Content uploaded by Oleksii Khudyi
Author content
All content in this area was uploaded by Oleksii Khudyi on Sep 07, 2015
Content may be subject to copyright.
Біологічні системи. Т. 4. Вип. 4. 2012 393
УДК 597.551.2 – 111.12:546.173
ВПЛИВ НІТРИТНОЇ ІНТОКСИКАЦІЇ НА СИСТЕМУ ВІДНОВЛЕННЯ
МЕТГЕМОГЛОБІНУ В ЕРИТРОЦИТАХ КАРАСЯ СРІБЛЯСТОГО
Л.В. Худа, М.М. Марченко, Я.Ю. Хачман, О.І. Худий
Чернівецький національний університет імені Юрія Федьковича,
вул. Коцюбинського, 2, м. Чернівці, 58012, e-mail: lidia_khuda@email.ua
Досліджували вплив нітритної інтоксикації на вміст метгемоглобіну та функціонування системи його від-
новлення в еритроцитах карася сріблястого Carassius gibelio (Bloch). Встановлено підвищений вміст метгемо-
глобіну за дії усіх досліджуваних концентрацій NaNO
2
та зниження метгемоглобінредуктазної та каталазної
активності еритроцитів. Провідна роль у процесі відновлення метгемоглобіну при підвищенні концентрації
нітритів у плазмі крові належить неензиматичним механізмам із залученням глутатіону та аскорбінової кис-
лоти.
Ключові слова: нітрити, метгемоглобін, еритроцити, Carassius gibelio.
Вступ. Одним з найефективніших методів ін-
дустріальної аквакультури є вирощування риби
за контрольованих умов в установках із замкну-
тим водопостачанням, що, поряд із високою
щільністю посадки, дозволяє досягти значно ви-
щої рибопродуктивності у порівнянні з тради-
ційними типами рибних господарств. Однак, такі
технології ускладнюються можливістю амоній-
но-нітритної інтоксикації гідробіонтів. Амоній –
основний продукт білкового метаболізму у риб,
видаляється з середовища завдяки конверсії у ні-
трити та в подальшому у нітрати, що здійсню-
ється на біофільтрах. Розбалансування процесів
нітрифікації може призвести до накопичення у
водному середовищі значних концентрацій ніт-
ритів (Raja, 2011; Svobodova, 2000).
Як відомо, основним проявом нітритної інто-
ксикації є посилене формування в еритроцитах
метгемоглобіну. Гемоглобін, перетворюючись у
метгемоглобін при переході заліза гему у форму
Fe
3+
, втрачає свою основну кисень-транспортну
функцію, що зумовлює розвиток гемічної гіпок-
сії. За фізіологічних умов в еритроцитах риб рі-
вень метгемоглобіну може варіювати в широких
межах за рахунок функціонування багатокомпо-
нентної системи його відновлення (Солдатов,
2002). Неензиматичне відновлення метгемогло-
біну відбувається за участю глутатіону та аскор-
бінової кислоти. Однак, основним фактором, що
контролює рівень оксигенації-дезоксигенації ге-
моглобіну, є функціонування ензиму NADH-
залежної метгемоглобінредуктази (NADH-Н-
цитохром b
5
-редуктаза, КФ 1.6.2.2), що виконує
роль специфічного переносника електронів від
NADH через цитохром b
5
на MtHb (при цьому
залізо в гемі переходить із тривалентного стану в
двовалентний). Шляхом редукції із системою
NADH-H-редуктази майже 70-90% MetHb тран-
сформується в Hb (Saleh, 2012; Проданчук,
2007). Гомеостатична функція крові сформована
таким чином, що механізми оксигенації-дезокси-
генації гемоглобіну, окислення-відновлення глу-
татіону та інших ензиматичних та неензиматич-
них шляхів відновлення метгемоглобіну
пов’язані між собою в одну буферну систему,
спрямовану проти вибіркової деструктивної дії
окисників, причому не лише на гем, а і на глобін.
Метою роботи було визначення впливу нітри-
тної інтоксикації на вміст метгемоглобіну та фу-
нкціонування системи його відновлення в ерит-
роцитах карася сріблястого Carassius gibelio
(Bloch).
Матеріали та методи. Відбір проб крові здій-
снювали із спинної аорти з використанням в яко-
сті антикоагулянта гепарину. Еритроцити відді-
ляли від плазми центрифугуванням при 500g та
тричі промивали у розчині Рінгера. Виділені ери-
троцити розподіляли на 6 груп: контрольну та 5
дослідних, які підлягали 30-хвилинній інкубації
при 20ºС в розчині Рінгера, що містив наступні
концентрації NaNO
2
: 7,25 ммоль/л (І група);
14,5 (ІІ); 72,5 (ІІІ); 145,0 (ІV) та 217,5 ммоль/л
(V). Відомо, що напівлетальна доза нітрит-іонів у
воді для низки видів прісноводних риб складає
1,45 ммоль/л (Alexander et al., 2009; Svobodova et
al., 2000). Враховуючи, що для риб характерною
є десятикратна акумуляція нітрит-іону в плазмі
крові (Kroupova et al., 2006), концентрації нітрит-
іонів в середовищі інкубації еритроцитів були ві-
дповідно збільшені.
Вміст метгемоглобіну оцінювали спектрофо-
тометрично ацетон-ціангідриновим методом.
Метгемоглобінредуктазну активність визначали
за швидкістю відновлення метгемоглобіну в при-
сутності NADH (Горячковский, 2005). Каталазну
активність оцінювали за швидкістю утилізації
пероксиду водню в кольоровій реакції з молібда-
том амонію (Біохімія гідробіонтів, 2009). Вміст
394 Біологічні системи. Т. 4. Вип. 4. 2012
відновленого глутатіону визначали в реакції з
5,5-дітіо-біс-(2-нітробензойною) кислотою (Ме-
тоды оценки…, 2009). Вміст відновленої аскор-
бінової кислоти визначали за різницею між вміс-
том усіх форм аскорбату та суми дегідроаскорбі-
нової та дикетогулонової кислот (Горячковский,
2005).
Вміст загального білку визначали методом
Лоурі, гемоглобіну – гемоглобінціанідним мето-
дом (Методические указания…, 1999).
Статистичну обробку даних проводили з ви-
користанням критерію Стьюдента.
Результати й обговорення. Дослідження по-
казали підвищений вміст метгемоглобіну в ерит-
роцитах карася за дії усіх застосованих концент-
рацій нітритів (рис. 1). Найбільш посилене фор-
мування MtHb відмічається в еритроцитах риб ІІ
та ІІІ груп
.
– його частка сягає близько 50% від
вмісту загального гемоглобіну. Це може бути
зумовлено недостатньо ефективною реакцією си-
стем відновлення на зростання рівня MtHb в ери-
троцитах досліджуваного виду риб.
0
10
20
30
40
50
60
K I II III IV V
%
*
*
*
*
*
Рис. 1. Вміст метгемоглобіну в еритроцитах кара-
ся сріблястого за дії різних концентрацій NaNO
2
Примітка (тут і надалі): К – контрольна група, І – 7,25 ммоль/л
NaNO
2
, ІІ – 14,5 ммоль/л, III -72,5 ммоль/л, IV – 145,0 ммоль/л, V – 217,5
ммоль/л. * - вірогідна різниця порівняо з контролем.
Fig. 1. The content of methemoglobin in erythrocytes of
Carassius gibelio under the condition of different
NaNO
2
concentrations
Note (hereinafter): К – control group, І – 7,25 mmol/l NaNO
2
, ІІ – 14,5
mmol/l, III -72,5 mmol/l, IV – 145,0 mmol/l, V – 217,5 mmol/l. * - significant
difference compared to control group.
Для перевірки цього припущення нами було
досліджено рівень метгемоглобінредуктазної ак-
тивності еритроцитів, адже відомо, що головним
компонентом, що в нормі забезпечує відновлен-
ня метгемоглобіну в гемоглобін, є цитозольна
форма NADH-Н-цитохром b
5
-редуктази (NADH-
метгемоглобінредуктаза) (Saleh, 2012).
Очевидно, що зростання рівня метгемоглобіну
мало б викликати активацію редуктазної систе-
ми. Однак, нами встановлено, що інкубація ерит-
роцитів карася з усіма варіантами концентрацій
NaNO
2
викликає пригнічення активності дослі-
джуваного ензиму (рис. 2 А). Зниження метгемо-
глобінредуктазної активності на фоні зростання
відсоткового вмісту метгемоглобіну може вказу-
вати на порушення у функціонуванні даного ен-
зиму. Як відомо, метгемоглобінредуктазна сис-
тема в еритроцитах утворена двома складовими –
NADH-редуктазою та цитохромом b
5
. В молеку-
лярній структурі гему b цитохрому b
5
присутній
іон заліза. Подібно тому, як нітрити атакують
гем у складі гемоглобіну, інші гемопротеїни, зо-
крема цитохром b
5,
за цих умов також зазнають
зміни ступеня окислення іону заліза (Moraes,
2002). Відповідно, пошкоджуюча дія нітрит-іонів
може проявлятися у зниженні ензиматичної ак-
тивності.
Підтвердженням припущення щодо інгібую-
чої дії нітрит-іонів на метгемоглобінредуктазний
комплекс через зміну ступеня окислення іону за-
ліза гему є результати наших досліджень зміни
каталазної активності еритроцитів карася. Так,
нами встановлено знижений у порівнянні з конт-
ролем рівень каталазної активності еритроцитів
за умов нітритної інтоксикації. Як відомо, ката-
лаза складається з чотирьох ідентичних субоди-
ниць, кожна з яких містить простетичну гемову
групу, до складу якої входить залізо. В еритро-
цитах каталаза разом з глутатіонпероксидазою і
метгемоглобінредуктазою попереджають нако-
пичення метгемоглобіну в фізіологічних умовах
шляхом захисту гемоглобіну від окислення. По-
казано, що нітрит-аніони (при концентрації від
10
-3
М і вище) можуть зв’язуватись із залізом ге-
му каталази (Маєвська, 2004). Оскільки гем вхо-
дить до складу активного центру ензиму, то така
взаємодія може спричиняти інгібування активно-
сті каталази.
Таким чином, метгемоглобінутворюючі аген-
ти можуть окислювати гемоглобін як безпосере-
дньо, так і опосередковано, пошкоджуючи ензи-
матичні системи захисту гемоглобіну від окис-
лення або системи, що каталізують відновлення
метгемоглобіну.
Зазначимо, що NADH-залежна метгемоглобі-
нредуктаза є основним відновлюючим агентом в
еритроцитах риб за фізіологічних умов. Імовірно,
за досліджуваних нами високих концентрацій ні-
тритів пріоритетними в відновленні MtHb стають
альтернативні шляхи за участю низькомолекуля-
рних сполук. Прямою редукуючою дією на мет-
гемоглобін саме за нітрит-індукованих метгемо-
глобінемій володіє аскорбінова кислота та глута-
тіон.
Відомо, що процес окислення гемоглобіну ні-
тритами спряжений з генерацією активних спо-
Біологічні системи. Т. 4. Вип. 4. 2012 395
лук та вільних радикалів – супероксидного ані-
он-радикалу, NO·, ONOO
-
, Н
2
O
2
тощо. Вагомий
внесок у формування антиоксидантного потенці-
алу еритроцитів належить глутатіону, редокс-
система якого (GSH-GSSG) служить буфером,
який захищає від деструктивної дії активних
форм кисню. Легке окислення сульфгідрильних
груп відновленого глутатіону захищає SH-групи
гемоглобіну та низки білків і ферментів еритро-
цитів від вільнорадикального окислення. Таким
чином, можливість прямого відновлення метге-
моглобіну та антиоксидантні властивості GSH
зумовлюють його помітну роль у системі підт-
римання структури та функцій гемоглобіну.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
K I II III IV V
од. акт.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
K I II III IV
ммоль/хв.мг білка
A B
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
K I II III IV V
ммоль/мг білка
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
K I II III IV V
мкмоль/мл
C D
Рис. 2. Метгемоглобінредуктазна активність (А),
каталазна активність (В), вміст GSH (C) та аско-
рбінової кислоти (D) в еритроцитах карася срібля-
стого за дії різних концентрацій NaNO
2
Fig. 2. The methemoglobinreductase activity, catalase activ-
ity, content of GSH and ascorbatyc acid in erythrocytes of
Carassius gibelio under the condition of different
NaNO
2
concentrations
Порівняльні дослідження ряду авторів пока-
зали, що для еритроцитів риб характерна висока
концентрація GSH. Відношення GSH/Hb у них
значно вище, ніж у ссавців, що зумовлено знач-
ними пристосувальними можливостями еритро-
цитів гідробіонтів через їх перебування в змін-
них умовах водного середовища (Солдатов,
2002).
Нашими дослідженнями встановлено, що ін-
кубація еритроцитів карася з NaNO
2
зумовлює
майже триразове зниження вмісту GSH вже при
застосуванні найменшої з досліджуваних конце-
нтрацій нітритів. Одержані результати свідчать
про стрімке залучення відновленого глутатіону в
реакції еритроцитів на нітритну інтоксикацію.
Показано, що прямою відновлюючою дією на
метгемоглобін, окрім GSH, володіє аскорбінова
кислота, яка виступає потужним терапевтичним
агентом за умов нітритної метгемоглобінемії
(Проданчук, 2007). На відміну від людини,
приматів, деяких ссавців, у яких відсутні два
ферменти - D-глюкуронредуктаза і α-гулоно-γ-
лактоноксидаза, що забезпечують синтез аско-
рбінової кислоти з глюкози, аскорбінова кислота
в організмі риб синтезується (Verlhac, 2010). Ен-
догенний синтез аскорбінової кислоти дозволяє з
високою вірогідністю припустити, що вона є од-
ним з найпотужніших адаптаційних засобів, що
реагують на неспецифічні стрес-фактори.
Встановлено, що інкубація еритроцитів з
NaNO
2
в концентрації 7,25 ммоль/л (І група) при-
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
396 Біологічні системи. Т. 4. Вип. 4. 2012
зводить до майже дворазового зменшення вмісту
відновленого аскорбату, у порівнянні з контро-
лем, що, очевидно, пов’язано з його переходом у
дегідроаскорбінову кислоту після відповідного
залучення в якості відновлюючого агента та ан-
тиоксиданта.
Відомо, що відновлення дегідроаскорбінової
кислоти в аскорбінову відбувається досить
швидко у присутності сульфгідрильних сполук,
таких як цистеїн, глутатіон (Проданчук, 2007).
Збільшення концентрації в інкубаційному
середовищі NaNO
2
проявилось в нашому
дослідженні зростанням вмісту аскорбінової ки-
слоти із досягненням максимального значення
(серед дослідних груп) у V групі. Необхідно
відмітити, що у цій же дослідній групі нами
відмічений найбільший вміст відновленого
глутатіону. Імовірно, такі його кількості забезпе-
чують швидке відновлення дегідроаскобінової
кислоти.
Необхідно зауважити, що, загалом, найістот-
ніші відхилення досліджуваних показників від
контролю спостерігаються при застосуванні
найменших з апробованих концентрацій нітрит-
іонів. Інкубація еритроцитів із вищою концент-
рацією нітрит-іонів (IV та V групи) призводила
до накопичення метгемоглобіну в менших кіль-
костях та утримання функціональної активності
компонентів системи його відновлення в межах,
близьких до контрольних значень.
Висновки. Значне накопичення метгемогло-
біну в еритроцитах карася сріблястого за умов
нітритної інтоксикації зумовлене не лише безпо-
середньою дією нітрит-іонів на гемоглобін, а й
пошкодженням гем-вмісних ензимів, які за фізі-
ологічних умов забезпечують його відновлення.
У зв’язку з цим, провідна роль у процесі від-
новлення метгемоглобіну при підвищенні конце-
нтрації нітритів у плазмі крові належить неензи-
матичним механізмам із залученням глутатіону
та аскорбінової кислоти.
Список літератури:
1. Alexander J. Nitrite as undesirable substances in ani-
mal feed / J. Alexander, D. Benford, A. Cookburn //
The EFSA Journal. – 2009. – V. 1017. – P. 1-47.
2. Kroupova H. Nitrite intoxication of cоmmоn carp
(Cyprinus carpio L.) at different water temperatures /
H. Kroupava, J. Machava, V. Piackova // Acta Vet.
Brno. – 2006. – V. 75. – P. 561-569.
3. Moraes G. Biochemical effects of environmental ni-
trite in matrinxa (Brycon cephalus) / G. Moraes,
I.M. Avilez, A.E. Altran // Aqatic Toxicology: Mech-
anisms and Consequences. International Congress on
the Biology of Fish. Symposium Proceedings. – Van-
couver. – 2002. – P. 15-26.
4. Raja I.A. Blood and electrolyte responses in Clarias
batrachus exposed to nitrogen pollution / I.A. Raja,
H.P. Sapkal // Biosci. Biotech. Res. Comm. – 2011. –
Vol. 4, №2. – P. 219-222.
5. Saleh M.C. NADH-dependent cytochrome b
5
reductase and NADPH methemoglobin reductase ac-
tivity in the erythrocytes of Oncorhynchus mykiss /
M.C. Saleh, S. McConkey // Fish Physiol. Biochem. –
2012. – №38(6). – P.1807-1813.
6. Svobodova Z. Nitrite poisoning of fish in aquaculture
facilities with water-recirculating system /
Z. Svobodova, J. Machova, G. Poleszczuk // Acta Vet.
Brno. – 2000. – V. 74. – P. 129-137.
7. Verlhac V. The effect of vitamin C on fish health /
V. Verlhac, J. Gabaudan. – Centre for research in an-
imal nutrition, Saint-Louis Cedex. – 2010. – 35 p.
8. Біохімія гідробіонтів / Вогнівенко Л.П., Євтушен-
ко М.Ю., Шевряков М.В. та ін. – Херсон: Олді-
плюс, 2009. – 536 с.
9. Горячковский А.М. Клиническая биохимия в ла-
бораторной диагностике / А.М. Горячковский //
Одесса: Экология. – 2005. – 616 с.
10. Маєвська О.М. Активність каталази за дії нітриту
натрію / О.М. Маєвська, М.М. Бойко, М.М. Вели-
кий // Укр. біохім. журн. – 2004. – Т. 76, №5. –
С. 140-143.
11. Методические указания по проведению гематоло-
гического обследования рыб / Минсельхозпрод
РФ. – 1999. – №13-4-2-/1487. – 20 с.
12. Методы оценки оксидативного статуса / Под ред.
Рахманова Т.И., Матасова Л.В., Семенихина А.В.
и др. – Воронежский гос. у-нт, 2009. – 62 с.
13. Проданчук Г.Н. Токсические метгемоглобинемии:
механизмы формирования и пути оптимизации ле-
чения / Г.Н. Проданчук, Г.М. Балан // Соврем.
проблемы токсикологии. – 2007. – №1. – С. 37-45.
14. Солдатов А.А. Особенности структуры, полимор-
физм и устойчивость к окислению гемоглобинов
рыб / А.А. Солдатов // Журн. эвол. биох. и физиол.
– 2002. – Т. 38, №4. – С. 305-308.
NITRITE INTOXICATION INFLUENCE ON THE METHEMOGLOBIN REDUCTION IN
ERYTHROCYTES OF PRUSSIAN CARP
L.V. Khuda, M.M. Marchenko, Ya.Yu. Hachman, O.I. Khudyi
The effects of nitrite intoxication on the content of methemoglobin and the system of its reduction in erythrocytes
prussian carp Carassius gibelio (Bloch) have been investigated. It was found an increased amount of methemoglobin
for all investigated concentrations NaNO
2
and decrease methemohlobin reductase and catalase activities in erythro-
cytes. Leading role in the methemoglobin reduction with increasing concentrations of nitrite in blood belongs
nonenzymatic mechanisms involving glutathione and ascorbic acid.
Keywords: nitrite, methemoglobin, erythrocytes, prussian carp.
Отримано редколегією 30.05.2012
