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Interpretation der Acridinorange Färbung von
Ciliaten (Ciliophora) des Süßwassers und des
Bodens
Thilo Bauer!
Zusammenfassung
Färbungen mit Acridinorange (AO) fallen
bei verschiedenen Gattungen der Ciliaten
(Ciliophora) sehr spezifisch aus. Eine
minimale Laborausstattung und ein Protokoll
für reproduzierbare Färbungen der Ciliaten
des Süßwassers und des Bodens mit AO
w e r d e n b e s c h r i e b e n . D i g i t a l e
Spiegelreflexkameras mit Videofunktion
erm ögli chen Liv e-Ce ll-I magi ng. Die
Fä r b u ng d e r D N A un te rs tü tz t di e
Bestimmung der Arten durch Identifikation
von Macro- und Micronuclei. AO ermöglicht
ferner eine Differenzierung von dsDNA und
ssDNA in den aktiven Regionen des
Zellkerns während der Mitose. Phagosome,
Lysosome und Acidosome werden von AO
in Abhängigkeit vom pH-Wert in Farben von
grün bis rot gefärbt. Dies ermöglicht die
Darstellung von Vorgängen der Endocytose
und Exocytose. Entlang der Cilien-Linien
einiger Gattungen der Ciliaten treten mit AO
Färbung rot gefärbte Zellorganellen nahe der
Zellmembran hervor. Dieser Befund wird
mit früheren Untersuchungen der AO
Färbung des Trichocysten Systems der
Gattung Paramecium verglichen.
Sch lüss elwör ter: Acrid inor ange –
Ciliaten – Ciliophora – Acidosom – Lysosom
– dsDNA – ssDNA – Endocytose –
Exocytose – Färbeprotokoll
Inter pretation o f acridine orange
staining of ciliates living in freshwater
and in the soil
Acridine orange staining is found to be
specific for the different genera of the
Ciliates (Ciliophora). Minimal laboratory
equipment and protocol are presented for
reproducible AO staining of the ciliates
living in freshwater and in the soil. Live-
Cell-Imaging can be obtained by using
digital single lens reflex cameras (DSLRs)
with video function. Staining of DNA
supports identification of species by showing
macronuclei und micronuclei. Localization
of active DNA by differentiation of dsDNA
und ssDNA is possible during mitosis by
staining with AO. Phagosomes, lysosomes
and acidosomes will be stained depending on
pH f ro m gree n to r ed s u p p or t i ng
visualization of processes during endocytosis
and exocytosis. Organelles in regions of the
cilia and close to cell membrane will be
stained in red for certain genera. This is
compared with previous examination of the
trichocyst system of the genus Paramecium.
Keywords: Acridine orange – ciliates –
ciliophora – acidosome – lysosome – dsDNA
– ssDNA – endocytosis – exocytosis –
staining protocol
Einführung
Far b stoff e abs o rbier en L i cht bei
bestimmten Wellenlängen. Weil im
gestreuten Licht die absorbierten Anteile
fehlen, erscheinen mit ihnen gefärbte Stoffe
im weißen Licht farbig. Bei Fluorophoren
(Fluorochromen, Fluoreszenz-Farbstoffen)
treten (spin-) erlaubte Elektronen-Übergänge
auf, bei denen das absorbierte Licht rasch
wieder emittiert wird. Dabei wird ein Teil
der absorbierten Energie strahlungslos, der
andere Teil sichtbar oder im Infraroten
emittiert. Nach dem physikalischen Energie-
Erhaltung ssatz mu ss di e Summe der
emittierten Energien der Anregungsenergie
(Wellenlänge der Absorption) entsprechen.
Die Energie des emittierten Lichts ist daher
geringer und erscheint gegen die absorbierte
Lichtfarbe zum Roten hin verschoben
(Stokes Shift). Auch in der Lichtmikroskopie
und Histologie verwendete Farbstoffe
kö n n en f l uo resz i e re n. D ie i n d e r
Mikroskopie verwendeten Fluorophore
erfüllen jedoch eine weitere Anforderung:
Sie sollen einen hohen Wirkungsgrad haben,
die absorbierte Energie wieder zu emittieren.
So genügen geringste Mengen, den Farbstoff
dort zu lokalisieren, wo er zu finden sein
so l l . Di e s e s e i n f ac he P r in zi p ha t
Fluorophoren zu einem Siegeszug in der
mi k r os kopi s c he n N a c h we iste c h ni k
verholfen, da ihre Anwendung schonend
erfolgen kann, sofern es gelingt, sie
spezifisch dorthin zu befördern, wo man sie
haben will.
Acridinorange
Acridinorange, im Folgenden kurz AO,
wurde 1889 zum ersten Mal synthetisch
hergestellt [10]. AO ist wasserlöslich, eine
schwache Base und lipophil, also Fett
liebend [7]. AO wird in zwei wichtigen
Formen gehandelt und in der Mikroskopie
ge n u tz t. D a s r e i n e A cr id inor a n ge
Hydrochlorid (CAS Nr. 65-61-2) besitzt ein
molares Gewicht von 301,82 g/mol. Das
Mikroskopie, Dustri-Verlag Dr. Karl Feistle GmbH & Co. KG, https://www.dustri.com/
DOI 10.5414/MKX0058
preiswerte Acridinorange-Zinkchlorid
Doppelsalz (CAS Nr. 10127-02-3) hat ein
höheres molares Gewicht von 438,09 g/mol.
Die erhältlichen Mengen mögen gering
erscheinen, können jedoch von den meisten
Anwendern innerhalb von Jahren kaum
aufgebraucht werden. Auf die Möglichkeit,
AO auf Verunr einigungen durch die
Herstellung zu untersuchen, wurde von
Kasten (1967) bereits hingewiesen [10].
Verschiedene Quellen geben die Spektren
de r Fl uor eszenz sowie Max ima von
Ab s o r pt io n un d Em i s si on f ü r A O
unterschiedlich an [7][10][24][25]. Die
Maxima liegen bei 430-490 nm für die
Absorption (=Anregung), sowie 500-650 nm
für die Emission (Abb. 1). Diese Variabilität
der Maxima von Absorption und Emission
wurde von Kasten (1967) als Metachromasie
bezeichnet [10]. Stockinger (1958) wies auf
die Unklarheit des Begriffs Metachromasie
hin und grenzte ihn innerhalb der Histologie
als eine vom Gewebe abhängige Färbung ab
[22]. Bezogen auf die Unterschiede in der
Färbung von AO innerhalb einer einzelnen
Zelle und weitere Untersuchungen an AO
erscheint Stockingers Abgrenzung des
Begriffs Metachromasie jedoch wenig
zwe ckmäß ig. Für die Proto zool o gie
interessant ist hingegen das Phänomen der
Metachromasie durch spezifische Färbungen
der Organellen, die bei unterschiedlichen
Gat t unge n der Cili a ten versc hiede n
ausfallen.
AO bildet mit der DNA-Doppelhelix
(double-stranded, dsDNA) der Eukaryoten,
einsträngiger DNA (single-stranded, ssDNA)
sowie RNA verschiedene Komplexe aus, die
grün (dsDNA) bzw. gelb bis rot (ssDNA,
RNA) fluoreszieren. Diese Eigenschaften
ließen den Farbstoff populär werden, da er
zur Färbung der Zellkerne (DNA) geeignet
ist. Untersuchungen des AO-RNA Komplex
wurden unter anderem an isolierter RNA und
CHO Zellen durchg e f ührt [ 9]. D e r
Mikroskopiker wird auf Probleme stoßen,
aus grüner oder roter Fluoreszenz auf DNA
bzw. RNA zu schließen und dies auf die
eigenen Ergebnisse unmittelbar anzuwenden.
Die Auffassung, AO würde lediglich DNA
und RNA färben und über rot-grün Kontrast
differenzieren, erweist sich nämlich als
falsch [10]. Ausgehend von Struggers
Untersuchungen in den 1940ern [23] bleibt
d i e F r ag e , o b A O z ur s ch n ell e n
Differenzierung lebender und toter Zellen
geeignet ist, b i s heute u m s t r i t ten.
Verschiedene Untersuchungen an Bakterien,
Hefezellen oder Spermien ergeben ein
widersprüchliches Bild [2][4][8][10][12].
Häusler (1967) erwähnt, dass AO neben
Zellkernen auch andere Bestandteile der
Zellen färbt [8]. Ein wichtiger Befund aus
den bisherigen Arbeiten ist der Hinweis, dass
bei hoher Konzentration des Farbstoffs
toxische Effekte auftreten.
Offenbar f a ll e n Ergebnisse von
Färbungen mit AO bei verschiedenen
Organismen spezifisch aus, doch sind die
Ergebnisse nicht ohne Weiteres auf andere
Organismen übertragbar. Sicherlich kann
dies jedoch auch zur schnellen Einordnung
der Spezies genutzt werden. Bislang ist die
Färbung von Zellkernen mit AO eine
gebräuchliche Methode bei der Bestimmung
von Ciliaten (Ciliophora). Darüber hinaus
erscheint es interessant, die differenzierte
Färbung der übrigen Organellen zu verstehen
und richtig zu deuten.
Material und Methode
Acridinorange-Zinkchlorid (CAS Nr.
10127-02-3) wurde im Oktober 2013 von
Omikron bezogen und wie im Folgenden
beschrieben angesetzt. Die Abbildungen in
dieser Arbeit sin d mi t e inem Zeiss
A x i oL ab. A 1 F L -L ED F lu ore s z en z
Mikroskop, Zeiss Filtersatz 09 (Anregung:
Mikroskopie, Dustri-Verlag Dr. Karl Feistle GmbH & Co. KG, https://www.dustri.com/
DOI 10.5414/MKX0058
Abb. 1. Fluoreszenz-
Spektrum von Acridinorange.
Dargestellt sind relative
Absorption (Max.: 490 nm)
und Emission (Max.: 520
nm ) bei Bindung an DNA
sowie ungefähre Zuordnung
von Farben und
Wellenlängen. Im Bereich der
Überlappung beider Kurven
tritt bei hoher Konzentration
eine Eigenfilterung des
F a rb st o f fs e in , d ie z u
Metachromasie der Färbung
führt.
450-490 nm, Emission: Langpass ab 515
nm) und Zeiss LED-Beleuchtung (470 nm)
erstellt worden. Videoaufnahmen wurden im
Format Full-HD (1920x1080 Pixel) mit einer
Canon EOS 60D am Fotoadapter 1,6x
erstellt. Die gezeigten Aufnahmen wurden
aus den Videosequenzen einzeln ausgewählt.
Einzige Auswahlkriterien waren die Lage der
Fokusebene in der Zelle und die Bildschärfe
bzw. Unbeweglichkeit der Ciliaten im
Moment der Aufnahme, um die Organellen
scharf abzubilden.
Proben aus Aquarien oder anderen
Gewässern wurden, wenn sie nicht sofort
u n t e rs u c h t w ur d en , e nt w ed er i n
Fundortwasser gehalten oder in Erdlösung
nach Meyer (1980) kultiviert [14]. Zur
Anreicherung der Individuenzahl wurden die
Erdkulturen mit pasteurisierter Milch (H-
Milch) gefüttert, alle 2-3 Tage werden 3
Tropfen Milch auf 100 ml Kultur gegeben.
Der in Abb. 3 dargestellte Ciliat wurde im
November 2014 einem Heuaufguss des
letzten, getrockneten Grasschnitts aus dem
Oktober 2014 entnommen.
Erforderliche Labor-
Grundausstattung
Häusler (1967) und Mulisch & Welsch
(2010) beschreiben für den Ansatz einer AO
Lösung Konzentrationen von 1:5.000 bis
1:20.000 [8][15]. In der Fachliteratur ist die
Konzentration nur selten in Prozent (%)
angegeben, häufiger jedoch in Einheiten von
1 M oder 1 µg/ml. In SI-Einheiten entspricht
1 M der Angabe 1 mol/l. Dennoch ist die
ä l t e r e S c h r e i b w e i s e 1 M i n
wissenschaftlichen Publikationen bis heute
erhalten geblieben. Die Molarität M der
Lösung beschreibt die Anzahl der Moleküle
pro Liter Lösung über die Avogadro-
Konstante. Bei der Umrechnung von
Konzentrationsangaben ist das molare
Gewicht der verschiedenen Salze des
Acridinorange zu beachten. Eine digitale
Waage mit einer Auflösung und Genauigkeit
von 1 Milligramm (mg) ist unverzichtbar.
Feinwaagen aus dem Online-Versand leisten
bereits gute Dienste. Für die Fluoreszenz-
Mikroskopie empfiehlt sich die Anschaffung
eines Satzes von Mikroliter-Pipetten mit
einstellbarem Volumen von 100-1000 µl,
20-200 µl und 2-20 µl (z.B. Eppendorf,
pipet4u). Passende Pipettenspitzen werden in
Geb i nden von 1 .000 Stück günst i g
angeboten. Sauberes Arbeiten ist wichtig,
Pip e ttensp i tzen werde n nac h jede m
Arbeitsgang gewechselt, damit sich die sehr
geringen Mengen der Fluorophore und
Hilfsstoff e nicht m i s c h e n und d a s
mikroskopische Präparat auf diese Weise
verunreinigen. Für die Herstellung der
Gebrauchslösung und die mikroskopische
Präparation empfiehlt sich weiterhin ein
Vorrat an Reaktionsgefäßen mit 1,5 ml
Volumen, welche ebenfalls in Gebinden zu
1.000 Stück erworben werden können.
Bedruckbare Etiketten (z.B. Herma Nr.
2370) zur Beschriftung von Experimenten
und Farbstoff-Ansätzen sollten nicht fehlen.
Phototoxizität
Der Mikroskopiker wird enttäuscht,
wenn er versucht, die im vorigen Abschnitt
bes c h r i e b en e K o n z e n t ra t i on di r e k t
a nz u w e n d e n . Vo n d e r M e t h o d e ,
Farbstofflösung mit einer Präpariernadel
aufzunehmen und zur Probe zu geben, ist
ebenso abzuraten. In hoher Konzentration
zur mikroskopischen Probe der Protozoen
gegeben, wird AO beim Zuschalten des
intensiven Anregungslichts eines modernen
Epi-Fluoreszenz Mikroskops viele Protozoen
des Süßwassers und der Bodenfauna rasch
abtöten. Raab beschrieb 1900 eine der ersten
Anwendungen in der Biologie, nämlich die
Phototoxizität von AO bei der Färbung von
Paramecium [17]. Neben AO wirken auch
andere Fluorophore phototoxisch. Der Effekt
ist von der Konzentration des Fluorophors
und der Lichtintensität abhängig, und tritt
offenbar erst bei dem Überschreiten eines
Schwellenwerts auf. N ac h eigenen
Beobachtungen ist die letale Konzentration
der Fluorophore auch von der Spezies und
der Verfa ssun g de r Pr otoz oen (z. B.
Fütterung) abhängig. Alter und Art der
Kultur scheinen ebenfalls Faktoren zu sein,
die die Verträglichkeit der Farbstoffe und
erforderliche Verdünnung beeinflussen
können. Insbesondere bei Ciliaten ist zu
beobachten, dass die Tendenz zur Flucht aus
dem Bildfeld nach dem Einschalten des
g r el l en A nr e gu n gs l ic h ts m i t d er
Aufenthaltsdauer im Farbstoff abnimmt,
ebenso wie die phototoxische Wirkung mit
der Aufenthaltsdauer abnimmt.
Herstellung der Gebrauchslösung
Als Leitfaden soll die folgende Vorschrift
dienen, welche reproduzierbare Ergebnisse
fü r Le ben dfä rbu nge n l iefert: 10 mg
Acridinorange-Zinkchlorid werden in 50 ml
sterilem, destillierten Wasser gelöst. Dies
ergibt eine Konzentration von 0,02 %
be z i eh ungs w e is e 0 , 4 6 mM . D i e se
Stammlösung ist bei Zimmertemperatur im
Dunklen lange h altbar. Eine w eitere
Verdü n n u n g von 1:100 e rgibt eine
Gebrauchslösung von 4,6 µM. In ein
Reaktionsgefäß werden hierfür 10 µl der AO
Stammlösung pipettiert, auf 1 ml Volumen
a uf g e f ü l l t u n d g es ch üt te l t . D i e
„homöopathisch“ verdünnte
Gebrauchslösung kann verschlossen einige
Zeit aufbewahrt werden und reicht für viele
Einzelpräparate. Für spezielle Anwendungen
werden gelegentlich auch höhere AO
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DOI 10.5414/MKX0058
Konzentrationen beschrieben [13]. Die
Ver d ü n nu n g der Stam m l ö su n g zur
Gebrauchslösung soll generell mit dem
st eri len Kultu rme diu m e rfolgen. Ein
Abweichen von dieser Regel wird durch
plötzliche Veränderung des osmotischen
Drucks im mikroskopischen Präparat Stress
für die Zelle bedeuten und die Phototoxizität
begünstigen. Ist die Kulturlösung der des
Leitungswasser sehr ähnlich, z.B. bei einer
E r d k ul tu r o d e r e in e r K u l t u r i m
Fundortwasser, kann im Ausnahmefall mit
sterilem (abgekochten) Brunnen- oder
Leitungswasser verdünnt werden. Größere
Mengen der Gebrauchslösung anzusetzen,
empfiehlt sich nicht, da sich in den
Kulturmedien Bakterien, Protozoen und
Pilze ansiedeln können, auch wenn sie mit
Fluorophoren versetzt sind.
Mikroskopische Präparation
Das Volumen einer Protozoen-Kultur
unter einem Deckglas von 18x18 mm, bei
der auch grö ßte Cilia ten noch frei
schwimmen können, beträgt etwa 30 µl. Von
der im vorigen Abschnitt beschriebenen AO
Gebrauchslösung (4,6 µM) pipettiert man 5
µl in die Mitte des Objektträgers. 25 µl der
Probe mit den Protozoen werden darauf
getropft und anschließend das Deckglas
aufgesetzt. Der Farbstoff hat nun rechnerisch
eine Konzentration von etwa 0,8 µM. Dies
liegt im Bereich der von Herstellern
empf o h l enen Anwe n d ung [ 1 6 ]. D i e
Konzentration steigt im mikroskopischen
P r äp a ra t d u rc h Ve rd u ns t un g u nd
Anreicherung in den Organ ellen de r
Protozoen.
Sind nur wenige Protozoen in der Probe
zu erwarten, lässt sich die Prozedur wie folgt
modifizieren: 2 µl der AO Stammlösung
werden in ein Reaktionsgefäß pipettiert.
Anschließend wird 1 ml der Probe mit den
Protozoen hinein gespült und geschüttelt.
Nac h de r im f ol g en d en A bs c hn i tt
beschriebenen Einwirkdauer im Dunklen
wird bei geringer Drehzahl 1-2 Minuten in
der Mikrozentrifuge zentrifugiert (max.
2.000 U/min). Anschließend werden 30 µl
des Bodensatzes mit der Pipette auf einen
Objekt träger geg eben, d as Deckgla s
aufgelegt und mikroskopiert.
AO benötigt eine gewisse Zeit, bis es die
Zellmembran durchdringt und sich in der
Zelle anrei chert. Das Präparat sollte
währenddessen in einer feuchten Kammer
(z.B. Petrischale) dunkel aufbewahrt werden.
Die Dauer sollte bei lebenden Protozoen
wenigstens 30 bis 60 Minuten betragen und
ist im Zweifel experimentell zu ermitteln.
Mit herunter geregelter Lichtquelle wird im
Hel lfel d ode r b esser im lich tarm en
Phasenkontrast beobachtet, bis die Protozoen
unter dem Deckglas eingeklemmt und somit
in ihrer Bewegung eingeschränkt werden.
Organellen können nun in Fluoreszenz
beobachtet und fotografiert werden.
Mikroskopische Beobachtung
Für AO werden gelegentlich Filtersätze
empfohlen, die eine Anregung im UV oder
bei 430 nm erfordern [13][25].
Kurzwelliges, energiereiches Licht ist jedoch
für die Beobachtung von lebenden Protozoen
problematisch. Alternativ ist für AO auch ein
universeller FITC Filtersatz mit Anregung
im Blauen bei 470 nm und einem Sperrfilter
a b 5 1 0 n m z u e m p f e h l e n . D a s
Emissionsfilter (=Sperrfilter) so ll als
Langpass-Filter ausgeführt sein sein, das
sowohl grünes, als auch rotes Licht passieren
lässt. Das Mikroskop sollte mit geeigneten
Objektiven ausgestattet sein, die über eine
ausgezeichnete Farbkorrektur verfügen, da
der Farbkontrast grün-rot bei unzureichender
Farbkorrektur zu einem defokussierten Bild
im Roten führen wird.
Die digitale Spiegelreflexkamera, kurz
DSLR (digital single-lens reflex camera), hat
in der Fluoreszenz gewisse Vorzüge, denn
sie liefert Farbaufnahmen bei sehr geringem
Detektor-Rauschen. Aufgrund der geringen
Lichtmengen der Fluoreszenz bleiben
Mikroskopie, Dustri-Verlag Dr. Karl Feistle GmbH & Co. KG, https://www.dustri.com/
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Abb. 2. Bildbearbeitung bei ungünstiger Wiedergabe der Farben: Durch Korrektur
der Farben wird das Bild dem visuellen Eindruck angepasst. Gelb- und
Orangetöne sind nun besser zu erkennen. Phasenkontrastaufnahme (A),
unbearbeitete Aufnahme in Fluoreszenz (B), sowie farbkorrigierte, zeitaufgelöste
Aufnahmen (C, D). Markiert sind Macronucleus (Ma), pulsierende Vakuole (pV),
ein Chlorophylleinschluss (Chl), vermutlich von einer verspeisten Alge, sowie
weitere Zelleinschlüsse (En). Plan-Neofluar 40x/0,75 Ph2.
natürlich auch Aufnahmen mit der DSLR
durch das Quantenrauschen des Lichts selbst
begrenzt. Die optimale ISO Einstellung einer
DSLR findet man über eine Rauschanalyse
eines gleichmäßig ausgeleuchteten Bildes.
Bei Canon EOS Modellen mit einer
Auflösung von 14 Bit pro Farbkanal (z.B.
EOS 40D, 60D) findet man diese Einstellung
beispielsweise bei ISO 400. Hier arbeitet die
Kamera in einem Bereich, in dem ein
Photoelektron bereits mehr als einer
Helligkeitsstufe im Farbkanal entspricht.
Höhere ISO Werte bringen also keinen
G e wi n n a n B ild i nf o rm a tio n . F ür
Videoaufnahmen ist dennoch anzuraten,
höhere ISO Zahlen um ISO 6400 zu wählen,
um die sehr geringen, photonen-verrauschten
He lligkeiten der F luoreszenz in de n
geringeren Dynamikumfang der digitalen
Videoformate anzuheben (8 Bit), wobei die
Aufna h m e n naturgemä ß verraus c h t
ersc h e i nen. Eine a utomati s c he I S O
Einstellung ist für diesen Anwendungsfall
unzuverlässig und für Messungen nicht
geeignet. Der automatische Weißabgleich
und die Belichtungsoptimierung sollten
e b en f al l s a b ge s ch a lte t s ei n . D i e
Belichtungsz ei t wird b e i A u flicht-
Fluoreszenz selten unter 1/30 Sekunde
liegen. Ein 50:50 Phototubus ist bei
Vid eoauf nahmen e mpfeh lensw ert, um
während der Aufnahme visuell beobachten
und fokussieren zu können. Aufgrund
unterschiedlicher spektraler Empfindlichkeit
geben Kameras die Fluoreszenz von AO
nicht so wieder, wie sie vom Auge gesehen
wird. Über die Farbkorrektur und Anpassung
der Gradation können Bilder für die
Dokumentation dem visuellen Eindruck
nachträglich angepasst werden (Abb. 2).
Photobleaching
Photobleaching bezeichnet das zeitliche
Verblassen der Fluoreszenz. Der Effekt wird
m i t z u n eh me n d e r I nt en s i t ät d e s
A n r e g u n g s l i c h t s b e s c h l e u n i g t .
Photobleaching kann bei AO zu rascher
Abnahme der Fluoreszenz innerhalb weniger
Sekunden füh ren . E inzelbilde r e ine r
Videosequenz eines nicht näher bestimmten,
erdbew ohn ende n C iliaten aus einem
Heuaufguss sind in Abbildung 3 mit
Z e i t a n g a b e n w i e d e r g e g e b e n .
Charakteristisch für diese Spezies sind vier
Macron ucle i w elche i n M itos e e ine
Quereinschnürung zeigen. Bereits fünf
S e k u n d e n n a c h Z u s c h a l t e n d e s
Anregungslichts erscheinen Cytoplasma und
Macronuclei weitgehend entfärbt. Eine
empfindliche Kamera mit Videofunktion ist
vorteilhaft, um in den ersten Sekunden nach
dem Umscha l t e n v o m Hellf e l d zur
Fluoresze nz ge suchte Details in de n
Aufnahmen aus dem Video zu gewinnen.
Der Verfasser beobachtete, dass auch
Photobleaching von der Verfassung der
Ciliaten, Alter und Phase der Kultur und
Nahrungsangebot (z.B. Milchfütterung)
abhängen kann.
Depolymerisation der DNA
AO lagert sich in die DNA-Helix ein und
bildet mit der DNA Komplexe. Versuche an
isolierter DNA und hoher Konzentration
von AO führen zu Depolymerisation der
DNA, einer strukturellen Veränderung des
DNA Strangs durch Auftrennung der
Dop pelh elix in zwei Einz elst räng e
(ssDNA), die unter Einwirkung von Licht
und Sauerstoff bis zum Bruch der DNA
führen kann [5]. Daher kann AO unter
solchen Umständen mutagen wirken. Bei
Auftrennung der DNA Stränge interagieren
die Farbstoffmoleküle ähnlich wie bei RNA
und es erfolgt eine zusätzliche Bindung der
Farbstoffmoleküle untereinander, welche
gelb bis rot fluoresziert. Diese Befunde an
isolierter DNA oder fixierten Zellen können
jedoch nicht unmittelbar auf lebende Zellen
übertragen werden [10].
Umgekehrt sind die Verfärbungen der mit
AO gefärbten DNA-Helix der Chromosomen
ebenfalls auf diese Weise zu deuten. Ciliaten
der Gattu ng C h ilodo n ella tret e n i n
bestimmten Phas en der K ultur einer
Aquarienprobe gelegentlich häufiger auf.
Chilodonella gehört zu einer Gruppe von
Mikroskopie, Dustri-Verlag Dr. Karl Feistle GmbH & Co. KG, https://www.dustri.com/
DOI 10.5414/MKX0058
Abb. 3. Photobleaching der gefärbten Macronuclei (Ma) eines erdbewohnenden
Ci li aten. E in zelbilder wurd en au s der V id eo sequenz g ewonnen in
Phasenkontrast (A) und Fluoreszenz (B, C, D). Aufnahme (B) wurde bei
maximaler Intensität der Fluoreszenz LED nach Umschaltvorgang gewonnen bei
0,00 s, sowie in der Folge bei 2,76 s (C) und 5,52 s (D) Dauer der Sequenz.
Gefärbter Detritus (De) am Vorderende des Ciliaten, ungefärbte Vakuole (V) und
ein vermutlich phagozytiertes Objekt (Ph), welches in einem späteren Teil der
Sequenz aus der Zelle ausgeschieden wird (Exocytose, nicht abgebildet). Plan-
Neofluar 40x/0,75 Ph2, ohne Farbkorrektur.
Ciliatengattungen, welche ausgeprägte
Riesenchromosomen zeigen und auch in der
Genetik der Ciliaten eine wichtige Rolle
spielen [ 1 9]. E in e vorüberg e h e n d e
Depolymerisation der DNA-Helix geschieht
auf natürliche Weise bei der Mitose
(Kernteilung). AO Färbung zeigt den
M a c r o n u c l e u s m i t s e i n e n
R ie s e n c h r o m o s o m e n, s ow ie d en
lichtmikroskopisch kaum identifizierbaren
Micronucleus (Abb. 4A-4F). Zellen in
Interphase zeigen grün gefärbte Macro- und
Micronuclei (Abb. 4A, 4F). Auch die bereits
geteilten Micronuclei eines kopulierenden
Paares sind grün gefärbt (Abb. 4B). Während
der Mitose werden verschiedene Phasen der
Teilung von Macro- und Micronucleus
sichtbar (4C-4E). Der Micronucleus fehlt
von der späten Anaphase (Bild 4C) bis zur
Telophas e (Bild 4D), b ei d e r sich
lichtmikroskopisch bereits die Einschnürung
der Zelle abzeichnet. Der Macronucleus von
Chilodonella weist in der Telophase bei
starker Vergrößerung deutlich gelb gefärbte
Regionen depolymerisierter DNA auf (Bild
4D). Der Micronucleus wird erst mit der
Teilung der Tochterzellen wieder gebildet
(Bild 4E). Depolymerisierte DNA fördert die
Anlagerung von Gruppen der planaren
Moleküle des Farbstoffs AO, die sich „wie
ein Stapel Münzen aneinanderreihen“ [10].
Die örtlich höhere Konzentration von AO
führt zur Verschiebung der Fluoreszenz ins
Rote durch Eigenfilterung des Farbstoffs. In
d e r v i s u e l l e n B e t r a c h t u n g u n d
Nachbearbeitung der Videoaufnahme findet
man daher knotige Strukturen der beiden
sich neu bildenden Zellkerne in Regionen
aktiver DNA gelb verfärbt. Auf diese Weise
ist die i n der M it os e a u f t r et e nd e
Depolymerisation der DNA über die
Metachromasie des AO gut zu lokalisieren.
Stabilität des AO-DNA-Komplex
G ö rtz ( 1 988 ) b es ch r eib t , d as s
Paramecium in keiner Phase des Zellzyklus
Chromosomen zeigt [6]. Der Macronucleus
von Paramecium erscheint, falls überhaupt,
mit AO homogen gefärbt, auch während der
Teilung. Es ist häufig zu beobachten, dass
Paramecium eine entfärbte Region des
Mikroskopie, Dustri-Verlag Dr. Karl Feistle GmbH & Co. KG, https://www.dustri.com/
DOI 10.5414/MKX0058
Abb. 4. Verschiedene
Zellstadien von
Chilodonella sp.: Der
Macronucleus (Ma) von
Chilodonella zeigt auch in
der Interphase (Bilder A
und F) und während der
Kopulation (Bild B) eine
auffällige Struktur.
Mi cronu clei (Mi ) sow ie
Nahrungsvakuolen
(= Pha gos om, Ph ) s ind
ebenfalls markiert. Durch
höhere Konzentration von
AO in Regionen
depolymerisierter DNA ist
anhand der Gelbfärbung
eine Unterscheidung der
sich in Teilung befindlichen
Macronuclei von solchen in
Ruhephase (grün) möglich
(Bild C, D). Beschreibung
der Abbildungen im
Haupttext. Optik: Plan-
Neofluar 40x/0,75 Ph2 (A-
C, E, F); N-Achroplan 63x/
0,85 Ph3 Trockenobjektiv
(D), Farbkorrektur.
Ze llker n zeigt, wä hrend di e übrigen
Organellen intensive Fluoreszenz des
Farbstoffs aufweisen (Abb. 6). Auch bei
anderen Gattungen findet man homogen
gefärbte Macronuclei in verschiedener
Anzahl ohne erkennbare Chromosomen
(Abb. 2 und Abb. 3). Einer der Gründe ist
das bereits beschriebene Photobleaching
gefärbter DNA, welches teilweise sehr
schnell e r f o l g t . Die F ak t o r e n , die
Photobleaching von AO in der lebenden
Zelle beeinflussen, sind praktisch kaum
erforscht. Robbins et al. (1963) betonen, dass
eine sinnvolle Interpretation der Färbung nur
be i g ena uer Kontrolle ve rsc hie den er
Parameter wie Farbstoffkonzentration,
Temperatur und pH-Wert möglich sind [20].
Eigene Beobachtungen an Ciliaten legen
komplexe Diffusionsprozesse durch die
unterschiedlich beschaffenen Membranen
der Organellen nahe. Bei einigen Gattungen
der Ciliaten scheint die Diffusionsrate des
Farbstoffs in den Zellkern erheblich
geringer, als bei den übrigen Organellen,
weshalb vorwiegend Phagosome und andere
Organellen intensive Fluoreszenz aufweisen
können. Ein Austausch der zerstörten
Farbstoffmoleküle findet im Zellkern
offenbar nur sehr langsam durch Diffusion
des Farbstoffs in der Zelle statt. Die Bindung
des AO-DNA-Komplex ist eventuell sogar
irreversibel selbst nach dem Ausbleichen
(des vermutlich zerstörten Moleküls). Bei
anderen gefärbten Organellen kann AO
off e n b ar l e i c hter d i ffundi e r e n. D i e
Wa h r s c h e i n l i c h k e i t , dass M o l e k ü l e
ausbleichen, scheint in diesen Organellen
geringer oder die Diffusionsrate aus dem
Cytoplasma in saure Organellen ist höher,
was die wesentlich länger anhaltende
Fluoreszenz der übrigen Organellen erklären
könnte. Festzuhalten bleibt jedoch, dass
gelungene Kernfärbungen wenigstens eine
strikte Einhaltung der Konzentration des
Farbstoffs, eine gute Vorbereitung und
längere Einwirkdauer des Farbstoffs AO
erfordern.
Endocytose und das Acidosom
Die Beobachtung, dass AO RNA rot
färbt, löste eine interessante Kontroverse
über die rot fluoreszierenden Bestandteile
der Zelle aus. Der Effekt hat in die Literatur
auch unter der Bezeichnung „Acridinorange
Partikel“ Eingang gefunden und induzierte
versch iede ne The orien, die let ztlich
verworfen wurden, unter anderem auch die
mutma ß l i che F ä rbung v on R N A i n
Mit o chond r ien (das Deri v at N onyl-
Acr i dinor a nge w ird in d e r Ta t zur
Mitochondrien Färbung verwendet, stellt
chemisch jedoch eine andere Verbindung dar
und sollte nicht mit dem gewöhnlichen AO
verwechselt werden). Robbins et al. (1964)
fanden stattdessen komplexe Interaktionen
zw i s c he n A O un d Ph o s p ha ta s e in
multivesikulären Körpern bei der Färbung
von HeL a-Ze l len [21 ] (me nsch lich e
Karzinomzellen, welche in Zellkultur
G e g e n s t a n d w i s s e n s c h a f t i c h e r
Untersuchungen sind). Offenbar konzentriert
sich AO bevorzugt in Organellen mit einem
sauren pH-Wert und lagert sich bevorzugt
auch an Phosphatgruppen an [10]. Allen &
Fok (1983) konnten saure Organellen auch
für Paramecium nachweisen [1]. Die in
Paramecium von AO rot gefärbten und neu
entdeckten Organellen wurden aufgrund
ihrer sauren Eigenschaft Acidosome genannt.
Im Elektronenmikroskop können Acidosome
von anderen Organellen, wie Lysosomen,
M it oc h o n d r i e n o d er L ip o s o m e n
unterschieden werden. Ramoino et al. (2012)
zeigen mit Methoden der Fluoreszenz im
Konfokal-Mikroskop, wie Lysosome und
Acidosome die Verdauungssekrete für die
Phagosome (Nahrungsvakuolen) liefern,
welche durch Abschnürung der Zellmembran
entstehen [18]. Die Bildung der Phagosome
kann in der Fluoreszenz gut beobachtet
werden. Im Farbspektrum zwischen grün
und rot lässt sich der unterschiedliche pH-
Wert der Nahrungsvakuolen über die Zeit
verfolgen, welche anfangs rötlich (sauer)
und später über Gelb ins Grüne umschlagen
(weniger sauer). Die Beobachtung solcher
Vorgänge erfordert nicht zwingend ein
Konfokalmikroskop. Auch mit Auflicht-
Fluoreszenz und einer DSLR können die
Vorgänge mit dem Mikroskop in der
lebenden Zelle sehr gut visuell beobachtet
und gefilmt werden (Abb. 6). Die lang
anhalten de Fluore sz enz d e r sauren
Organellen ermöglicht bei hoher ISO Zahl
und moderater Fluoreszenzbeleuchtung
Filmau fnah men übe r e inen län gere n
Zeitraum. Messungen des pH-Werts in der
Zelle mittels AO scheinen jedoch nicht
praktikabel, da die Färbung auch von
and e ren Fakto ren abhän g t, w ie d er
Tem p er a tu r . A uc h N O 3– A ni o ne n
(Nitrationen) können ein Aggregieren der
basischen AO-Moleküle fördern, wa s
ebenfalls zu roter Fluoreszenz führt [7].
Exocytose und Trichocysten
Im Gegensatz zur Aufnahme von Stoffen
bezeichnet Exocytose den Stofftransport
über Vesikel durch die äußere Zellmembran
hindurch nach außen. Bei Ciliaten kommt
auch den Trichocysten eine Aufgabe im
Rahmen der Exocytose zu. Busch & Satir
(1989) beschreiben für Paramecium saure,
von Membranen umschlossene Vesikel, in
welchen die Trichocysten gebildet werden
und die mit AO Färbung fluoreszieren [3].
Lumpert et al. (1992) zeigen in einem
anderen Experiment, dass die Trichocysten
von Paramecium mit AO in höhere r
Konzentration und unter UV Anregung
Mikroskopie, Dustri-Verlag Dr. Karl Feistle GmbH & Co. KG, https://www.dustri.com/
DOI 10.5414/MKX0058
orange gefärbt werden [13]. Gleichzeitig
widersprechen sie allerdings dem Befund,
dass diese Vesikel ungewöhnlich sauer seien.
Hinsichtlich der Anregungswellenlängen
unterscheiden sich die bisherigen Befunde:
Busch & Satir verwendeten einen Filtersatz
mit Anregung bei 465 nm, während Lumpert
et al. eine Anregung bei 436 nm mittlerer
Wellenlänge verwendeten [3][13]. So könnte
die unterschiedliche Färbung ein Hinweis
darauf sein, dass die Metachromasie von AO
n i ch t n ur v o n u nt e rs c hi e dl i ch e n
Kulturbedingungen, sondern auch von der
Wahl der Anregungsenergie abhängt. Daher
sollte der verwendete Filtersatz und die
Beleuchtung (z.B. LED oder Xenon Lampe)
stets genau beschrieben sein. Der Verfasser
konnt e mit d er h i e r besc h r i ebenen
Blauanregung bei Paramecium (vgl. Material
und Methoden) bislang keine besonders
auffällig e F ärbu ng der Trich ocysten
beobachten, auch wenn die Trichocysten im
Phasenkontrast sehr gut zu erkennen sind.
Bei anderen Gattungen der Ciliaten des
Süßwassers jedoch fallen mit AO Färbung
und Blauanregung rot-orange gefärbte
Organellen knapp unterhalb der äußeren
Zellmembran auf (Abb. 7, Abb. 8). Die Lage
der Organellen entlang der Zellmembran
scheint den lichtmikroskopisch erkennbaren
Reihen der Cilien oder Strukturen der
Zellmembran zu folgen. Dieser Befund
wid e rspri c ht z unäch s t den früh e ren
Be oba cht ung en ins ofe rn, als sie für
Paramecium vom Verfasser nicht in der
gleichen Art und Weise bestätigt werden
können. Die Wirkung von AO als pH-
Indikator legt wiederum nahe, dass rote
Fluoreszenz auf saures Milieu hinweist. Die
Lage der gefundenen Verfärbungen unterhalb
der Zellmembran könnte zudem darauf
hinweisen, dass die gefärbten Regionen
ebenfalls an der Exocytose beteiligt sind.
Ein e Färb ung v on Lys o somen oder
Acidosomen erscheint weniger plausibel, da
diese Organellen aufgrund ihrer Funktion im
inneren Cytoplasma und eher statistisch
verteilt zu vermuten sind, dort jedoch keine
rote Färbung beobachtet wird. So bleibt
zunächst offen, welche Ursache diese
F ä r b u n g b e i d e n b e o b a c h t e t e n
Ciliatengattungen tatsächlich hat und ob hier
ebenfalls Trichocysten gefärbt werden.
Immerhin ist diese partielle, rote Färbung
von Vesikeln unter der Zellmembran ein
charakteristisches Merkmal, das nicht bei
allen Gattungen der Ciliaten beobachtet
werden kann. Im Umkehrschluss kann dies
auch als ein Merkmal zur Bestimmung bei
der Beobachtung im natürlichen Medium
(z.B. Fundortwasser) genutzt werden.
Schlussbemerkungen
Es stellt sich heraus, dass Protokolle in
der Fachliteratur für nicht eingearbeitete
Leser nicht immer einfach zu verstehen und
zu vergleichen sind. So sollen in dieser
Arbeit auch das Färbeprotokoll und die
Methode sowie deren Begründung im
Vordergrund stehen. Bei der Färbung mit AO
sp ielen Rezep tur en der Fä rbelösun g,
Beschaffenheit des Kulturmediums und
offenbar auch die Beleuchtungstechnik eine
wichtige Rolle. Lichtquellen, mittlere
Wellenlängen und Verlauf der Transmission
des verwendeten Filtersatzes erscheinen
ebenso wichtig, um eine Vergleichbarkeit der
Ergebnisse herzustellen und sollten daher
stets genau beschrieben werden. Die früher
typischen, in der Fluoreszenz verwendeten
Lichtquellen, wie Halogen- oder Xenon-
Lampe, unterscheiden sich von LEDs oder
La s e rlic h t m o de rn er F l uo resz e n z-
Mikroskope, weswegen die Resul tate
unterschiedlich ausfallen können.
Die Wirkung von Acridinorange auf
verschiedene Zellorganellen ist vielfältig und
in den letzten 125 Jahren sicherlich längst
ni cht volls tän dig aufge klä rt worden.
Bisherige Ergebnisse zeigen ein scheinbar
widersprüchliches Bild der Färbungen, in
Mikroskopie, Dustri-Verlag Dr. Karl Feistle GmbH & Co. KG, https://www.dustri.com/
DOI 10.5414/MKX0058
Abb. 5: AO Färbung von Paramecium. Neben dem ungefärbten Macronucleus
(Ma) sowie den beiden typischen, pulsierenden Vakuolen (pV). zeigen grün,
gelb und rot gefärbte Phagosome (Ph) unterschiedlichen, vorwiegend sauren
pH-Wert an. Winzige, rot gefärbte Acidosomen (Ac) durchziehen den hinteren
Teil das Cytoplasma. Am Ende des Cytostom (Cy, Mundöffnung) bildet sich ein
neues Phagsosom (Ph*), um das sich bereits Acidosome sammeln. Plan-
Neofluar 40x/0.75 Ph2, Anpassung der Gradation ohne Farbkorrektur.
dem jedoch Trends erkennbar sind. Weitere
Un tersuchungen ersche ine n d urc hau s
lohnenswe rt . A O unters tü t zt d ur ch
spezifische Färbung die Bestimmung der Art
– nicht nur durch eine Färbung der
Zellkerne. Nicht selten wird bei Protozoen
eine rasche Entfärbung des stabilen AO
DNA-Komplex im Zellkern beobachtet. Dies
kann bei Pro tozoen zur Fehldeutung
gefärbter Organellen (z.B. Phagosome)
fü hre n, fal ls der Zellk ern ungefärbt
erscheint.
Die toxische Wirkung von AO ist
differenziert zu betrachten. Die von Raab
(1900) beschriebene Phototoxizität ist
zweifellos ein wichtiger Befund [17] und
führte zur Entwicklung der Phototherapie.
Kasten (1967) beschreibt andererseits, dass
ohne Einfluss von Licht Zellteilung und
Pro t einsy n these weit e rhin unges t ört
vonstatten gehen [10]. Der Verfasser konnte
für Paramecium bis zu vier Tagen bei
Auf e nthalt in AO noch Zellt e ilung
beobachten. Die Beobachtung ist begrenzt
durch die Möglichkeit unter Deckglas in der
feuchten Kammer Kulturen längere Zeit zu
erhalten. Solche Experimente sind besser in
Reaktionsgefäßen oder größeren Behältern
mit AO zu kultivieren. Zudem scheint
Phototoxizität bei niedriger Konzentration
mit der Verweildauer der Ciliaten im
Farbstoff abzunehmen. Betrachtet man die
Wirkung von AO, nämlich sich in den DNA
Strang einzulagern und auch in sauren
Organe llen anz ureic hern , s tell t dies
sicherlich einen invasiven Eingriff in die
Zelle dar, der einem osmotischen Schock
während der Diffusion des Farbstoffs in die
verschiedenen Organellen gleichkommt. So
wird bei Färbung mit Fluorophoren auch ein
Qu e l l en d e r g e f ä rb te n Orga n e l le n
beschrieben. Eine These zur Erklärung
dieses Effekts wäre, dass aufgrund der
invasiven Veränderungen (Einlagerung von
AO in die DNA-Stränge, Anlagerung an
Phosphatase und Phosphatgruppen) auch das
allmähliche Erreichen eines Diffusions-
Gleichgewichts durch die permeablen
Membranen der Zelle und ihren Organellen
eine gewisse Entspannung der Zelle bewirkt
und die anfängliche Toxizität wieder
herabsetzt (Gewöhnungseffekt). Sicherlich
ist der Einfluss der Färbemethode hier
wichtig (z.B. Mischen mit Kulturlösung, um
w e ite r en o sm o s ti s che n S t re s s z u
vermindern). Ähnliche Effekte konnten vom
Verfasser auch mit anderen Fluorophoren
(z.B. Rhodamin B, Rhodamin 6G, Rhodamin
12 3) beobachtet werden, für w elche
ebenfalls noch nach Tagen lebende und
teilungsfähige Zellen gefunden werden.
Un abh äng ige Beobachtungen anderer
Beobachter sollten diese Befunde jedoch
untermauern.
Für den Mikroskopiker biete t der
Farbstoff AO über die Kernfärbung hinaus
wei tere Mög lich keit en. Ein e hö here
Konzentration und Eigenfilterung des in der
Zelle diffundierenden AO führen zu einer
Ve r sch i eb un g d e s M a x imu m s d e r
Fluoreszenz von Grün über Gelb zum roten
Licht. Vom pH-Wert abhängig stellt AO
Organellen auf interessante Weise im Grün-
Gelb-R ot Kont rast dar. Cyt opla sma ,
Phagosome (Nahrungsvakuolen), Acidosome
und Lysosome und in bestimmten Fällen
auch Regionen der Trichocysten oder
Cilienstrukturen werden in verschiedenen
Farben eingefärbt. Mit depolymerisierter
ss DNA und RNA wer den Komplexe
gebildet, die ebenfalls gelb bis rötlich
fluoreszieren. Solche Fähigkeiten sind vor
allem auch didaktisch interessant für den
Biologieunterricht, um die Vorgänge der
Zellteilung anschaulich darzustellen,
Regionen aktiver DNA zu markieren oder
die Verdauung der Ciliaten zu demonstrieren.
Die beschriebene Methode der AO
Färbung liefert bei verschiedenen Gattungen
der Ciliaten unterschiedliche , jedoch
charakteristische Ergebnisse. Daher können
AO Färbungen auch eine Einordnung der
Mikroskopie, Dustri-Verlag Dr. Karl Feistle GmbH & Co. KG, https://www.dustri.com/
DOI 10.5414/MKX0058
A bb . 7 . N i c h t n äh e r
bestimmter Ciliat aus einer
Kultur des Altwassers eines
Aquariums. Das Zellplasma
(Cy) erscheint strukturiert
mit kleinen Vesikeln (grün)
durchzogen. Die Fokuslage
entspricht der Ebene der
oberen Zellmembran. Rot
fluoreszierende Vesikel (rV)
liegen eventuell
unregelmäßig den Linien der
Cilien folgend unter der
äußeren Zellmembran und
geben dem Bild eine
räumliche Dimension. Plan-
Neofluar 40x/0.75 Ph2, ohne
Farbkorrektur.
jeweiligen Gattung erleichtern. Die sichere
Interpretation roter Färbungen setzt voraus,
dass die Kultur der untersuchten Protozoen
(z.B. Paramecium) frei von Photosynthese
treibenden Protozoen und Algen ist, welche
für Ciliaten auch Nahrung darstellen.
Kulturen sollten daher generell dunkel
st ehen. Da Chlorophyl l i nte nsi v r ot
fluoresziert, kann die Anwesenheit von
Chlorophyll durch eine Gegenprobe eines
ungefärbten Präparats in Fluoreszenz rasch
überprüft werden. Die Fluoreszenz von
Chlorophyll fällt in digitalen Fotos tiefrot
aus, ist mit dem bloßen Auge jedoch weniger
gut zu erkennen. Die korrekte Interpretation
der Färbung kann auch über Doppelfärbung
mit anderen Fluorophoren geklärt werden
(z. B. R hoda min B, Hoech st 33258 ,
LysoTracker, MitoTracker).
Bezugsquellen
Acridinorange-Zinkchlorid kann bei der
Firma Omikron in Rietberg bezogen werden.
Sigma Aldrich, Carl Roth, PromoKine oder
Life Technologies liefern auch das teurere,
re ine Hy drochlor id, nicht jedoch an
P r i v a t pe rs o n e n . M ik r o s k o pi sc h e
Vereinigungen können eventuell bei der
B e s c h a f f u n g h e l f e n . D a s
Sicherheitsdatenblatt des Farbstoffs ist zu
b e a c h t e n , d a s T r a g e n v o n
Sc hut zha nds chu hen is t o bli gat ori sch .
Pipetten und Waagen können im Fachhandel
oder Online Versand bezogen werden.
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DOI 10.5414/MKX0058
Abb. 8. Acineria uncinata im
B a k t e r i e n f i l m d e r
Wasseroberfläche.
Phasenkontrastaufnahme (A),
Dun kelf eld zur bes s ere n
Darstellung der ventralen (vC)
und oralen (oC) Cilien (B) und
AO Färbung (C). Neben zwei
Macronuclei (Ma) und der
pulsierenden Vacuole (pV)
erkennt man rot verfärbte
Ve sik el ( rV) en t lan g d e r
Zellmembran. Phako und
Fluoreszenz m it EC Plan-
Neofluar 40x/0.75 Ph2,
Dunkelfeld mit N-Achroplan
40x/0.65 Ph2.
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Heimerzheimer Str. 2
53332 Bornheim
tbauer@microinformatics.net
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DOI 10.5414/MKX0058
