
&
RODRIGUEZ-AMAYA, D. B. Avaliação do teor de colesterol como parâmetro de controle de
qualidade para massas com ovos. Rev. Inst. Adolfo Lutz; 53(1/2):21-26, 1993.
FIGURA 2
Fluxograma para determinação de colesterol em
massas com ovos, segundo Bohac et alil.
Extração
dos
Iipídios
Saponificação
Extração da
matéria
insaponificável
Reação
de
cor
adicionar 40 ml de clorofórmio-metanol
(2:1)
agitar 2 minutos com triturador
minipimer (Braun)
passar para tubo de centrífuga
adicionar 8 ml de NaCI 0,58% agitar
levemente
centrifugar 10 minutos a 2500 rpm
retirar a fase sobrenadante por sucção
transferir o extrato clorofórmico para
um frasco
evaporar o clorofórmio sob N2 em
banho-maria a 55·C
adicionar 10 ml de KOH 12% em
etanol9O%
misturar em agitador de tubo vortex
deixar 15 minutos a 80·C em
banho-maria com agitação
adicionar 5 ml de H:20
misturar em agitador de tubo
vortex
esfriar
colocar 5 ml de hexano
misturar em agitador de tubo
vortex
tomar 4 ml do extrato de hexano
evaporar sob N2 em banho-maria 55·C
adicionar
6
ml de ácido acético
saturado com FeS04
misturar em agitador de tubo vortex
colocar 2 ml de H2S04 concentrado
com bureta, misturando com agitador
de tubo vortex
resfriar a 2O·C
ler em 490 nm após 10 min
FIGURA 3
Fluxograma para determinação de colesterol em
massas com ovos por CLAE.
Extração
dos
Iipídios
Saponificação De acordo com o método de Bohac
et alil.
Extração
da matéria
insaponificável
adicionar 5 ml de HzQ
misturar em agitador de tubo
vortex
esfriar
colocar 10 ml de hexano
misturar em agitador de tubo
vortex
CLAE
tomar 5 ml de hexano
evaporar sob N2 em banho-maria a 55·C
redissolver em 1 ml da fase móvel
agitar em banho ultra-sônico
filtrar (0,45
11m)
injetar (10 ul)
coluna: CI8, 5
11m
(150
x
4,6 mm)
fase móvel: acetonitrila: isopropanol
(75:25)
detector: conjunto de diodos fixados a
205nm
Um teste de recuperação foi feito adicionando-se
quantidades conhecidas de colesterol (0,2 e 0,4 mg)
ao extrato de clorofórmio.
Análise estatfstica
Com o objetivo de verificar as diferenças entre os
três métodos, foi realizada análise de
variãncia
de um
fator ("one
way"),
crmauxílio
do
SOftwareMICROSTAT.
A comparação entre as médias foi feita pelo teste de
Tukey, a um nível de significância de 5%.
23
BRAGAGNOLO, N.
&
RODRIGUEZ-AMAYA, D. B. Avaliação do teor de colesterol como parâmetro de controle de
qualidade para massas com ovos. Rev. Inst. Adol]o Lutz, 53(1/2):21-26, 1993.
(a)
12
12
Te rn
p
c
de retenção (min)
Tempo de retenção (min)
FIGURA 4
Cromatogramas característicos do padrão colesterol (a) e de
uma amostra de massa com ovos (b). Condições
cromatográficas: coluna, Spherisorb ODS-l,5
um
(150 x
4,6 mm), fase móvel, acetonitrila: isopropanol (75:25),
fluxo, 1,2 ml/minutos, detector, conjunto de diodos fixados
a
205 nrn.
~ O'100~
t~
0,050
Ir
s:
.,
..
0,0190
2~4
278
A Inml
325 367
•• O"OO~
t~
.•.. 0,050
~
0,0
i
190 234
I
278
À
(nml
367
FIGURA
5
Espectros de absorbância obtidos pelo detector conjunto de
diodos do padrão colesterol
(b)
e de uma amostra de massa
com ovos (a).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Avaliação do método por CLAE para massas
com ovos
Como o método por CLAE foi estabelecido no
presente trabalho, avaliou-se a sua confiabilidade.
Embora o método colorimétrico do IALsnão
incluísse a etapa de saponíflcação para massas com
ovos, os testes preliminares demonstraram a
importância da mesma para remoção dos
24
interferentes, como mostram os cromatogramas na
Figura 6.
(a)
(b)
o
"
o
o
Tempo de retenção Imin)
3 6 9 12
Tempo de retenção (min)
(o)
FIGURA 6
Crornatogramas de uma amostra de massa com ovos não
saponificada (b) e submetida a saponíficação (a). Condições
cromatográficas: coluna, Spherisorb ODS-l, 5 11m(150 x 4,6
mm); fase móvel, acetonitrila-metanol (50:50); fluxo, 1,2
ml/minuto; detector conjunto de diodos fixado a 205 nrn.
(b)
Esta etapa, portanto, foi incluída no método por
CLAE.
A recuperação do colesterol no método
estabelecido foi excelente, com valores de 97-98%
(Tabela 1). TABELA 1
Recuperação do colesterol em massa com ovos
pelo método por CLAE
mg DE COLESTEROL
ADICIONADA
%
RECUPERAÇÃO
n
0,2
0,4 98
97
2
2
n
=
número de determinações
BRAGAGNOLO, N.
&
RODRIGUEZ-AMAYA, D. B. Avaliação do teor de colesterol como parâmetro de controle de
qualidade para massas com
ovos.Rev.lllst.
Adolfo Lutz, 53(1/2):21-26, 1993.
A eficiência da extração foi verificada através de
duas extrações consecutivas. O valor máximo obtido
na segunda extração foi de 0,0159 g de colesterol por
kg de massa.
Teores de colesterol em massas com ovos
Os níveis de colesterol em massas com ovos
obtidos pelos três métodos, os desvios padrão e os
coeficientes de variação encontram-se na Tabela 2.
TABELA 2
Comparação dos teores de colesterol em massas com ovos (gJkg) obtidos por três métodos
COLORIMETRICOS CLAE
AMOSTRAS* IALS Bohac
et
aliã
MÉDIA± DP %CV MÊDIA±DP %CV MÉDIA±DP %CV
i
0,39 ± 0,04 10,2 0,52±0,01 1,9 0,11 ±0,01 9,1
2 0,77 ± 0,04 5,2 0,64 ±0,02 3,1 0,24 ±O,OO 0,0
3 0,76 ± 0,01 1,3 0,70 ±0,01 1,4 0,18 ± 0,01 5,6
4 0,42 ± 0,03 7,1 0,44±0,01 2,3 0,02 ± 0,00 0,0
5 0,48 ± 0,03 6,2 0,60 ±0,01 1,7 0,24 ±0,01 4,2
DP - desvio padrão
CV - coeficiente de variação
Os coeficientes de variação (%CV), média? de
6,0, 2,1 e3,8, obtidos para os métodos de IAL , do
BOHAC
et
alii' e por CLAE, respectivamente,
demonstraram uma precisão boa dos três métodos.
Em relação aos teores de colesterol, uma avaliação
estatística do conjunto dos dados demonstrou que os
valores obtidos pelos métodos colorimétricos não
diferiram entre si, mas foram significativamente
maiores que os obtidos por CLAE. Estes resultados
indicam a existência de substâncias interferentes nos
métodos colorimétricos. A diferença entre os
resultados obtidos pelos métodos colorimétricos e
cromatográfico foi especialmente pronunciada com a
amostra 4. CLAE acusou um valor baixíssimo, o
cromatograma (Figura 7) mostrando um pico bem
menor que os das demais amostras.
*Amostras analisadas em duplicata.
2
'"
o
O-
..,
••
cr
3 6 9
Tempo de retenção (min
I
12
FIGURA 7
Cromatograma da amostra 4 de massa com ovos. Condições
cromatográficas:coluna, Spherisorb ODS-1, 5
f1II1
(150 x
4,6 mm); fase móvel, acetonitrila-isopropanol (75:25);
fluxo, 1,2 ml/mínuto; detector conjunto de diodos fixado a
205nm.
Pelos resultados obtidos pelo método IAL5,duas
massas apresentaram colesterol abaixo do mínimo
estabelecido. No entanto, utilizando-se o método por
CLAE, todas as marcas de massa com ovos
analisadas deram valores de colesterol abaixo do
mínimo permitido pela legislação vigente, indicando
que menos de
3
ovos foram adicionados por quilo de
massa.
Considerando a discrepância nos resultados, foi
preparada e analisada em triplicata por CLAE uma
massa caseira com
3
ovos. A média obtida foi de
0,44
±
0,01 gJkg,correspondendo ao valor estipulado
pelas normas brasileiras, equivalente a
3
ovos
adicionados na massa.
CONCLUSÃO
O método colorimétrico do IAL
5
utilizado pelos
laboratórios de fiscalização, superestimou o conteúdo
de colesterol e, conseqüentemente, a quantidade de
ovo nas massas. O outro método colorimétrico, de
Bohac et aUi', também superestimou os teores de
colesterol.
É
evidente, portanto, a ,necessidade de que a
metodologiaoficialseja modificadaa fim de remover os
interferentesantes da reação colorimétricaou utilizar
CLAE, uma técnicaconfíável,porém, onerosa.
AGRADECIMENIDS
Os autores agradecem
à
Financiadora de Estudos e
Projetos (FINEP) pelo suporte financeiro.
25
BRAGAGNOLO, N.
&
RODRIGUEZ-AMAYA, D. B. Avaliação do teor de colesterol como parâmetro de controle de
qualidade para massas com ovos. Rev. Inst. Adolfo Lutz, 53(1/2):21-26, 1993.
RIALA6/742
BRAGAGNOLO, N.
&
RODRIGUEZ-AMA Y A, D. B. - Evaluation of the cholesterol
concentration as quality control parameter for egg noodles. Rev. Inst. Adolfo Lutz,
53(1/2):21-26,1993.
ABSTRACf: The cholesterol content has served as index of the amount of eggs in egg
noodles.Resolution 12/78 of the "Comissão Nacional de Normas e Padrões para Alimentos", of the
Ministry of Health (CNNPA-MS) specifies three eggs per kg of noodles, corresponding to 0.450 g
of cholesterol per
kg
of noodles. The method used by regulatory laboratories is the colorimetric
method of the Instituto Adolfo Lutz (lAL). In the present work, a comparative evaluation of two
colorimetric methods, those of lAL (which utilizes acetic acid, acetic anhydride and concentrated
sulfuric acid) and of Bohac et alii (which employs acetic acid saturated with ferrous sulfate and
concentrated sulfuric acid), and a method whích involves high performance liquid chromatography
(HPLC), established in our laboratory, for the determination of cholesterol in egg noodles was
carried out. For the latter method, a Cl8 column, acetonitrile-isopropanol (75:25) as mobile phase
and a diode array detector were used, quantitation was carried out by external standardization. The
colorimetric methods overestimated the cholesterol levels, consequently, the quantity of eggs added
to the noodles. The HPLC method revealed that the five samples of egg noodles analyzed contained
eggs at amounts lower than the minimum stipulated by current regulation.
DESCRIPTORS: egg noodles, cholesterol, colorimetric method, quality control, HPLC.
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