![Tableau 4 : Valeur nutritionnelle par 100 g de fruits de Eugenia jambolana [30]](https://www.researchgate.net/profile/Santatra-Ravelomanantsoa/publication/280040316/figure/tbl1/AS:614304055324717@1523472908896/Tableau-4-Valeur-nutritionnelle-par-100-g-de-fruits-de-Eugenia-jambolana-30_Q320.jpg)
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UNIVERSITE D’ANTANANARIVO
_______________
FACULTE DES SCIENCES
_______________
DEPARTEMENT DE BIOLOGIE ET ECOLOGIE VEGETALES
________________
MEMOIRE POUR L'OBTENTION DU DIPLOME D'ETUDES APPROFONDIES
en BIOLOGIE et ECOLOGIE VEGETALES
Option : PHYSIOLOGIE VEGETALE
Les endophytes de Eugenia jambolana Lam. (MYRTACEae) :
un modèle de relation plante – microorganismes.
Présenté par :
Santatra Herilalaina RAVELOMANANTSOA
Maître ès Sciences
______
Soutenu publiquement le 20 décembre 2004
Devant la commission d'examen composée de :
Président :
Rapporteurs :
Examinateur :
Professeur RAMAVOVOLOLONA
Docteur Eliane RALAMBOFETRA
Docteur Christian RABEMANANTSOA
Professeur Blandine ANDRIANARISOA
Mes hommages au Professeur Didier RAVELOMANANA, Professeur Titulaire à la
Faculté des Sciences, Responsable du troisième Cycle en Sciences Biologiques Appliquées,
Option Physiologie Végétale qui a daigné me prendre comme étudiant préparant le Diplôme
d’Etudes Approfondies et qui m’a considéré instinctivement comme sa fille.
REMERCIEMENTS
Je rends grâce au Seigneur Dieu Tout puissant qui, par son Eternel Amour et sa
Bénédiction, me guide chaque jour vers le droit chemin en me tendant Sa Sainte Main. Que
Son Nom soit sanctifié.
Ce mémoire est le fruit de la collaboration entre l’Université d’Antananarivo,
l’Institut Malgache de Recherches Appliquées (IMRA), et l’Université libre de Bruxelles
(ULB). Le travail a été réalisé dans le laboratoire de Microbiologie de l’IMRA, au sein des
deux unités : « Validation des Nouvelles Pistes et Opportunités » et « Biodiversité » du
département Biomédical.
Ma ferveur et mon admiration au Professeur RAKOTO-RATSIMAMANGA,
Fondateur de l’Institut Malgache de Recherches Appliquées (IMRA).
Ma reconnaissance au Professeur Suzanne RATSIMAMANGA, Présidente de
l’IMRA, qui a bien voulu accorder ma demande de stage au sein de son institut, en vue de la
préparation du Diplôme d’Etudes Approfondies.
Ma gratitude au Docteur Kiban CHEUK, Directeur du Département Biomédical de
l’IMRA, Co-promoteur du projet « Biodiversité et Biotechnologie à MADAGASCAR », qui,
directement ou indirectement, a contribué pour l’accomplissement de mon stage à l’institut.
Mes respects au Docteur Christian RABEMANANTSOA, Maître de Recherches à
l’IMRA, Chef du laboratoire « Validation des Nouvelles Pistes et Opportunités » et de
« Biodiversité », Coordinateur pour l’IMRA de l’Unité Biodiversité, de m’avoir accueilli dans
son laboratoire et de me diriger dans mon travail malgré ses multiples engagements.
Ma sympathie à l’égard de :
- Professeur Mondher El JAZIRI, Directeur de Laboratoire de Biotechnologie végétale de
l’Université libre de Bruxelles, de m’avoir proposé ce sujet intéressant, pour les précieux
conseils et les recommandations très utiles qu’il m’a prodigué pour mener à bien mon
travail,
- Professeur Anne Marie CORBISIER, Directeur de Laboratoire de Microbiologie à
l’Université catholique de Louvain pour les discussions scientifiques que nous avons eues,
- Docteur Erick Francisco RAKOTONIRIANA, Responsable du laboratoire de
Microbiologie à l’IMRA, pour les précieuses aides dans le transfert de connaissance et
pour les appuis techniques qu’il m’a offerts au cours de mon travail. Son intègre sévérité
envers moi et ses critiques instructives m’ont permis de découvrir la délicatesse de ce
travail.
Mes remerciements les plus sincères s’adressent aussi aux membres du Jury :
- Madame RAMAVOVOLOLONA, Professeur, Enseignant-chercheur, Responsable de la
formation doctorale au département de Biologie et Ecologie végétales, à la Faculté des
Sciences, qui a bien voulu accepter de présider le jury de ce mémoire.
- Madame Blandine ANDRIANARISOA, Professeur Titulaire à la Faculté des Sciences,
Chef des laboratoires de Biotechnologie – Microbiologie du département de Biochimie
fondamentale et Appliquée, qui a bien voulu examiner ce travail. Vous m’avez montré
votre intérêt sur le travail que j’ai réalisé. Votre présence parmi les membres du Jury
m’honore.
- Madame Eliane RALAMBOFETRA, Maître de conférences à la Faculté des Sciences,
Chef de Laboratoire de Physiologie Végétale d’avoir accepté d’être mon rapporteur. Vos
encouragements et vos précieux conseils m’ont été très utiles dans la réalisation de ce
mémoire.
Mes vifs remerciements à tout le personnel et à tous les chercheurs de l’IMRA, surtout
l’équipe du laboratoire de Microbiologie qui ont offert leur généreuse collaboration pour la
réalisation de ce travail.
Mes amitiés à mes camarades de promotion qui ont su créer une ambiance conviviale
maintenue dans un esprit de collaboration et de solidarité tout au long de notre vie au
laboratoire.
Ma considération envers mes parents, mes sœurs, mon frère et mes amis pour leurs
soutiens et les encouragements qu’ils m’ont prodigués.
Enfin, à toux ceux qui ont contribué, de près ou de loin à ce travail et à tous ceux qui
ont bien voulu honorer de leur présence cette présentation, veuillez recevoir mes sincères
remerciements.
TABLE DES MATIERES
Page
REMERCIEMENTS
Glossaire
Liste des abréviations
Liste des annexes
Listes des figures
Liste des tableaux
INTRODUCTION ........................................................................................................... 1
PREMIERE PARTIE : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
I GENERALITES ................................................................................................... 4
I-1 Interactions entre les organismes vivants ................................................... 4
I-2 Interaction plante - microorganisme ........................................................... 4
I-3 Introduction à l’endophytisme .................................................................... 5
I-3-1 Historique ....................................................................................... 5
I-3-2 Terminologie ................................................................................. 5
I-3-3 Définition ....................................................................................... 6
II BIOLOGIE DES ENDOPHYTES .................................................................... 6
II-1 Les endophytes ......................................................................................... 6
II-1-1 Les champignons ........................................................................... 6
II-1-2 Les bactéries .................................................................................. 7
II-2 Notion d’écologie des endophytes ............................................................. 7
II-2-1 Localisation ................................................................................... 7
II-2-2 Distribution ................................................................................... 8
II-2-3 Source des endophytes .................................................................. 8
II-3 Action des facteurs du milieu ................................................................... 8
II-3-1 La plante hôte ................................................................................ 9
III-3-2 L’environnement .......................................................................... 9
II-3-2-1 Les facteurs biotiques ....................................................... 9
II-3-2-2 Les facteurs abiotiques ....................................................... 9
III- IMPORTANCE DES ENDOPHYTES ........................................................... 10
III-1 Activités des endophytes dans la plante hôte ........................................... 10
III-1-1 Facilité d’accès aux nutriments .................................................... 10
III-1-2 Influence sur la biologie de la plante hôte ................................... 11
III-1-3 Protection de la plante hôte contre leurs ennemis naturels .......... 11
III-2 Endophytes : source de métabolites bioactifs .......................................... 12
IV- LES METABOLITES SECONDAIRES ........................................................ 12
IV-1 Les métabolites secondaires des plantes .................................................. 12
IV-2 Les métabolites secondaires de microorganismes ................................... 12
IV-3 Les métabolites secondaires du système symbiotique ............................. 13
DEUXIEME PARTIE : PARTIE EXPERIMENTALE
I- MATERIELS ....................................................................................................... 16
I-1 Le matériel végétal ...................................................................................... 16
I-1-1 Systématique .................................................................................. 16
I-1-2 Description .................................................................................... 16
I-1-3 Distribution ..................................................................................... 17
I-1-4 Biologie .......................................................................................... 17
I-1-5 Phytochimie .................................................................................... 17
I-1-6 Utilisation ...................................................................................... 18
I-2 Les parties végétales utilisées ..................................................................... 20
I-3 Les souches bactériennes ............................................................................ 20
I-4 Les milieux d’étude..................................................................................... 20
I-5 Les désinfectants ......................................................................................... 20
II- METHODOLOGIE ........................................................................................... 21
II-1 Technique d’isolement des souches pures .......................................................... 21
II-1-1 Choix des échantillons à étudier ............................................................ 21
II-1-2 Traitement des échantillons .................................................................... 21
II-1-2-1 La stérilisation en surface .......................................................... 21
II-1-2-2 Préparation des échantillons stériles pour la culture .................. 22
II-1-3 Culture .................................................................................................... 22
II-1-3-1 Inoculation du milieu ................................................................. 22
II-1-3-2 Incubation .................................................................................. 22
II-1-3-3 Lecture des boîtes et transfert .................................................... 22
II-1-4 Purification des souches ......................................................................... 23
II-1-5 Conservation des souches ...................................................................... 23
II-2 Technique d’identification .................................................................................. 24
II-2-1 L’étude des caractères culturaux ............................................................ 24
II-2-2 L’étude des caractères morphologiques et structuraux .......................... 24
II-2-2-1 Examen microscopique .............................................................. 25
II-2-2-2 Les critères morphologiques et structuraux ............................... 25
II-2-3 L’étude des caractères physiologiques ................................................... 26
II-2-4 L’étude des caractères biochimiques...................................................... 27
II-3 Recherche d’activité antimicrobienne ................................................................ 28
II-3-1 Induction de synthèse de métabolites secondaires chez les bactéries .... 28
II-3-2 Etude de l’activité antimicrobienne........................................................ 28
II-3-2-1 Méthode de diffusion sur gélose ou méthode des disques ......... 29
II-3-2-2 Mode opératoire : Antibiogramme............................................. 30
TROISIEME PARTIE : RESULTATS – INTERPRETATIONS – DISCUSSIONS
I- LES MICROORGANISMES ENDOPHYTES ISOLES ........................................... 33
Interprétations des résultats ........................................................................................ 36
Discussion ................................................................................................................... 38
II- IDENTIFICATION DES MICROORGANISMES ENDOPHYTES ............. 40
II-1 Les champignons endophytes de Eugenia jambolana ........................................ 40
Interprétations des résultats ............................................................................... 46
II-2 Les bactéries endophytes de Eugenia jambolana ................................................ 48
II-2-1 Etude des caractères culturaux ................................................................ 48
II-2-2 Etude des caractères morphologiques et structuraux .............................. 48
II-2-3 Etude des caractères physiologiques et biochimiques............................. 48
Interprétations des résultats ...................................................................... 52
Discussion ................................................................................................................... 53
III- ETUDE DE L’ACTIVITE ANTIMICROBIIENNE ............................................... 56
Interprétations des résultats et discussions ................................................................. 57
CONCLUSION GENERALE ......................................................................................... 58
PERSPECTIVES .............................................................................................................. 59
ANNEXES
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
GLOSSAIRE
Acervule : fructification à base concave, recouverte par les tissus de l’hôte, d’abord close puis libre à
l’air par suite de l’éclatement des assises sus jacentes
Allélopathie : inhibition d’une espèce de plantes par des substances chimiques produites par une autre
plante
Apothécie : fructification en forme de coupe, pédicellée ou non, de certains champignons
Ascomycètes. La face supérieure des apothécies porte les asques et les ascospores.
Ascome : structure pluricellulaire des ascomycètes, couverte de cellules spécialisées, les asques. Il
peut être ouvert ou fermé. (= ascocarpe)
Ascomycète : ordre de champignons dont les spores naissent dans des asques
Ascospores : spore de champignons Ascomycètes produite à l'intérieur d'un asque.
Asque : cellule en forme de sac, libre ou contenue dans une fructification (périthèce, apothécie) à
l'intérieur de laquelle se forment les ascospores.
Baside : cellule cloisonnée ou non, spécialisée dans la production de basidiospores.
Basidiomycète : ordre de champignons dont les spores naissent sur des basides
Basidiospore : spore de champignons Basidiomycètes, portée par une baside.
Cleistothèce : ascome sphérique
Columelle : extrémité renflée du conidiophore autour de laquelle se différencient les spores.
Conceptacle : organe creux (périthèce ou pycnide) renfermant des organes reproducteurs.
Conidie : spore de multiplication asexuée produite en général par bourgeonnement à l'extrémité de
filaments mycéliens appelés conidiophores.
Conidiophore : filament différencié d'un champignon, spécialisé dans la production des conidies.
Corémie : conidiophores groupés en colonnette.
Endophyte : organisme parasite vivant à l'intérieur d'une plante.
Ecidie : structure cupuliforme des rouilles, où sont produites les écidiospores
Fermentation : extraction de l’énergie de composés organiques sans intervention de l’oxygène
Hyalin : qui a la transparence du verre, (antonyme : mélanisé)
Hyphe : filament mycélien qui constitue l'appareil végétatif des champignons.
In vitro : en milieu artificiel.
Macronémé : conidiophore différencié, éloignant les conidies des hyphes végétatifs
Mycélium : appareil végétatif du champignon constitué d'un ensemble de filaments appelés hyphes.
Mycorhize : filaments mycéliens entourant les radicelles des végétaux dont ils remplacent les poils
absorbants et avec lesquels ils vivent en association (symbiose).
Mycotoxines : métabolites synthétisés par les champignons eux-mêmes.
Périthèce : organe de reproduction de certains champignons Ascomycètes, généralement globuleux ou
en forme de poire et renfermant des asques et des ascospores.
Phialide : cellule située à l'extrémité d'un conidiophore, en forme de bouteille très allongée, produisant
des spores.
Pycnide : organe de reproduction asexuée, clos ou en forme de poire, elle est munie d'un ostiole par où
s'échappent les spores (pycniospores) souvent dans une gelée (cirrhe).
Pycniospores : conidies formées dans une pycnide.
Rostré : conidiome présentant un appendice en forme de bec
Saprophyte : organisme se nourrissant aux dépens de débris organiques ou végétaux.
Sclérote : organe de conservation d'un champignon formé de filaments mycéliens entrelacés à
membrane épaisse et dure.
Spore : organe de conservation ou de propagation des champignons issu de la multiplication asexuée
(conidie..) ou sexuée (ascospore, basidiospore...).
Sporocyste : cellule de la reproduction asexuée dont le contenu se transforme en spores qui
s'échappent par une ouverture ou une rupture de la paroi du sporocyste.
Sporodochie : masse de conidiophores placés côte à côte sur un stroma mycélien.
Sporulation : émission de spores.
Stérigmate : petit prolongement d'une cellule productrice de spores, qui porte ces spores.
Symbiose : association de deux espèces distinctes dont la vie en commun est profitable à chacune
d'elles
Téléomorphe : forme sexuée, stade parfait des champignons
Versicolore : de couleur variée
LISTE DES ABREVIATIONS
Aéro. str.
Ana. fac.
B, CB
B.
CaOCl2
C +
C -
CMA
CMP
CNRS
°C
E28, E37, E44
F.
Fr.
F
G +
G –
I
IMRA
j.
KCN
kDa
M
MEA
min.
ml
:
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:
:
:
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:
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:
:
:
:
:
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:
:
:
:
:
:
:
aérobie strict
anaérobie facultatif
bacille, coccobacille
bouillon
hypochlorite de calcium
catalase positive
catalase négative
milieu Corn Meal agar
chloramphénicol
Centre National de
Recherche Scientifique
degré Celsius
extraits bruts de 28, 37, 44
feuilles
fruit
fermentatif
gram positif
gram négatif
immobile
Institut Malgache de
Recherches Appliquées
jours
acide cyanhydrique
kilo dalton
mobile
milieu Malt Extract agar
minute
millilitre
mm
McF
MS
MUCL
nm
NI.
Nys
O +
O -
OA
PDA
Ram.
RBA
sec.
sp +
sp.
t/min
TSA
UI
V
vit. C
WA
Z.i
µ
µg
µl
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:
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:
:
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:
:
:
:
:
millimètre
MacFarland (3.108 bactéries/ml)
milieu Murashige & Skoog
Mycothèque de l’Université
catholique de Louvain
nanomètre
non identifié
nystatine
oxydase positive
oxydase négative
milieu Oat Meal agar
milieu Potato Dextrose agar
rameaux
milieu Rose Bengal agar
secondes
présence de spore bactérienne
espèce
tours par minute
milieu Tryptic Soya agar
unité internationale
volume
acide ascorbique (vitamine C)
milieu Water agar
zone d’inhibition
1 micromètre (10-6 m)
microgramme
microlitre
LISTE DES ANNEXES
Annexe
Annexe
Annexe
Annexe
Annexe
I
II
III
IV
V
:
:
:
:
:
Liste des champignons et bactéries pouvant être des endophytes ............................. .........
Milieux de culture ..................................................................................................... .........
Les caractères à mettre en évidence au niveau des organes
reproducteurs des champignons................................................................................ .........
Identification des bactéries ........................................................................................
Liste des indicateurs .................................................................................................. .........
Page
i
iv
v
vii
ix
LISTE DES FIGURES
Figure
Figure
Figure
Figure
1
2
3
4
:
:
:
:
Eugenia jambolana .................................................................................................... . .......................................................................
Champignons et bactéries isolés de Eugenia jambolana ........................................... ........................................................................
Colonisation des champignons endophytes dans les différentes
parties de Eugenia jambolana ................................................................................... ........................................................
Répartition des champignons et des bactéries endophytes dans les
différentes parties de Eugenia jambolana ................................................................. ........................................................
Page
17
37
42
55
LISTE DES TABLEAUX
Tableau
Tableau
Tableau
Tableau
Tableau
Tableau
Tableau
Tableau
Tableau
Tableau
Tableau
Tableau
Tableau
Tableau
Tableau
Tableau
Tableau
Tableau
Tableau
Tableau
Tableau
Tableau
Tableau
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:
Les métabolites secondaires des plantes et leurs propriétés ...................................... ........................................
Interaction et production de métabolites bioactifs .................................................... ...........
Composés chimiques rencontrés chez Eugenia jambolana ...................................... . ..................................................................................
Valeur nutritionnelle par 100 g de fruits de Eugenia jambolana .............................. ...................................................................................
Protocoles de désinfection ......................................................................................... .........................................................
Préparation des explants ............................................................................................ . ...........................................................
Les caractères morphologiques et structuraux .......................................................... ..................................
Expression de la sensibilité des microbes à l’antibiotique ........................................ .......................................................
La nature des deux produits témoins ......................................................................... .........................................
Echelle de McFarland ................................................................................................ ...............................................................
Résultats de l’isolement selon les explants, traitements et milieux ......................... .......................................
Les endophytes isolés dans les différentes parties de Eugenia jambolana ............... ....................
Les champignons endophytes isolés de Eugenia jambolana ....................................
Identification et classification des champignons endophytes ................................... .....................
Dominance et abondance des taxa dans chaque partie de Eugenia jambolana ........ ......
Distribution des mycètes dans les différentes parties de Eugenia jambolana .......... .........
Les caractères culturaux des colonies de bactéries ................................................... ..............
Les caractères morphologiques et structuraux des bactéries ..................................... .....
Les caractères physiologiques et biochimiques des bactéries ................................... ......................................................
Distribution des bactéries dans les différentes parties de Eugenia jambolana ......... .....................................................
Les caractéristiques de l’ensemble des espèces bactériennes ...................................
Les champignons endophytes pathogènes latents .....................................................
Zone d’inhibition induite par les extraits E28, E37, E44 .......................................... ..........................................................
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49
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54
56
- 1 -
INTRODUCTION
« J'espère prouver que la nature possède les moyens et les facultés qui lui sont
nécessaires pour produire elle-même ce que nous admirons en elle ». Lamarck
Tous les organismes vivants constituent un ensemble cohérent, d’une part, par leur
origine commune, d’autre part, en raison des relations et interactions multiples qui existent
entre eux les conduisant au niveau du globe à des associations complexes, logiques ,
dynamiques mais en équilibre.
La plupart des plantes hébergent des microorganismes endosymbiotiques, appelés
« endophytes », à l’intérieur de leurs tissus [17, 49]. Ces endophytes sont notamment
composés de bactéries et de champignons microscopiques [58]. Ils peuvent développer avec la
plante hôte diverses interactions qui sont souvent d’ordre trophique. Par ailleurs, ces
interactions pourraient aboutir à l’élaboration de métabolites dits « secondaires » chez le
système symbiotique. A ce sujet, il est probable que les endophytes puissent être impliqués
dans la synthèse de métabolites secondaires produits par la plante, qui constituent une source
importante de composés biologiquement actifs. Evoquons ici le cas du taxol : il a été découvert
que le taxol, un agent antitumoral, depuis toujours extrait du Taxus (If), est en réalité produit
par des champignons endophytes : Taxomyces andreane et Pestalotiopsis microspora, qui sont
isolés du bois de l’If [50].
La connaissance de l’interaction qui existe entre la plante hôte et l’(es) endophyte(s) se
révèle ainsi intéressante. Des efforts sur l’isolement des endophytes et l’étude de ses produits
naturels sont de nos jours entrepris.
A Madagascar, des isolements et études des microorganismes endophytes associés aux plantes
médicinales comme Centella asiatica, Catharantus, etc. sont actuellement en cours à l’Institut
Malgache de Recherches Appliquées (IMRA), dans le but de dépister le rôle éventuel des
endophytes dans la synthèse des principes actifs trouvés dans la plante.
- 2 -
Eugenia jambolana compte parmi les plantes d’intérêt médicinal et fait l’objet d’étude à
l’IMRA. En réalité, Eugenia jambolana est la plante à partir de laquelle le Professeur
RAKOTO-RATSIMAMANGA et ses collaborateurs de l’IMRA ont préparé le Madeglucyl®,
le premier antidiabétique mondial d’origine végétale. Le Madeglucyl® est un médicament
utilisé par les diabétiques. Aujourd’hui, le nombre des malades atteints du diabète devient de
plus en plus important et la demande annuelle en produits finis à partir des graines augmente
aussi. La mise sur le marché national et international de ce produit requiert ainsi une quantité
énorme de matières végétales. Et pourtant, la production annuelle de graines ne se fait qu’à une
saison bien déterminée, de courte durée et le rendement par pied est largement insuffisant pour
assurer les besoins annuels en matières premières. De plus, Eugenia jambolana n’est pas
encore cultivé mais pousse naturellement. A cet égard, porter des études sur les
microorganismes endophytes associés à Eugenia jambolana s’avère captivante car si les
endophytes sont impliquées d’une façon quelconque à la synthèse des principes actifs d’intérêt
médicinal ; par approche microbiologique nous pourrions soulever les problèmes précités, par
l’exploitation de ces endophytes. Néanmoins, faut-il encore démontrer l’existence de
microorganismes endophytes associés à Eugenia jambolana.
A ce propos, les objectifs poursuivis dans ce travail repose principalement sur
l’isolement des microorganismes endophytes associés à Eugenia jambolana, et l’identification
des endophytes isolés. Toutefois, une recherche d’activité antimicrobienne est entreprise dans
le but d’apprécier par anticipation le potentiel des microorganismes endophytes associés à
Eugenia jambolana.
Première partie :
SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
- 4 -
I GENERALITES
I-1 INTERACTIONS ENTRE LES ORGANISMES VIVANTS
L’interaction est au centre de l’écologie : il paraît impossible d’identifier un système
biologique dans son habitat naturel qui ne participe pas dans une forme d’interaction. Elle
joue un rôle prépondérant au cours de l’évolution des organismes qui interagissent. Au cours
du temps, elle devient de plus en plus nombreuse et étroite, et est à l’origine de la
diversification des plantes, mais également des microorganismes et des animaux participants
aux interactions. De plus, elle conduit à l’apparition de nombreuses adaptations
morphologiques, biochimiques et comportementales des organismes impliqués [38]. Les
relations entre organismes vivants au sein des populations et des biocénoses peuvent être :
des relations symbiotiques qui incluent entre autres [38] :
- le commensalisme : relation dans laquelle un organisme, le commensal, tire un
avantage alors que l’autre, l’hôte, n’est affecté. Souvent les deux organismes
mangent « à la même table » ;
- le parasitisme : mode de vie des organismes qui en parasite d’autres;
- le mutualisme : relation avantageuse entre deux organismes ;
- la pathogénicité : condition de vie des organismes provoquant une maladie ;
Par ailleurs, la relation pourrait renfermer de nombreuses imbrications de liens étroites,
intimes d’éléments divers.
des relations non symbiotiques qui s’expriment, en général, par la compétition. C’est
une interaction entre membres d’une même population ou des populations qui tentent de
se procurer une même ressource essentielle, disponible qu’en quantité limitée. Pour cela,
une espèce peut aller jusqu’à empêcher à une autre l’accès à cette ressource.
I-2 INTERACTION PLANTE - MICROORGANISME
Pour les microorganismes, les plantes peuvent se présenter dans l’espace et dans le
temps comme un habitat écologique où s’établissent diverses interrelations.
Les associations entre les plantes et les microorganismes sont anciennes et plusieurs
exemples de complexe symbiotique ont été décrits [46], à savoir : les mycorhizes, les lichens,
la relation plante – pathogène [38].
Une autre relation symbiotique entre plante et microorganisme attire actuellement
l’attention des scientifiques et devient sujet d’intérêt : c’est l’endophytisme qui exprime une
relation plante – endophyte.
- 5 -
I-3 INTRODUCTION A L’ENDOPHYTISME
I-3-1 Historique
La présence des microorganismes endophytes dans les plantes est établie depuis des
décennies [8].
Certes, des fossiles de restes végétaux qui datent du Dévonien contenaient déjà des
champignons endosymbiotes, mais ils étaient probablement saprophytes [38].
D’autre part en 1926, Perotti a établi une théorie stipulant l’existence de bactéries non
pathogène à l’intérieur des tissus de plantes ; mais les recherches sur ces bactéries ont été déjà
entreprises en 1870 par Pasteur et al. [17].
Hollis, en 1951, affirme que les tissus sont fréquemment colonisés par des procaryotes
endosymbiotiques ; une affirmation confirmé par Kloepper et al. en 1992 [47].
Aujourd’hui ces microorganismes endosymbiotes vivant à l’intérieur des tissus des plantes
sont appelés « endophytes ».
I-3-2 Terminologie
Le mot « endophyte » est un assemblage de mots grecs endon (dedans) et phuton
(plante) qui signifient littéralement « dans la plante ».
Plusieurs définitions sont attribuées au terme « endophyte » :
De Bary (1986) attribue au terme « endophyte » tout organisme habitant à l’intérieur des
tissus de plantes, distinct des épiphytes qui tapissent la surface des tissus végétales [41].
Kado (1992) définit les endophytes comme des microorganismes qui résident à l’intérieur
des tissus des plantes, sans les endommager, ni tirer du profit de l’association. Cependant
cette définition semble limitée car elle ne considère pas la possibilité des relations
symbiotiques avec l’hôte [17].
Quispel (1992) considère que les endophytes établissent une relation endosymbiotique
avec la plante par laquelle la plante tire profit (d’ordre écologique) de la présence du
symbiote. Encore une fois cette définition est restreinte incluant seulement les
microorganismes bénéfiques pour la plante et excluant ceux qui ont des actions neutres ou
effets négligeables sur la plante [17].
Par ailleurs, les pathogènes latents et quiescents sont eux aussi considérés comme
endophytes [21, 47] du moment où ils habitent dans les tissus de la plante.
Généralement, les endophytes incluent des bactéries et des champignons microscopiques
(Chanway, 1996) [17].
- 6 -
I-3-3 Définition
Le mot « endophyte » désigne des microorganismes : champignons et bactéries [17],
habitant dans les tissus des plantes, dont leur présence ne nuit pas la plante ou ne cause pas
d’effets négatifs immédiats à la plante. Cette définition inclue les spectres entiers des
interactions symbiotiques dans lesquelles les plantes et microorganismes participent :
parasitisme, commensalisme, mutualisme [47].
II- BIOLOGIE DES ENDOPHYTES
II-1 LES ENDOPHYTES
Il existe trois types d’endophytes :
les endophytes asymptomatiques : ce sont des microorganismes qui ne provoquent pas de
maladie à la plante hôte durant presque toute la durée de leur cycle de vie à l’intérieur de la
plante hôte (Bacillus spp., Cladosporium sp.) [45],
les endophytes symbiotiques : ils sont asymptomatiques mais qui forment des associations
bénéfique et mutuelle avec la plante hôte. Cas des bactéries fixatrices d’azote (Acetobacter
diazotrophicus), ou le champignon Rhizoctonia dans les graines des orchidées [45],
les endophytes pathogènes latents : ce sont de véritables phytopathogènes
(Colletotrichum sp., Alternaria alternata, etc.) mais qui ne s’expriment que si la plante se
trouve dans des conditions défavorables ou de stress tel que la sècheresse, l’attaque par les
insectes [45].
II-1-1 Les champignons
Appelé aussi « mycète », un champignon est un organisme : eucaryote, uni- ou
pluricellulaire, comprenant de nombreuses cellules assemblées en un réseau de filaments : le
mycélium ou thalle. L’hyphe est l’élément structural. Ce sont surtout les champignons
microscopiques ou micromycètes qui criblent souvent par leurs hyphes fongiques les tissus
des plantes.
Le champignon est un organisme hétérotrophe et quand il se nourrit, le champignon
fonctionne soit comme saprophyte, parasite ou symbiote.
Le règne des « Fungi » est composé de 4 embranchements :
CHYTRIDIOMYCOTA – ZYGOMYCOTA – ASCOMYCOTA – BASIDIOMYCOTA,
plus un groupe des DEUTEROMYCOTA ou FUNGI IMPERFECTI.
- 7 -
II-1-2 Les bactéries
Une bactérie est un organisme procaryote, unicellulaire, microscopique (de l’ordre de
quelques microns à 1 millimètre). Les bactéries présentent une diversité dans leur
morphologie, leur biologie qui évoque leurs caractéristiques structurales et fonctionnelles. Il
existe principalement 3 catégories de formes de bactéries : coque ou cocci – bâtonnet ou
bacille – spiralée ou spirochète.
Les bactéries sont classiquement représentées dans 12 ordres bien distincts et dont
chacun constitue un groupe hétérogène d’organismes [25, 26]:
PSEUDOMONALES – CHALMYDOBACTERIALES – HYPHOMICROBIALES –
EUBACTERIALES – CARYOPHANALES – ACTINOMYCETALES –
CYTOPHAGALES – MYXOBACTERIALES – SPIROCHETALES –
RICKETTSIALES – CHLAMYDIALES – MYCOPLASMATALES (qui constituent une
classe isolée, celle des MOLLICUTES).
Toutefois, les bactéries peuvent être groupées en GRAM NEGATIF (G+) et GRAM
POSITIF (G-) selon la capacité de leur paroi à fixer le colorant cristal violet (coloration de
Gram).
II-2 NOTION D’ ECOLOGIE DES ENDOPHYTES
Les endophytes ont été isolés, observés, étudiés chez une large sélection d’espèce de
plantes de Monocotylédones et Dicotylédones, allant des espèces ligneuses telles que les
chênes, les poivriers, le cerisier, le citronnier, vers les espèces herbacées comme les betteraves
sucrières, le maïs, la canne à sucre, les choux, le trèfle et les tomates [4, 21].
II-2-1 Localisation
Les endophytes occupent principalement les espaces intercellulaires des tissus
végétaux [17]. Par ailleurs, certaines bactéries endophytes présentent une colonisation
intracellulaire : dans les parenchymes des cellules, dans les vacuoles [17]. Les tissus internes
des plantes offrent un milieu favorable pour les microorganismes en les protégeant des
conditions extrêmes de l’environnement comme la température, la radiation ultraviolette, la
compétition microbienne, etc. [17].
- 8 -
II-2-2 Distribution
Les endophytes représentent un groupe écologiquement hétérogène. Ils se rencontrent
au niveau du système racinaire, du système caulinaire et des feuilles [4, 16, 17, 29, 58] et
peuvent être aussi présents dans d’autres parties de la plante telles que les fruits, les
tubercules, les graines et les ovules [29], dans les écorces, les chaumes des tiges [46].
D’autre part, des études plus poussées ont démontré qu’ils sont aussi présents dans le xylème
[46], notamment attachés à la paroi des vaisseaux [4].
La densité de la population de bactéries endophytes semble être considérable dans les
racines et dans les tiges [17] tandis que les champignons se rencontrent fréquemment dans la
partie supérieure de la plante (plus précisément dans les espaces intercellulaires des cellules
périphériques et des vaisseaux conducteurs [57]).
II-2-3 Source des endophytes
Les microorganismes endophytes peuvent provenir : du sol (rhizosphère) [17, 29], de
la surface des feuilles (phylloplane) [4,17], des organes végétatifs [17, 29], des semences ou
des graines [21, 58]. En outre, chez certaines plantes, l’association symbiotique est établie
depuis le stade graine [21, 58].
A l’exception des endophytes transmises par les graines, qui sont d’office présents
dans la plante, l’entrée des endophytes s’effectue généralement au niveau [17] :
des stomates : petites ouvertures dans l’épiderme des feuilles et des tiges par où
s’effectuent les échanges gazeux,
des lenticelles : zone spongieux à la surface de l’écorce des tiges, des racines, et des autres
parties de la plante, permettant les échanges de gaz entre les tissus internes et l’atmosphère à
travers le périderme,
des blessures : induites par les facteurs biotiques (champignons, parasites, nématodes,
insectes) et les facteurs abiotiques (température, labourage, greffage, taillage, etc.),
des racines : la colonisation y est abondante ; il se peut que la racine est le site primaire où
les endophytes pénètrent dans la plante [21].
II-3 FACTEURS DU MILIEU ET BIOLOGIE DES ENDOPHYTES
La microflore endophyte est une structure dynamique influencée par des facteurs
biotiques et abiotiques ; la plante hôte elle-même est l’un des facteurs majeurs d’influence.
- 9 -
II-3-1 La plante hôte
L’écologie des endophytes dans la plante est en relation étroite avec :
le type de tissu [21, 46],
l’âge de la plante [21, 46],
la distribution géographique de l’hôte [46,58] : L’abondance relative de la population
d’endophytes peut être différente selon la localisation géographique. Pour les espèces
identiques dans la même localité, la fréquence de colonisation des endophytes dans les
différentes parties de la plante varie largement mais les espèces d’endophytes présentes, dans
une plante déterminée, sont communes pour les autres espèces qui lui sont identiques [58],
le facteur temps : La densité de la population des endophytes à l’intérieur de la plante
résulte entièrement de l’immigration des endophytes et la sénescence d’une (des) partie(s) de
l’hôte qui leur servent d’habitat. Toutefois, la population n’est pas affectée par la reproduction
de l’hôte et l’émigration des endophytes [46, 58],
la physionomie de la plante hôte [58] : par exemple, la fréquence de l’infection
microbienne décroît au fur et à mesure que la canopée croisse. Les conditions y sont
défavorables pour les spores : l’intensité de la pluie peut disloquer les spores qui ne peuvent
pas se fixer, la radiation ultraviolette est élevée, l’humidité est faible.
II-3-2 L’environnement
II-3-2-1 Les facteurs biotiques
Les microorganismes associés à la plante [17]
Un endophyte coexiste avec d’autres microorganismes qui colonisent eux aussi la plante, à
savoir les virus, les autres bactéries et champignons. Plusieurs scénarii d’interactions entre
microorganismes peuvent être ainsi imaginés tel que la concurrence, l’antibiose, l’exclusion,
la symbiose et le mutualisme.
Les nématodes, parasites des plantes [17]
La présence de ces parasites semble augmenter le nombre total des bactéries endophytes. Les
blessures créées par les nématodes dans la racine au niveau de la zone d’élongation et de
différenciation serviront de porte d’entrée pour les bactéries. Une fuite de nutriments attire la
population bactérienne.
III-3-2-2 Les facteurs abiotiques
Les tissus internes de la plante fournissent un environnement protecteur des endophytes.
Cependant, de nombreux facteurs peuvent affecter indirectement la colonisation microbienne
- 10 -
dans le phylloplane et la rhizosphère, du moment où ces facteurs provoquent des effets directs
sur l’hôte, à savoir : la température, la pluie, la radiation ultraviolette, les facteurs
édaphiques.
La nature physique et chimique du sol incluant le pH, la salinité, la texture du sol affectent
indirectement les endophytes en altérant les communautés microbiennes saprophytes du
rhizosphère donc présélectionnent déjà les endophytes potentiels.
L’amendement organique peut entraîner des changements dans la population
d’endophytes en modifiant la physiologie de la plante [17].
III- IMPORTANCE DES ENDOPHYTES
L’exploitation des microorganismes remonte à la plus haute antiquité. Cependant, il a
fallu les découvertes de Pasteur en 1870 sur l’action des microorganismes dans la
fermentation d’une part, et la découverte de la pénicilline – antibiotique bactéricide produite
par Penicillium – en 1928 par Alexander Fleming, d’autre part, pour voir s’établir les
connaissances scientifiques précises des microorganismes et d’apprécier leurs valeurs utiles.
Dès lors, les microorganismes ont trouvé sa place dans l’industrie pharmaceutique, chimique,
alimentaire et agricole. Il ne faut pas, néanmoins négliger les méfaits causés par ces
organismes, à savoir les altérations au niveau de la santé, des fonctions des êtres vivants
(hommes, animaux, végétaux) qui provoquent la détérioration des aliments (pourriture) ; etc.
Concernant les endophytes, bien que leur existence est bien connue, la mise en valeur et
l’exploitation de leur activité potentielle ne sont florissantes que pendant ces dix dernières
années. A partir des résultats obtenus des différentes investigations portées sur ces
microorganismes, une liste exhaustive des rôles utiles et des valeurs des endophytes peut
s’établir.
III-1 ACTIVITES DES ENDOPHYTES DANS LA PLANTE HOTE
III-1-1 Facilité d’accès aux nutriments
Au cours de la germination des graines, les endophytes jouent, chez les plantes telles que
les orchidées, un rôle nourricier. De nombreuses orchidées contiennent des champignons
endophytes du genre Rhizoctonia. [23, 50]. Les graines d’orchidées étant si petites et non
chlorophylliennes, manquent de nutriments pour alimenter la croissance des graines.
Rhizoctonia, après la dispersion des graines, émet ses mycéliums hors de la graine et puisent à
l’extérieur les nutriments qui lui sont nécessaires. Corrélativement l’embryon sera alimenté.
- 11 -
Au niveau du système racinaire, des microorganismes endosymbiotes qualifiés
d’endomycorhizes augmentent l’absorption de l’eau et des nutriments du sol dans la
rhizosphère. [19, 23]. Par exemple, les glomales, avec le genre Glomus, qui forme des
mycorhizes à arbuscule font bénéficier la plante hôte du phosphore qu’ils absorbent. Il existe
aussi ceux qui sont capable de fixer l’azote atmosphérique, qui après transformation, sera
utilisé par la plante : cas de Rhizobium et Frankia.
III-1-2 Influence sur la biologie de la plante hôte
Des endophytes (Alternaria et Cladosporium) semblent induire une abscission prématurée
et la sénescence des feuilles (chez le blé et les haricots) [21].
En revanche, d’autres microorganismes comme Rhodococcus, une bactérie qui peut être
un endophyte, retarde la sénescence de la plante hôte après son infection [13].
Il existe des microorganismes qui entraînent un phénomène de gigantisme chez la plante,
c’est le cas de Gibberella fujikuroï, un champignon endophyte rencontré chez le riz. Ce
champignon produit de la gibbérelline, un facteur de croissance végétale favorisant la
germination et la croissance des plantes. [38, 59]
En outre, d’autres microorganismes comme Agrobacterium provoquent des tumeurs, qui
sont des amas de cellules indifférenciées, chez la plante hôte. Ces excroissances peuvent être
utilisées comme explant de la multiplication végétative [13].
III-1-3 Protection de la plante hôte contre leurs ennemis naturels
Les endophytes peuvent être des candidats potentiels comme contrôleurs biologiques
en protégeant la plante hôte des aléas de l’environnement et de leurs ennemis naturels tels que
les herbivores et les microorganismes pathogènes. Lorsque l’aptitude de la plante hôte à vivre
est réduite par les différents stress de l’environnement, la vie des endophytes sera aussi
affectée. Dans cette optique, il s’avère capital pour les endophytes de protéger leur hôte. Pour
cela, ils stimulent la plante à produire des substances allélochimiques comme les
phytoalexines, les phénols, les flavonoïdes et les alcaloïdes qui sont généralement des
métabolites secondaires toxiques qui paraissent protéger les plantes [58].
Par ailleurs, les endophytes peuvent construire et porter des gènes antibiotiques et insecticides
contre les pathogènes, les insectes et les herbivores respectivement [29].
Les rôles bénéfiques des endophytes peuvent être classés en 2 catégories bien
distinctes en se basant sur leur activité potentielle [21] :
Endophytes : Promoteurs de croissance
Endophytes : Agents de contrôle biologique
- 12 -
III-2 ENDOPHYTES : SOURCE DE METABOLITES BIOACTIFS
Auparavant, les sources majeures de métabolites bioactifs sont les microorganismes du
sol. Aujourd’hui, les endophytes constituent un trésor de nouveaux métabolites
biologiquement actifs [49]. La découverte de deux champignons endophytes : Taxomyces
andreane et Pestalotiopsis microspora, isolés du bois de l’if (Taxus), comme des
microorganismes producteurs de taxol, est un exemple, parmi tant d’autres, qui illustre
l’importance des ressources que peuvent posséder les endophytes. Le taxol est un diterpenoïde
à propriété antitumorale (Stierle, Strobel et Stierle, 1993 ; Strobel et al., 1993, une molécule
qui a valu des millions de dollars [49].
IV- LES METABOLITES SECONDAIRES
Les plantes produisent des composés qui ne sont pas produits directement lors de la
photosynthèse mais résultent de réactions du métabolisme secondaire. Les champignons et les
bactéries produisent de métabolites secondaires qui jouent un rôle important dans les
interactions avec les autres microorganismes (microorganismes, plantes, invertébrés et
mammifères) [28].
Les métabolites secondaires sont classés en 3 groupes principaux [38.] :
les terpenoïdes (taxol, caoutchouc, les glycosides cardiotoniques, etc.),
les composés phénoliques (lignine, flavonoïdes, anthocyanes),
les composés azotés (alcaloïdes, glycosides).
IV-1 LES METABOLITES SECONDAIRES DES PLANTES
Les métabolites secondaires sont typiquement produits dans un organe, tissu ou type
cellulaire spécifique, à des stades particuliers de développement (durant le développement de
la fleur, des fruits, de la graine ou des plantules). Ils se localisent dans toutes les parties de la
plante (trichomes, vacuoles, cires, glandes à huiles, etc.) mais distribués selon leur rôle
défensif. Les métabolites secondaires des plantes sont consignés dans le tableau 1.
IV-2 LES METABOLITES SECONDAIRES DE MICROORGANISME
Les microorganismes sont susceptibles de fournir de très nombreux métabolites
comme l’a montré le Pfizer Metabolites Handbook de Miller, 1961 [28]. L’étendu des
interactions possible, y compris l’antagonisme, la synergie et les autres interactions, entre
- 13 -
organismes - à travers leurs métabolites secondaires - et les autres systèmes vivants est
énorme. Les métabolites secondaires des microorganismes expriment en général des réactions
de l’organisme en conditions de stress.
Tableau 2 : Interaction et production de métabolites bioactifs
Interaction
Produits microbiens bioactifs
Microorganisme – Microorganisme
Antibiotiques, régulateurs, composés hormonaux
Microorganisme – Mammifères (homme)
Agents pharmacologique, immunologique,
enzymes inhibiteurs, aliments
Microorganismes – Invertébrés
Antiparasites, insecticides, antihelminthiques
Microorganisme – Plante
Phytotoxines, composés hormonaux, facteur de
croissance des plantes, phytoalexines, herbicides
IV-3 LES METABOLITES SECONDAIRES DU SYSTEME SYMBIOTIQUE
La cohabitation et l’établissement d’une association complètement compatible entre
les endophytes et la plante hôte sont apparemment basés sur le besoin des métabolites
secondaires qui manquent dans la plante hôte, et qui sont fournis par les endophytes. Certes, il
est probable que plusieurs endophytes produisent des métabolites secondaires ou induisent sa
synthèse chez la plante hôte. Ces métabolites secondaires jouent des rôles majeurs, en relation
avec la survie des microorganismes voire du système symbiotique.
Le degré d’expression chimique des endophytes mutualistes ne dépend pas seulement
des compétences biochimiques ou du génotype des endophytes, mais aussi ceux de la plante
hôte [2]. Il peut être également influencé par les facteurs de l’environnement ou des autres
facteurs nutritionnels de l’hôte [2].
- 14 -
Tableau 1 : Les métabolites secondaires des plantes et leurs propriétés
Métabolites secondaires
Caractéristique
Propriété
Exemples de plante
Les mucilages
macro glucides gonflant avec l'eau
adoucissant (sur tissus lésés),
expectorant, cicatrisant
Malvales, Violales, Lauraceae,
Tiliaceae...
Les gommes et les résines
substances insolubles dans les
solvants organiques
substances adhésives
"Résineux", Urticales, Hypericaceae,
Fabaceae (gomme arabique, adragante)
Les tanins
mélange de nature polyphénolique
avec polymérisation
capacité à coaguler (à former des
complexes stables) et à fixer les
protéines
Hamamelideae, Rosideae, Rhamnaceae,
Geraniaceae, Hippocastanaceae,
Araceae, Liliaceae, ...
Les hétérosides :
Les saponosides
Les cardiotoniques
Les anthracéniques
Les cyanogènes
Les lactoniques
Les sulfurés
molécules liées à des oses
hétérosides ou non
-
molécules liés à un sucre,
susceptibles de libérer de l’acide
cyanhydrique (HCN)
composés amers
molécules contenant des atomes
de soufre
moussent avec l’eau
agissent sur le coeur
purgatifs, laxatifs drastiques...
antispasmodique, calmant
pour la fabrication de solutions
alcoolisées, stomachique, apéritif
bon pour les phanères (ongle et
poils), et les voies respiratoires
Arecaceae, Renonculaceae, ...
Digitalis purpurea, le muguet, ...
Polygonaceae, Rhamnaceae
Rosaceae (laurier-rose), le manioc, ...
Gentianaceae
Crucifères, Lilioideae
Les huiles essentielles
substances à terpènes
(hydrocarbures oxygénés)
antiseptique, arôme, parfum,
antimoustique, ...
Lauraceae, Rutaceae, Piperaceae,
Myrtaceae, Geraniaceae,
Hypericaceae.
Les latex
émulsions ou suspensions
pouvant contenir des alcaloïdes
Papaveraceae, Euphorbiaceae,
Asteraceae, ...
Les vitamines
substances aminées
nécessaire en faible quantité au
maintien de la vie
Les plantes fournissent quasiment
toutes les vitamines
Les alcaloïdes
classe de composés organiques, à
caractère basique
principes actifs les plus importants
en pharmacologie et en médecine
Tabac (nicotine), café (caféine),
Quinquina (quinine), pervenche
(vincamine), Coca (cocaïne), ...
Deuxième partie :
PARTIE EXPERIMENTALE
- 16 -
Les objectifs principaux de ce travail consistent à : (1) isoler les endophytes associés à
Eugenia jambolana, (2) identifier les endophytes recueillis, (3) rechercher une activité
antimicrobienne chez quelques endophytes.
I- MATERIELS
I-1 LE MATERIEL VEGETAL : Eugenia jambolana Lam.
I-1-1 Systématique
Règne :
Sous Règne :
Super embranchement :
Embranchement :
Sous-embranchement :
Classe :
Ordre :
Famille :
Genre :
Espèce :
Synonymes :
Nom malgache :
Autres noms :
VEGETAL
EUCARYOTES
CORMOPHYTES
SPERMAPHYTES
ANGIOSPERMES
DICOTYLEDONES
MYRTALES
MYRTACEAE
Eugenia
jambolana Lamarck.
Syzygium cumini Skeels, Syzygium jambolanum DC.,
Eugenia cumini Druce, Eugenia djouat Perrieri, Myrtus
cumini Linné, Calyptranthes jambolana Willd.
Rotra (toute l'île), Robazaha (Betsileo), Rotrambazaha
(Merina), Varotra (Betsimisaraka).
Java plum, Purple plum, Jambul, Jaman, Jambolan (Inde) ...
I-1-2 Description
Figure 1 : Eugenia jambolana
- Port ligneux,
- Feuilles opposées simples,
- Fleur épigyne,
- Périanthe tétramère ou pentamère,
- Corolle dialypétale et actinomorphe,
- Androcée composé de plusieurs étamines bien développées
courbées dans le bouton,
- Carpelles soudées,
- Fruits ovales, charnus, à goût sucré ou acide, de couleur rose
violacée, à noyau oblongue multiembryonnaire.
- 17 -
I-1-3 Distribution
Eugenia jambolana est originaire des tropiques, particulièrement de l’Inde, à
Myanmar, de Burma, de Ceylan et des îles Andaman. C’est une plante tropicale qui est
naturalisée à Hawaï, aux Philippines, Zanzibar, Pemba, Mombassa, et au Kenya. Eugenia
jambolana est introduite très anciennement à Madagascar où elle est naturalisée. Elle se
trouve surtout dans les régions de basse altitude, surtout le long des marges des cours d’eau.
Eugenia jambolana est localisé ainsi sur la Côte-Est, la Côte-Ouest, à Vohémar,
Maroantsetra, Tamatave, Fort-Dauphin, Nosy-be, Majunga, Diégo-Suarez et aussi à Tuléar.
I-1-4 Biologie
Eugenia jambolana est une plante qui se développe bien à une altitude comprise entre
0 à 1800 m environ. Elle fleurit chaque année, principalement au printemps et fructifie à partir
de sa 5ème ou 6ème année. Les graines multiembryonnaires servent de matériel de propagation
et sont dispersées par les oiseaux et les mammifères.
Eugenia jambolana requiert un climat humide, mais pour la floraison et la
fructification elle préfère une période sèche. En revanche, les fruits sont mûrs pendant la
saison des pluies (au mois de Février à Avril) et chaque pied d’Eugenia jambolana produit
environ 15 à 180 kg de fruits à raison de 5 à 60 kg de graines.
Eugenia jambolana peut contracter des maladies telle que [30]:
« Black leaf spot » ou tâches noires sur les feuilles par Asterinella puiggarii (mycètes),
« Green curf » ou « algal leaf spot » par Cephaleura virescens (mycètes),
« Mushroom root rot » (pourriture des racines) par Clytocybe tabescens (mycètes),
Anthracnose par Colletotrichum glosporioides (mycètes),
« Leaf spot » par Phyllosticta eugeniae (mycètes).
I-1-5 Phytochimie
Eugenia jambolana renferme divers composés chimiques complexes, mais dont
quelques uns seulement sont identifiés.
- 18 -
Tableau 3 : Exemples de composés chimiques rencontrés dans Eugenia jambolana [30]
Composés chimiques
Partie de la plante
Triterpènes
Anthocyanes
Huiles essentielles
Acide oléanolique
Flavonol
Quercetin, myricetin, myretin
Flavonol glycosides
Tanins
Acide maslinique
Saponines
Alcaloïdes (jambosine)
Mono- et sesquiterpènes
Feuilles, fleurs
Fruits
Feuilles, tiges, fruits
Fleurs
Feuilles
Feuilles
Feuilles, racine
Feuilles, graines
Fleurs
Feuilles
Graines
Feuilles
In Morton J. (1987). : Jambolan, fruits of warm climates. p. 375-378
I-1-6 Utilisation
Plante millénaire, datant de -400 avant JC, Eugenia jambolana trouve sa valeur en
médecine traditionnelle pour ses vertus hypoglycémiantes.
Plante introduite à Madagascar, c’est vers 1957 que le professeur Rakoto-Ratsimamanga et
ses collaborateurs s’intéressèrent à Eugenia jambolana où ils ont effectué des études sur cette
plante, en particulier sur les graines, à l’Institut Malgache de Recherches Appliquées (IMRA)
et au Centre National de Recherche Scientifique (CNRS) de la Faculté de Médecine de
l’Université de Paris. Vingt cinq ans plus tard, le Madeglucyl®, le premier médicament
mondial antidiabétique d’origine végétale, est le fruit de ces plusieurs années de recherche et
d’observations.
A part son caractère normoglycémiant, Eugenia jambolana présente diverses propriétés.
Usage médicinal
Fruits
Feuilles
Ecorce
Boutons floraux
:
:
:
:
Astringent, stomachique, antiscorbut, diurétique, antidiarrhéique (jus),
gargarisme (jus).
Le jus est employé pour le traitement de la dysenterie, en cataplasme
sur les maladies de la peau (tanin), antibiotique, astringent.
Antibiotique, la décoction est utilisée pour le traitement de la
dyspepsie, la dysenterie, la diarrhée, clystère, utilisé en cas d’asthme,
de bronchite, gargarisme, bain de bouche pour les inflammations
locales.
Antibiotique
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Usage alimentaire
Les fruits sucrés et parfois acidulés sont souvent mangés comme dessert. Les analyses faites
en Asie et en Amérique tropicale permettent de dresser un tableau de la valeur nutritionnelle
par 100 g de la partie comestible du fruit [30].
Tableau 4 : Valeur nutritionnelle par 100 g de fruits de Eugenia jambolana [30]
Eau
Protéines
Matières grasses
Fibre brute
Hydrates de carbone
Cendre
Calcium
Magnésium
Phosphore
Fer
Sodium
Potassium
Soufre
83,7 - 85,8 g
0,7 – 0,129 g
0,15 – 0,3 g
0,3 – 0,9 g
14 g
0,32 – 0,4 g
8,3 – 15 mg
35 mg
15 – 16,2 mg
1,2 – 1,62 mg
26,2 mg
55 mg
0,83 mg
Cuivre
Chlorine
Vitamine A
Thiamine
Riboflavine
Niacin
Acide ascorbique
Choline
Acide folique
Acide gallique
Tanin
Acide oxalique
13 mg
8 mg
80UI
0,008 – 0,03 mg
0,009 – 0,01 mg
0,2 – 0,29 mg
5,7 – 18 mg
7 mg
3 mg
-
-
-
In Morton J. (1987). : Jambolan, fruits of warm climates. p. 375-378
Autres utilisations [30]
Feuilles
Ecorce
Bois
Nectar
Fruits
:
:
:
:
:
- En Inde, elles servent de fourrage pour le bétail.
- En Zanzibar et Pemba, les jeunes feuilles sont utilisées comme dentifrice.
- Les feuilles sont riches en tanin (12 à 13 % du poids sec) et contiennent des
enzymes (estérases, galloyl carboxylase)
- L’huile essentielle extraite des feuilles sert à fabriquer du savon et utilisée en
parfumerie et cosmétique.
L’écorce contient 8 à 19 % de tanin qui est utilisé en tannage du cuir et pour la
fabrication des filets de poisson.
Bois rouge, gris rougeâtre ou gris brunâtre, à fibre droite, résistante à l’eau et
les termites. Il sert à la fabrication des meubles, etc.
Les fleurs saillantes et fragrantes possèdent un nectar abondant et visitées par
les abeilles. Ainsi, Eugenia jambolana trouve sa valeur en apiculture avec un
miel de bonne qualité.
En Inde, quelques tribus utilisent les fruits et feuilles pour laver le visage après
la naissance et soigner les blessures faciales. Elle a aussi la propriété de
stimuler le cuir chevelu et régénérer les cheveux endommagés.
Aux Philippines, les fruits servent à fabriquer du vin et du vinaigre.
- 20 -
I-2 LES PARTIES VEGETALES UTILISEES
Nous avons extrait les endophytes des graines, les fruits, les rameaux fructifères, les
feuilles et les boutons floraux de Eugenia jambolana. Ils sont fraîchement collectés de
Eugenia jambolana, du jardin botanique de l’IMRA, pendant la période de fructification.
I-3 LES SOUCHES BACTERIENNES
Les souches bactériennes constituent les indicateurs. Elles sont fournies par MUCL
(Mycothèque de l’Université catholique de Louvain). Elles sont composées de germes
d’intérêt médical : Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa,
Bacillus subtilis, Candida albicans.
I-4 LES MILIEUX D’ETUDE
L’étude des endophytes s’effectue sur différents milieux selon les informations
recherchées.
Les milieux de culture
Milieux solides :
Champignons : Malt Extract agar (MEA), Potato Dextrose agar (PDA)
Bactéries : Trypto Soya agar (TSA)
Milieux liquides :
Champignons : milieu de Czapek Dox
Bactéries : bouillon de peptone de soja
Les milieux de conservation
Champignons : Oat Meal agar (OA), Corn Meal agar (CMA)
Bactéries : Beef Extract agar (gélose molle)
Les milieux de sporulation
Champignons : Oat Meal agar (OA), Corn Meal agar (CMA), Water agar (WA)
Les milieux pour l’étude du type respiratoire et de fermentation pour les bactéries
Respiration : Milieu VL
Fermentation : Milieu de Hugh et Leifson
I-5 LES DESINFECTANTS
Hypochlorite de Calcium (CaOCl2) 3 %
Ethanol 70 %
- 21 -
II- METHODOLOGIE
II-1 TECHNIQUE D’ISOLEMENT DES SOUCHES PURES
Le but est d’isoler des souches pures de microorganismes endophytes afin de les
identifier ensuite.
II-1-1 Choix des échantillons à étudier
L’échantillonnage est une étape essentielle puisque de sa bonne réalisation dépendra la
fiabilité des résultats.
Des échantillons sains, macroscopiquement dénués de lésions ou de tâches sont choisis. Après
le tri, les échantillons sont lavés et frottés légèrement avec du coton imbibé d’eau savonneuse
pour enlever les impuretés qui s’y sont déposés (terre, poussière, etc.).
II-1-2 Traitement des explants
II-1-2-1 La stérilisation en surface
Le but est d’éliminer les microorganismes qui adhèrent à la surface des tissus des plantes tout
en préservant la population microbienne intérieure.
Plusieurs gammes de méthodes de stérilisation ont été établies en faisant varier la
concentration ou l’ordre d’utilisation des désinfectants ou le temps d’immersion des explants.
Notons que les manipulations s’effectuent dans des conditions d’asepsie : travail sous hotte à
flux laminaire, désinfection des mains et des matériels avec de l’éthanol 70 %, manipulation
autour d’une flamme de bec bunsen dans un rayon de 15 centimètres.
Tableau 5 : Conditions de désinfection utilisées
Graines
Rameaux, feuilles, fruits, boutons floraux
1- Ethanol 70 % (1 min.)
2 - Flambage
1 - Ethanol 70 % (1 min.)
2 - Hypochlorite de Calcium 3 % (5 min.)
3 - Ethanol 70 % (1 min.)
4 - Rinçage 3 fois à l’eau distillée stérile
Test de stérilité : Pour vérifier l’efficacité de la désinfection en surface, la dernière eau de
rinçage ou la surface des explants stérilisée est ensemencée sur les milieux de culture. Au cas
- 22 -
où pousse des microorganismes, ils sont qualifiés de « contaminants ». Ils peuvent être utilisés
comme référence (si nous rencontrons des souches identiques aux contaminants, ils sont
systématiquement éliminés).
II-1-2-2 Préparation des échantillons préalablement stérilisés en
surface pour la culture isolement
Après désinfection, les explants sont préparés comme il est indiqué dans le tableau 6.
Tableau 6 : Préparation des explants
Fruits
Feuilles, tiges, boutons floraux
Fruits utilisés : fruits immatures et fruits mûrs
Parties utilisées : pulpe et graine
Pulpe mûre : la pulpe est prélevée avec
une pince.
Pulpe immature : n’étant pas encore
développé, elle est obtenu en découpant la
formation autour de la graine en petits
morceaux de 1 mm d’épaisseur.
Graines : elles sont découpées en fines
rondelles de 0,5 mm d’épaisseur.
Les feuilles sont découpées en petits
fragments de 2 mm de coté.
Les tiges sont façonnées en petits disques de
2 mm d’épaisseur.
Les boutons floraux sont broyés.
II-1-3 Culture
II-1-3-1 Inoculation du milieu
Après ces opérations respectives, les fragments sont déposés immédiatement sur
milieu nutritif solide approprié (MEA : champignons et TSA : bactéries) qui est contenu dans
des boîtes de pétri.
II-1-3-2 Incubation
Après inoculation, les boîtes sont maintenues à 26°C, favorables au développement
des microorganismes.
II-1-3-3 Lecture des boîtes et transfert
Les boîtes sont observées tous les jours en notant l’aspect des colonies, les espèces
dominantes, etc. Après quelques jours d’incubation, les colonies qui se sont développées sont
transférées dans une autre boîte pour sa croissance et pour permettre la croissance des autres
microorganismes à pousse plus lente dans la boîte mère.
- 23 -
II-1-4 Purification des souches
L’expression « culture pure » implique le développement d’une seule espèce
microbienne dans un milieu donné. En principe, tous les microorganismes de cette culture
présentent les mêmes caractéristiques morphologiques, anatomiques, physiologiques,
biochimiques.
Pour purifier, des repiquages successifs sur un nouveau milieu de culture à partir d’une seule
colonie bien isolée sont réalisés.
Cas des champignons : Lorsque le développement du mycélium à purifier est suffisant pour
permettre un prélèvement, un morceau d’explant est transféré en découpant la gélose dans une
nouvelle boîte.
Cas des bactéries :
- Pour chaque type de colonies, les piquer avec une pipette pasteur stérile,
- Diluer la colonie dans 1 ml d’eau distillée stérile,
- Faire un isolement par épuisement : elle consiste en un étalement progressif des
microorganismes sur une boîte de pétri à l’aide d’un fil de platine stérile, en effectuant des
stries à la surface de la gélose. A mesure que le fil s’éloigne de la zone de contact initial, le
nombre de bactéries présentes sur le fil diminue. Dans la dernière zone, c’est à dire dans la
zone la plus éloignée de l’endroit où le fil de platine a touché la gélose pour la première fois
que le nombre de bactéries est très faible ; ce qui nous permet d’obtenir des colonies bien
isolées dont chacune constituera une culture pure.
Puis les cultures sont incubées à 26°C à l’obscurité et observées journalièrement.
La vérification de la pureté des souches, pour les bactéries, est renforcée par l’observation de
leurs caractères morphologiques sous microscope à immersion, au grossissement x100 après
coloration de Gram des cellules.
II-1-5 Conservation des souches
Lorsque les souches obtenues sont pures, une colonie de la culture est transférée
directement dans un tube stérile bouché, contenant un milieu de conservation gélosé. La
souche est ainsi conservée pour d’autres utilisations ultérieures.
Le milieu de conservation est généralement un milieu pauvre en éléments nutritifs, ceci pour
ralentir la croissance des souches.
- 24 -
Cas des champignons :
Après stérilisation du milieu de culture (CMA et OA), les tubes sont légèrement inclinés dans
le but d’obtenir une gélose pente. Une portion de la souche pure est ensuite déposée sur cette
dernière. Les champignons, après quelques jours d’incubation et de croissance, sont ensuite
conservés soit sous huile, soit sous eau, c’est la conservation proprement dite.
- La conservation sous huile pourvoit une conservation à moyen ou à long terme des
champignons et des levures, en condition d’anaérobiose. Pour ce faire, la gélose pente et le
mycélium sont immergés d’huile de paraffine stérile.
- La conservation sous eau, quand à elle, assure une conservation à moyen ou à long
terme des champignons non sporulant et des levures. Cette fois ci c’est l’eau distillée stérile
qui remplit le tube.
Cas des bactéries :
Pour les bactéries les tubes sont maintenus verticalement pendant le refroidissement du
milieu. Les souches pures sont inoculées par piqûre centrale dans une gélose molle d’extrait
de viande puis incuber quelques jours à 26°C et conserver à l’abri de la lumière.
II-2 TECHNIQUE D’IDENTIFICATION
L’identification comprend : l’étude des caractères culturaux - l’étude morphologique
et structurale - l’étude des caractères physiologiques - l’étude de caractère biochimique des
microorganismes.
II-2-1 L’étude des caractères culturaux
Il permet d’observer macroscopiquement : l’aspect, le relief, le contour, la couleur, la
consistance, la forme, la taille des colonies et les transformations macroscopiques des
milieux de culture (présence de pigment, couleur).
II-2-2 L’étude des caractères morphologiques et structuraux
Chaque espèce possède une morphologie propre, reconnaissable principalement à
l’aide des critères morphologiques et structuraux. L’étude se fait sous microscope à
immersion, au grossissement x100 des cellules à l’état frais, après fixation et coloration du
frottis.
- 25 -
II-2-2-1 Examen microscopique
Examen à l’état frais : les colonies microbiennes sont montées entre lame et lamelle.
L’examen permet de connaître la morphologie, le mode de groupement, la mobilité des
cellules.
Examen après coloration pour les bactéries:
Coloration de Gram : cette méthode permet à la fois de connaître la forme des bactéries et
de les classer en 2 groupes en fonction de leur capacité ou non à retenir la coloration violette
du cristal violet dans les conditions opératoires :
1- solution de cristal violet (1 min)
2- solution d’iode (1 min.)
3- éthanol 95 % (1 min.)
4- solution de fuschine (1 min.).
Cellule violette : bactérie Gram positif, cellule rose : bactérie Gram négatif.
Coloration au vert malachite : elle met en évidence la présence ou l’absence des spores
bactériennes qui sont colorés en vert.
Examen après coloration au bleu de lactophenol pour les champignons :
Le bleu de lactophenol colore les spores en bleu.
II-2-2-2 Les critères morphologiques et structuraux
Les critères microscopiques à mettre en évidence sont consignés dans le tableau 7.
Tableau 7 : Les caractères morphologiques et structuraux
Champignons
Bactéries
Forme des filaments
Présence de spores ou organes de
fructification : pycnides, asques,
zygospores, sclérotes, chlamydospores,
basides…
Mode de formation des spores :
interne ou externe, thallique ou blastique,
isolés ou en chaînettes, phialospores,
alieuspores, blastospore…
Morphologie des spores : couleur,
forme, taille, aspect, uni- ou
pluricellulaire, à paroi mince ou
épaisse…
Disposition des spores : solitaire, en
chaîne, en bouquet…
Forme et taille de la cellule : bâtonnet,
virgule, coque
Réaction à la coloration : coloration de
Gram, au vert malachite pour la mise en
évidence des spores…
Présence d’endospores
Forme et localisation de l’endospore
Mobilité
Morphologie et localisation des spores
de multiplication : plan médian,
subterminal, terminal
Inclusions cellulaires, pigmentation…
- 26 -
L’identification des champignons n’est possible que si le champignon présente de
spores. Il existe des champignons qui sporulent facilement et d’autres, difficilement. Dans ce
dernier cas, la fructification peut être induite par :
culture des champignons provenant d’une culture pure sur des milieux pauvres tels que le
Water agar (WA), Oat Meal agar (OA), Malt agar 2 %, Corn Meal agar (CMA), etc., et les
incuber à 26°C pendant 12 heures sous la lumière et 12 heures à l’obscurité.
exposition de la culture sous la lumière ultraviolette de longueur d’onde 366 nm jusqu’à
ce que la souche sporule.
Lorsque les organes de fructification sont bien distincts dans la boîte, ils sont recueillis à
l’aide d’une aiguille et sont ensuite montés entre lame et lamelle avec quelques gouttes de
solution de bleu de lactophénol.
Observation microscopique : les spores sont colorés en bleu.
Après avoir déterminé les grandes divisions auxquelles le champignon appartient
(ASCOMYCETES, DEUTEROMYCETES, BASIDIOMYCETES, ZYGOMYCETES),
l’identification est complétée en suivant la clé dichotomique dans un livre d’identification
correspondant à chaque groupe, menant à la détermination du genre. Au cours de la lecture,
les différents caractères de l’organe reproducteur sont observés (annexe III).
II-2-3 L’étude des caractères physiologiques
L’étude est surtout faite sur les bactéries. Il renseigne sur le comportement des
bactéries vis à vis de certains facteurs du milieu. Il comprend l’étude du type respiratoire et le
test de catalase.
Type respiratoire :
La détermination du type respiratoire permet d’observer le caractère des bactéries vis à vis de
l’oxygène. Il existe des bactéries de type respiratoire : aérobie strict/facultatif, anaérobie
strict/facultatif, aéro-anaérobie, microaérophile. La réalisation de l’étude se fait sur milieu
solide VL.
Chaque souche de colonies pures de bactéries est ensemencée dans le milieu VL stérile
non solidifié (maintenu dans un bain-marie à 80°C) en réalisant des tours de spires du fond du
tube à 1 cm en dessous de la surface de la gélose. Tout de suite après inoculation, les colonies
- 27 -
sont emprisonnées dans le milieu en refroidissant le tube au bain-marie. Ensuite les cultures
sont incubées pour la croissance de bactéries.
croissance des bactéries à la surface du milieu (en contact de l’air) : type respiratoire
aérobie strict ;
croissance des bactéries le long des spires : type respiratoire anaérobie facultatif ;
croissance des bactéries dans la partie supérieure (ne croissant par en surface) : type
respiratoire microaérophile ;
croissance dans le fond du tube : type respiratoire anaérobie strict.
Ce test peut être confirmé par la recherche d’enzyme impliquée dans le métabolisme
respiratoire des bactéries : la catalase et l’oxydase.
Test de catalase :
La catalase catalyse la décomposition du peroxyde d’oxygène, très toxique, produits par des
réactions cellulaires selon la réaction suivante :
2 H2O2 catalase 2 H2O + O2
peroxyde d’hydrogène eau oxygène moléculaire
Une colonie de bactéries est disposée sur une goutte de H2O2 30 %
Dégagement de bulles : oui (catalase +) ; non (catalase –)
Test oxydase :
Le principe de ce test repose sur la propriété de l’oxydase, un enzyme respiratoire, à catalyser
la réaction d’oxydation d’un substrat organique. Le test s’effectue sur une culture jeune.
Une colonie de bactéries est étalée sur un disque imprégné de solution à 1 % de
chlorhydrate de tetraméthyl-p-phenylènediamine.
Un test positif se traduit par une coloration violette pourpre en 10 secondes.
II-2-4 L’étude des caractères biochimiques
L’étude biochimique permet de distinguer les différents genres ou espèces
microbiennes en se basant sur la différence de métabolisme. Elle est surtout effectuée chez les
bactéries dans notre travail. Mais par manque de consommables, seul l’étude du métabolisme
oxydatif et fermentatif des bactéries est réalisé sur milieu de Hugh et Leifson.
- 28 -
Une colonie pure de bactéries provenant d’une culture jeune est inoculée dans 2 tubes
contenant le milieu stérile de Hugh et Leifson avec 10 % de glucose. L’une des tubes est
ensuite recouverte par de l’huile de paraffine pour créer une condition d’anaérobie. A la fin, la
culture est incubée pendant 48 heures à température ambiante.
Les bactéries fermentatives acidifient les 2 milieux qui deviennent jaunes.
Les bactéries oxydatives acidifient uniquement le tube non recouvert d’huile de paraffine.
Les bactéries inactives ne changent pas la couleur, ou font virer au bleu le milieu
(alcalinisation).
II-3 RECHERCHE D’ACTIVITE ANTIMICROBIENNE
Conscient de l’importance que nous attribuons aujourd’hui aux recherches de
nouvelles substances naturelles, susceptibles de présenter des activités intéressantes, nous
nous proposons, dans ce sens, d’évaluer le potentiel des quelques microorganismes
endophytes associés à Eugenia jambolana. Il s’agit d’une recherche préliminaire sur les
potentiels de quelques bactéries endophytes.
II-3-1 Induction de synthèse de métabolites secondaires chez les bactéries
Les bactéries sont cultivées dans des conditions difficiles mais maîtrisées, afin
d'obtenir des concentrations beaucoup plus élevées en métabolites secondaires.
Les bactéries sélectionnées sont régénérées et cultivées dans des conditions de stress
de façon à les pousser à produire des métabolites secondaires. Pour cela, les souches pures de
bactéries sont multipliées dans un milieu nutritif liquide (Bouillon de peptone de soja 5 g/l),
un milieu pauvre non renouvelé, pendant quelques jours. La concentration de la population
bactérienne est mesurée journalièrement au densitomètre (Il mesure la densité optique d’une
suspension bactérienne réalisée dans un tube de milieu liquide) jusqu’à ce que la croissance
bactérienne reste stationnaire.
Lorsque la phase stationnaire est atteinte, le bouillon est centrifugé 30 minutes à une vitesse
de 36000 t/min. puis filtré.
Le filtrat obtenu constitue un extrait de cellules et de milieu de culture qui est par la suite
utilisé pour le test biologique.
II-3-2 Etude de l’activité antimicrobienne
Les microorganismes ont la faculté de produire des métabolites secondaires qui jouent,
dans la plupart du temps, un rôle de défense « antagoniste » lorsqu’ils sont soumis à des
- 29 -
conditions défavorables ou de stress. Parmi ces métabolites secondaires sont les substances
qualifiées d’« antibiotique ».
Un antibiotique est une substance chimiquement définie, produite par des
microorganismes, capable d’inhiber la croissance et de détruire d’autres microorganismes, en
interférant dans leur métabolisme cellulaire.
Pour apprécier la production de substance antibiotique par les microorganismes qui sont
qualifiés d’ « antagonistes », nous avons utilisé la méthode de diffusion sur gélose ou la
méthode des disques. Ces antagonistes sont supposés produire de substance antibiotique.
II-3-2-1 Méthode de diffusion sur gélose ou méthode des disques
Principe :
Lorsqu’un antibiotique est soumis à une population microbienne, si celle-ci cesse de croître,
les microorganismes en question sont sensibles à l’antibiotique ; d’où l’antibiotique est actif.
Dans le cas contraire, l’antibiotique est inactif ; ce qui veut dire que les microorganismes lui
résiste.
La méthode des disques :
Un disque imprégné de l’extrait à étudier est déposé sur un tapis microbien qui est composé
de la population microbienne dite « indicateurs » (celle ci croissant sur la surface d’un milieu
gélosé). L’antibiotique se propage sur la gélose de façon radiale et dans toutes les directions
avec un gradient de concentration décroissante. Après incubation, il se crée un halo
d’inhibition ou une zone d’inhibition si l’antibiotique est actif.
La sensibilité des microorganismes indicateurs vis-à-vis de l’antibiotique est estimée en
mesurant la zone d’inhibition autour de chaque disque :
la zone d’inhibition est étendue, l’efficacité de l’antibiotique est considérable,
la zone d’inhibition est moindre voire même absente, l’antibiotique n’agit pas contre les
microorganismes indicateurs,
un germe est d’une sensibilité intermédiaire vis-à-vis d’un antibiotique si sa croissance
n’est inhibée que par des concentrations justes supérieures à celles atteintes aux doses
habituelles d’antibiotiques.
Le tableau 8 permet d’évaluer le degré de sensibilité des indicateurs à un antibiotique donné et
de qualifier par conséquent le spectre d’action de l’antibiotique vis-à-vis des indicateurs.
- 30 -
Tableau 8 : Normes utilisés dans l’expression de la sensibilité des microbes à l’antibiotique
avec des disques de 6 mm de diamètre [26]
Diamètre de la zone d’inhibition (Z.i) en mm.
Sensibilité des microbes
Z.i < 7
7 < Z.i < 9
Z.i > 9
Résistant
Sensible
Très sensible
II-3-2-2 Mode opératoire : Antibiogramme
L’antibiogramme est une méthode analytique qui permet de définir in vitro
l’antibiotique le plus actif sur un germe. Après 24 heures d’incubation, un examen attentif de
la croissance des indicateurs révèle l’importance de l’inhibition. La mesure est simplement
qualitative.
Les extraits à tester :
L’extrait recueilli de la centrifugation est supposé contenir une substance antibiotique.
Les indicateurs :
Les indicateurs sont eux aussi régénérés dans un milieu nutritif gélosé (TSA). Après
régénération, les colonies pures sont mises en suspension dans de l’eau distillée stérile de
façon avoir une concentration de 1.5 108 bactéries/ml (0,5 McF). La suspension bactérienne
est ensuite étalée uniformément sur le milieu gélosé.
Les produits témoins :
Un agent antimicrobien est caractérisé par son spectre d’activité. Il agit à des concentrations
très faibles de l’ordre de µg/ml. Les produits antimicrobiens témoins utilisés sont le
chloramphénicol (*CMP) et la nystatine (*Nys).
Tableau 9 : Nature des deux produits témoins
Antibiotique
Source
Type chimique
Spectre d’action
Chloramphénicol
Streptomyces venzuelae
Composés
benzoïques
G + et G -, Rickettsia,
Treponema
Nystatine
Streptomyces noursei
Polyène
Champignons, levures
Les disques :
Les disques de 6 mm de diamètre, confectionnés avec du papier Wattman, sont stérilisés avant
l’emploi. Ensuite, ils sont imprégnés par l’extrait de chaque antagoniste à tester, le bouillon
nutritif sans bactéries et le produit témoin ; et déposés à équidistance sur le tapis bactérien des
indicateurs respectifs aussitôt que ces derniers sont ensemencés.
- 31 -
Quantité d’extrait d’antagoniste par disque : 2 µl
Quantité de bouillon nutritif témoin par disque : 2 µl
Quantité de produits témoins antibiotiques par disque : *CMP. (30 µg), *Nys. (200 UI)
Echelle de McFarland (McF)
La densité optique d’une suspension bactérienne réalisée dans un tube de milieu liquide est
mesurée par un densitomètre. L’appareil donne des valeurs McFarland proportionnelles à des
valeurs moyennes de concentration bactérienne.
Tableau 10: Correspondance échelle McFarland/concentration bactérienne/densité optique
Echelle McF
Concentration bactérienne (108/ml)
Densité optique à 550 nm.
0,5
1
2
3
4
5
1.5
3
6
9
12
15
0,125
0,25
0,50
0,75
1,00
1,25
Après toutes ces opérations, chaque boîte de pétri contenant la préparation est incubée à
température ambiante.
Troisième partie :
RESULTATS - INTERPRETATIONS
DISCUSSIONS
- 33 -
I- LES MICROORGANISMES ENDOPHYTES ISOLES
L’objectif est de connaître tout d’abord si des microorganismes endophytes sont
présents dans Eugenia jambolana. Après avoir fixé et suivi au préalable le protocole
d’isolement des endophytes, nous avons obtenu les résultats suivants :
Tableau 11 : Résultats de l’isolement selon les explants, les traitements et les milieux de
culture utilisés.
EXPLANT
TRAITEMENT
MILIEU
ENDOPHYTES
Chpg.
Bact.
Boutons
floraux
- Ethanol 70 % (30 sec.)
- Hypochlorite de Calcium 3 % (3 min.)
- Broyage, dilution
- Disques fins
PDA
7
4
TSA
Fruits
immatures
(pulpe et
graine)
- Ethanol 70 % (30 sec.)
- Hypochlorite de Calcium 3 % (3 min.)
- Disques fins
PDA
29
19
TSA
Graine de
fruit
immature
- Stérilisation en surface
- Pulpe enlevée
- Graine en disques fins
PDA
PDA + Vit. C
PDA + Charbon actif
0
0
0
0
présent
présent
TSA
TSA + Vit. C
TSA + Charbon actif
- Trempage à l’eau pendant 3 j.
- Ethanol 70 %
- Flambage
MEA
MEA + Vit. C + antibiotique
MEA + Charbon + antibiotique
3
1
1
0
0
0
TSA
TSA + Vit. C + antibiotique
TSA + Vit. C + antibiotique
- Stérilisation en surface
- Récupération de la graine
- Trempage dans le milieu de Czapek Dox
pendant 3 j.
PDA
0
0
TSA
Pulpe de
fruit mûr
Stérilisation en surface
Sabouraud + antibiotique
MEA
Rose Bengal
0
3
0
4
TSA + antibiotique
Pulpe de
fruit
immature
Stérilisation en surface
Sabouraud + antibiotique
MEA + antibiotique
Rose Bengal + antibiotique
3
2
0
3
TSA + antibiotique
- 34 -
Graine de
fruit mûr
- Trempage à l’eau pendant 3 j.
- Ethanol 70 %
- Flambage
MEA
MEA + Vit. C + antibiotique
MEA + Charbon + antibiotique
0
0
0
0
1
0
TSA
TSA + Vit. C + antibiotique.
TSA + Charbon + antibiotique
- Stérilisation en surface
- Récupération de la graine
- Trempage dans le milieu de Czapek Dox
pendant 3 j.
PDA
1
0
TSA
Graine de
fruit mûr
séché
- Fruit séché pendant 3 j.
- Récupération de la graine
- Ethanol 70 %
- Flambage
- Disques fins et broyage
PDA
PDA + Vit. C
PDA + Charbon actif
5
0
0
2
0
0
TSA
TSA + Vit. C
TSA + Charbon actif
Graine
séchée de
fruit mûr
-Graines séchées pendant 3 j.
-Ethanol 70 %
-Flambage
PDA
3
3
TSA
Graine de
fruit
immature
séché
- Fruit séché pendant 3 j.
- Récupération de la graine
- Ethanol 70 %
- Flambage
- Disques fines, et broyage
PDA
0
3
TSA
Contaminant
provenant de
la CIV
Culture in vitro (CIV) de graine
MS
2
Rameau 1
- Désinfection en surface
- Ethanol 70 % (1 min.)
- Hypochlorite de Calcium 3 % (5 min.)
- Ethanol 70 % (1 min.)
PDA
20
TSA
1
Rameau 2
PDA
14
TSA
2
Feuille 1
(limbe)
PDA
15
TSA
2
Feuille 2
(nervure)
PDA
31
TSA
4
Feuille 3
(limbe)
PDA
10
TSA
0
- 35 -
Tableau 12 : Les endophytes isolés dans les différentes parties de Eugenia jambolana
Ram. 1 : rameau fructifère principal
Ram. 2 : rameau fructifère secondaire
F. 1 : limbe droit d’une feuille
F. 2 : nervure principale d’une feuille
F. 3 : limbe gauche d’une feuille
Boutons
floraux (11)
Rameaux (37)
Feuilles (62)
Fruits (46)
Graines (23)
TOTAL
Ram. 1
Ram. 2
F. 1,3
(limbe)
F. 2
(nervure)
graine+pulpe
(29)
Pulpe
(17)
Graines non
séchées
(7)
Graines
séchées
(16)
Jeune
Mûre
Jeune
Mûre
Jeune
Mûre
Champignons
7
20
14
25
31
10
5
3
5
1
0
8
129
Bactéries
4
1
2
2
4
19
5
4
0
1
3
5
50
Total
11
21
16
27
35
29
10
7
5
2
3
13
179
- 36 -
Au cours de nos observations : après 48 heures d’incubation, nous avons constaté
l’apparition d’une coloration brunâtre dans le milieu de culture. C’est une coloration
caractéristique des produits phénoliques. Certes, les composés phénoliques s’oxydent à l’air et
donnent une coloration brunâtre. Cette substance est surtout en quantité élevée au niveau du
fruit (graine, pulpe) et en quantité négligeable au niveau des rameaux et de la feuille.
La présence du produit phénolique a rendu difficile l’isolement des microorganismes
endophytes au niveau des fruits. En effet, ce produit a la propriété inhibitrice de la croissance
chez les microorganismes. Pour ce faire, nous avons eu recours aux méthodes d’élimination
de ce produit ou du moins atténuer leur sortie dans le milieu de culture par :
utilisation de produits antioxydants tel que : l’acide ascorbique, le charbon actif.
Un antioxydant empêche l’oxydation des composés phénoliques en phénol. Le phénol est
responsable de l’activité inhibitrice de croissance chez certains individus.
séchage des fruits : dans le but de dégrader les substances phénoliques.
trempage des graines dans l’eau pendant plusieurs jours.
régénération des microorganismes dans un milieu nutritif : bouillon de Czapek Dox
Par ailleurs, pour affiner l’isolement des endophytes, des antibiotiques sont additionnés au
milieu de culture (tableau 11) :
antifongique : Nystatine (50 µg/ml) + Cycloheximide (50 µg/ml)
antibactérien : Pénicilline G (1 µg/ml) + Chloramphénicol (100 µg/ml)
milieu Rose Bengal (50 µg/ml) favorisant la croissance des champignons.
Interprétations des résultats :
Le tableau 12 nous permet de constater premièrement que les endophytes sont présents
dans les différentes parties de Eugenia jambolana.
Nous avons pu isoler en tout 129 champignons et 50 bactéries. Les champignons sont
ainsi les microorganismes majoritaires.
Quant à la colonisation dans les différentes parties de Eugenia jambolana, les
champignons sont considérables dans les feuilles, les rameaux que dans les graines et
inversement les bactéries sont plus fréquentes dans le fruit que dans les autres parties.
Néanmoins les microorganismes sont peu fréquents au niveau des graines (figure 2).
- 37 -
0
10
20
30
40
50
60
endophytes
Rameaux Feuilles Fruits Graines Pulpe Boutons
floraux
partie de la plante
Figure 2 : Champignons et bactéries isolés des différentes parties de Eugenia
jambolana
Champignon
s
Bactéries
L’utilisation des produits antioxydants et des autres méthodes pour réduire voire
supprimer la sortie des produits phénoliques n’a pas permis d’obtenir de bon résultat. Le
produit phénolique a été toujours présent dans le milieu de culture.
L’explication que nous pourrions supposer quant à la rareté des microorganismes
endophytes isolés des fruits (essentiellement au niveau des graines) serait en outre fondée
sur le rôle inhibiteur de croissance des composés phénoliques, qui empêcherait entre autre
la croissance des microorganismes présents. Certes, les composés phénoliques jouissent
de propriétés bactéricide et fongicide grâce à leur fonction phénol.
Jusqu’ici chaque isolat est considéré comme unité, même s’il peut présenter des doublons –
c’est à dire qu’un isolât, lors de la numération, peut se répéter plusieurs fois et se localiser
dans chacune des différentes parties (ce dernier ne désignant ainsi qu’une seule espèce) –
étant donné que l’identification n’est pas encore faite.
- 38 -
Discussions :
Le protocole de désinfection :
La concentration et la durée de contact avec les explants devraient être préalablement
mises au point. Elles dépendent généralement de l’espèce, de l’âge de la plante, des
différentes parties de la plante (tige, feuilles, racines, etc.).
Les désinfectants les plus souvent employés sont l’hypochlorite de sodium (eau de javel
commercial), l’hypochlorite de calcium et l’éthanol 70 % [4, 17, 22, 27]. Après différents
essais dans la mise au point du protocole, nous avons choisi d’utiliser comme désinfectants :
l’hypochlorite de calcium (CaOCl2) au lieu de l’eau de javel car CaOCl2, ramené à
concentration identique à celle de l’eau de javel, est plus efficace (l’efficacité est
quantifiée sur la présence ou non des microorganismes qualifiés de contaminants dans la
dernière eau de rinçage). Quant à la concentration, nous avons employé 3 % de CaOCl2.
De plus, l’avantage d’utiliser CaOCl2 est qu’il a la propriété de ne pas pénétrer dans les
tissus, ce qui nous permettrait de préserver la population microbienne existant dans les
tissus végétaux ;
l’éthanol : il est surtout efficace lorsque sa teneur alcoolique est ramené à 70 %V
d’alcool. A cette teneur, elle renforce l’action des autres désinfectants ;
en outre, pour les graines, nous avons opté pour le flambage après rinçage dans l’éthanol
70 % étant donné que la graine possède une enveloppe souple protégeant l’amande, qui
après sera enlevée.
La préparation des échantillons préalablement stérilisés en surface pour la culture
isolement :
Pour faire sortir les microorganismes endophytes des différentes explants, nous avons choisi
de réduire les explants tel que les graines, les boutons floraux au broyage d’une part, et
feuilles, rameaux, graines sont fragmentés en des petites portions d’autre part.
La taille des explants est à considérer si nous voulons obtenir le maximum de
microorganismes. Selon Gamboa, Laureano et Baymann dans leur rapport [16], la taille
optimale des fragments de matériel végétal est de 2,5 x 2,5 mm. Au delà de ces mesures, la
manipulation manuelle de fragmentation peut léser les tissus végétaux. Ces mêmes auteurs
recommandent que la taille des explants devrait être la plus petite que possible car ceci permet
d’estimer la diversité des microorganismes endophytes dans les tissus végétaux. Plus les
- 39 -
fragments sont petits, plus le nombre des isolats sera élevé. Cette technique réduit le
phénomène de compétition entre les microorganismes, leurs permettant tous de s’exprimer.
Les endophytes recueillis :
La cartographie des endophytes n’est pas l’objectif du présent travail donc nous ne pouvons
rien avancé quant à la localisation, le nombre exact et à la diversité des endophytes dans
chaque partie de l’explant. Dûment nous pouvons confirmer par nos résultats que les
champignons endophytes sont majoritaires dans la partie aérienne de la plante. Cette
constatation ne fait que renforcer celles émises par d’autres auteurs [17, 56]. Ici, nous avons
isolé 129 champignons et 50 bactéries.
Par ailleurs, il pourrait encore exister des microorganismes qui ne se sont pas exprimés, en
tenant compte de la compétition qui peut se présenter entre les microorganismes pour
coloniser le nouveau milieu, d’une part ; et d’autre part, il faut tenir compte des
microorganismes non extractibles (cas des microorganismes anaérobies stricts).
Les substances phénoliques :
La plante, les microorganismes – face à une agression quelconque, sous des conditions de
stress, ou lorsqu’il y a perturbation de leur environnement respectif – produisent des
substances phénoliques. Pour chacun de ces individus, ces composés phénoliques jouent de
rôles bien déterminés, mais ils se résument à un rôle de défense où ils sont qualifiés
d’inhibiteurs de croissance. Pour sa propriété bactéricide et antifongique, les composés
phénoliques sont peu actifs sur les formes sporulées [6]
Les différentes parties de Eugenia jambolana sont colonisées par des
microorganismes endophytes : champignons et bactéries.
Les champignons endophytes colonisent plutôt la partie aérienne
de la plante.
- 40 -
II- IDENTIFICATION DES MICROORGANISMES ENDOPHYTES
Nous savons maintenant que les endophytes sont présents dans les différentes parties de
Eugenia jambolana. Aussi faut-il maintenant les identifier pour ensuite les classer.
II-1 LES CHAMPIGNONS ENDOPHYTES DE Eugenia jambolana
Nous avons isolé 129 souches de champignons. Chaque souche est cotée par des
chiffres arabes de 1 à 129.
Pour les champignons, nous avons effectué des études des caractères culturaux,
morphologiques et structuraux.
Après observation macroscopique, les souches, qui se ressemblent, sont placées ensemble.
C’est juste après que nous avons procédé à l’examen microscopique, qui permet de bien
distinguer chaque souche et déterminer l’espèce à laquelle elle appartient. A ce niveau, seuls
les champignons qui présentent des organes de fructification sont identifiés en suivant les clés
de détermination sous microscope. Par conséquent, les champignons qui ne sporulent pas
encore ne peuvent pas être déterminé. Dans ce cas, nous les avons classés dans un groupe de
champignons non identifié (NI). Leur identification sera effectuée du moment où ils
sporulent.
Le nom des 129 champignons est dressé dans le tableau 13. Leur nombre et distribution
respectifs dans les différentes parties sont représentés par la figure 3.
L’examen microscopique couplé avec la clé de détermination nous a permis de classer les
champignons isolés comme il est indiqué dans le tableau 15.
Certains de ces champignons sont représentés en photos avec les informations respectives
qui permettent leur identification.
- 41 -
Tableau 13 : Les champignons endophytes isolés de Eugenia jambolana.
Bout. fl : boutons floraux, F. (nervure) : nervure d’une feuille, F. (limbe) : limbe d’une feuille, Gr. imm : graine immature, Gr. imm. séchée : graine immature séchée, Gr.
sec. mûr : graine séchée mûre, Gr. fr. mûr. sec. : graine de fruit mûr séché, Pulp. imm : pulpe immature, Pulp. mûr : pulpe mûre, Ram. 1 : rameau fructifère principal,
Ram. 2 : rameau fructifère secondaire.
N°
Nom scientifique
Localisation
N°
Nom scientifique
Localisation
N°
Nom scientifique
Localisation
N°
Nom scientifique
Localisation
1
Curvularia
Pulp. imm
34
NI
Ram.2
67
Colletotrichum sp1
F. (limbe)
100
Leptodermella
Fr. imm.
2
NI
Gr. imm.
35
Guignardia
F. (limbe)
68
Colletotrichum sp1
F. (limbe)
101
Leptodermella
Bout. fl
3
Phomopsis sp2
Pulp. imm
36
Phomopsis sp2
F. (limbe)
69
NI
F. (nervure)
102
Leptodermella
Bout. fl
4
NI
Gr. imm.
37
Leptodermella sp2
F. (limbe)
70
NI
F. (nervure)
103
Guignardia
F. (limbe)
5
Phoma
Pulp. imm
38
NI
F. (limbe)
71
Phomopsis sp2
F. (nervure)
104
Guignardia
F. (limbe)
6
NI
Gr. imm.
39
Phoma
F. (limbe)
72
Phomopsis sp2
Ram.2
105
Guignardia
F. (limbe)
7
Guignardia
Pulp. imm
40
Glomerella
F. (nervure)
73
Phomopsis sp2
Ram.2
106
NI
Ram.2
8
Phomopsis sp1
Pulp. imm
41
Phomopsis sp2
F. (nervure)
74
Glomerella
Ram.1
107
Colletotrichum sp1
F. (nervure)
9
NI
Gr. imm.
42
Pestalotiopsis
F. (nervure)
75
Phomopsis sp2
Ram.1
108
NI
Ram.1
10
NI
Gr. imm.
43
Glomerella
F. (nervure)
76
Pestalotiopsis
Ram.1
109
Guignardia
F. (limbe)
11
NI
Gr. imm.
44
NI
F. (nervure)
77
NI
Ram.1
110
Guignardia
F. (limbe)
12
NI
Gr. sec. mûr
45
Colletotrichum sp1
F. (nervure)
78
Colletotrichum sp2
Ram.1
111
Guignardia
F. (limbe)
13
NI
Gr. sec. mûr
46
NI
F. (nervure)
79
Pestalotiopsis
Ram.1
112
Leptodermella
Fr. imm.
14
NI
Gr. sec. mûr
47
Colletotrichum sp1
F. (nervure)
80
Glomerella
Ram.1
112
NI
F. (nervure)
15
NI
Gr. sec. mûr
48
Phomopsis sp1
F. (nervure)
81
NI
Gr. fr. mûr. sec.
114
Guignardia
F. (limbe)
16
*Aleuriosporés
Gr. sec. mûr
49
NI
F. (nervure)
82
NI
Gr. fr. mûr. sec.
115
NI
F. (nervure)
17
NI
Gr. imm. séchée
50
Phomopsis sp2
F. (nervure)
83
NI
Gr. fr. mûr. sec.
116
Guignardia
F. (limbe)
18
NI
Gr. imm. séchée
51
Phomopsis sp2
F. (nervure)
84
Leptodermella sp2
Bout. fl
117
Guignardia
F. (limbe)
19
Phomopsis sp1
cont.
52
Colletotrichum sp1
F. (nervure)
85
Pestalotiopsis
Bout. fl
118
Guignardia
F. (limbe)
20
NI
cont.
53
Colletotrichum sp2
F. (limbe)
86
Leptodermella
Fr. imm.
119
NI
Ram.2
21
NI
Ram.1
54
Colletotrichum sp2
Pulp. mûr.
87
Pestalotiopsis
Fr. imm.
120
NI
Ram.2
22
Phomopsis sp 2
Ram.1
55
Colletotrichum sp1
Pulp. mûr.
88
Lophotrichus
Fr. imm.
121
Leptodermella
Bout. fl
23
Phomopsis sp2
Ram.1
56
Leptodermella sp2
Gr. fr. mûr. sec.
89
Fusarium
Fr. imm.
122
Leptodermella
Bout. fl
24
NI
Ram.1
57
Leptodermella sp2
Pulp. mûr.
90
Lophotrichus
Fr. imm.
123
Leptodermella
Fr. imm.
25
NI
Ram.1
58
NI
Gr. imm. séchée
91
Leptodermella
Bout. fl
124
Guignardia
F. (limbe)
26
Phomopsis sp 2
Ram.1
59
Colletotrichum sp1
Ram.1
92
NI
Ram.1
125
Guignardia
F. (limbe)
27
Colletotrichum sp2
Ram.1
60
Colletotrichum sp1
Ram.2
93
Guignardia
Fr. imm.
126
Colletotrichum sp1
F. (nervure)
28
NI
Ram.1
61
Colletotrichum sp1
F. (nervure)
94
NI
F. (limbe)
127
NI
Ram.2
29
Phomopsis sp2
Ram.1
62
Colletotrichum sp1
F. (nervure)
95
Leptodermella
Fr. imm.
128
NI
Ram.2
30
Colletotrichum sp2
Ram.2
63
Colletotrichum sp1
F. (nervure)
96
NI
Ram.1
129
NI
Ram.2
31
NI
Ram.2
64
NI
F. (nervure)
97
Guignardia
F. (limbe)
32
Phomopsis sp1
Ram.2
65
Colletotrichum sp1
F. (nervure)
98
Guignardia
F. (limbe)
33
NI
Ram.2
66
Colletotrichum sp1
F. (limbe)
99
Guignardia
F. (limbe)
- 42 -
Figure 3 : Colonisation des champignons endophytes dans les différentes parties de Eugenia jambolana
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Ram.1 Ram. 2 F. limbe F. nervure Fruits jeunes Pulpe jeune Pulpe mûre Graine
séchée jeune Graine
sechée mûre Graine non
séchée
partie de la plante
nombre des endophytes
*Alieusporés Colletotrichum sp1 Colletotrichum sp2 Curvularia Fusarium Glomerella Guignardia
Leptodermella sp1 Leptodermella sp2 Lophotrichus Pestaliotopsis Phoma Phomopsis sp1 Phomopsis sp2
Ram. 1 : rameau fructifère principal, Ram. 2 : rameau fructifère secondaire, F. : feuille
- 43 -
Tableau 14 : Identification et classification des champignons endophytes
Nom scientifique
Division
Classe
Groupe
Caractères microscopiques
*Aleuriosporés
DEUTEROMYCOTINA
ALEURIOSPORES
Conidie terminale unique, cloison
basale
Colletotrichum sp.1
Colletotrichum sp.2
DEUTEROMYCOTINA
COELOMYCETES
PHIALOSPORES
Conidiomes acervulaires, conidies non
septées
Curvularia
DEUTEROMYCOTINA
POROSPORES
Conidiophore macronémé, conidies
solitaires mélanisées, apicales et
latérales, à 3 septa, repousse du
conidiophore subterminale
Fusarium
DEUTEROMYCOTINA
HYPHOMYCETES
PHRAGMOSPORES
Conidie à base pédiforme, à phyalide
Glomerella
ASCOMYCOTINA
PYRENOMYCETES
O. SPHERIALES
F. POLYSTIMATACEAE
Stade parfait de Colletotrichum
(téléomorphe), ascome petite
sphérique, à parenchyme de couleur
sombre, ascospore hyaline
Guignardia
ASCOMYCOTINA
LOCULOASCOMYCETES
O. DOTHIDEALES
F. DOTHIDEACEAE
Asque court, ascospores hyalines à
brun pâle, non septé
Leptodermella sp.1
Leptodermella sp.2
DEUTEROMYCOTINA
MONOBLASTOSPORES
Conidiomale, à acervule, conidie
hyaline
Lophotrichus
ASCOMYCOTINA
PYRENOMYCETES
O. SPHAERIALES
F. MELANOSPORACEAE
Ascome ostiolé, ascospore de couleur
marron
Pestaliotopsis
DEUTEROMYCOTINA
ANNELLOSPORES
Conidiome acervulaire, conidies
brunes, versicolores, et septées
Phoma
DEUTEROMYCOTINA
COELOMYCETES
PHIALOSPORES
Conidiome pycnidien, pycnide brun
doré à brun sombre, de texture
homogène, conidie hyaline, non septée,
cylindrique, ellipsoïde, absence de
conidiophore
Phomopsis sp.1
Phomopsis sp.2
DEUTEROMYCOTINA
COELOMYCETES
PHIALOSPORES
Conidiome pseudopycnidien, non
ramifié, conidies hyalines, ellipsoïdes à
fusiforme, sans appendice
- 44 -
Les champignons endophytes isolés de Eugenia jambolana
Colletotrichum
Règne :
FUNGI
Division :
DEUTEROMYCOTINA
Classe :
COELOMYCETES
Groupe :
PHIALOSPORES
Genre :
Colletotrichum sp1
Observation macroscopique :
- Mycélium blanc vert
- Masse conidienne orange
Observation microscopique :
- Mycélium asepté
- Conidies cylindriques 12-15
x 4,5-5 µm
Colletotrichum sp2
- Mycélium blanc marron
- Masse conidienne orange
- Conidies cylindriques 15-17
x 3-4,5 µm
Curvularia
Règne :
FUNGI
Division :
DEUTEROMYCOTINA
Groupe :
POROSPORES
Genre :
Curvularia sp.
Observation macroscopique :
- Mycélium mélanisé
Observation microscopique :
- Conidiophore macronémé à
répousse subterminale
- Conidies solitaires
mélanisées, phragmosporées,
souvent courbes à cellules
extrêmes plus claires
Guignardia
Règne :
FUNGI
Division :
ASCOMYCOTINA
Classe :
LOCULOASCOMYCETES
Ordre :
DOTHIDEALES
Famille :
DOTHIDEACEAE
Genre :
Guignardia
Observation macroscopique :
- Mycélium vert brunâtre
Observation microscopique :
- Asque non septé, bituniqué,
à 8 spores
- Ascospore hyaline
- 45 -
Leptodermella
Règne :
FUNGI
Division :
DEUTEROMYCOTINA
Groupe :
MONOBLASTOSPORES
Genre :
Leptodermella sp1
Observation macroscopique :
- Mycélium brunâtre
Observation microscopique :
- Conidiome acervulaire
- Conidiophores absents
- Cellules conidiogènes
holoblastiques
- Conidie hyaline, filiforme,
cylindrique, non septée
-15-20 x 2-3 µm à 15-18 x 5-6
µm.
Leptodermella sp2
- Mycélium jaune marron
Lophotrichus
Règne :
FUNGI
Division :
ASCOMYCOTINA
Classe :
PYRENOMYCETES
Ordre :
SPHAERIALES
Famille :
MELANOSPORACEAE
Genre :
Lophotrichus
Observation macroscopique :
- Mycélium verdâtre
Observation microscopique :
- Ascome à perithecium,
ostiolé
- Asque à 8 spores, 30-35 x 8-
12 µm
- Ascospore limoniforme, de
couleur marron, 8-10 x 5-8 µm
Pestaliotopsis
Règne :
FUNGI
Groupe :
ANNELLOSPORES
Genre :
Pestalotiopsis
Observation macroscopique :
- Mycélium blanc
- Masse conidienne noire
Observation microscopique :
- Conidiome acervulaire
- Cellules conidiogènes
annellidiques
- Conidies fusiforme, 4 septa,
cellule basale hyaline, cellule
apicale conique hyaline, 18-22 x
5-7 µm
- 46 -
Phomopsis
Règne :
FUNGI
Division :
DEUTEROMYCOTINA
Classe :
COELOMYCETES
Groupe :
PHIALOSPORES
Genre :
Phomopsis sp1
Observation macroscopique :
- Mycélium vert clair
Observation microscopique :
- Coelomycètes à acervules
- Conidiophore de petite taille
- Cellules conidiogènes
phyalidiques, filiforme, 10-15
x 2-2,5 µm
- Conidie fusiforme : 5-7 x 2-
2,5 µm
Interprétations des résultats :
Nous avons identifié 13 espèces de champignons, plus 1 dont le groupe auquel elle appartient est
seulement connu (tableau 14). Le reste des champignons NI ne sont pas identifiés car la seule
condition requise pour l’identification des champignons n’est pas satisfaite (les champignons sont
encore en état végétatif, d’où pas d’organe de fructification). Les différents caractères qui doivent être
mise en exergue dans l’identification des champignons sont mentionnés dans l’annexe III.
En analysant la figure 3, nous pouvons en tirer les informations suivantes :
- Les espèces représentatives de la population de champignons endophytes dans Eugenia
jambolana sont Guignardia, Colletotrichum sp., Phomopsis, et Leptodermella sp.
- La dominance de chaque taxa est représentée dans le tableau 15.
- La distribution des espèces dans les différentes parties de Eugenia jambolana est
consignée dans le tableau 16.
La majorité des champignons identifiés (11 taxa) appartiennent à la division des
DEUTEROMYCETES, et les autres (3 taxa) à celle des ASCOMYCETES.
- 47 -
Tableau 15 : Dominance des taxa dans chaque partie de la plante
Partie de la plante
Taxa représentatifs
Taxon dominant
Taxa
les moins représentés
Rameaux
1
Phomopsis sp2,
Colletotrichum sp.
Phomopsis sp2
Pestaliotopsis
2
Phomopsis sp2
Lophotrichus
Feuilles
Limbe
Colletotrichum sp.,
Phomopsis sp2
Guignardia
Leptodermella, Phoma
Nervure
Colletotrichum sp1
Pestalotiopsis,Phomopsis sp1
Fruits
Fruits
jeunes
Guignardia
Leptodermella sp1
Fusarium, Pestalotiopsis,
Phoma
Fruits
mûrs
Leptodermella sp2
Leptodermella sp2
Curvularia, Colletotrichum,
*Aleuriosporés
Boutons
floraux
Leptodermella sp2,
Pestaliotopsis
Tableau 16 : Distribution des espèces dans les différentes parties de Eugenia jambolana
Taxa
Partie de la plante
Note
Colletotrichum sp1
(5) : Ram.1, 2 – F. limbe, nervure – pulpe
mûre
Abondant en nombre au niveau des
feuilles
Colletotrichum sp2
(5) : Ram.1, 2 – F. limbe, nervure – pulpe
mûre
Présence
Pestalotiopsis
(4) : Ram. 1 – F. nervure – Fr. Jeune –
boutons floraux
Phomopsis
(4) : Ram. 1, 2 – F. limbe, nervure
Moins abondant
Leptodermella sp2
(4) : F. limbe – Pulpe mûre – graine mûre
– boutons floraux
Guignardia
(3) : F. limbe – Fr. jeune – pulpe jeune
Très abondant dans la limbe des
feuilles
Phoma
(2) : F. limbe –Fr. jeune
Glomerella
(2) : Ram. 1 – F. nervure
Leptodermella sp1
(1) : Fr. jeunes
Abondant dans les jeunes fruits
Curvularia
(1) : Pulpe jeune
*Aleuriosporés
(1) : Graine séchée mûre
Fusarium
(1) : Fr. jeune
Lophotrichus
(1) : Fr. jeune
- 48 -
II-2 LES BACTERIES ENDOPHYTES de Eugenia jambolana
50 souches de bactéries sont isolées des différentes parties de Eugenia jambolana. Leur
identification se base sur les études des caractères culturaux, morphologiques et structuraux,
physiologiques et biochimiques. Les souches bactériennes sont numérotées par de chiffres arabes.
II-2-1 Etude des caractères culturaux
Le tableau 17 montre les points caractéristiques des colonies après examen à l’œil nu.
II-2-2 Etude des caractères morphologiques et structuraux
Les caractères morphologiques et structuraux des bactéries sont consignés dans le tableau 18.
II-2-3 Etude des caractères physiologiques et biochimiques
Les résultats de l’étude des caractères physiologiques et biochimiques sont représentés dans le
tableau 19.
La distribution et le nombre des bactéries dans les différentes parties de Eugenia jambolana sont donnés
dans le tableau ci-dessous :
Tableau 20 : Distribution et nombre de bactéries dans les différentes parties de Eugenia jambolana
Partie de la plante
Nombre
Isolâts
Rameaux
1
1
47
2
2
45 - 46
Feuilles
limbe
2
44 - 52
nervure
4
40 - 41 - 42 - 43
Fruits jeunes
22
5 - 6 - 8 - 9 - 12 - 13 - 14 - 15 -19 - 20 - 21 - 22 - 23 - 24 -
28 - 29 - 30 - 33 - 35 - 37 - 38 - 39
Pulpe
jeune
mûre
6
24' - 26 - 31 - 34 - 36
Graine
séchée
jeune
mûre
5
25 - 48 - 49 - 50 - 51
non
séchée
jeune
mûre
2
27 - 32
Boutons floraux
4
1 - 2 - 3 - 4
- 49 -
Tableau 17 : Les caractères culturaux des colonies de bactéries endophytes
COTE
FORME
SURFACE
HAUTEUR
CONTOUR
CARACTERE
OPTIQUE
COULEUR
1
circulaire
lisse
convexe
régulier
transparent
jaune brun
2
circulaire
lisse
plate
régulier
transparent
jaune clair
3
circulaire
lisse
plate
régulier
transparent
jaune clair
4
circulaire
lisse
plate
irrégulier
opaque
blanchâtre
5
circulaire
lisse
plate
régulier
transparent
jaune poussin
6
circulaire
lisse
convexe
irrégulier
transparent
jaune poussin
8
circulaire
lisse
convexe
irrégulier
transparent
jaune œuf
9
circulaire
lisse
convexe
régulier
transparent
jaune poussin
12
circulaire
lisse
plate
régulier
transparent
jaune œuf
13
circulaire
lisse
plate
régulier
transparent
jaune poussin
15
circulaire
lisse
plate
régulier
opaque
jaune poussin
19
circulaire
lisse
plate
régulier
transparent
jaune poussin
20
circulaire
lisse
plate
régulier
opaque
jaune œuf
21
circulaire
lisse
plate
régulier
opaque
jaune œuf
22
circulaire
lisse
plate
irrégulier
opaque
blanchâtre
23
circulaire
lisse
convexe
régulier
opaque
jaune œuf
24
circulaire
lisse
plate
régulier
opaque
jaune poussin
24'
circulaire
lisse
plate
régulier
transparent
jaune poussin
25
circulaire
lisse
plate
irrégulier
transparent
jaune œuf
26
circulaire
lisse
plate
régulier
transparent
jaune poussin
27
circulaire
lisse
plate
régulier
transparent
jaune poussin
28
rhizoïde
lisse
plate
irrégulier
opaque
blanchâtre
29
circulaire
lisse
plate
irrégulier
transparent
jaune brun
30
circulaire
lisse
convexe
irrégulier
transparent
jaune poussin
31
circulaire
lisse
plate
irrégulier
transparent
jaune œuf
32
circulaire
lisse
plate
irrégulier
transparent
jaune poussin
33
circulaire
lisse
concave
irrégulier
transparent
jaune brun
34
circulaire
lisse
plate
irrégulier
transparent
jaune clair
35
circulaire
lisse
plate
irrégulier
transparent
jaune œuf
36
circulaire
lisse
plate
régulier
transparent
jaune poussin
37
circulaire
rugueuse
en relief
régulier
opaque
blanchâtre
38
circulaire
lisse
plate
régulier
transparent
jaune brun
39
circulaire
lisse
plate
irrégulier
transparent
jaune brun
40
circulaire
rugueuse
en relief
irrégulier
opaque
blanchâtre
41
circulaire
rugueuse
en relief
irrégulier
opaque
jaunâtre
42
circulaire
lisse
plate
régulier
opaque
blanchâtre
43
circulaire
lisse
plate
régulier
opaque
blanchâtre
44
circulaire
lisse
plate
régulier
opaque
blanchâtre
45
circulaire
lisse
plate
irrégulier
opaque
blanchâtre
46
circulaire
lisse
plate
irrégulier
opaque
jaunâtre
47
circulaire
lisse
plate
irrégulier
transparent
jaunâtre
48
circulaire
lisse
concave
régulier
opaque
blanchâtre
49
circulaire
lisse
concave
régulier
opaque
blanchâtre
50
circulaire
lisse
plate
régulier
opaque
blanchâtre
51
circulaire
lisse
plate
régulier
opaque
blanchâtre
52
circulaire
rugueuse
en relief
régulier
opaque
blanchâtre
- 50 -
Tableau 18 : Les caractères morphologiques et structuraux des bactéries
COTE
GRAM
SPORE
MOBILITE
FORME
TAILLE (µm)
1
G -
-
M
B
2
G -
-
M
CB
0,5 / 1 x 0,5
3
G -
-
M
B
0,5 x 0,5
4
G +
sp +
M
B
1,5 x 0,5
5
G -
-
M
B
1,5 / 1 x 0,5
6
G -
-
M
CB
-
8
G -
-
M
CB
1 / 0,5 x 0,5
9
G -
-
M
B
-
12
G -
-
M
CB
1 / 0,5 x 0,5
13
G -
-
M
CB
1,5 x 1
15
G +
sp +
M
B
2 / 1,5 x 1
19
G -
-
M
B
1 / 0,5 x 0,5
20
G +
sp +
M
Coques
0,5 x 0,5
21
G -
-
M
B
0,5 x 0,5
22
G +
sp +
M
B
1,5 / 1 x 0,5
23
G -
-
M
B
0,5 x 0,5
24
G -
-
M
B
1 x 0,5
24'
G -
-
M
B
1 / 0,5 x 0,5
25
G -
-
M
B
1 / 0,5 x 0,5
26
G -
-
M
B